一種單增李斯特菌溶血素o的原核表達及純化方法

2023-10-29 16:34:37 4

專利名稱：：一種單增李斯特菌溶血素o的原核表達及純化方法
技術領域：
：本發明涉及一種單增李斯特菌溶血素O的原核表達及純化方法。
背景技術：
：農產品和食品安全是一全球性問題，食源性疾病是食品安全的主要問題，近年來，國內外食源性疾病事件頻頻發生，而單增李斯特菌在食源性細菌中毒中佔主要地位，李斯特菌屬是最重要的人類食源性病原菌，是90年代食品中四大病原菌之一，在美國被列為7種主要的食源性致病菌之一。單增李斯特氏菌廣泛存在於自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，在土壤、地表水、汙水、廢水、植物、青儲飼料、爛菜中均有該菌存在，所以動物很容易食入該菌，並通過口腔-糞便的途徑進行傳播。據報導，健康人糞便中單增李氏菌的攜帶率為0.6-16%，有70%的人可短期帶菌，4-8%的水產品、5-10%的奶及其產品、30%以上的肉製品及15%以上的家禽均被該菌汙染。人主要通過食入軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、巻心菜色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染，約佔85-90%的病例是由被汙染的食品引起的。該菌可通過眼及破損皮膚、黏膜進入體內而造成感染，孕婦感染後通過胎盤或產道感染胎兒或新生兒，棲居於陰道、子宮頸的該菌也引起感染，性接觸也是本病傳播的可能途徑，且有上升趨勢。單增李斯特菌是典型的胞內寄生菌，可在巨噬細胞和許多非吞噬細胞(如上皮細胞、內皮細胞和肝細胞)內增殖。其毒力因子包括李斯特菌溶血素(ListeriolysionO，LLO)，ActA蛋白，磷脂酶C，P60蛋白，PrfA蛋白，內化素，表面蛋白P104。其中LLO是最主要的毒力因子，由hly基因編碼的Hly蛋白，與破壞吞噬體，促進菌體進入胞液有關，是細菌得以在胞液內增殖的先決條件，它的缺失將會導致細菌毒力的全部喪失。不產生LLO的單增李斯特菌突變株雖可在非吞噬細胞的胞液中生存一段時間，但卻不能繁殖，並且因無法逃逸吞噬體而不能對其他細胞的感染。除此之外，LLO還參與了同單增李斯特菌致病性有關的其它反應，研究顯示一單增李斯特菌感染鼠脾臟和骨髓的樹突狀細胞，可導致細胞的凋亡；不產生LLO的單增李斯特菌突變體不能誘導細胞的凋亡，而提純的LLO則可引起這種程序性控可引起這種程序性控制的細胞死亡。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種製備單增李斯特溶血素0的原核表達及純化方法，選取致病性李斯特菌主要毒力因子--溶血素O為對象，利用原核表達系統表達溶血素O蛋白，以親合層析純化表達產物，獲得較高純度的表達蛋白溶血素O。為了達到上述目的，本發明採用以下技術方案來實現—種單增李斯特菌溶血素0的原核表達方法，包括以下步驟l)根據NCBI上登錄的單增李斯特菌的基因序列，以及所要連接的載體PMD18-T的多克隆位點設計引物，進行PCR擴增、電泳和回收，並對該PCR回收物進行DNA連接反應；2)大腸桿菌感受態細胞的製備和轉化；3)鹼法小量製備質粒DNA;4)表達質粒的重組構建、重組菌的誘導表達。所述引物序列如下正向引物Hly-F:5，.GCGTCGAC(SalI)CCAATTGCGCAACAAACTGA-3'反向引物Hly-R:5'-CCCTCGAG(XhoI)TTTTGCGGAACCACCGTAA-3'。所述大腸感受態細胞為E.coliDH5a禾PE.coilBL21(DE3)。進一步的，通過Ni-NTA親和層析進行表達蛋白純化。所述單增李斯特菌溶血素0蛋白的抗體在金標速測卡中的應用。本發明是通過製備溶血素0的抗體在膠體金免疫技術中的應用來達到檢測單增李斯特菌的目的。膠體金免疫技術，是90年代新興的一種免疫學方法，現在生物醫學各領域得到了日益廣泛的應用。它實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程，顯色程度與抗原含量成正比。通過製備單增李斯特菌溶血素O蛋白進而獲得抗體製作膠體金免疫層析試紙條，以便在食品檢測中快速，準確的檢測出單增李斯特菌。本發明所研製的膠體金免疫層析試紙條是將金標單增李斯特菌溶血素單克隆抗體噴塗在玻璃纖維膜上，由於毛細管作用，樣品將沿著硝酸纖維素膜移動，當有單增李斯特菌溶血素O存在時繼而被固定的抗體著色，在樣品觀察區(S區)可形成一條色帶。以此來檢測單增李斯特菌的存在，同時內置質控色帶(C區)是為了確認該實驗是否成立。膠體金免疫技術具有便捷、快速、靈敏、安全、低成本等特點，由於不需要酶促反應的底物，單份測定，除試劑外無需任何特殊的儀器設備，且試劑穩定，近年來發展迅速。該法檢測速度快，一般一兩分鐘可出結果，靈敏度高，可達50IU/L。圖1為單增李斯特菌溶血素O的原核表達及純化路線圖。圖2為My基因PCR擴增結果。圖3為My-T重組克隆質粒PCR鑑定結果，其中1陽性對照；2、3、4重組克隆質粒；5陰性對照；6空白對照。圖4為My-T重組克隆質粒酶切鑑定結果，其中lhly-T重組質粒；2、3My-T雙酶切後(sall/xho1)。圖5為蛋白質純化結果，其中1Maker(KD97.4，66.2，43，31，20，14.4);2宿主菌(E.coliBL21(DE3》；3PET-22b(+);4誘導前；5誘導後；6上清；7純化後。具體實施例方式以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案。本發明所用限制性內切酶均購自寶生物工程(大連)有限責任公司，引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成，DNA基因組提取試劑盒，DNA回收試劑盒與親和層析柱也購自該公司，其他所用化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。實施例1單增李斯特菌Hly基因編碼的溶血素O蛋白的原核表達及純化方法l.PCR擴增根據NCBI上登錄的單增李斯特菌的基因序列，並根據所要連接的載體PMD18-T的多克隆位點設計引物。在正向引物(Hly-F)加上SalI位點，在反向引物(Hly-R)加上XhoI位點。引物序列如下正向引物Hly-F:5'-GCGTCGAC(SalI)CCAATTGCGCAACAAACTGA-3'反向引物Hly-R:5'-CCCTCGAG(XhoI)TTTTGCGGAACCACCGTAA-3'PCR反應程序如下94°C4min2.PCR產物的電泳和回收用1X瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，電泳結束，將凝膠置於紫外分析儀內，切取含PCR產物的膠塊，用DNA凝膠回收試劑盒回收。3.DNA連接反應在無菌Eppendorf管中加入4iU回收PCR產物，1y1pMD18-T載體，5y1Solution1，總體積為10iU。將各組分混勻，16t:連接過夜。4.E.coliDH5a感受態細胞的製備挑取大腸桿菌DH5a單菌落到含有50mlLB培養基的三角瓶中，於37。C振蕩培養過夜；取10iU到含有50mlLB培養基的三角瓶中，37°C振蕩培養到OD600值為0.4-0.6;將培養好的的菌液轉移到50ml的離心管中，冰浴10min;在4。C，5000rpm條件下離心5min，去上清，收集細胞；用20ml冰預冷的0.1MCaC^輕輕懸浮沉澱，在冰上放置10min;在4"，5000rpm條件下離心10min，用2ml0.1MCaCl2懸浮沉澱，按每管200ii1分裝細胞懸浮液於無菌的Eppenforf管中，用液氮快速冷凍，儲存於-70°C。5.大腸桿菌的轉化在200iU大腸桿菌感受態細胞中加入10iUDNA連接產物，手指輕彈管壁，混72°ClOminPCR反應擴增體系如下ddH2037ii110XBuffer5ii1dNTP(10mM;)5ii1模板DNA(100ng/y1)liU引物(10pm/yl)(20pm/y1)各1P1Taq酶(5U/iU)1P1總體積勻混合物，置於冰上30min;42t:水浴熱激處理90sec，迅速放回冰上，冰浴2-3min;加入800iULB培養液，混勻，37t:振蕩培養lh;將混合液塗布在Amp固體LB培養基上，37t:過夜培養。6.鹼法小量製備質粒DNA從培養基平板上挑取含目的質粒的單菌落，接種於3ml含相應抗生素的LB液體培養基中，振蕩培養過夜(37t:，200rpm)。在1.5ml離心管中，倒入1.5ml菌液，離心(4。C，13000rpm，lmin);去上清，收集菌體，加入100y1預冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl(pH8.0)，1Ommol/LEDTA(pH8.0))，劇烈振蕩，懸浮菌體；加入200ii1新鮮的溶液II(0.2mol/LNaOH，1%SDS，現配現用)，蓋緊管蓋並迅速顛倒4-5次至溶液呈透明粘稠狀；加入150ii1溶液III(5mol/LKAc60mL，冰醋酸11.5mL，H2028.5mL)，顛倒數次至白色絮狀沉澱呈均勻分散狀，冰浴3-5min;離心(4。C，13000rpm，15min)，將上清轉移到新的離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻並離心(4°C，13000rpm，5min);將上清液轉入一新離心管中，加入2倍體積無水乙醇混勻，常溫放置10min後離心(4。C，13000rpm，2min);倒去上清，將離心管倒扣在紙巾上，室溫放置數分鐘，等管壁上的殘餘乙醇液滴揮發完全，用30iUTE(pH8.0，含20iig/mlDnase-freeRnaseA)溶解DNA沉澱，37°C保溫30min，DNA保存於-20°C備用。7.表達質粒的重組構建待測序結果正確後，用限制性內切酶酶切DNA，酶切反應參照限制性內切酶說明書(寶生物工程(大連)有限責任公司)中的具體操作進行。反應結束，通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物，回收操作與PCR產物回收相同。回收的Hly基因片段與雙酶切後(salI/xhoI)的表達載體pET-22b(+)連接，連接體系參照連接酶試劑盒說明書(寶生物工程(大連)有限責任公司DNALigationKitVer.2.0)中的具體操作進行，獲得重組表達質粒pET-22b(+)-My後轉化到E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，經過雙酶切和PCR鑑定正確後，進行序列分析鑑定，讀框正確後開始表達。8.重組菌的誘導表達將重組菌落接種於5mlLB培養基(含氨苄青黴素100Ug/ml)中，37。C搖床培養至對數生長前期(OD值約為0.6)，加入lmmol/LIPTG誘導3-4h。取適量菌液離心集菌後進行SDS-PAGE分析表達情況。取培養好的菌液1.5mL，以lOOOOrpm室溫離心3分鐘集菌，棄上清，200iU純水懸起沉澱，取20iU懸浮液加入20iU2XSDS凝膠加樣緩衝液，煮沸十分鐘，取20iU進行SDS-PAGE分析。電壓80V，20min;120V，80min，進行染色、脫色。對凝膠染色30分鐘後，脫色l小時後進行分析。9.表達蛋白的Ni-NTA親和層析純化將重組菌落接種於5mlLB培養基(含氨苄青黴素100Ug/ml)中，！3rC搖床培養過夜後按l:100比例接種於大三角瓶中至對數生長前期(OD值約為0.6)，加入lmmol/LIPTG誘導3-4hr。收集菌體後加入超聲Buffer,100ml培養基所的菌體加20ml超聲緩衝液。將菌懸起後，超聲破碎(超聲破碎30次，超聲10s，間隔10s)。4°C5000rpm離心15min，溶血素O蛋白位於上清中。具體純化過程如下①向1ml50%Ni-NTAHisBindSlurry中加入4mlBindBuffer輕輕混勻，通過重力作用自然沉降，移棄懸浮液。②將菌體超聲破碎後收集的上清與Ni-NTA200rpm4。C振搖2h，裝柱後收集穿透液，做SDS-PAGE分析。③用4X4mlWashBuffer洗雜，裝入洗雜液後先用橡皮帽堵住出口處靜置半小時後，移除橡皮帽，流速控制在30ml/h分別收集流出液，做SDS-PAGE分析。用4X0.5mlEluteBuffer洗脫，分別用4個eppendorf管收集洗脫液，流速控制在15ml/h，做SDS-PAGE分析，結果顯示目的蛋白在此條件下被洗脫下來。附說明1.蛋白純化用Buffer超聲Buffer(BindBuffer):20mM、Tris-HclpH7.9、0.5MNaCl、10%Glycerol。WashBuffer:20mM、Tris-HclpH7.9、0.5MNaCl、10%Glycerol、20mMImidazonle。EluteBuffer:20mM、Tris-HclpH7.9、0.5MNaCl、10%Glycerol、500mMImidazonle。2.親和層析柱的製備①輕輕顛倒混勻固化Ni2+樹脂取2ml裝入層析柱，樹脂自然沉降。②用3倍體積的無菌水衝洗樹脂(樹脂沉降後為一個柱體積)。③用3倍柱體積的BindBufferpH=7.9平衡樹脂，靜置。3.親和層析柱的徹底再生2倍柱體積的再生緩衝液(6M鹽酸胍或0.2M的乙酸)5倍柱體積的無菌蒸餾水3倍柱體積的SDS1倍柱體積的25%乙醇1倍柱體積的50%乙醇1倍柱體積的75%乙醇5倍柱體積的100%乙醇1倍柱體積的75%乙醇1倍柱體積的50%乙醇1倍柱體積的25%乙醇1倍柱體積的無菌蒸餾水1倍柱體積的無菌蒸餾水1倍柱體積的NISO4(0.1M)3倍柱體積的無菌蒸餾水20%的乙醇洗1倍柱體積的體積之後，加1倍柱體積的20%的乙醇fC保存。4.蛋白電泳用溶液①2X蛋白電泳加樣緩衝液(貯存液)4XTris-HCI(pH6.8)25ml，甘油20ml，SDS4g，溴酚藍(0.001%W/v)2-3ml去離子水定容至lOOml，應用時取95iU加入5iUI3-巰基乙醇。②5XTris-甘氨酸電泳緩衝液12.1gTris，94gGly，5gSDS，加蒸餾水定容至1L，應用時用蒸餾水稀釋5倍。③SDS-PAGE凝膠染色液(100ml)甲醇水(l:l)90ml，乙酸10ml;考馬斯亮藍R2500.25g。SDS-PAGE凝膠快速脫色液(100ml)甲醇30ml，乙酸10ml;蒸餾水60ml;用Whatmanl號濾紙過濾以除去顆粒狀物質，室溫保存。5.SDS聚丙烯醯胺凝膠配製表1兩塊15%聚丙烯醯胺凝膠(15mi;)tableseeoriginaldocumentpage8注意灌制聚丙烯酞胺凝膠時最後加入TEMED。6.聚丙烯酞胺凝膠灌制和電泳如上方法配製好的聚丙烯醯胺凝膠試劑放一邊待用，先將清洗好的電泳玻璃板弄乾(分為薄厚兩種)，薄的玻璃板要放在厚的玻璃板上有突出的那一面，一薄一厚重疊後中間會留有空隙，玻璃下面對齊後裝在綠色架子中慢慢加緊，薄玻璃的上緣比厚玻璃要低一些，將低一些的薄玻璃這一面朝向外面固定在配膠的大架子上。將配製好的分離膠加入TEMED後用吸管貼著玻璃板的壁，緩慢加到兩塊玻璃間的空隙中，液面在距玻璃上端邊緣2cm處，然後慢慢加入純水壓平液面。(操作中注意加入TEMED後的聚丙烯酞胺凝膠會很快聚合)。等候30min後，可以清楚的看到分離膠已經聚合，和純水之間有一條明顯的分界線，這時可以把水倒出，然後用濾紙邊緣把玻璃中間的水充分吸乾，不要用力太大以免破壞膠的平面。將配製好的積層膠加入TEMED後用吸管加入到聚合的分離膠上面，液面要加滿，然後將電泳梳子插到玻璃之間，不要出現氣泡。(操作中注意加入TEMED後的聚丙烯酞胺凝膠會很快聚合)30min後積層膠聚合。積層膠聚合後，小心拔出梳子，將凝膠固定於電泳裝置上，內外槽各加入Tris一甘氨酸緩衝液。將樣品加入等體積的2XSDS加樣緩衝液後，於IO(TC煮沸3min，取15iU上樣。在80V電壓下電泳，當溴酚蘭前沿進入分離膠後，提高電壓至120V，直至溴酚蘭到達分離膠底部，關閉電源。將分離膠取出放入適量考馬斯亮蘭染色液中1-1.5小時，室溫條件下搖床上染色。將凝膠浸入脫色液中，室溫條件下在搖床上脫色過夜，再於水中浸泡，取出後於UVPBioimagingsystem下拍照並保存結果。0115]附本發明所涉及的DNA核苷酸序列和蛋白質的胺基酸序列如下0116]SEQUENCELISTING0117]atgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaa600118]caaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggca1200119]ccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaa1800120]atcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacgga2400121]gatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgtt3000122]gtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgca3600123]atttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaat4200124]caaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggt■0125]atgactaatcaagacaataaaatcgttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaac5400126]gcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgta6000127]agtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaa6600128]tttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagt7200129]gaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgtt7800130]aatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaa8400131]gcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgt■0132]caagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgat9600133]gctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaat10200134]tcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgac10800135]ggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaaca11400136]ccaggagttcccattgcttatacaacaaatttcctaaaagacaatgaattagctgttatt12000137]aaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaac12600138]atcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattat13200139]gatcctgaaggtaacgaaattgttcaacataaaaactggagcgaaaacaataaaagcaag13800140]ctagctcatttcacatcgtccatctatttgccaggtaacgcaagaaatattaatgtttac14400141]gccaaagaatgcactggtttagcttgggaatggtggagaacggtaattgatgaccggaac15000142]ctaccacttgtaaaaaatagaaatatctccatctggggcactacgctttatccgaaatat15600143]agtaatagtgtagataatccaatcgaataa15900144]MetLysLyslieMetLeuValPhelieThrLeulieLeuValSerLeuProlie0145]1510150146]AlaGinGinThrGluAlaLysAspAlaSerAlaPheAsnLysGluAsnSerlie0147]202530350148]SerSerMETAlaProProAlaSerProProAlaSerProLysThrProlieGlu0149]404550jA工bivs人iJ3SJq工Jq工ni￡>qijA工ni￡>usyusysXqqiib八可vnsq[88山:%S06SS8S08S[mo:nl￡)usVdsV"1ti3i叫dusvJq工Jq工"工可V3II0JdPAjq工ni￡>[9810:S丄S(USS9S[s8u):gjyusv叫d巧工可V人IDs人ls人iti3i3iidsydsyusy|>8m:09s靴ossdsy叩3iiui￡>iB八wodsys人l可v々￡)jA工3iiiB八可vs人l3iy[28cm;sssossszs[陽:rasJ3Susvs人l叩3iiusvJq工n"，p;八dsy人K)p八s人i[08山:OZSSTSOTS[6"0:SOS00SS6Z062[mo:t\3is人it\3ijA工paui￡>gjy"工可vPAjA工可vojjojj[9(l0:弧082S丄Z[s"o:usv可VusvPA々￡)ti3i可v可{)ti3qiqosXqjq工ib八可vs人q々￡>山:0"S9Z092SSZ[s"0:叫d3iygjygjyJq工ojjni￡>usvPAusvPAusv"工jA工iq￡)[2丄m:oszs招o招sszs人i3iyJ3Sanpawowoui￡>工sws人lwoJ3S叩可v人k)叫dusv[OAm:400405410ThrAspGlyLyslieAsnlieAspHisSerGlyGlyTyrValAlaGinPheAsn415420425430lieSerTrpAspGluValAsnTyrAspProGluGlyAsnGlulieValGinHis435440445450LysAsnTrpSerGluAsnAsnLysSerLysLeuAlaHisPheThrSerSerlie455460465TyrLeuProGlyAsnAlaArgAsnlieAsnValTyrAlaLysGluCysThrGly470475■485LeuAlaTrpGluTrpTrpArgThrVallieAspAspArgAsnLeuProLeu490495500ValLysAsnArgAsnlieSerlieTrpGlyThrThrLeuTyrProLysTyr505510515520SerAsnSerValAspAsnProlieGlu*"525529權利要求一種單增李斯特菌溶血素O的原核表達方法，包括以下步驟1)根據NCBI上登錄的單增李斯特菌的基因序列，以及所要連接的載體PMD18-T的多克隆位點設計引物，進行PCR擴增、電泳和回收，並對該PCR回收物進行DNA連接反應；2)大腸桿菌感受態細胞的製備和轉化；3)鹼法小量製備質粒DNA；4)表達質粒的重組構建、重組菌的誘導表達。2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述引物序列如下正向引物Hly-F:5'-GCGTCGAC(SalI)CCAATTGCGCAACAAACTGA-3，反向弓|物Hly-R:5，-CCCTCGAG(XhoI)TTTTGCGGAACCACCGTAA-3'。3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述大腸桿菌感受態細胞為E.coliDH5a和E.coilBL21(DE3)。4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過Ni-NTA親和層析進行表達蛋白的進一步純化。5.根據權利要求1所述的單增李斯特菌溶血素O蛋白在金標速測卡中的應用。全文摘要本發明公開了一種單增李斯特菌溶血素O的原核表達及純化方法，包括以下步驟1)根據NCBI上登錄的單增李斯特菌的基因序列，以及所要連接的載體PMD18-T的多克隆位點設計引物，進行PCR擴增、電泳和回收，並對該PCR回收物進行DNA連接反應；2)大腸桿菌感受態細胞的製備和轉化；3)鹼法小量製備質粒DNA；4)表達質粒的重組構建、重組菌的誘導表達；5)表達蛋白Ni-NTA親和層析純化。本發明通過製備單增李斯特菌溶血素O蛋白進而獲得抗體製作膠體金免疫層析試紙條，以便在食品檢測中快速、準確的檢測出單增李斯特菌。文檔編號C12R1/19GK101691582SQ20091019741公開日2010年4月7日申請日期2009年10月20日優先權日2009年10月20日發明者吳瀟,唐雪明,孫曉飛,朱宏,王金斌,蔣玲曦,譚芙蓉,趙凱,陶世如申請人:上海市農業科學院