一種HBV病毒rtA181V突變的螢光擴增檢測試劑盒的製作方法

2023-10-29 11:01:42 1

專利名稱：一種HBV病毒rtA181V突變的螢光擴增檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種快速而且方便的HBV病毒rtA181V突變的雙色螢光PCR擴增檢測 試劑盒。
背景技術：
B型肝炎病毒(HBV)流行世界各地，估計全球有20億人感染，其中慢性感染者3. 5 億，我國約佔半數，全球每年約有120萬人死於HBV感染。此種感染最終可發展為肝硬化、肝 癌，是當前WH0公布的人類疾病死亡原因中居第9位的疾病。因此針對HBV的抗病毒治療 受到廣泛重視。隨著對HBV聚合酶的結構和功能的深入認識，一些有效抑制HBV DNA複製 的核苷類藥物(如拉米夫定LAM、阿德福韋ADV)逐步成為抗HBV治療的新選擇。由於HBV 聚合酶如同其他逆轉錄病毒的逆轉錄酶一樣具有較高的錯配傾向且缺乏校對能力，因此隨 著感染的持續病毒準種逐年增多，在核苷類藥物的選擇壓力下，耐藥變異株將逐漸增多，最 終替代野生株成為優勢株，從而導致臨床耐藥現象的出現。 拉米夫定是L-核苷類似物，曾經是治療B型肝炎的最有效的藥物，已在全球廣泛 使用，在中國已成為銷量最大的處方藥。但拉米夫定的藥發生率非常高，在治療l年時，耐 藥發生率約為14% 32%，治療時間延長耐藥發生率升高，治療5年時耐藥發生率達到 60% 70%。而阿德福韋耐藥變異位點集中於P基因D區rtN236T和(或)B區rtA181V， 與拉米夫定無交叉耐藥現象。阿德福韋耐藥發生率相對拉米夫定耐藥要低得多，阿德福韋 治療HBeAg陰性慢性B肝的III期臨床試驗結果顯示，治療1、2、3、4、5年時累積的基因型 耐藥發生率約為0、 3 % 、 11 % 、 18 %和29 % 。因此，阿德福韋已越來越多的被應用於HBV的 抗病毒治療中，通常與其他藥物進行聯合用藥。 目前，國內外尚無快速、靈敏的檢測阿德福韋耐藥突變的技術和產品，通常使用基 因測序的方法進行突變檢測，但一方面，測序反應靈敏度低導致假陰性率較高。另一方面， 由於HBV耐藥株與敏感株常共存於患者血清中，對於HBV耐藥突變基因的檢測，該方法有致 命的缺陷。椐了解，當耐藥株低於50%時，隨耐藥毒株比例的下降，基因測序的假陰性率迅 猛增高，通常不能對低於20%的突變基因進行檢測。 國內外，均有人使用ntPCR-RFLP的技術對rtA181V位點突變進行檢測，但該技術 操作複雜、耗時長且價格昂貴又容易造成PCR產物汙染，無法進行推廣和臨床應用。
T叫Man PCR技術作為一種快速診斷技術，具有特異性高、靈敏度高、操作簡便且價 格較便宜等優點，已在科研和臨床上得到廣泛的應用。使用特異性探針雜交的方法結合常 規T叫Man技術進行rtl81基因突變檢測設計，由於rtl81位點除發生A — V (即GCT — GTT) 變異外，還發現有A — T ( S卩GCT — ACT)變異，很難避免假陽性，不利於設計引物或探針，並 且與測序技術一樣無法對病毒的共生關係進行準確判斷。 本發明對傳統TaqMan PCR技術進行了巧妙改進，不僅可對rtl81V變異的病毒DNA 進行定量分析，同時，在同一個PCR管內完成了 HBV DNA的定量檢測。

發明內容
本發明的目的是提供一種快速、簡便的HBV病毒rtA181V突變的螢光定量PCR擴 增檢測技術。 為達到上述目的，本發明採用的技術方案是使用一對特異性引物和一對特異性
探針，擴增目標片段長度為94bp，引物序列為 引物1 :5—-GGCTTTCGCAAGATTCCTA-3— (Seq No. 1) 引物2 :5— -GGAAAGCCCTACGAACCA-3— (Seq No. 2) 或者上述弓I物序列的互補序列，或者上述序列同源性大於75 %的序列。 設計的兩條探針方向相反，除突變檢測位點和3'端外(突變檢測位點序列可互
補，也可不互補，根據檢測要求決定)其餘區域互補；探針1和探針2的Tm值相近，同時也
與兩條引物的Tm值相近(相互間的差異均小於3tO，兩條探針的3'端除互補序列外均
延伸2-4個鹼基；探針1在rtl81密碼子位點對應位置使用了 "GTT"，由於已經證實G與T
在PCR反應中，能形成穩定的2價氫離子鍵(A = G)，因而GTT與野生株(rtl81A)和變異
株(rtl81V)相應互補序列均能進行雜交配對，產生螢光擴增信號，可用於檢測總的HBV病
毒DNA，探針2能與變異株(rtl81V)相應序列特異性雜交配對，產生螢光擴增信號，用於檢
測rtA181V變異(即GCT — GTT)。探針序列為 探針1 :5—-TTTCTCCTGGTTCAGTTTACTAGT-3— (Seq No. 3) 探針2 :5—-TAAACTGAACCAGGAGAAACG-3— (Seq No. 4) 或者上述弓I物序列的互補序列，或者上述序列同源性大於75 %的序列。 上述的HBV病毒rtA181V突變的螢光定量PCR擴增檢測試劑盒，探針的螢光發光
基團為可標記為麗、TET、 J0E、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Fluorescein、 Rhodamine、 RhodamineRed、
Rhodamine Green、 Rhodamine 6G、 Oregon Green 488、 Oregon Green 500、 Oregon Green
514、 Texas Red、 TAMRA、 Inosine、 HEX、 FITC、 Acridine orange、或ROX中的任意兩禾中組合；
螢光淬滅基團為DABCYL、 DABSYL、 TAMRA、 BHQ-1、 BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上
的組合。 上述的HBV病毒rtA181V突變的螢光定量PCR擴增檢測試劑盒，採用多色螢光PCR 定量檢測技術，在一個反應管內同時對總HBV病毒DNA和發生rtA181V突變的HBV病毒DNA 進行定量分析。 上述的HBV病毒rtA181V突變的螢光定量PCR擴增檢測試劑盒，使用人工設計的 寡核苷酸片段進行適當稀釋作為HBV總DNA和rtA181V突變的DNA病毒定量標準品，寡核 苷酸的序列如下
突變型模板seq-M:
TGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCC(94bp)(Seq No. 5) 上述的HBV病毒rtA181V突變的螢光定量PCR擴增檢測試劑盒，使用的反應組分 包括10mM Tris-HCl(Ph 8.3)、50mM KCl、300iiM d (AGC) TP、300 ii M dUTP、5薩gC12、200nM 引物1、200nM引物2、200nM探針1和200nM探針2、1U Taq酶、0. 05UUNG酶，另外，試劑盒還 包括人工合成突變型模板seq-M的稀釋產物。按如下程序進行實時螢光PCR檢測反應管 先在5Q。C反應2分鐘，然後95。C保溫5分鐘，再按94°C 20秒一60°C 35秒循環40次(60°C退火條件下同時採集相應探針標記通道的螢光)。 本發明與現有HBV病毒DNA rtA181V突變檢測方法及傳統的T叫Man技術相比，具 有以下有益的技術效果 (1)與傳統的T叫Man技術相比縮短探針的長度，使Tm值下降至與引物相近，以 增強探針對突變位點的特異性，同時保證了靈敏性。傳統的T叫Man技術要求探針的Tm值 相對引物高6-l(TC，是為了保證探針比引物優先與模板退火雜交，以防止引物快速延伸至 探針結合部位而阻止探針的結合，從而降低靈敏度，但這種設計使得探針對模板的選擇特 異性較低，根本不能鑑別單個鹼基的突變。本發明通過探針濃度的調節保證了較高的靈敏 度，可實現對1000copies/ml的突變DNA進行檢測，另外，本發明設計的兩條探針為反向序 列，分別與模板的正反鏈結合，不存在競爭關係，不會降低靈敏度。由於探針的Tm值與引物 相近，通過優化退火溫度和提高反應條件的特異性，探針能與完全配對的模板進行雜交，通 過引物的延伸的酶切產生螢光擴增信號，而不能與發生變異的模板雜交，從而不產生螢光 擴增信號。 (2)與其他技術相比本發明在一個反應管內實行了全部的檢測，從HBV病毒核酸 提取到檢測完畢，僅需要2個小時，操作非常簡單，且產物不開蓋，不會發生PCR產物的汙 染。並且本發明通過設計人工模板製作標準曲線，可以對突變病毒的核酸進行定量分析， ntPCR-RFLP和測序技術均不能得到定量的結果。另外，本發明還可同時完成HBV病毒含量 的測定，而其他技術不能滿足要求，需要另外重新對HBV病毒進行定量分析。通過HBV病毒 總量和rtA181V突變病毒的定量檢測，還可以檢測出rtA181V突變病毒的含量。
本發明提供一種準確快速對HBV病毒rtA181V突變進行螢光定量檢測的技術。同 時本發明還可用於其他基因突變的檢測。
具體實施例方式
設計和製備引物、探針序列(針對HBV DNA P基因相關序列設計，GeneBank序列 號為AF182802，下同) 引物1 :5—-GGCTTTCGCAAGATTCCTA-3— (Seq No. 1) 引物2 :5—-GGAAAGCCCTACGAACCA-3— (Seq No. 2) 探針1 :5 — FAM-TTTCTCCTGGTTCAGTTTACTAGT-BHQ13 — (Seq No. 3)
探針2 :5—TET-TAAACTGAACCAGGAGAAACG-BHQ13— (Seq No. 4)
合成突變型模板seq-M:
TGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCC(94bp)(Seq No. 5) 上述引物和探針均在寶生物工程(大連)有限公司合成。 HBV病毒rtA181V突變的螢光擴增檢測試劑盒的組成為(20人份) 組成成份名稱 體積 提取液A 1ml 提取液B 1ml PCR反應緩衝液460 ii 1 PCR反應酶 40 ii 1
陽性標準品 20 ill 陽性對照品 50 ill 陰性對照品 50 ill 其中，PCR反應緩衝液(使用終濃度)包括10mM Tris-HCl (PH 8. 3) 、50mM KCl、 300 iiM d(AGC)TP、300iiM dUTP、5mM MgCl2、200nM引物1、200nM引物2、200nM探針1和 200nM探針2 ;PCR反應酶(終濃度)包括1U Taq酶、0. 05U UNG酶；陽性標準品含適當濃度 的合成突變型模板seq-M，陽性對照品為A181V突變陽性的臨床血清，陰性對照品為HBVDNA 陰性的血清。 試劑盒的操作步驟如下
(1)標準曲線標準點的製備 使用ddH20將陽性標準品梯度稀釋至10、100、1000倍，此時，總HBV DNA(即 rtl81V突變型DNA)論濃度依次為107copies/ml、 106copies/ml、 105copies/ml和 104copies/ml，作為HBV病毒總DNA和rtl81V突變型DNA的定量標準品。 [OO48] (2)病毒核酸提取 取待測血清樣本50iil，加入50iU核酸提取液A。振蕩混勻15s。 13， OOOrpm 離心10min，棄上清。加入充分混勻的核酸提取液B 50iil，振蕩混勻，10(TC水浴lOmin， 13， OOOrpm離心3min。取上清供PCR擴增用。
(3)螢光PCR反應液的配製 按每人份PCR反應緩衝液23ul 、PCR反應酶2ul的配方配製PCR反應液，並按25ul/ 管分裝到O. 2ml PCR管中，然後加入5ul待檢的核酸提取產物以及稀釋好的定量標準品，按 如下程序進行實時螢光PCR檢測反應管先在5(TC反應2分鐘，然後95t:保溫5分鐘，再按 94°C 20秒一60°C 35秒循環40次(6(TC退火條件下同時採集FAM和TET通道螢光)。
(4)質量監控與結果分析 根據儀器分析的結果，在如下情況視實驗有效標準品稀釋產物的Ct值均 0. 9);陽性對照品Ct值均< 35 ;陰性對照品Ct值均< 35 ;。
讀取FAM通道的定量值即為HBV DNA的定量值。
讀取TET通道的定量值即為rtl81V突變型DNA的定量值。 當定量值< 100copies/ml時，判斷為陰性；當100copies/ml《定量值 < 1000copies/ml時，判斷為檢測灰區，建議重新檢測。
試劑盒性能指標
最低檢測量 取中檢所HBV核酸定量檢測標準品，對其進行HBV DNA核酸定量，用HBV陰性血清 分別稀釋至lX104IU/ml、lX103IU/ml和1 X 102IU/ml，各稀釋產物均使用本發明試劑盒重 復檢測10次，統計FAM螢光的檢測Ct值，結果表明，試劑盒能穩定檢測出1 X 103IU/ml濃 度的HBVDNA (10/10); 將人工合成的突變型模板，用TE緩衝液稀釋至適當濃度，測定260波長下 的OD值，根據0D26。的值計算核酸序列的濃度，用TE緩衝液稀釋至IX 104COpieS/ml、 lX103copies/ml和1 X 102copies/ml，稀釋產物均使用本發明試劑盒重複檢測10次，統計 TET螢光的檢測Ct值，結果表明，試劑盒能穩定檢測出1 X 103COpieS/ml濃度的合成突變型模板seq-M (10/10);
特異性 使用本發明試劑盒對中檢所提供的HBV核酸定量特異性參考品進行檢測，結果全 部為陰性，特異性為100%。
精密性 使用本發明試劑盒對濃度為2. 4X 105IU/ml的HBV DNA陽性參考品重複10次檢 測，統計檢測Ct值為CV < 3% ; 使用本發明試劑盒對濃度為7. 2X 105COpieS/ml的合成突變型模板seq-M重複10 次檢測，統計檢測Ct值為CV < 3% ;
臨床標本的檢測 對25例長期服用阿德福韋藥物治療的B肝患者血清進行rtl81位點核酸測序分 析，並使用本試劑盒進行HBV DNA和突變DNA定量檢測，HBV DNA的定量值均> 5X 104IU/ ml，突變檢出率為32X (8/25)，與測序結果的符合率為96% (24/25)，不符合的1例標本， 基因測序結果為rtl81A，而本發明試劑盒HBV DNA定量值為4. 6X 106IU/ml， rtl81V突變 DNA定量值為3. 3X10、opies/ml，提示野生型HBV DNA為優勢株，而突變型DNA只佔總HBV DNA的小部分，測序技術不能分辨和檢測。 上述實驗結果表明，本發明試劑盒操作簡單，可在單管內同時完成HBV DNA定量檢 測和rtA181V突變DNA的定量檢測，具有靈敏度高，特異性強的特點。
SEQUENCE LISTING〈110〉上海復星醫藥(集團)股份有限公司
上海復星醫學科技發展有限公司
劍軍，何
懿，夏 〈120〉 一種HBV病毒rtA181V突變的螢光擴增檢測試劑盒
〈160>5 〈170>Patentln version 3. 3 〈210>1 〈211>19 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 1 ggctttcgca agattccta 19 〈210>2 〈211>18 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>2 ggaaagccct acgaacca 18
〈210>3




〈211>24
〈212>DNA 〈213〉人工序列
〈400>3
tttctcctgg ttcagtttac tagt 〈210>4 〈211>21 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>4 te朋ctg朋c cagg3gaaac g 21 〈210>5 〈211〉94 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈400>5 ggctttcgca卿ttcctet gggagtgggc ctcagtccgt ttctcctggt tcagtttect 60 agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct ttcc 9權利要求
一種HBV病毒rtA181V突變的螢光擴增檢測試劑盒，其特徵在於包含一對特異性引物和一對特異性探針，擴增目標片段長度為94bp，引物序列為引物15`-GGCTTTCGCAAGATTCCTA-3`(Seq No.1)引物25`-GGAAAGCCCTACGAACCA-3`(Seq No.2)或者上述引物序列的互補序列，或者上述序列同源性大於75％的序列。設計的兩條探針方向相反，除突變檢測位點和3』端外(突變檢測位點序列可互補，也可不互補，根據檢測要求決定)其餘區域互補；探針1和探針2的Tm值相近，同時也與兩條引物的Tm值相近(相互間的差異均小於3℃)，兩條探針的3』端除互補序列外均延伸2-4個鹼基；探針1在rt81密碼子位點對應位置使用了「GTT」，在螢光PCR檢測中，對野生株(rt81A)和變異株(rt81V)相應序列均能進行雜交配對，產生螢光擴增信號，可用於檢測總的HBV病毒DNA，探針2能與變異株(rt81V)相應序列特異性雜交配對，產生螢光擴增信號，用於檢測rtA181V變異(即GCT→GTT)。探針序列為探針15`-TTTCTCCTGGTTCAGTTTACTAGT-3`(Seq No.3)探針25`-TAAACTGAACCAGGAGAAACG-3`(Seq No.4)或者上述引物序列的互補序列，或者上述序列同源性大於75％的序列。
2. 根據權利要求1所述的HBV病毒rtA181V突變的螢光擴增檢測試劑盒，其特徵在於 標記探針的螢光發光基團可以為FAM、TET、J0E、Cy3、Cy5、Cy5. 5、Fluorescein、Rhodamine、 Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine 6G、 Oregon Green 488、 OregonGreen 500、 Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、 Inosine、HEX、FITC、Acridineorange、或ROX中的任 意兩種組合；螢光淬滅基團為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-l、BHQ-2或BHQ-3中的任意一種 或一種以上的組合。
3. 根據權利要求1所述的HBV病毒rtA181V突變的螢光擴增檢測試劑盒，其特徵在於 採用多色螢光PCR定量檢測技術，在一個反應管內同時對總HBV病毒DNA和發生rtA181V 突變的HBV病毒DNA進行定量分析。
4. 根據權力要求1所述的HBV病毒rtA181V突變的螢光擴增檢測試劑盒，其特徵在於 使用人工設計的寡核苷酸片段進行適當稀釋作為HBV總DNA和rtA181V突變的DNA病毒定 量標準品，寡核苷酸的序列如下突變型模板seq-M:CAGTGGTTCGTAGGGCTTTCC(94bp)(Seq No. 5)。
5. 根據權利要求1所述的HBV病毒rtA181V突變的螢光擴增檢測試劑盒，其特徵在 於，PCR反應體系包括10mMTris-HCl(PH8. 3)、50mM KCl、300iiM d (AGC) TP、300 ii M dUTP、 5mMMgCl2、200nM引物1、200nM引物2、200nM探針1和200nM探針2、1U Taq酶、0. 05U UNG 酶，另外，試劑盒還包括使用突變型模板seq-M製備的定量標準品。
6. 根據權利要求1所述的HBV病毒rtA181V突變的螢光擴增檢測試劑盒，其特徵在於， 按如下程序進行實時螢光PCR檢測反應管先在5(TC反應2分鐘，然後95t:保溫5分鐘， 再按94°C 20秒一60°C 35秒循環40次(6(TC退火條件下同時採集相應探針標記通道的熒 光)。
全文摘要
本發明涉及一種HBV病毒rtA181V突變的螢光擴增檢測試劑盒。本發明針對rtA181V變異(即181GCT→GTT突變)設計了一對引物和分別用兩種螢光染料標記的一對特異性探針，在單管內使用雙色螢光定量PCR技術實現了分別對總HBV病毒DNA和發生rtA181V變異的HBV病毒DNA進行定量檢測。本發明還人工設計了rtA181V變異型DNA模板用於製作HBV總DNA和突變型DNA的定量標準曲線。本發明技術能快速、簡便的對HBV DNA和rtA181V變異的HBV DNA同時進行定量檢測，具有較高的特異性和靈敏性。
文檔編號G01N21/64GK101760559SQ20081020164
公開日2010年6月30日 申請日期2008年10月23日 優先權日2008年10月23日
發明者何劍軍, 夏懿 申請人:上海復星醫藥(集團)股份有限公司;上海復星醫學科技發展有限公司