靶向人凋亡抑制蛋白家族成員存活蛋白mRNA的反義寡核苷酸，含有它們的藥物組合及其...的製作方法

2023-09-24 05:16:50 2

專利名稱：靶向人凋亡抑制蛋白家族成員存活蛋白mRNA的反義寡核苷酸，含有它們的藥物組合及其 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及靶向人凋亡抑制蛋白家族成員存活蛋白(Survivin)mRNA的反義脫氧寡核苷酸，含它們的藥物組合及其用於治療癌症的用途。
背景技術：
癌症由至少兩種癌基因經多階段變化而引起，傳統的基於細胞毒化學治療具有選擇性差、毒副作用強等缺點，目前人們希望尋找特異性強、尤其是幹擾與腫瘤行為密切相關的基因表達的藥物。反義藥物是以Watson-Crick鹼基配對原理與靶mRNA結合，幹擾其翻譯的脫氧寡核苷酸類藥物。它能特異性的抑制腫瘤相關基因，在癌症治療方面有廣闊的應用前景。
凋亡是基因控制的細胞死亡過程，凋亡減少與腫瘤的發生、發展及抗藥性密切相關。凋亡由多種因素嚴密控制，包括Fas/TNF受體，bcl-2家族成員，以及凋亡抑制蛋白IAP(Inhibitor of ApoptosisProtein)。現已發現了六種人類IAP成員(Deveraux QL，Reed JC.，IAP家族蛋白質-凋亡的抑制物，Genes Dev.1999；13(3)239-252)，其中大部分能夠直接抑制凋亡執行過程中的中心環節天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)。存活蛋白是近來發現的人IAP成員，它在最終分化的成人組織中不表達，而在一系列人類腫瘤中呈高表達。有實驗表明存活蛋白強烈抑制由caspase-3或-7過度表達誘發的凋亡(Tamm I，Wang Y，Sausville E，et al.IAP家族蛋白質存活蛋白抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性以及由Fas(CD95)、Bax、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶和抗癌症藥物誘導的凋亡，Cancer Res.1998；58(23)5315-20)。存活蛋白表達對於細胞存活或癌症中的化學藥物抗性很重要。Kato J.等的研究表明，存活蛋白的高表達能夠對抗抗癌藥引起的凋亡(Kato J，Kuwabara J，Mitani M，等人，在食管癌中存活蛋白的表達與預後和對化療的反應之相關性，Int.J.Cancer.2001；95(2)92-5)。存活蛋白在一些腫瘤細胞中的特異表達及其重要功能，使它成為一個腫瘤治療的新的靶點。因此，需要尋找靶向存活蛋白的反義核苷酸藥物是積極治療腫瘤的手段之一。
本發明者經廣泛深入研究，通過固相合成法(全自動DNA合成儀)合成了一系列硫代寡核苷酸並進行了篩選。現已發現一組針對癌症中存活蛋白mRNA高表達的腫瘤的生長有抑制作用，特別是如肺腺癌A549細胞株和胃癌BGC823細胞株中的高表達有良好的抑制作用的反義硫代寡核苷酸。
發明概述本發明第一方面涉及可以反向互補性結合到人凋亡抑制蛋白家族成員存活蛋白mRNA的反義脫氧寡核苷酸，其選自如下所示的SEQID NO1-10，或其功能等同物。
SEQ ID NO15』-GGTCCCGCGATTCAAATCTG-3』，簡稱TXM001；SEQ ID NO25』-ACCCATGCCGCCGCCGCCAC-3』，簡稱TXM002；SEQ ID NO35』-GGGCCAGTTCTTGAATGTAG-3』，簡稱TXM003；SEQ ID NO45』-CAGTGGATGAAGCCAGCCTC-3』，簡稱TXM004；SEQ ID NO55』-CTTTTTATGTTCCTCTATGG-3』，簡稱TXM005；SEQ ID NO65』-GTTTCAAAAATTCACCAAGG-3』，簡稱TXM006；SEQ ID NO75』-AGAGGCCTCAATCCATGGCA-3』，簡稱TXM009；SEQ ID NO85』-CTGTGACAGCCTCAACAACA-3』，簡稱TXM012；SEQ ID NO95』-AACAATTCAAACAAAATAAG-3』，簡稱TXM014；和SEQ ID NO105』-GTATCTGCCAGACGCTTCCT-3』，簡稱TXM016。
本發明再一方面涉及選自SEQ ID NO1-10的反義寡核苷酸序列用於製備用於治療癌症的藥物的用途。
本發明再一方面涉及的是藥物組合物，其中含有治療有效量的至少一種選自SEQ ID NO1-10的反義寡核苷酸序列，或其混合物，以及藥學可接受的載體，佐劑或賦型劑。
本發明再一方面涉及一種利用至少一種選自SEQ ID NO1-10的反義寡核苷酸序列用於治療癌症的方法。


圖1。顯示來自不同腫瘤細胞中存活蛋白mRNA表達的檢測結果。高表存活蛋白mRNA的腫瘤細胞包括KCC853腎癌細胞；BGC823胃腺癌細胞；A549肺腺癌細胞；SGC7901胃腺癌細胞；GLC-82肺癌細胞；HCT結腸癌細胞；MKN-45胃腺癌細胞；HEPG-2肝癌細胞。而在KB口腔癌細胞、HELF人胚肺成纖維細胞、小鼠黑色素瘤B1 6細胞中未檢測出表達的存活蛋白mRNA.
圖2。顯示本發明所述TXM004反義硫代脫氧寡核苷酸對肺腺癌A549細胞抑制的劑量效應關係。
圖3。顯示RT-PCR方法檢測TXM004反義硫代脫氧寡核苷酸對肺腺癌A549細胞中存活蛋白mRNA表達的抑制。
圖4。顯示RT-PCR方法檢測TXM004反義硫代脫氧寡核苷酸對肺腺癌A549細胞中存活蛋白mRNA表達抑制的劑量效應關係。顯示TXM004在100、20、400nM下，抑制存活蛋白mRNA的表達分別為51％、84％和94％。
圖5。顯示TXM004反義硫代脫氧寡核苷酸對肺腺癌A549細胞中存活蛋白水平的下調作用。
圖6。顯示TXM004反義硫代脫氧寡核苷酸誘導肺腺癌A549細胞的凋亡。
圖7。顯示TXM004反義硫代脫氧寡核苷酸與常規化療藥物的協同作用。
發明詳述根據已知的存活蛋白mRNA序列(SEQ ID NO21.NM 001168，人-杆狀病毒IAP重複，其含有5(存活蛋白)(BIRC5)，mRNA.1619個鹼基)，本發明人針對存活蛋白mRNA的下列區域靶點而設計反義硫代寡核苷酸，所述靶點包括1)存活蛋白mRNA的5』-非翻譯端，例如5』-CAGAUUUGAAUCGCGGGACC-3』(SEQ ID NO11)2)翻譯起始密碼子區域，例如5』-GUGGCGGCGGCGGCAUGGGU-3』(SEQ ID NO12)3)蛋白編碼區，例如5』-CUACAUUCAAGAACUGGCCC-3』(SEQ ID NO13)5』-GAGGCUGGCUUCAUCCACUG-3』(SEQ ID NO14)5』-CCAUAGAGGAACAUAAAAAG-3』(SEQ ID NO15)5』-CCUUGGUGAAUUUUUGAAAC-3』(SEQ ID NO16)4)終止密碼子區域，例如5』-UGCCAUGGAUUGAGGCCUCU-3』(SEQ ID NO17)5)3』-非翻譯端，例如5』-UGUUGUUGAGGCUGUCACAG-3』(SEQ ID NO18)5』-CUUAUUUUGUUUGAAUUGUU-3』(SEQ ID NO19)5』-AGGAAGCGUCUGGCAGAUAC-3』(SEQ ID NO20)經大量研究發現，針對上述靶序列之本發明所要求保護的反義脫氧寡核苷酸序列SEQ ID NO1-10，分別對涉及存活蛋白mRNA高表達的癌症具有良好的抑制作用。本發明中所述具有存活蛋白mRNA高表達的癌症包括但不限於肺癌、胃癌、腎癌、結腸癌、大腸癌、乳腺癌、膀胱癌、口腔癌、肝癌、腦腫瘤、鼻咽癌、頸部鱗癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、睪丸腫瘤、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、絨癌、白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、骨肉瘤，軟組織肉瘤、耳鼻喉科腫瘤、眼科腫瘤等。在本發明的一個實施方案中，本發明所述反義寡核苷酸特別是肺腺癌A549細胞株和胃癌BGC823細胞株有良好的抑制作用。
本領域技術人員知曉，所述反義寡核苷酸的設計並不僅僅局限於本發明中具體公開的上述靶序列，而可以針對包括上述靶序列的5』和3』端兩側之外1-10個鹼基範圍內，優選地1-5個鹼基，特別優選的1-3個鹼基的靶序列，設計相應的反義寡核苷酸，也能夠獲得具有與本發明所述具體反義寡核苷酸相似的抑制作用的反義寡核苷酸。另一方面，根據本發明所公開的內容，還可以僅針對上述靶序列的5』和3』端兩側之內1-7個鹼基範圍內，優選地1-5個鹼基，特別優選的1-3個鹼基的靶序列，設計相應的反義寡核苷酸，也能夠獲得具有與本發明所述具體反義寡核苷酸相似的抑制作用的反義寡核苷酸。換言之，所述對涉及存活蛋白mRNA高表達的癌症具有抑制作用的反義寡核苷酸所針對的靶序列，並不僅僅局限於本發明所公開的長度為20的靶序列，而是包括了所述靶序列之片段和/或其兩側一定數目的鹼基在內的序列，其長度可以在10-30個寡核苷酸，優選為13-27個，更優選為17-23個寡核苷酸之間變化。
本發明中，所述「反義寡核苷酸」是指能夠與靶序列互補性結合的、與靶序列的「正義(sense)」方向相反的「反義(antisense)」方向的寡核苷酸序列。因此，一旦將其導入表達靶序列的細胞中，其能夠與所述靶序列結合形成雙螺旋，進而抑制所述序列的翻譯表達蛋白的活性。編碼所述反義寡核苷酸的序列可以基於需要抑制其活性的靶序列的全長，或其片段，只要所述反義寡核苷酸能夠有效的與靶序列的部分結合，並抑制所述靶序列的活性。所述靶序列的部位可以是非編碼區，例如5』-非翻譯端和3』-非翻譯端，也可以是編碼區，包括編碼目標蛋白的全長序列。同時，本領域技術人員知曉，上述靶序列的部分或片段也可以作為反義寡核苷酸使用。
本領域技術人員知曉，所述反義寡核苷酸可以通過多種已知方法製備和使用(例如參見，反義RNA和DNA，D.A.Melton，編，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988))。例如，可以採用自動DNA合成儀，或重組DNA技術製備。
另一方面，本發明所述反義寡核苷酸可以通過在所述反義寡核苷酸的例如5』端、3』端和/或內部添加硫代磷酸酯基團、酯基和/或糖基和/或其它基團加以修飾。例如，在自動DNA合成儀合成所述反義寡核苷酸的過程中，可以例如通過將磷酸基團中氧原子用硫原子取代對全部或部分鹼基進行修飾，從而防止所述鹼基被細胞中的核酸酶降解。為此，可以採用例如二硫化四乙基秋蘭姆進行上述修飾。
在本發明的一個優選實施方案中，將所述SEQ ID NO1-10的反義寡核苷酸經過修飾，成為反義硫代寡核苷酸，或者其它反義寡核苷酸形式。所述的修飾包括但不限於將反義脫氧寡核苷酸經過硫原子對一個或兩個連接鹼基的磷酸基團上氧原子的取代加以修飾得到具有如下特徵的結構 或者將磷酸二酯鍵連接的鹼基側鏈上的基團用本領域知曉的方法採用其它合適的化學基團進行如下修飾 或者寡核苷酸鏈骨架通過本領域周知的方法被用其它類型的骨架代替，優選為肽鏈骨架。
本發明所述反義硫化寡核苷酸可以體內(in vivo)或離體(exvivo)施用。對於離體施用，本領域技術人員知曉，首先將所述反義寡核苷酸通過已知的基因遞送方式導入到分離自患者的細胞或者體外培養的腫瘤細胞系內，包括但不限於病毒介導的基因遞送，其中所述載體可為市售的腺病毒載體(Quantum Biotechnologies，Inc.Laval，Quebec，加拿大)；磷酸鈣介導的基因遞送；電穿孔，例如按照Genetronics，Inc.(San Diego，Calif.)所述的方法，以及使用SONOPORATION儀(ImaRx Pharmaceutical Corp.，Tucson，Ariz.)；顯微注射或脂質體介導，例如LIPOFECTIN，LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，Md.)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，德國)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，Wis.)，以及其它本領域已知的標準方法。然後，利用針對所述細胞類型的標準方法將所述經處理的細胞回輸到患者體內。
對於體內施用，可以將本發明所述的反義寡核苷酸與藥學可接受的載體一起製成相應的藥物組合物，以便於施用於患者。本發明所述「藥學可接受的」是指所述材料不是製藥學或生物學意義上不相容的，所述材料可以與所述反義寡核苷酸一起施用於受試者，而不引起不期望的生物學作用，或以不利的方式與所述藥物組合物中的其他成分相互作用。根據需要，含有本發明所述反義寡核苷酸的藥物組合物可以製成口服、非胃腸道施用(如靜脈施用)、肌肉內注射、腹膜內注射、透皮給藥、局部給藥等形式，優選為靜脈內和/或局部給藥。
本發明中所述組合物中含有的反義寡核苷酸的量取決於患者的個體狀況(年齡、體重、一般狀況)、疾病的嚴重程度以及所採用的具體反義寡核苷酸。本領域普通技術人員容易根據常規經驗確定合適的量。
具體的，所述「治療有效量」是指與對照相比，能夠有效減緩或抑制涉及存活蛋白mRNA(Survivin mRNA)高表達的癌症進程，優選的能夠最終殺死所述癌症細胞的量。所述結果，優選地能夠通過臨床或病理學的診斷或檢測加以確定。在本發明的一個實施方案中，所述單劑組合物中可以含有約0.01-約1.0mg/公斤體重，優選0.1-0.5mg/公斤體重的至少一種本發明所述的反義寡核苷酸。
本發明所述的藥物組合物可以通過例如注射給藥。因此，所述藥物組合物可製成適於注射給藥的常規形式，例如水溶液或懸浮液的形式，或是適於現用現配的固體形式，或乳液。此外，所述組合物還可以製成緩釋形式。
適於注射給藥的本發明所述藥物組合物中採用的藥學可接受的載體包括但不限於無熱原的生理鹽水。
適於口服施用反義核酸的藥物組合物中，合適的載體包括一種或多種的香味劑、潤滑劑、懸浮劑、保護劑等。合適的固體載體包括但不限於磷酸鈣、碳酸鈣、硬脂酸鎂、糖、澱粉、明膠、纖維素、環糊精等。合適的液體載體包括但不限於水、藥學可接受的油或其混合物。所述組合物中還可以添加其他佐劑，包括但不限於緩衝劑、防腐劑、香味劑、粘度或滲透壓調節劑、穩定劑或懸浮劑。
在本發明的優選實施方案中，所述藥物組合物中含有作用於肺腺癌A549細胞株和胃癌BGC823細胞株的SEQ ID NO4的反義硫代寡核苷酸，以及藥學可接受的載體。
在本發明另一優選的實施方案中，所述藥物組合物中含有至少一種選自SEQ ID NO1-10反義寡核苷酸，以及藥學可接受的載體。
本發明的藥物組合物中還任選的含有可作用於涉及存活蛋白mRNA高表達的癌症的其他一種或多種已知常規藥物。
下面的實施例是對本發明的進一步說明，但不意味著對本發明任何限制。
實施例一反義硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODN)的設計和合成本發明所述反義寡核苷酸的採用本領域中周知的固相合成法製備。具體的，本發明所述合成方法為寡核苷酸固相合成亞磷醯胺法，通過使用美國ABI公司生產的ABI390Z核酸自動合成儀，以其25umol合成程序合成，將待合成序列提供給核酸合成儀，及提供相應的原料製備。主要原料為四乙基秋蘭姆(TETD)、亞磷醯胺單體(phosphoramidite monomers)。製備時，將固相支持物連接保護的、通過固相合成的含本發明核苷酸序列的硫代寡核苷酸脫保護，從固相支持物上切離。用HPLC法進行純化。
實施例二本發明所述反義寡核苷酸對腫瘤細胞的生長抑制1.人腫瘤細胞系(A549等)的培養及反義寡核苷酸的處理接種細胞於含10％胎牛血清的RPMI1640培養基中(補充青、鏈黴素各100ku·L-1)，培養器皿置於37℃含有5％CO2的細胞培養箱中。培養細胞達到培養細胞達到50％-60％融合時，用無血清無抗生素培養基衝洗2遍。按Gibcol BRL公司脂質體轉染說明書的要求，將反義寡核苷酸導入到腫瘤細胞內。將脂質體/無血清無抗生素培養基＝1/5的比例配製成脂質體溶液，室溫靜置30-40分鐘，等體積混合用無血清培養基溶解的不同濃度的反義寡核苷酸，靜置10-15分鐘後，加入培養器皿中，迅速補充4倍的無血清培養基。置於37℃含5％CO2的培養箱中6小時後，換正常培養基，培養48-72小時後MTT法測定細胞活度。對照組只含等濃度的脂質體。
2.細胞中存活蛋白mRNA表達的檢測接種9種腫瘤細胞及一種正常細胞HELF細胞於培養瓶中，待長滿後，用Gibcol公司的TRIzol試劑提取細胞總RNA。提取的RNA用DEPC水重溶，以Beckman蛋白核酸分析儀讀取260nm與280nm光吸收值，以DEPC水為空白對照。進行RNA純度鑑定以及定量。適量RNA用Promega公司的Reverse Transcription System試劑盒，以oligo(dT)15為引物合成cDNA第一鏈。然後再用目標引物和內標引物進行特異性的PCR擴增。引物序列為目標引物(存活蛋白，擴增片段431bp)，上遊5』-GCATGG GTGCCCCGACGTTG-3』，下遊5』-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3』；內標引物(GAPDH，擴增片段306bp)，上遊5』-CGAAGT CAACGGATTTGGTCGTAT-3』，下遊5』-AGCCTTCTCGGTGGT GAAGAC-3』。擴增條件為94℃變性30秒，67℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共30個循環。產物加10×Loading Buffer，2％瓊脂糖凝膠電泳，結果在紫外燈下觀察拍照。結果見圖1。腫瘤細胞中基本都有存活蛋白mRNA的表達(8/9)，而HELF細胞中沒有。
3.靶向存活蛋白mRNA的反義硫代寡核苷酸對腫瘤細胞的抑制作用將對數生長期的A549細胞或其它的細胞接種於96孔培養板中，4000個細胞/孔。培養18-24小時，按上述方法，加入不同濃度的反義寡核苷酸，反應終體積均為200l。換正常培養基繼續培養48-72小時，棄上清。每孔加入200μl新鮮配製的含0.5mg/ml四氮唑鹽(MTT)的無血清培養基，37℃培養4小時後棄上清。以200μlDMSO溶解甲月替。輕度振蕩後，用酶標儀在檢測波長為570nm、參比波長為450nm下測定光吸收值。
本發明反義硫代寡核苷酸(TXM001～TXM016等)對肺腺癌A549細胞系、胃癌BGC細胞系有較強的抑制作用。而對正常的HELF細胞基本沒有明顯的抑制作用。
表1-3顯示本發明反義硫代寡核苷酸對A549肺腺癌細胞、胃癌BGC823細胞及HELF細胞體外增殖的抑制作用。(對照組為脂質體對照)
表1反義寡核苷酸序列對A549細胞生長的抑制作用

表2反義寡核苷酸序列對BGC823細胞生長的抑制作用

表3反義寡核苷酸序列對HELF細胞生長的作用

實施例三TXM004抑制癌症細胞生長的進一步研究1.TXM004反義寡核苷酸對肺腺癌A549細胞生長抑制的劑量效應關係按實施例二中方法，測TXM004反義寡核苷酸6個不同濃度(400nM、200nM、100nM、5nM、25nM、12.5nM)對A549細胞的抑制作用。結果見表4。其S形量效曲線如圖2。它的最大抑制率為83％，IC50為62.86nM。
表4不同濃度的TXM004對A549細胞生長的抑制作用

2.關於TXM004反義寡核苷酸的陰性對照合成TXM004反義寡核苷酸的錯配序列TXMno75』-GTCAGGATCTTCCCACGGAG-3』，用MTT法檢測對A549細胞的抑制。結果見表5。
表5 TXM004與錯配序列作用比較

3.靶位延長對TXM004反義寡核苷酸抑制A549細胞的影響合成TXM004反義寡核苷酸序列兩端各延長1nt(長22nt)和2nt(長24nt)的反義序列，分別為TXM022 5』-GCAGTGGATGAAGCCAGCCTCG-3』，TXM024 5』-GGCAGTGGATGAAGCCAGCCTCGG-3』。用MTT法檢測對抑制力的影響。結果見表6。靶位的延長並沒有影響對細胞的抑制作用，這說明TXM004的靶位點可以在一定範圍內加以變化，也是合適的。
表6 TXM004與延長鹼基序列的作用比較

實施例四反義硫代寡核苷酸特異性抑制A549細胞存活蛋白mRNA的表達
1.用RT-PCR方法檢測TXM004反義硫代寡核苷酸(200nM)對A549細胞中存活蛋白mRNA的抑制接種A549細胞於培養瓶中，培養18-24小時，細胞達50-60％融合時，按實施例二中的方法導入終濃度為200nM的TXM004反義硫代寡核苷酸，對照只含等量的脂質體。置於37℃含5％CO2的培養箱中培養6小時後取出，用Gibcol公司的TRIzol試劑提取細胞總RNA。提取的RNA用DEPC水重溶，以Beckman蛋白核酸分析儀讀取260nm與280nm光吸收值，以DEPC水為空白對照。進行RNA純度鑑定以及定量。取等量的對照及處理細胞總RNA，用Promega公司的Reverse Transcription System試劑盒，以oligo(dT)15為引物合成cDNA第一鏈。然後再用目標引物和內標引物進行特異性的PCR擴增。引物序列為目標引物(存活蛋白，擴增片段431bp)，上遊5』-GCATGG GTGCCCCGACGTTG-3』，下遊5』-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3』；內標引物(GAPDH，擴增片段306bp)，上遊5』-CGAAGT CAACGGATTTGGTCGTAT-3』，下遊5』-AGCCTTCTCGGTGGT GAAGAC-3』。擴增條件為94℃變性30秒，67℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共30個循環。產物加10×Loading Buffer，2％瓊脂糖凝膠電泳，結果在紫外燈下觀察拍照。結果見圖3。
2.用RT-PCR方法檢測TXM004反義硫代寡核苷酸抑制A549細胞存活蛋白mRNA表達的劑量依賴關係方法同1中所述。結果見圖4。隨著TXM004反義硫代寡核苷酸濃度增大(100nm、200nm及400nm)，A549細胞中存活蛋白mRNA的含量明顯減少。反義寡核苷酸對靶mRNA抑制的程度與藥物濃度成正比，在100nM、200nM、400nM時的抑制率分別為51％、84％、94％。
實施例五反義硫代寡核苷酸特異性抑制A549細胞存活蛋白1.用Western印跡方法檢測TXM004反義硫代寡核苷酸(200nM)對A549細胞中存活蛋白蛋白的抑制接種A549細胞於培養瓶中，培養18-24小時，細胞達50-60％融合時，按實施例二中的方法導入終濃度為200nM的TXM004反義硫代寡核苷酸，對照只含等量的脂質體。置於37℃含5％CO2的培養箱中培養6小時後，換完全培養基培養20小時。取出，用含蛋白酶抑制劑的三去汙劑細胞裂解液提取細胞總蛋白，用二金雞鈉酸蛋白定量試劑盒定量。取等量的對照及反義寡核苷酸處理過的細胞總蛋白，經不連續SDS聚丙烯醯胺凝膠(12％分離膠)電泳分離。然後經電轉移將蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉封閉後，膜與抗存活蛋白蛋白的非標記抗體反應，洗滌後再將膜與辣根過氧化物酶標記的二抗一同溫育。用ECL試劑盒顯色。結果見圖5，TXM004反義硫代寡核苷酸明顯下調存活蛋白蛋白水平。
實施例六TXM004反義寡核苷酸誘導A549細胞凋亡接種A549細胞於培養瓶中，培養18-24小時，細胞達50-60％融合時，按實施例二中方法導入終濃度為200nM的TXM004反義硫代寡核苷酸，對照只含等量的脂質體。置於37℃含5％CO2的培養箱中培養6小時後，換完全培養基培養24小時，收集細胞，固定，染色，用流式細胞儀檢測凋亡細胞。結果見圖6，對照細胞有1.12％凋亡，而處理後細胞有17.95％凋亡。
實施例七TXM004反義寡核苷酸與抗癌藥協同作用接種A549細胞於培養瓶中，培養18-24小時，細胞達50-60％融合時，按實施例二中方法導入終濃度為5nM的TXM004反義硫代寡核苷酸，對照只含等量的脂質體。轉染6小時後，再分別加入不同濃度的順鉑、5-氟尿嘧啶和三尖杉酯鹼繼續作用66-68小時，MTT法檢測。結果見圖7，其IC50值的改變見表7。反義寡核苷酸與抗癌藥的協同應用，使三種抗癌藥的S形量效曲線左移，增加了細胞對抗癌藥的敏感性。從而提示在臨床上將反義寡核苷酸與傳統抗癌藥協同應用，可以增強癌症治療的特異性，降低抗癌藥用量，減輕化療毒性。
表7 TXM004與常規化療藥的協同作用

序列表110中國人民解放軍軍事醫學科學院放射醫學研究所120靶向人凋亡抑制蛋白家族成員存活蛋白mRNA的反義寡核苷酸，含有其的藥物組合物及其用途130IDC03000816021170PatentIn version 3.1210121120212DNA213Homo sapiens4001ggtcccgcga ttcaaatctg 20210221120212DNA213Homo sapiens4002acccatgccg ccgccgccac 20210321120212DNA213Homo sapiens4003gggccagttc ttgaatgtag 20210421120212DNA213Homo sapiens
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權利要求
1.一種可反向互補性結合到人凋亡抑制蛋白家族成員存活蛋白mRNA的反義脫氧寡核苷酸，其選自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，或其功能等同物。
2.權利要求1所述的反義脫氧寡核苷酸，其選自經修飾的SEQID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
3.權利要求1所述的反義脫氧寡核苷酸，其中所述的反義脫氧寡核苷酸任選的經過硫原子對一個或兩個連接鹼基的磷酸基團上氧原子的取代，將磷酸二酯鍵連接的鹼基側鏈上的基團用其它化學基團進行修飾，或者寡核苷酸鏈骨架用其它類型的骨架代替。
4.權利要求1所述的反義脫氧寡核苷酸序列用於製備治療涉及存活蛋白mRNA高表達的癌症的藥物的用途。
5.權利要求4所述的用途，其中所述存活蛋白mRNA高表達的癌症選自肺癌、胃癌、腎癌、結腸癌、大腸癌、乳腺癌、膀胱癌、口腔癌、肝癌、腦腫瘤、鼻咽癌、頸部鱗癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、睪丸腫瘤、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、絨癌、白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、骨肉瘤，軟組織肉瘤、耳鼻喉科腫瘤、眼科腫瘤。
6.一種藥物組合物，其中含有治療有效量的至少一種選自權利要求1的反義脫氧寡核苷酸序列以及藥學可接受的載體，佐劑或賦型劑。
7. 權利要求6所述的藥物組合物，其中任選的還含有常規治療腫瘤的藥物。
8.一種利用權利要求1所述的反義脫氧寡核苷酸序列治療涉及存活蛋白mRNA高表達的癌症的方法。
9.權利要求8所述的方法，其中所述存活蛋白mRNA高表達的癌症選自肺癌、胃癌、腎癌、結腸癌、大腸癌、乳腺癌、膀胱癌、口腔癌、肝癌、腦腫瘤、鼻咽癌、頸部鱗癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、睪丸腫瘤、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、絨癌、白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、骨肉瘤，軟組織肉瘤、耳鼻喉科腫瘤、眼科腫瘤。
全文摘要
本發明涉及靶向人凋亡抑制蛋白家族成員存活蛋白mRNA的反義寡核苷酸序列，含有它們的藥物組合物及其用於治療癌症的用途。
文檔編號A61K31/7088GK1532202SQ0312075
公開日2004年9月29日 申請日期2003年3月19日 優先權日2003年3月19日
發明者袁守軍, 馬靜, 田增月, 徐蘭平, 韓昌明, 丁林茂 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射醫學研究所, 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射醫