非交叉反應性抗IgG抗體的製作方法

2023-10-29 07:59:17 6

專利名稱：非交叉反應性抗IgG抗體的製作方法
非交叉反應性抗IgG抗體本發明報導了特異性結合人和黒猩猩IgG類抗體的IgG-Fab片段的恆定區的抗體及其在免疫測定中的用途。
背景技術：
自從Koehler和Milstein在1974年開發了首例單克隆抗體以來，進行了許多努カ以開發適用於治療人的抗體。首例可獲得的單克隆抗體已在小鼠和大鼠中被開發。在過去10年中，越來越多的人單克隆抗體或人源化單克隆抗體已進入市場。熟知的實例包括例如來自 F. Hoffmann-La Roche AG, Basel 的 Herceptin ⑧和 MabThera 。極大量的人或人源化抗體正在調查研究中，並在能夠考慮進入人體進行初步試驗以前需要在實驗動物中研究。必須研究如生物可用性和抗體清除等(只提到其中2種)的重要標準。許多這些研究需要在實驗動物自身抗體的背景下定量治療抗體。在大多數情況下使用哺乳動物作為實驗動物。通常最先在嚙齒類如小鼠或大鼠中評估毒理學。在更高級的藥物開發階段，特別是在藥物進入人體以前，甚至必須將猴子包括在這樣的臨床前研究中。哺乳動物循環中通常具有約10至約30毫克/ml之間的抗體。治療單克隆抗體一般必須以範圍從約I納克/ml至約100毫克/ml之間的血清水平進行檢測。因此，必須在實驗動物抗體的背景下檢測治療抗體，所述實驗動物抗體為約100倍至I千萬倍過量。在實驗動物抗體的背景下檢測人或人源化治療抗體是對藥理學家的極為嚴峻的任務。檢測動物與智人的親緣關係越近，人或人源化抗體的檢測就變得越來越困難。在WO 2008/031532中報導了一種抗藥物抗體測定。在WO 2006/066912中報導了在實驗動物中檢測治療抗體。在US 5，332，665中報導了物種特異性、高親和カ的單克隆抗體。發明概述本發明首先報導了在人和黒猩猩的G型免疫球蛋白的抗體上的構象表位，其不存在於通常使用的實驗動物中。其次報導了與此表位結合的非交叉反應性抗人IgG抗體和抗黒猩猩IgG抗體。第三，報導了使用這些抗體的測定。本發明報導的ー個方面是結合人或黒猩猩IgG(G亞類的免疫球蛋白)但不結合犬和絨猴(marmoset) IgG的抗體。在一個實施方案中,所述抗體不結合犬、恆河猴(Rhesus-monkey)、絨猴、狒狒和食蟹猴(cynomolgus) IgG。在另ー個實施方案中,所述抗體特異性結合人和黑猩猩IgG。在另外的實施方案中，通過表面等離子共振測定的結合人或黒猩猩IgG的Kd值是10_9mol/l或更低，結合犬、恆河猴、絨猴、狒狒和食蟹猴IgG的Kd值是10_6mOl/l或更高。在一個實施方案中，結合人或黒猩猩IgG的Kd值是10_9mol/l至10_13mol/l。在另ー個實施方案中，結合 犬、恆河猴、絨猴、狒狒和食蟹猴IgG的Kd值不能通過表面等離子共振測定。在一個實施方案中，所述抗體是單克隆抗體。本發明報導的另ー個方面是特異性結合包含K輕鏈恆定結構域的IgGl (Gl亞類的免疫球蛋白)的抗體。
在一個實施方案中，所述抗體還結合IgG2。在另ー個實施方案中，所述抗體還結合IgG4。在另ー個實施方案中，所述抗體不結合IgG3。在一個實施方案中，所述抗體不結合包含\輕鏈恆定結構域的IgGl。在一個實施方案中,所述抗體是單克隆抗體。本發明報導的從細胞系DSM ACC3006(M-1. 3. 2)，DSM ACC3007(M_1. 5. 8)和 DSMACC3008(M-1. 7. 10)得到的抗體與例如細胞系DSM ACC2708產生的抗體M-R10Z8E9比較時顯示了降低的交叉反應性，它們結合Fab區中的不同表位，不受鄰近的糖基化位點的影響，並可在免疫測定中混合用於測定Fab治療抗體，因為每種抗體的結合位點在Fab片段中僅出現I次。本發明報導的各方面是細胞系DSM ACC3006, DSM ACC3007和DSM ACC3008，以及 從所述細胞系得到的各個抗體和這些抗體在免疫測定中的用途。另ー個方面是ー種試劑盒，其包含a)從 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008，或 DSM ACC2708 得到的抗體的生物素化形式，b)從 DSM ACC3006,或 DSM ACC3007,或 DSM ACC3008,或 DSM ACC2708 得到的抗體的地高辛化(digoxygenylated)形式。本發明報導的另ー個方面是檢測從實驗動物得到的樣品中的治療抗體的方法，其包括以下步驟a)提供待分析的樣品，b)將所述樣品與和本發明報導的抗體結合相同表位的抗體孵育，c)任選地將所述樣品與適於選擇性檢測總治療抗體、活性治療抗體或結合抗原的治療抗體的試劑孵育，和d)任選地通過校準曲線將在(b)或(C)中形成的複合物與治療抗體的濃度相關聯。本發明報導的另ー個方面是使用包含捕獲抗體和示蹤抗體的抗原橋連免疫測定，進行免疫學測定從實驗動物得到的樣品中的治療抗體的方法，其中所述捕獲抗體和示蹤抗體都獨立地選自和本發明報導的抗體結合相同表位的抗體。在一個實施方案中，所述免疫測定是夾心免疫測定。在另ー個實施方案中，抗體與其綴合配偶體的綴合通過經由抗體的胺基酸骨架的N-端和/或e-氨基(賴氨酸)、不同賴氨酸的e -氨基、羧基、巰基、羥基和/或酚官能團，和/或抗體的碳水化合物結構的糖醇基的化學結合進行。在另外的實施方案中，捕獲抗體通過特異性結合對固定。在一個實施方案中，捕獲抗體與生物素綴合併通過固定化的抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素進行固定。在另一個實施方案中，示蹤抗體通過特異性結合對與可檢測的標記物綴合。在一個實施方案中，示蹤抗體與地高辛綴合併通過針對地高辛的抗體進行與可檢測的標記物的連接。在另ー個實施方案中，治療抗體是Fab。在一個實施方案中，實驗動物選自絨猴和絹毛猴(tamarin)、舊大陸猴(old world monkey)、侏儒狐猴和鼠狐猴(dwarf and mouse lemur)、長臂猿和小猿(lesser ape)、美狐猴(true lemur)家族的成員，以及其雜種。在一個實施方案中，實驗動物選自狗、恆河猴、絨猴、狒狒和食蟹猴。在一個實施方案中，實驗動物是獼猴(Macacamonkey)。在另ー個實施方案中，結合治療抗體但不結合實驗動物的免疫球蛋白的抗體是本發明報導的抗體。在一個實施方案中，治療抗體是人或人源化抗體。在另ー個實施方案中，人或人源化抗體是單克隆抗體。在一個實施方案中，檢測總治療抗體，在另ー個實施方案中檢測活性治療抗體，在另ー個實施方案中檢測與其抗原結合的治療抗體。本發明報導的另ー個方面是結合治療抗體但不結合實驗動物的免疫球蛋白的抗體在測定從實驗動物獲得的樣品中的總治療抗體、活性治療抗體或抗原結合的治療抗體的濃度中的用途，其中所述抗體和本發明報導的抗體結合相同的表位。在一個實施方案中，所述抗體是本發明報導的抗體。本發明報導的另ー個方面是抗體組合物，其包含由細胞系DSM ACC3006、細胞系DSM ACC3007、細胞系DSM ACC3008和/或細胞系DSM ACC2708產生的抗體的混合物。另ー個方面是本發明報導的抗體組合物在本發明報導的方法中的用途。發明詳述名為M-R10Z8E9的非交叉反應性抗人IgG抗體(從細胞系DSM ACC2708中獲得) 結合G型人免疫球蛋白的CH2結構域中的靠近糖基化位點Asn297的表位。本發明報導的抗體M-1. 3. 2,M-1. 5. 8和M-1. 7. 10與抗體M-R10Z8E9相比顯示了降低的交叉反應性，結合Fab區中的不同表位，不受鄰近的糖基化位點的影響，且可在免疫測定中混合用於測定治療抗體，特別是Fab治療抗體，因為每種抗體的結合位點都在Fab片段中存在。術語「治療抗體」表示在臨床研究中檢測的被批准用作人治療劑的抗體，且其可對個體施用用於治療疾病。在一個實施方案中，治療抗體是單克隆抗體。在另ー個實施方案中，治療抗體選自從類人猿(great ape)得到的抗體，從用人抗體基因座轉化的動物得到的抗體，人單克隆抗體，或人源化單克隆抗體。在一個實施方案中，治療抗體是人單克隆抗體。在另ー個實施方案中，治療抗體是人源化單克隆抗體。治療抗體被廣泛用於多種疾病的治療，例如腫瘤疾病(例如血液和實體惡性腫瘤，包括非何杰金氏淋巴瘤、乳腺癌和結腸直腸癌)，免疫疾病，中樞神經疾病，血管疾病或傳染病。這樣的抗體為，例如，針對CD20，CD22，HLA-DR, CD33，CD52，EGFR, G250,⑶3，HER2, PSMA, CD56，VEGF, VEGF2, CEA, Levis Y 抗原，IL-6受體(IL6R)或IGF-I受體(IGFlR)的抗體。術語「抗體」包含抗體結構的多種形式，包括整個抗體和抗體片段。本發明報導的抗體在一個實施方案中是人抗體，人源化抗體，嵌合抗體，或T細胞抗原耗盡的抗體(T-cell antigen depleted antibody)。例如在 Morrison, S. L ,等人，Proc. Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855 ；US 5，202，238 和 US 5，204，244 ;Riechmann，L.，等人，Nature 332(1988)323-327 ；Neuberger, M. S.，等人，Nature 314(1985)268-270 ；Lonberg,N.，Nat. Biotechnol. 23(2005) 1117-1125 中描述了抗體的基因工程。非人(例如嚙齒類)抗體的「人源化」形式是包含來源於非人抗體和來源於人抗體的部分序列的嵌合抗體。大部分人源化抗體來源於人抗體(接受體抗體)，其中高變區的殘基被具有期望的特異性和親和カ的非人物種，例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的的高變區(供體抗體)的殘基替換。有時候，人抗體的框架區(FR)殘基被相應的非人殘基替換。此夕卜，人源化抗體可包含另外的修飾，例如在接受體抗體或供體抗體中不存在的胺基酸殘基。這樣的修飾導致這樣的接受體或供體抗體的變體，其與相應的親本序列同源但不同一。進行這些修飾以進一歩改善抗體性能。大體上，人源化抗體將包含至少ー個、通常2個可變結構域的基本全部，其中高變環對應非人供體抗體的高變環，FR的全部或基本全部是人接受體抗體的FR。人源化抗體任選地也包含至少一部分抗體恆定區，通常是人抗體恆定區的一部分。人源化非人抗體的方法已在領域中描述。在一個實施方案中，人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入的胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基通常被稱為「輸入」殘基，其一般來自「輸入」可變結構域。可基本上遵照Winter及其同事的方法，通過將高變區序列取代為相應的非人抗體的序列進行人源化。因此，這樣的「人源化」抗體是嵌合抗體，其中實質上少於完整的人可變結構域的序列被來自非人物種的相應序列取代。實際上，人源化抗體一般是人抗體，其中一些高變區殘基和可能有一些框架區殘基被來自嚙齒類或非人靈長類抗體的類似位點中的殘基取代。本發明使用的術語「單克隆抗體」指從基本均質的抗體群體中得到的抗體，即組成群體的個體抗體是同一的，除了可能以少量存在的可能天然發生的突變以外。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原位點。此外，與包含針對不同抗原位點(決定簇或表位)的不同抗體的多克隆抗體製品相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單個抗原位點。除了其特 異性以外，單克隆抗體的優勢在於其合成可不被其他抗體汙染。修飾語「單克隆」表示抗體的特徵是從基本均質的抗體群體中獲得，而不應被視為需要通過任何特定方法產生所述抗體。本發明使用的術語「實驗動物」表示以下靈長目的各科成員，即包含絨猴和絹毛猴(絨猴(Callitrichidae)科)，新大陸猴(捲尾猴(Cebidae)科)，舊大陸猴(獼猴(Cercopithecidae)科，例如稱猴(Macaca monkey)),侏儒狐猴和鼠狐猴(鼠狐猴(Cheirogaleidae)科)，指狐猴(aye-aye)(指猴(Daubentoniidae)科)，嬰猴(bushbaby)和夜猴(galago)(嬰猴(Galagonidae)科)，長臂猿和小猿(長臂猿(Hylobatidae)科)，馬達加斯加大狐猴(indris),馬達加斯加狐猴(sifaka),和其親屬(大狐猴(Indridae)科)，美狐猴(狐猴(Lemuridae)科)，懶猴(Iorise)(懶猴(Loridae)科)，嬉猴(sportivelemur)(嬉猴(Megaladapidae)科)，眼鏡猴(tarsier)(眼鏡猴(Tarsiidae)科)，及其雜種。在一個實施方案中，實驗動物選自絨猴和絹毛猴、舊大陸猴、侏儒狐猴和鼠狐猴、長臂猿和小猿、美狐猴各科的成員，及其雜種。在此實施方案中，排除了離人類最近的親屬，類人猿，特別是黒猩猩、倭黒猩猩(bonobo)、大猩猩(gorilla)和猩猩(orangutan)的組。術語「樣品」表示從實驗動物移取的任意組織或液體樣品。在一個實施方案中，樣品可為液體樣品如唾液、尿、全血、血漿或血清。在另ー個實施方案中，樣品將為全血、血漿或血清。 「結合治療抗體但不結合實驗動物抗體的抗體」將以至少l(T9mol/l的解離常數(=Klliss)，在另ー個實施方案中以至少I(T1V)Vl的Klliss結合治療抗體。同時通過10_7mol/I或更差的Kmss確保不結合實驗動物抗體的性能。在另ー個實施方案中，結合治療抗體但不結合實驗動物抗體的抗體在分別針對實驗動物的G型免疫球蛋白和針對人或黒猩猩的G型免疫球蛋白的反應性之間將具有至少100倍的Kmss差距。大體上,術語「結合」表示抗體以10_9mol/l或更低的解離常數(=Kd = KDiss.),在另ー個實施方案中以至少l(Tlclmol/l的Kd結合其抗原或相應的抗體受體(看相應的上下文而定)。同時通過10_7mol/l或更高(例如10_5mol/l)的Kd確保不結合的性能。在另ー個實施方案中，結合第一抗體但不結合第二抗體的抗體在分別針對第一種G型免疫球蛋白和針對第二種G型免疫球蛋白的反應性之間將具有至少100倍的Kd差距。
在一個實施方案中通過在BIAcore⑧儀器上的表面等離子共振評估抗體的結合性能，特別是KDiss。在此方法中，通過表面等離子共振(SPR)的變化評估結合性能。可便利地將研究中的抗體與固相(稱為晶片)結合併用於評估單克隆抗體、多克隆抗體或甚至包含IgG的血清與此包被的晶片的結合。研究中的結合治療抗體但不結合實驗動物抗體的抗體可為單克隆抗體，這樣的抗體的片段，以及包含這樣的抗體的結合結構域的基因構建體。可使用保留上述結合治療抗體但不結合實驗動物的抗體的標準的任意抗體片段。可能必須在臨床前研究期間評估與治療抗體在實驗動物中的應用相關的多個方面。在特定設置下，可能與分析存在的治療抗體的總量相關，或分析治療抗體的特定片段，或治療抗體的特定修飾，或與抗原結合的治療抗體的濃度，或仍然能夠結合抗原的治療抗體的部分(fraction)可能是重要的。在一個實施方案中，本發明報導的抗體和方法可用於分別檢測總治療抗體、活性治療抗體或結合抗原的治療抗體。術語「總治療抗體」表示檢測的任意抗體，與抗體是否有活性(即仍然可與其抗原反應)、無活性和/或結合抗原無關。術語「活性治療抗體」表示在實驗動物中存在的仍然能夠結合其抗原的治療抗體。例如，這樣的抗體在其抗原結合位點上還未結合其抗原或任意其他分子。術語「結合抗原的治療抗體」表示在實驗動物的循環中存在的與其抗原結合的治療抗體。可使用本發明報導的抗體和方法直接檢測如上定義的總治療抗體、活性治療抗體或結合抗原的治療抗體。另外，可以檢測無活性的治療抗體的其他形式，例如被抗藥物抗體或抗個體基因型抗體或特別是中和抗藥物抗體結合的治療抗體。另外，也可以間接評估任意「無活性的治療抗體」。這樣的無活性的治療抗體可為，例如與其抗原結合的治療抗體，或與交叉反應性抗原結合的治療抗體，或被針對治療抗體的自身或抗個體基因型抗體阻斷的治療抗體。如果總抗體量大於活性抗體和結合抗原的抗體的和，將存在包含未與其相應抗原結合的無活性抗體的另外一部分抗體。可在例如所謂的競爭免疫測定系統或在所謂的夾心型測定系統中檢測總治療抗體。這樣的測定可在一個不含洗滌步驟的實施方案(均質免疫測定)中進行，或在含有洗滌步驟的另ー個實施方案(異質免疫測定)中進行。在一個實施方案中，在夾心型免疫測定中檢測總治療抗體，其中結合治療抗體但不結合實驗動物抗體的抗體在這樣的夾心測定的兩側使用。在這樣的夾心的ー側使用的抗體與固相結合或能夠與固相結合(通常被稱為捕獲抗體)，而在這樣的夾心的另ー側的抗體以便於直接或間接檢測的方式被標記(所謂的檢測抗體)。在這樣的夾心測定程序中結合的檢測抗體的量與所研究的樣品中的治療抗體的量直接相關。可通過方便的現有技術程序實現樣品中的活性治療抗體的檢測。然而，總治療抗體或與其抗原結合的治療抗體的部分的檢測相當複雜，並且需要相當不同的測定設置，特別是需要定製的試劑用於每個不同的測定。使用本發明報導的結合治療抗體但不結合實驗動物抗體的抗體，可以在彼此類似的檢測系統中評估活性治療抗體、總治療抗體或結合抗原的治療抗體的部分。當在這些治療抗體的不同部分之間進行定量比較時，此類總治療抗體、活性治療抗體或結合抗原的治療抗體的比較測定應當具有優勢。在一個實施方案中，設置夾心型測定形式用於檢測活性治療抗體。在另ー個實施方案中，結合治療抗體但不結合實驗動物抗體的抗體被用作捕獲抗體，且這樣的夾心測定的檢測側使用標記形式的抗原，或在結合抗原後使用不結合或不競爭結合治療抗體識別的表位的第二抗體，其中所述第二抗體是可特異性檢測的和/或以便於直接或間接檢測的方式被標記。在一個實施方案中以夾心型測定的形式檢測結合抗原的治療抗體，使用結合治療抗體但不結合實驗動物抗體的抗體作為捕獲試劑。在一個實施方案中在檢測中使用在不與治療抗體的表位競爭的表位上結合抗原的第二抗體。在一個實施方案中以便於直接或間接檢測的方式標記第二抗體。為了直接檢測，標記組可選自任意已知的可檢測的標記組，例如染料、發光標記組如化學發光組，例如吖啶酯或ニ氧雜環丁烷(dioxetane)，或螢光染料，例如螢光素、香豆 素、羅丹明、嗪、試滷靈(resorufin)、青色素及其衍生物。標記組的另外實例是發光金屬複合物，例如釕或銪複合物，酶，例如用於ELISA或用於CEDIA(克隆酶供體免疫測定)，和放射性同位素。在信號發射組的一個實施方案中也使用可通過電子化學發光檢測的金屬螯合物作為可檢測的標記物，特別優選釕螯合物。在一個實施方案中，標記組是釕(聯吡啶)32+螯合物。間接檢測系統包含，例如檢測試劑，例如用結合對的第一配偶體標記的檢測抗體。合適的結合對的實例是半抗原或抗原/抗體，生物素或生物素類似物例如氨基生物素、亞氨基生物素(iminobiotin)或脫硫生物素/杭生物素蛋白或鏈黴抗生物素，糖/凝集素，核酸或核酸類似物/互補核酸，和受體/配體，例如類固醇激素受體/類固醇激素。在ー個實施方案中，第一結合對成員選自半抗原、抗原和激素。在一個實施方案中，半抗原選自地高辛和生物素及其類似物。這樣的結合對的第二配偶體，例如抗體、鏈黴抗生物素等通常被標記以允許直接檢測，例如通過如上所述的標記物標記。在所有上述免疫檢測方法中，選擇允許使用的試劑結合的試劑條件，例如用於抗體與其相應抗原的結合。熟練技術人員使用術語複合物表示這樣的結合的結果。通過現有技術程序將在本發明報導的測定方法中形成的複合物與治療抗體的相應濃度相關聯。可通過例如使用本發明報導的方法在相應的複合物的稀釋系列中製備和測定複合物，並將得到的結果與各個複合物成分的濃度相關聯進行這樣的關聯。取決於使用的檢測試劑，此關聯步驟將得到總治療抗體、活性治療抗體或結合抗原的治療抗體的濃度。熟練技術人員將理解，本發明報導的方法將不僅僅顯示總治療抗體、結合抗原的治療抗體、活性治療抗體或甚至無活性治療抗體的濃度。由於使用一種相同試劑，即結合治療抗體但不結合實驗動物抗體的抗體，在不同測定中得到的值可容易地彼此比較並甚至評估其比率。在另ー個實施方案中，本發明涉及活性治療抗體與總治療抗體的比率。此比率將作為治療抗體效カ的指示。在實驗過程中發現，在所有類型的人和黑猩猩G型抗體上存在的ー個或多個表位在任何實驗動物的抗體上都不存在。此表位的特徵在於，其結合由保藏的細胞系DSMACC3006, DSM ACC3007, DSM ACC3008產生的抗體。因此，本發明報導的ー個方面是由細胞系 DSM ACC3006, DSM ACC3007 或 DSM ACC3008 產生的抗體。
由於3種保藏的細胞系識別的表位在抗體的Fab區中是唯一的，本發明報導的另ー個方面是與從保藏的細胞系DSM ACC3006，DSM ACC3007，DSM ACC3008得到的抗體結合的表位。在本發明報導的ー個方面中，結合治療抗體但不結合實驗動物抗體的抗體的特徵在於，所述抗體是與由細胞系DSM ACC3006, DSM ACC3007, DSM ACC3008產生的抗體之ー結合相同表位的抗體。例如，可使用如下方法，其中在競爭檢測系統的幫助下測定結合相同靶抗原的2種抗體的表位重疊。為此，例如在酶免疫測定的幫助下，檢測研究中的抗體與已知抗體競爭結合固定的靶抗原的程度，例如使用由本發明報導的細胞系之一產生的抗體。為此，適當固定的靶抗原與標記形式的已知抗體和過量的所檢測的抗體孵育。通過檢測結合的標記可容易地確定所研究的抗體可在多大程度上置換結合的已知抗體。如果在相同的濃度下存在超過20%的置換，在另ー個實施方案中超過30%的置換，或在更高的濃度下，在一個實施方案中在研究中的抗體相對已知抗體過量IO3-IO5-倍的情況下，存在超過70%的置換，在另一個實施方案中超過80%的置換,則存在表位重疊且兩種抗體結合相同的表位或相同表位的重疊部分。可在使用各個抗體的生物素化和地高辛化變體和來自不同物種的血清的夾心ELISA中顯示從保藏的細胞系DSM ACC3006，DSM ACC3007 JPDSM ACC3008得到的抗體的特異性。在測定中(見圖I)，從相同的細胞系得到結合同一表位的捕獲和檢測抗體。為了作為通用測定用於檢測和定量實驗動物血清中的人IgG，這樣的測定需要抗人IgG抗體，其結合位點獨立於任何次級抗體修飾，例如糖基化或脫醯胺。否則，必須對每種待檢測和定量的治療抗體優化測定。此外，本發明報導的每種抗人IgG抗體也不同於分析的治療抗體並可被用作參考標準和陽性對照。用此測定得到的特異性結果顯示在圖2中。可以看到，本發明報導的抗體對人和黒猩猩G型免疫球蛋白的免疫球蛋白高度特異，並顯示了比抗體M-R10Z8E9更好的特異性，且不結合實驗動物的G型免疫球蛋白。實驗動物的所有值都遠低於用不存在過氧化物酶的ABTS得到的空白值。也可在使用BIAcore技術的表面等離子共振實驗中顯示本發明報導的抗體的特異性。在圖3a)至c)中顯示了抗體M-1. 7. 10 (從DSM ACC3008得到)、M-1. 3. 2 (從DSMACC3006得到)和M-1. 5. 8 (JA DSM ACC3007得到)的BIAcore圖表，從中可以看出抗體對人和黒猩猩G型免疫球蛋白是特異的。通過使用點印跡實驗顯示，本發明報導的抗體結合的表位是構象表位，因為在變性的人免疫球蛋白上結合消失(圖4)。本發明報導的另ー個方面是用於定量從實驗動物獲得的樣品中的人抗體或其衍生物例如Fab片段的測定，所述測定包括本發明報導的生物素化抗體作為捕獲抗體和本發明報導的地高辛化抗體作為示蹤抗體。在圖5中，顯示了使用本發明報導的代表性抗體的此測定的圖解測定設置和校準曲線(捕獲抗體生物素化M-1. 7. 10，分析物人抗IL13Ra I抗體的Fab片段，示蹤抗體地高辛化M-1. 3. 2)。此測定需要在2個不同的表位上結合人IgG的Fab片段的捕獲和示蹤抗體。本發明報導的抗體至少部分結合人或黒猩猩 的G型免疫球蛋白抗體的輕鏈恆定區，並因此適用於此測定。本發明報導的另ー個方面是ー種測定，其包括特異性結合人IgG的不同結構域上的表位的捕獲和示蹤抗體。在此測定中，只有完整的治療抗體將導致陽性測定結果和可檢測的信號。在一個實施方案中，捕獲抗體和示蹤抗體一方面獨立地選自本發明報導的抗體，另ー方面獨立地選自抗體M-R10Z8E9。在根據用於證明在實驗動物中的人IgG的結構完整性的此方面的代表性測定中，使用生物素化M-R10Z8E9作為捕獲抗體，抗IL13Ra I抗體作為分析物，地高辛化M-1. 3. 2作為示蹤抗體(在圖6中顯示了此測定的圖解測定設置和校準曲線)。本發明報導的另ー個方面是ー種測定，其中使用抗人IgG抗體作為參考標準和/或陽性對照，以模擬抗藥物抗體(ADA)。這在找出最佳測定條件和檢測測定的穩健性，即用不同的標準試劑/陽性對照檢查測定性能的測定開發中可能有用。考慮到ADA將是多克隆的並可能針對Fab片段和Fe部分二者的事實，此設置特別有利。在本發明報導的另ー個方面，在本發明報導的方法中使用從細胞系DSM ACC3006,DSM ACC3007和DSM ACC3008得到的抗體之一作為結合治療抗體但不結合實驗動物抗體的抗體。本發明報導的另ー個方面涉及結合治療抗體但不結合實驗動物抗體的抗體在測定從實驗動物獲得的樣品中的總治療抗體、活性治療抗體或結合抗原的治療抗體的濃度中的用途。在一個實施方案中，在這樣的方法中使用的抗體結合選自與從細胞系DSMACC3006, DSM ACC3007或DSM ACC3008得到的抗體之一所識別的相同表位或重疊的表位。本發明報導的另ー個方面涉及2種都結合治療抗體但不結合實驗動物抗體的抗體在測定從實驗動物獲得的樣品中的總治療抗體、活性治療抗體或結合抗原的治療抗體的濃度中的用途，其中ー種抗體是捕獲抗體，另ー種抗體是示蹤抗體。在一個實施方案中，治療抗體是Fab片段。可選地，本發明報導的抗體可在包含單個免疫球蛋白類型的參考免疫球蛋白作為一部分的綴合物中使用。參考免疫球蛋白提供免疫球蛋白類型特異性恆定區，其可被抗免疫球蛋白類型抗體，例如抗人免疫球蛋白G抗體特異性結合。因此，參考免疫球蛋白提供了例如具有免疫球蛋白類型特異性標籤的綴合物，其可被標籤特異性抗體特異性識別。例如，如果標籤是免疫球蛋白G恆定區，標籤特異性抗體則是抗免疫球蛋白G抗體。這樣的綴合物可在免疫測定中用作標準物或在免疫測定中用作陽性對照。在本發明報導的方法中，也可使用不同的捕獲分子，例如完整抗體、F(ab』)2K段、Fab片段或甚至單鏈抗體。本發明報導的分別表達抗體M-1. 3. 2，M-1. 5. 8和M_l. 7. 10的優選的雜交瘤細胞系 MAK〈H-IgG>M-l. 3. 2，MAKM-l. 5. 8，MAKM-l. 7. 10 在用於專利程序目的的國際認可的微生物保藏的布達佩斯條約下保藏在德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ), Germany)
權利要求
1.細胞系DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008。
2.從根據權利要求I的細胞系之一得到的抗體。
3.根據權利要求2的抗體在免疫測定中的用途。
4.試劑盒，其包含 a)從細胞系DSM ACC2708，或 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008 得到的抗體作為捕獲試劑， b)從細胞系DSM ACC2708，或 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008 得到的抗體作為檢測試劑。
5.檢測從實驗動物得到的樣品中的治療抗體的方法，其包括以下步驟 a)提供待分析的樣品， b)將所述樣品與和根據權利要求2的抗體結合相同表位的抗體進行孵育， c)任選地將所述樣品與適於選擇性檢測總治療抗體、活性治療抗體或抗原結合的治療抗體的試劑孵育，和 d)將在(b)或(c)中形成的複合物與所述治療抗體的濃度相關聯。
6.使用抗原橋連免疫測定對從實驗動物得到的樣品中的治療抗體進行免疫學測定的方法，所述抗原橋連免疫測定包含捕獲抗體和示蹤抗體，特徵在於所述捕獲抗體和所述示蹤抗體都獨立地選自和根據權利要求2的抗體結合相同表位的抗體。
7.根據權利要求6的方法，其特徵在於所述免疫測定是夾心免疫測定。
8.根據權利要求6或7中任ー項的方法，其特徵在於所述捕獲抗體與生物素綴合，並通過固定的抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素進行固定。
9.根據權利要求6至8中任ー項的方法，其特徵在於所述示蹤抗體與地高辛綴合，並通過針對地高辛的抗體進行與可檢測的標記物的連接。
10.根據權利要求5至9中任ー項的方法，其特徵在於所述治療抗體是Fab。
11.根據權利要求5至10中任ー項的方法，其特徵在於所述實驗動物選自絨猴和絹毛猴、舊大陸猴、侏儒狐猴和鼠狐猴(dwarf and mouse lemur)、長臂猿和小猿(lesser ape)、美狐猴家族的成員，以及其雜種。
12.根據權利要求5至11中任ー項的方法，其特徵在於所述治療抗體是人或人源化抗體。
13.結合治療抗體但不結合實驗動物的免疫球蛋白的抗體在測定從實驗動物獲得的樣品中的總治療抗體、活性治療抗體或抗原結合的治療抗體的濃度中的用途，其中所述抗體和根據權利要求2的抗體結合相同的表位。
14.抗體組合物，其特徵在於包含由細胞系DSMACC3006，細胞系DSM ACC3007，細胞系DSM ACC3008產生的抗體的混合物。
15.根據權利要求14的抗體組合物在根據權利要求5至12中任ー項的方法中的用途。
16.結合人或黒猩猩IgG但不結合犬和絨猴IgG的抗體。
17.根據權利要求16的抗體，其特徵在於所述抗體不結合犬、恆河猴、絨猴、狒狒和食蟹猴IgG。
18.根據權利要求16或17中任ー項的抗體，其特徵在於結合人或黒猩猩IgG的Kd值是10_9mol/l或更低，且結合犬、恆河猴、絨猴、狒狒和食蟹猴IgG的Kd值是10_6mol/l或更聞。
19.根據權利要求16至18中任ー項的抗體，其特徵在於所述抗體是單克隆抗體。
20.特異性結合包含K輕鏈恆定結構域的IgGl的抗體。
21.根據權利要求20的抗體，其特徵在於所述抗體還結合IgG2。
22.根據權利要求20至21中任ー項的抗體，其特徵在於所述抗體還結合IgG4。
23.根據權利要求20至22中任ー項的抗體，其特徵在於所述抗體不結合IgG3。
24.根據權利要求20至23中任ー項的抗體，其特徵在於所述抗體不結合包含\輕鏈恆定結構域的IgGl。
25.根據權利要求20至24中任ー項的抗體，其特徵在於所述抗體是單克隆抗體。
26.根據權利要求16至25中任ー項的抗體在根據權利要求5至12中任ー項的方法中的用途。
全文摘要
本發明報導了細胞系DSM ACC3006，DSM ACC3007和DSM ACC3008，以及從所述細胞系得到的抗體，和從所述細胞系得到的抗體在免疫測定中的用途。還報導了結合人或黑猩猩IgG但不結合犬和絨猴IgG的抗體，和特異性結合包含κ輕鏈恆定結構域的IgG1的抗體。
文檔編號C07K16/42GK102656460SQ201080047203
公開日2012年9月5日 申請日期2010年10月18日 優先權日2009年10月19日
發明者F·科瓦萊夫斯基, K-G·施圖本拉赫, R·福格爾, S·克洛斯特曼, U·埃西格, U·韋塞爾斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司