一種重組恆河猴尿酸酶蛋白及其應用的製作方法
2023-10-07 21:55:49
一種重組恆河猴尿酸酶蛋白及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組恆河猴尿酸酶蛋白及其應用，該尿酸酶蛋白源自於恆河猴，將其基因編碼序列克隆至表達質粒載體中進行體外重組表達，該酶蛋白可作為製備治療痛風或者高尿酸血症藥物的應用。本發明利用尿酸酶在痛風及高尿酸血症領域的治療效果，針對已上市尿酸酶產品，其蛋白序列與人體同源性較恆河猴低、免疫原性較強等問題，採用與人體同源性最高、具有活性尿酸酶的哺乳動物--恆河猴，作為重組尿酸酶蛋白的基因來源。該重組尿酸酶蛋白具有免疫原性低，患者易於耐受，可長期治療等優點。含有該尿酸酶基因的真核表達質粒還可以用體內轉染的手段轉染到患者體內，使其在體內表達活性尿酸酶蛋白，用於痛風和高尿酸血症的基因治療。
【專利說明】一種重組恆河猴尿酸酶蛋白及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫藥領域，具體是指一種重組恆河猴尿酸酶蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002]痛風和高尿酸血症是目前危害人類健康的常見疾病，據統計高尿酸血症的發病率已經達到了人群的10%。痛風是由於血尿酸水平過高而造成尿酸鹽結晶在關節中沉積而導致的一種急性關節炎。目前控制痛風的藥物主要是別嘌呤醇和丙磺舒類藥物。由於這兩類藥物均需要長期服用，加之該類藥物都有明顯的肝腎毒性以及過敏反應，尤其是別嘌呤醇，可以引起嚴重的剝脫性皮炎，甚至可危機患者的生命。導致目前這類疾病的控制不理想，而造成患者痛風石的形成和腎功能的障礙。目前，高尿酸血症已被列為心血管疾病的獨立風險因素。因此，尋找有效的治療手段勢在必行。
[0003]在動物體內，其尿酸的水平僅為人類的1/10。因此痛風和高尿酸血症也被認為是人類獨有的疾病。動物體內尿酸水平低的原因是由於其體內存在有能夠把尿酸進一步分解為極易溶解的尿囊素。通過對比發現，人類的基因組中也存在尿酸酶基因，但是在人類在進化的過程中，由於該基因的突變，造成其不能表達有功能的蛋白質。從而成為一個假基因。由此可見尿酸酶是治療痛風與高尿酸血症的理想藥物。20多年前，黃麴黴尿酸酶(Uricozyme)在法國和義大利批准。本世紀初,基因重組的酵母菌尿酸酶(Rasburicase)在美國和歐盟或批准。由於這兩種尿酸酶均來自於細菌，有很強的免疫原性，Uricozyme和Rasburicase出現嚴重過敏反應的比例達5%以上，並且還有近半數的患者出現發熱，噁心嘔吐等不良反應。目前在美國用於臨床的尿酸酶蛋白(Pegloticase)是經過PEG化修飾的豬和狒狒的重組尿酸酶嵌合蛋白，商品名為KRYSTEXXA。雖然該尿酸酶來源於哺乳動物(豬和狒狒)，但由於與人類的差異造成的排異反應，加之PEG化的影響，其免疫原性仍然較強。每兩周一次靜脈注射KRYSTEXXA的患者中92%產生了抗pegloticase的抗體。42%的患者產生了抗PEG抗體。輸 液反應的發生率達到26%。儘管如此，美國FDA於2010年批准了該藥上市。由此可見對該類藥物有著巨大的市場需求。為進一步改善從組尿酸酶的免疫原性，我們選擇與人類更為接近，且體內存在高活性尿酸酶蛋白的恆河猴作為尿酸酶基因的來源。通過對恆河猴尿酸酶(RhUOX)與推測出的人源尿酸酶的胺基酸序列進行比對，發現同源性約為93.4%;而其他哺乳動物狒狒、犬、豬、小鼠與推測出的人源尿酸酶的胺基酸序列一致性分別為:91.1%,88.49%,86.8%,85.2%。因此，從胺基酸序列的比對結果可以看出，恆河猴尿酸酶與人類具有更高的同源性。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種重組恆河猴尿酸酶蛋白及其應用。該酶源自恆河猴，在體外重組製備，能夠應用於痛風或者高尿酸血症的治療。該重組尿酸酶蛋白可以在體外用原核表達系統表達，且可以對表達出的尿酸酶蛋白進行PEG化修飾。或者應用真核表達系統進行表達，也可以在表達載體中將恆河猴尿酸酶基因連接免疫球蛋白的FC段，從而表達出帶有FC片段的恆河猴尿酸酶，進一步增強酶的活性和半衰期。或者直接將恆河猴尿酸酶的全長基因插入到表達載體，將該表達質粒轉入患者的體內，使其在體內表達完整的恆河猴尿酸酶蛋白，從而達到更為持續有效的治療效果。
[0005]本發明解決上述技術問題所採用的技術方案是:一種重組恆河猴尿酸酶蛋白，該尿酸酶蛋白源自於恆河猴。
[0006]進一步地，所述重組恆河猴尿酸酶蛋白由304個胺基酸組成。
[0007]進一步地，所述304個胺基酸中，包含恆河猴來源尿酸酶蛋白第2-69位，第156-192位及第202-240位胺基酸序列，見序列表1。
[0008]一種重組恆河猴尿酸酶蛋白的基因序列的表達系統，將恆河猴尿酸酶基因編碼序列插入表達系統中的表達載體進行表達。
[0009]進一步地，所述表達載體為原核表達載體。
[0010]進一步地，所述原核表達載體為pET_28c載體或pET-DsBA載體。或其他可表達恆河猴尿酸酶的原核表達的載體系統。
[0011]進一步地，所述表達載體為真核表達載體。
[0012]進一步地，所述真核表達載體為pcDNA3.1載體。或可用於恆河猴尿酸酶表達的真核表達載體。
[0013]本發明所述的一種重組恆河猴尿酸酶蛋白作為製備治療痛風或者高尿酸血症的藥物的應用。
[0014]進一步地，所述治`療痛風或者高尿酸血症的藥物為PEG化的原核表達出的活性恆河猴尿酸酶蛋白。
[0015]進一步地，所述的治療痛風或者高尿酸血症的藥物為表達出帶FC片段的恆河猴尿酸酶或表達完整的恆河猴尿酸酶蛋白的表達質粒。
[0016]恆河猴尿酸酶的製備方法，具體步驟為:
(O獲取恆河猴尿酸酶Rhuox基因編碼序列；
(2)構建恆河猴尿酸酶RhUOX的T載體，以獲取所需恆河猴尿酸酶RhUOX基因編碼序
列；
(3)將恆河猴尿酸酶RhUOX基因編碼序列插入表達載體；
(4)將表達載體導入感受態細胞，並使之表達，獲得恆河猴尿酸酶RhUOX；
(5)對恆河猴尿酸酶RhUOX進行檢測，檢測合格後進行酶活性測定。
[0017]採用Trizol法常規提取恆河猴肝臟的總RNA，通過逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉合成cDNA,具體操作參照試劑盒說明進行。
[0018]根據網站預測的RhUOX cDNA序列，設計上下遊引物擴增獲得恆河猴RhUOX⑶S序列。
[0019]上遊引物:5』-GGATCCGAATGGCCGACTACCATAAC-3』 ；
下遊引物:5』 -GAATTCGGTCACAGTCTTGAAGACAAC-3』。
[0020]構建恆河猴尿酸酶RhUOX的T載體的步驟為:
I)在PCR管中配製下列DNA溶液，全量為5 μ I ;
pMD19-TVechtor I μ I
目的 DNA'?μ I
dH2Q|3μ I2)加入5 μ I (等量)的 Solution I ；
3)16°C反應30分鐘；
4)全量(10μ?)加入至100 μ I JM109感受態細胞中，冰中放置30分鐘；
5)42°C加熱45秒鐘後，再在冰中放置I分鐘；
6)加入890μ I SOC培養基，37°C振蕩培養60分鐘；
7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落；
8)挑選白色菌落，使用PCR法確認載體中插入片段的長度大小；
9)將構建好的尿酸酶重組菌RhU0X/pMD19T測序，菌種置於_70°C冰箱甘油管保存。測序報告顯不，RhUOX基因已插入pMD19T載體中。
[0021 ] 將網站預測的RhUOX的cDNA序列(序列表2 )與網站預測的RhUOX的蛋白質序列(序列表3)分別與測序成功的RhUOX cDNA序列(序列表4)，以及測序成功的RhUOX蛋白質序列(序列表5)比對，所獲取的恆河猴尿酸酶RhUOX的胺基酸序列第157位為I而非網站公布的T。
[0022]表達系統中，表達載體為原核表達載體，具體為pET_28c載體或pET_DsBA載體。首先，構建RhU0X/pMD19T載體(方法同上)，質粒測序正確後，BamHl/EcoRl雙酶切插入片段(929bp)插入pET-28c載體或pET-DsBA載體中。
[0023]表達系統中，表達載體為真核表達載體，具體為pcDNA3.1載體。
[0024]pcDNA3.1 載體構建:
Trizol法常規提取恆河猴肝臟組織總RNA，mRNA逆轉錄為cDNA，PCR擴增RhUOX表達基因片段。
[0025]上遊引物:5』 -GGATCCGCCACCATGGCCGACTACCATAAC-3 』
下遊引物:5』 -AGAATTCAACAGTCTTGAAGACAACTTCCTC-3』
擴增產物純化後，插入PMD19T載體中，質粒測序正確後，BamHl/EcoRl酶切插入pcDNA3.1載體中。
[0026]所述pET_28c載體或pET_DsBA載體中，RhUOX基因的原核誘導表達方法:
1)使用大腸桿菌BL21(DE21)作為感受態細胞；
2)使用化學轉化法，使原核表達載體編碼的抗生素抗性標記基因；
3)進行重組質粒抽提；
4)使重組菌誘導表達。
[0027]RhUOX的原核誘導表達:
轉化:取感受態細胞(DH5 α ,100 μ I)置於冰浴上融化。加入I μ I質粒DNA，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰浴中放置30分鐘。從冰浴中取出離心管，立即置於42°C水浴中熱擊90秒。取出離心管快速放置到冰浴中，使細胞冷卻3分鐘。每管加800 μ I無抗性LB液體培養基，置於37°C搖床振搖培養溫育30-45分鐘使細菌復甦，以便表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。離心，吸棄800 μ I上清，將這些已轉化的感受態細胞均勻塗布至含相應抗生素的LB瓊脂糖培養基上。將平板置於室溫直至液體被吸收。倒置平板，於37°C培養12-16小時，觀察菌體生長情況。
[0028]重組質粒抽提，挑取單菌落，接種於含相應抗生素的LB液體培養基中，37 °C劇烈振搖培養過夜。將菌液收集至離心管中，室溫12000 rpm離心I min,收集菌體沉澱,採用試劑盒抽提重組質粒，具體方法步驟參照試劑說明書進行。抽提完的重組質粒溶解後，置於-20 1:冰箱保存備用。
[0029]重組菌的誘導表達，將抽提的重組質粒轉化轉至大腸桿菌BL21 (DE21)表達菌的感受態中(轉化方法同前述)，37 溫培養箱培養12-16 ho挑取單菌落接種於3 mL含相應抗生素的LB液體培養基中，37 °C劇烈振搖培養過夜。重組菌菌液按1%接種量轉接至3 mL含相應抗生素的LB液體培養基後，37 °C劇烈振搖繼續培養至0D600~0.6時加入終濃度為0.4 mM的IPTG，21°C振搖(120rpm)培養誘導過夜。收集菌液，4000 rpm離心5 min收集菌體沉澱，將菌體沉澱重懸於150 μ I硼酸-硼砂鹽緩衝液中(pH8.4)。冰浴中超聲破碎。4 V 12000 rpm離心lOmin，收集上清液即為粗酶液。
[0030]SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達:提取的粗酶液採用BCA法檢測蛋白濃度，採用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，考馬斯亮藍染色液G250染色後，脫色液脫色，最後於凝膠成像系統上拍照保存。
[0031]RhUOX酶活測定:由於尿酸在293 nm處有光吸收，可以通過檢測尿酸吸光度的降低來測定尿酸酶的活性。酶活力單位(U)定義:在pH 8.4和25 °C時，I min催化I μ mo I尿酸生成尿囊素所需的酶量為一個酶活單位。
[0032]尿酸酶活力測定具體如下:
取900 μ I 120 μmol/L尿酸，加入30 μ I粗酶液，混勻。
[0033]25 °C水浴反應5 min後，加入70 μ I 20% KOH終止反應。
[0034]取100 μ I反應液於微型石英比色皿中，置於紫外分光光度計中，293 nm波長下讀取吸光值。根據尿酸在293 nm波長下的微摩爾消光係數(ε =12.6 μ M—1.cm—1)，計算RhUOX酶活力。
[0035]pET-28載體酶活性檢測:IPTG誘導的B21 (DE3) pET_28c空載體對照(Control)菌裂解液和RhU0X/pET-28c重組菌裂解液上清RhUOX酶活性檢測。結果顯示，RhUOX裂解菌液可顯著降低溶液中的尿酸濃度，相較於Control組,其下降幅度為82.39% (P〈0.0001)。
[0036]pET-DsBA載體酶活性檢測:IPTG誘導的B21 (DE3) pET-DsBA空載體對照(Control)菌裂解液和RhU0X/pET_DsBA重組菌裂解液上清RhUOX酶活性檢測。結果顯示，RhUOX裂解菌液可顯著降低溶液中的尿酸濃度,相較於Control組,其下降幅度為66.53%(Ρ〈0.0001)。
[0037]進一步的，所述pcDNA3.1載體中RhUOX基因或RhUOX-Fc基因的真核表達方法: O使用人胚腎細胞(ΗΕΚ293Τ)作為宿主細胞；
2)進行細胞培養，ΗΕΚ293Τ細胞採用10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養，轉染前一天將細胞接種於培養皿中，使得第二天轉染時細胞融合率達到80%~90%。；
3)進行細胞轉染，採用lipofectamine2000轉染試劑將質粒轉染到293T細胞中，轉染後72 h，獲得基因表達成果。
[0038]轉染後72 h，將細胞收集到1.5 ml EP管中。
[0039]將收集的細胞每管分別加入120 μ I硼酸-硼砂鹽緩衝液(ρΗ8.4)，冰浴超聲破碎。將細胞裂解液於4 V 12000 rpm離心10 min，收集上清液。
[0040]細胞裂解上清液30 μ I與970 μ I尿酸溶液於25 °C水浴孵育7 h後，檢測尿酸濃度。[0041 ] 構建pCDNA3.1表達載體=Trizol法常規提取恆河猴肝臟組織總RNA，mRNA逆轉錄為cDNA，PCR擴增RhUOX表達基因片段。
[0042]上遊引物:5』 -GGATCCGCCACCATGGCCGACTACCATAAC-3 』
下遊引物:5』 -AGAATTCAACAGTCTTGAAGACAACTTCCTC-3』
擴增產物純化後，插入PMD19T載體中，質粒測序正確後，BamHl/EcoRl酶切插入pcDNA3.1載體中。
[0043]Human IgG Fe片段同樣通過RT-PCR的方法擴增於人淋巴細胞RNA。擴增產物純化後，插入PMD19T載體中。質粒測序正確後，EcoRl/Xbal酶切插入pcDNA3.1載體中。
[0044]RhU0X-Fc/pcDNA3.1質粒序列，其中重組RhUOX的基因序列見序列表6，FC片段的基因序列見序列表7。結果:與空載體組相比，轉染RhU0X/pcDNA3.1質粒組中尿酸濃度顯著低於轉染空載體組，其下降幅度為42.62% (P〈0.0001)。轉染RhU0X_Fc/pcDNA3.1質粒組中尿酸濃度也顯著低於轉染空載體組，其下降幅度為78.94% ;另外，轉染RhUOX-Fc/pcDNA3.1質粒組中尿酸濃度又顯著低於轉染RhU0X/pcDNA3.1質粒組，其下降幅度達63.30% (Ρ〈0.001)。
[0045]本發明還涉及所述的恆河猴尿酸酶RhUOX作為製備治療痛風或者高尿酸血症的藥物的應用。發明針對目前尿酸酶製劑存在的免疫原性高，副作用大等缺點。從基因選擇上，我們選擇與人類更為接近，且體內存在高活性尿酸酶蛋白的恆河猴作為尿酸酶基因的來源。`
[0046]為延長恆河猴尿酸酶蛋白的半衰期，我們將在恆河猴尿酸酶上連接人免疫球蛋白的FC段。從而表達出帶有FC片段的恆河猴尿酸酶。或者直接將恆河猴尿酸酶的全長基因插入到表達載體，將該表達質粒轉入患者體內，使其在體內表達完整的恆河猴尿酸酶蛋白。
[0047]本發明與現有技術相比，具有如下的優點和有益效果:
(I)本發明針對目前尿酸酶製劑存在的免疫原性高，副作用大等缺點，從基因選擇上，我們選擇與人類最為接近，且體內存在高活性尿酸酶蛋白的恆河猴作為尿酸酶基因的來源。體外表達重組恆河猴尿酸酶用於痛風和高尿酸血症的治療，該重組蛋白在保證療效的同時具有更低的免疫原性和更好的耐受性。
[0048](2)為延長恆河猴尿酸酶蛋白的半衰期，我們將在恆河猴尿酸酶上連接人免疫球蛋白的FC段，從而表達出帶有FC片段的恆河猴尿酸酶，使其在人體內具有更長的半衰期，減少針劑的注射周期。該發明一方面可以減少藥物的毒副作用，同時應用簡便。
[0049](3)本發明利用尿酸酶在痛風及高尿酸血症領域的治療效果，採用與人體更為接近的恆河猴尿酸酶，結合體內基因轉染技術，將該發明中含有完整恆河猴尿酸酶基因或帶FC片段的恆河猴尿酸酶基因的真核表達質粒可以靶向轉入患者體內，使其在體內表達有活性的尿酸酶蛋白，達到治療目的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0050]圖1為採用引物擴增獲得恆河猴RhUOX⑶S序列後構建的T載體(TakaraPMD19T)；
圖2為RhU0X/pET-28c重組質粒圖譜；
圖3為RhU0X/pcDNA3.1重組質粒圖譜；圖4為RhU0X-Fc/pcDNA3.1重組質粒圖譜；
圖5為pET-28c載體IPTG誘導RhUOX表達電泳圖譜；
圖6為RhU0X/pET-28c重組菌裂解液上清RhUOX酶活性檢測，其中Control組為pET-28c空載體，實驗組為RhU0X/pET-28c載體組。與空載體組相比，0001 ；
圖7為pET-DsBA載體IPTG誘導RhUOX表達電泳圖譜；
圖8為RhUOX/pET-DsBA重組菌裂解液上清RhUOX酶活性檢測。其中Control組為pET-DsBA空載體，實驗組為RhUOX/pET-DsBA載體組。與空載體組相比，0001 ；
圖9為人胚腎細胞293T細胞轉染轉染不同pcDNA3.1真核重組質粒後後，細胞裂解上清液30 μ I與970 μ I尿酸溶液於25°C水浴孵育7 h後，溶液中的尿酸濃度變化情況，其中Lipo2000為轉染試劑對照組，pcDNA3.1組為空載體對照組，RhU0X/pcDNA3.1轉染質粒組為實驗組，RhU0X-Fc/pcDNA3.1轉染質粒組為實驗組。與空載體組相比，#7X0.001 ;與RhU0X/pcDNA3.1 轉染組相比，***7X0.001。
【具體實施方式】
[0051]實施例1:
恆河猴尿酸酶的製備方法
(O獲取恆河猴尿酸酶RhUOX蛋白編碼序列，見序列表1 ;
(2)構建恆河猴尿酸酶RhUOX的T載體，如圖1所示，以獲取所需恆河猴尿酸酶RhUOX基因編碼序列；
(3)將恆河猴尿酸酶RhUOX基因編碼序列插入表達載體；
(4)將表達載體導入感受態細胞，並使之表達，獲得恆河猴尿酸酶RhUOX；
(5)對恆河猴尿酸酶RhUOX進行檢測，檢測合格後進行酶活性測定。
[0052]採用Trizol法常規提取恆河猴肝臟的總RNA，通過逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉合成cDNA,具體操作參照試劑盒說明進行。
[0053]根據網站預測的RhUOX cDNA序列，見序列表2，設計上下遊引物擴增獲得恆河猴RhUOX CDS 序列。
[0054]上遊引物:5』-GGATCCGAATGGCCGACTACCATAAC-3』 ；
下遊引物:5』 -GAATTCGGTCACAGTCTTGAAGACAAC-3』。
[0055]實施例2:
根據實施例1中所述的步驟(2)，步驟(2)中構建恆河猴尿酸酶RhUOX的T載體的具體實施方法:
【權利要求】
1.一種重組恆河猴尿酸酶蛋白，其特徵在於:該尿酸酶蛋白源自於恆河猴。
2.根據權利要求1所述的一種重組恆河猴尿酸酶蛋白，其特徵在於:所述尿酸酶蛋白由304個胺基酸組成。
3.根據權利要求2所述的一種重組恆河猴尿酸酶蛋白，其特徵在於:所述304個胺基酸中，包含恆河猴來源尿酸酶蛋白第2-69位，第156-192位及第202-240位胺基酸序列，見序列表1。
4.一種重組恆河猴尿酸酶蛋白的基因序列的表達系統，其特徵在於:將恆河猴尿酸酶基因編碼序列插入表達系統中的表達載體進彳丁表達。
5.根據權利要求4所述的一種重組恆河猴尿酸酶蛋白的基因序列的表達系統，其特徵在於:所述表達載體為原核表達載體。
6.根據權利要求5所述的一種重組恆河猴尿酸酶蛋白的基因序列的表達系統，其特徵在於:所述原核表達載體為pET-28c載體或pET-DsBA載體。
7.根據權利要求4所述的一種重組恆河猴尿酸酶蛋白的基因序列的表達系統，其特徵在於:所述表達載體為真核表達載體。
8.根據權利要求7所述的一種重組恆河猴尿酸酶蛋白的基因序列的表達系統，其特徵在於:所述真核表達載體為pcDNA3.1載體。
9.一種將權利要求f 8任一項所述的一種重組恆河猴尿酸酶蛋白作為製備治療痛風或者高尿酸血症的藥物的應用。
10.根據權利要求9所`述的一種重組恆河猴尿酸酶蛋白的應用，其特徵在於:所述治療痛風或者高尿酸血症的藥物為PEG化的原核表達出的活性恆河猴尿酸酶蛋白。
11.根據權利要求9所述的一種重組恆河猴尿酸酶蛋白的應用，其特徵在於:所述的治療痛風或者高尿酸血症的藥物為表達出帶FC片段的恆河猴尿酸酶或表達完整的恆河猴尿酸酶蛋白的表達質粒。
【文檔編號】A61K48/00GK103773743SQ201410017486
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】杜豔春 申請人:廈門敖依生物科技有限公司