一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子的製備及分離純化方法

2023-10-07 21:36:14 1

專利名稱：一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子的製備及分離純化方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥領域，具體涉及蛋白質聚乙二醇化修飾及分離純化，更具體地說，涉及了一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子的製備和分離純化方法。
背景技術：
重組人粒細胞集落刺激因子(Recombinant Human Granulocyte-Colony Stimulating Factor,rhG-CSF)是一種造血生長因子，促進粒細胞集落的形成，它作用於骨髓中性粒細胞系造血前體細胞，促進其增殖、分化。對成熟的中性粒細胞可促進遊走、吞噬、 產酶、釋放活性氧、殺菌能力和對外來異物的黏著作用。還可動員成熟中性粒細胞從骨髓進入外周。rhG-CSF最早的適應症是促進癌症化療以及骨髓移植後的中性粒細胞恢復，以後逐步擴大到各種病因引起的中性粒細胞減少症。然而rhG-CSF在機體內易受蛋白酶降解、半衰期短的特點，在人體內循環半衰期只有1. 3 4. 2h，需每日給藥，而持續給藥會引發藥疹、發熱、肌痛、骨痛等副作用，導致實際用量遠低於理論需用量，直接影響臨床治療效果，這極大的限制了其在臨床治療中的應用。聚乙二醇(PEG)化學修飾是延長蛋白類藥物半衰期的一個有效途徑，末端活化的 PEG是一種惰性、兩親、不帶電荷的柔性長鏈高分子聚合物，已經作為多種藥物的安全載體用於臨床應用，比如說PEG-幹擾素、PEG-生長抑素等。PEG通過共價鍵與蛋白質連接，可與蛋白質分子中的氨基(位於N末端的氨基或賴氨酸殘基)或者巰基(位於半胱氨酸)反應對蛋白質分子進行修飾。該修飾可以有效地改變蛋白類藥物在體內的分布和藥物學特性， 延長蛋白質藥物的血藥濃度，同時還可降低免疫原性。張兵在《重組人粒細胞集落刺激因子的克隆、表達、純化和PEG單修飾以及修飾前後的體內外生物學活性》(《安徽醫科大學》， 2008年)中對PEG以及聚乙二醇化G-CSF的做了一些介紹，然而該文獻所公布的聚乙二醇化G-CSF的修飾體系，通過SP-S^harose FF離子交換和kphacryl S-200分子篩層析收集的單聚PEG-G-CSF，經過SDS-PAGE與HPLC檢測得知PEG-G-CSF純度為95%，修飾後的體外活性為2. 0X107U/mgo中國發明專利申請CN101711876A公開了一種聚乙二醇修飾的重組人粒細胞集落刺激因子及其製備方法的技術方案。該技術內容中指出PEG聚合物鏈本身的結構、長度、分子量等對聚乙二醇蛋白的特性也有很大的影響。此外修飾過程中反應的溫度、PH值以及活性PEG與蛋白的比例均可能對聚乙二醇化的程度有影響，並產生不同的PEG與蛋白結合方式。一個蛋白分子結合一個PEG分子或蛋白的多個結合位點分別與PEG結合，使產物組分很複雜，包含了單、雙、多及未修飾偶聯產物，影響了藥物蛋白生物學活性和純度。通過調整 G-CSF原液濃度核pH制，加入氰硼氫化鈉和活化的聚乙二醇，於4°C反應，加入甘氨酸終止反應；採用離子交換和分子篩層析對反應混合物予以分離活化的技術方案得到的蛋白純度為95%，生物活性為8. 0X107IU/mg。
文獻報導的生產工藝中，普遍存在的一個問題是PEG化反應後經分離純化得到的產品純度和比活性都很低，這是因為混合物中單、雙修飾、多修飾及未修飾偶聯物大量存在，導致後期純化難以完全去除。

發明內容
為了生產具有高純度和高生物學活性的聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子， 本發明提供了一種單修飾聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子的製備和分離純化方法。本發明製備PEG-rhG-CSF方法的具體方案如下用pH3. 8 5. 8、10 20mmol/L的磷酸鹽緩衝液調節rhG-CSF原液的濃度和pH， 得調節後的rhG-CSF溶液，它的濃度為2 10mg/mL、pH為3. 8 5. 8 ；將終濃度為10 40mmol/L的催化劑三乙醯氧基硼氫化鈉加入到調節後的 rhG-CSF溶液中，攪拌使之迅速溶解；稱取活化的PEG，按照PEG與rhG-CSF的摩爾質量比為2 8 1計算，加入到 rhG-CSF溶液攪拌使之迅速溶解，避光4 25°C下攪拌反應4 Mh，加入終濃度為20 60mmol/L的胱氨酸終止反應，得到PEG-rhG-CSF。本發明所述的rhG-CSF為N末端帶有Met的重組人粒細胞集落刺激因子。本發明對PEG的分子量進行了優選，優選地，PEG的分子量為5KDa至20KDa，更優選20KDa，最優選為20KDa單甲氧基聚乙二醇丁醛。本發明對rhG-CSF原液的pH進行了優選，優選地，上述rhG-CSF原液的pH調整為 4. O 5. O。本發明中PEG與rhG-CSF的摩爾質量比進行了優選，優選地，PEG與rhG-CSF的摩爾質量比為3 1。本發明對PEG-rhG-CSF製備方法中的反應時間進行了優選，優選地，上述 PEG-rhG-CSF製備方法的反應時間10_24h。本發明純化PEG-rhG-CSF方法的具體方案如下層析柱裝填完畢後用注射用水衝洗5 10個柱體積，然後用pH3. 8 5. 8、10 30mmol/L的NaAc-HAc緩衝液平衡層析柱5 10個柱體積；將通過製備方法得到的PEG-rhG-CSF與注射用水等體積混合，稀醋酸調pH至 3. 8 5. 8，然後以10 20mL/min速度上層析柱；上樣完畢後用pH3. 8 5. 8、10 30mmol/ L的NaAc-HAc緩衝液平衡5 10個柱體積，NaAc-HAc緩衝液進行梯度洗脫，洗脫速度10 20mL/min，分部收集不同吸收峰的洗脫液。PEG修飾後的混合物，未修飾產物、多修飾產物與單修飾產物在表面電荷效應上存在一定差異，利用這一點可以用離子交換層析將樣品中單修飾、多修飾及未修飾產物有效的分離開來。本發明對純化過程中層析柱的填料進行了優選，優選地，上述層析柱的填料為MacroCap SP陽離子交換填料，此填料在高載樣量下仍可以有效的分離PEG單修飾、多修飾、未修飾產物。本發明對梯度洗脫的緩衝液進行了優選，優選地，上述梯度洗脫的緩衝液為 ρΗ3· 5 4. 5、5 20mmol/L 的 NaAc-HAc 緩衝液 a 禾Π ρΗ7· 0 8. 0、10 30mmol/L 的 NaAc-HAc 緩衝液 b。
本發明對梯度洗脫的程序進行了優選，優選地，上述梯度洗脫程序為0 30min， 100%緩衝液a ；30 90min, 100%~ 0%緩衝液a、0 100%緩衝液b ；保持5minl00%的緩衝液b。本發明與現有技術相比具有如下突出的優點本發明選用了磷酸鹽製備體系，通過優化製備方法中修飾反應體系的pH、反應溫度、PEG與rhG-CSF的摩爾質量比和催化劑及其濃度，控制反應時間，獲得了大於70%的單修飾PEG-rhG-CSF和小於2. 3%的多修飾PEG_rhG_CSF，在保證一定修飾效率的情況下，儘可能的減少了雙、多、未修飾偶聯物的產生，提高了樣品的純度，有利於後續步驟的純化。本發明通過一步離子交換層析，優選純化過程中的工藝條件，使PEG-rhG-CSF的純度大大提高，達到99. 65%以上，其比活性達到6X 108IU/mg。現有技術中鮮有公開PEG-rhG-CSF的收率問題，而通過本發明的技術方案，PEG-rhG-CSF收率達到85%以上，另外相對於現有技術公開的技術方案，本發明純化方法通過一步陽離子交換層析，簡化了步驟，節省了成本， 適合工業化大生產。本發明中稀醋酸按照《中國藥典》配製；MacroCap SP為GE公司生產。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明予以進一步詳細說明，但是本發明不限於以下實施例。實施例1. PEG-rhG-CSF 的製備取重組人粒細胞集落刺激因子溶液500mL，用pH4. 0、lOmmol/L的磷酸鹽緩衝液調節蛋白濃度為5mg/mL、pH4. 0 ；將終濃度為20mmol/L的催化劑三乙醯氧基硼氫化鈉加入調節後的rhG_CSF溶液中，攪拌使之迅速溶解；按PEG rhG-CSF為3 1的摩爾質量比計算，稱取單甲氧基聚乙二醇丁醛 (20KDa)，加入以上溶液攪拌使之迅速溶解，避光4°C下攪拌反應；在反應4h、8h、12h、16h、 20h時分別取樣做HPLC檢測PEG修飾效率及雙修飾偶產物含量，24h後加入終濃度為 40mmol/L的胱氨酸終止反應，得到PEG-rhG-CSF。表1不同反應時間的檢測結果
權利要求
1.一種製備PEG-rhG-CSF的方法，包括以下步驟用pH3. 8 5. 8、10 20mmol/L的磷酸鹽緩衝液調rhG-CSF原液的濃度至2 IOmg/ mL、pH 至 3. 8 5. 8 ；將終濃度為10 40mmol/L的催化劑三乙醯氧基硼氫化鈉加入到調節後的rhG_CSF溶液中，攪拌使之迅速溶解；稱取活化的PEG，按照PEG與rhG-CSF的摩爾質量比為2 8 1計算，加入到rhG-CSF 溶液攪拌使之迅速溶解，避光4 25°C下攪拌反應4 Mh，加入終濃度為20 60mmol/L 的胱氨酸終止反應，得到PEG-rhG-CSF。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於PEG的分子量為5KDa 20KDa。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於PEG為20KDa單甲氧基聚乙二醇丁醛。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於調節後的rhG-CSF溶液的pH為4.0 5. 0。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於rhG-CSF與PEG的攪拌反應時間10_Mh。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵PEG-rhG-CSF的純化方法，包括以下步驟 層析柱裝填完畢後用注射用水衝洗5 10個柱體積，然後用pH3. 8 4. 8、10 30mmol/L的NaAc-HAc緩衝液平衡層析柱5 10個柱體積；將製備得到的PEG-rhG-CSF混合物與注射用水等體積混合，稀醋酸調pH至3. 8 5. 8，然後以10 20mL/min速度上層析柱；上樣完畢後用pH3. 8 5. 8、10 30mmol/L的 NaAc-HAc緩衝液平衡5 10個柱體積，NaAc-HAc緩衝液進行梯度洗脫，洗脫速度10 20mL/min，分部收集不同吸收峰的洗脫液。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於層析柱填料為MacroCapSP陽離子交換填料。
8.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於梯度洗脫緩衝液為pH3.5 4. 5、5 20mmol/L 的 NaAc-Hac 緩衝液 a 和 pH7. 0 8. 0、10 30mmol/L 的 NaAc-HAc 緩衝液 b。
9.根據權利要求6或8所述的方法，其特徵在於梯度洗脫程序為0 30min，100%緩衝液a ；30 90min, 100% 0%緩衝液a、0 100%緩衝液b ；保持5minl00%的緩衝液b。
全文摘要
本發明屬於生物醫藥領域，具體涉及蛋白質的聚乙二醇修飾及分離純化，特別涉及一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)的製備和純化。通過優化修飾反應體系及反應條件，獲得了大於70％的單修飾PEG-rhG-CSF和小於2.3％的多修飾PEG-rhG-CSF；通過控制分離純化過程中的工藝參數，獲得了高純度和高活性的單修飾PEG-rhG-CSF，並且PEG-rhG-CSF收率達到85％以上。本發明純化方法中通過一步陽離子交換層析，簡化了步驟，節省了成本，適合工業化大生產。
文檔編號C07K14/535GK102485742SQ20101056960
公開日2012年6月6日 申請日期2010年12月2日 優先權日2010年12月2日
發明者劉忠, 張培彪, 趙志全 申請人:山東新時代藥業有限公司