一種植物重組表達載體及其包含該載體的轉化體的製作方法

2023-10-17 07:27:34

專利名稱：一種植物重組表達載體及其包含該載體的轉化體的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及一種植物重組表達載體及其包含該載體 的轉化體。
背景技術：
轉錄因子(transcriptionfactor, TF)又稱反式作用因子，是一群能與真核基因啟動子 區域中的順式作用元件發生特異性結合，從而保證目的基因以特定的強度、在特定的 時間與空間表達的蛋自質分子。當植物感受外界乾旱、高鹽、激素、病害時，通過一 系列信號傳遞，激發轉錄因子，轉錄因子與相應的順式作用元件結合後，激活RNA聚 合酶II轉錄複合物，從而啟動特定基因的轉錄表達，最後通過基因產物的作用對內、 外界信號做出的調節反應。植物許多基因的表達都是由特定的轉錄因子與特定的順式 作用元件相互作用調控的。
在植物代謝研究中，通過對特定轉錄因子的表達或者抑制的調控，可以同時調控 代謝途徑上多個對轉錄因子響應的關鍵酶基因，打破代謝物代謝途徑上的瓶頸，從而 達到對整個代謝途徑進行調控的目的。目前對轉錄因子的研究表明，轉錄因子對植物 代謝的調節是通過合成與基因啟動子上相應的順式作用元件結合的蛋白而實現的。由 於轉錄因子對於代謝途徑上的關鍵酶的調控具有特異性，所以構建只包含轉錄因子的 載體有時不能夠達到同時調控代謝途徑上所有關鍵酶基因的目的，而構建轉錄因子加
關鍵酶基因的載體又存在啟動子衝突的問題。因此，通過構建轉錄因子加關鍵酵基因 的載體，並對關鍵酶進行啟動子修飾是解決這一問題的最佳策略。

發明內容
本發明的目的是提供一種植物重組表達載體。
本發明所提供的植物重組表達載體，包含轉錄因子、啟動子和關鍵酶基因的的融 合序列，所述的啟動子為包含對轉錄因子特異響應元件的啟動子。所述啟動子可為組成型、誘導型或組織特異性表達啟動子，優選為帶有jere元件 的啟動子，最優選為tdc啟動子。
所述轉錄激活因子可為orca2、 orca3、 PAP1、 PAP2、 0SB1、 TTG1、 anl、 an2、 anll、 jafl3、 del、 antl、 Lc、 TT16、 B、 Sn、 Hopi、 Cl、 Pl、 ANL2、 TTG2、 ttl、 tt2、 CPRF、 Ntliml、 MybA中之一。
在一些實施方案裡，所述轉錄激活因子優選為具有與orca3相同或相似功能的所 有具有DNA結合蛋白區AP2結構域和轉錄激活結構域的轉錄激活因子如winl， orca2,erfl等，以及其它具有相似轉錄激活活性功能的基因；尤其優選為orca3。
所述關鍵酶基因可包括一個目的基因或多個相同或不同的目的基因。
所述關鍵酶基因可以是任何可以利用的基因，如gl0h基因。gl0h基因具有SEQ ID NO. l所述的序列。
所述植物重組表達載體可含有篩選標記。所述篩選標記可為潮黴素(hygroraycin) 和卡鈉黴素(kan呵cin)。
本發明的第二個目的是提供包含上述植物重組表達載體的轉化體。
本發明所述轉化體的製備方法，包括以下步驟
製備植物重組表達載體；
轉化植物材料；
篩選轉基因植物材料。
本發明的優點或有益效果本發明通過構建新型植物重組表達載體可以同時調節植 物代謝途徑上的多個關鍵酶基因的表達，不僅包含對轉錄因子響應的關鍵酶基因，也 包括對轉錄因子不響應的關鍵酶基因，從而達到打通代謝流，調控目標代謝產物含量 的目的。


圖1. rolB、 rolC和hpt基因的PCR電泳圖。
圖2.關鍵酶gl0h及轉錄因子orca3的PCR電泳圖。
具體實施例方式
下面對本發明進行更加詳細的描述
本發明中對植物代謝產物的調節可以包括提高有活性成分的含量或者降低毒性成 分的含量等，在本發明中"轉錄因子"的選擇不特定於某個轉錄因子，只要對於植物 代謝途徑有調控作用的"轉錄因子"均可以用來進行代謝調控研究，"特異啟動子" 必須為包含對"轉錄因子"特異響應元件的啟動子，並不特定於某一啟動子，"關鍵 酶基因"可以是單個基因或者多個基因，為目標代謝物合成途徑上的限速酶基因且自 然狀態下對轉錄因子的調控不響應。
構建包含"轉錄因子""特異啟動子""關鍵酶基因"的植物表達載體可以包括 一個或多個關鍵酶基因但最好只包含一個"關鍵酶基因"，這樣易於構建植物表達載 體。在進行遺傳轉化植物材料時，所選用的植物材料沒有特別要求，可以是植物葉片， 懸浮細胞系等。所採用的遺傳轉化方法無特殊要求，可以採用髮根農桿菌浸染法、基 因槍等方法。轉基因材料的擴大培養可以根據相應遺傳轉化方法及材料進行選擇。對 轉基因材料中目標代謝產物的檢測可採用多種方法，如高效液相色譜法、氣相色譜法 等方法能達到檢測到目標代謝產物即可。對於轉基因材料中位於代謝途徑上和目標代 謝產物相關的基因表達的測定可採用多種方法，如PCR和螢光定量PCR等方法達到 檢測目的即可。
下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所 述的條件，或按照製造廠商所建議的條件，實驗所用的試劑為常用試劑。
實施例1.採用基因克隆方法獲得長春花中轉錄因子orca3、特異啟動子tdc啟動 子及關鍵酶基因gl0h。 1.組織分離(Isolation)
將長春花種子用75%乙醇浸泡1 min，再用2%NaCl浸泡10min，無菌水衝洗3-4 次，用無菌吸水紙吸乾表面水分，接種於無激素的MS(MurashigeandSkoog， 1962) 固體培養基中，25'C、 12h/12h光照培養，即可獲得長春花無菌苗，待苗長至5cm左 右後，切取葉片和莖段用於RNA提取。2. RNA的分離(RNA isolation)
稱取0.5g所述的長春花無菌試管苗，用液氮速凍後，迅速用研缽研碎，加入盛有 1 mL TRIzol (TRIzol Reagents, GIBCO BRL, USA)的1.5 mL Eppendorf管中，充分振 蕩後，於室溫下放置5min,加200ML氯仿，用力振蕩15sec，室溫放置2-3 min後， 於4°C 、 12，000g離心15 min;將上清液(約600 ML)吸入乾淨的1.5 mL E卯endorf管中， 加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置10min後，於4'C、12，000g離心10min; 棄上清，加1 mL 75%乙醇清洗，振蕩後，於4°C、 7，500g離心5 min;室溫乾燥15-20 min後溶於適量(30-50 PL) RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量， 然後在分光光度計上測定RNA含量。
3. 基因克隆(Cloning of the gene) 3丄第一鏈cDNA的合成
3.2.1關鍵酶glOh基因編碼區的PCR擴增
根據所述關鍵酶gl0h的編碼序列(SEQIDNO. 1)，設計擴增出完整編碼框的上 下遊引物，(FglOh 5、-AGATCTATGGATTAVVTAVVTATTATTTAAVT-3、， RglOh 5、-GGTGACTTAAAGGGTGCTTGGTACAGCAC-3、)並在上遊和下遊引物上分別引 入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以所述的第一 鏈cDNA為模板，經PCR擴增後進行測序。DNA序列測定由上海博亞或晶泰生物技 術服務有限公司採用3730自動測序儀完成。測序結果表明，所克隆的序列與GenBank 中所報導的長春花glOh基因(SEQIDNO. 1)編碼序列一致。
3.2.2轉錄因子orca3基因編碼區的PCR擴增
根據所述轉錄因子orca3的編碼序列(SEQIDNO. 2)，設計擴增出完整編碼框 的上下遊引物(Forca3 5、- ATGTCCGAAGAA ATCATTTCCG TCTC陽3、， Rorca3 5、- TT AATATCGTCTCTTCTTCCTTCCTCC-3、)，並在上遊和下遊引物上分別引入限制性內 切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以所述的第一鏈cDNA 為模板，經PCR擴增後進行測序。DNA序列測定由上海博亞或晶泰生物技術服務有 限公司採用3730自動測序儀完成。測序結果表明，所克隆的序列與GenBank中所報 道的長春花的轉錄因子orca3基因(SEQIDNO. 2)編碼序列一致。
3.2.3 tdc啟動子基因編碼區的PCR擴增根據所述特異啟動子(帶有jere元件的tdc啟動子)的編碼序列(SEQ ID NO. 3)， 設計擴增出完整編碼框的上下遊引物(Ftdc 5 、-AAGCTTAAATACATTAAATCTTAATTTCAC-3', Rtdc
5 、 - AGATVTTCTGCTGCTTTTCTGT A AAACC AGT A-3 、)，並在上遊和下遊引物上分別 引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以所述的第 一鏈cDNA為模板，經PCR擴增後進行測序。DNA序列測定由上海博亞或晶泰生物 技術服務有限公司採用3730自動測序儀完成。測序結果表明，所克隆的序列與 GenBank中所報導的長春花的轉錄因子特異響應啟動子(帶有jere元件的tdc啟動子) 基因(SEQIDNO.3)編碼序列一致。
實施例2.包含構建包含orca3 (轉錄因子)、tdc (特異啟動子)、gl0h (關鍵酶 基因)的植物表達載體的構建。
1. 中間載體pCAMBIA1304+的構建
選用pBI121和pCAMBIA1304為基本元件，構建雙元植物表達載體 pCAMBIA1304+。
其構建流程如下ffindIII和EcoRI雙酶切pBI121和pCAMBIA1304;回收pBI121 GUS表達盒，回收pCAMBIA1304大片段；連接這兩個回收產物，轉化DH5 a ,在 LB/kan+平板上篩選得到單克隆，再抽提質粒，酶切驗證(Hindni和EcoRI雙酶切)， 即構建成功中間載體pCAMBIA1304+。
2. 包含轉錄因子orca3的中間載體pCAMBIA1304+-O的構建 選用轉錄因子orca3和pCAMBIA1304+為基本元件，構建雙元植物表達載體
pCAMBIA1304十-O。
其構建流程如下Sacl和Xbal雙酶切pCAMBIA1304+和含有orca3基因的pGEM T-easy vector;回收orca3基因，回收pCAMBIA1304+大片段；連接這兩個回收產物， 轉化DH5 a ，在LB/kan+平板上篩選得到單克隆，再抽提質粒，酶切驗證(SacI和Xbal 雙酶切)，即構建成功中間載體pCAMBIA1304+-O。3. 包含轉錄因子orca3及tdc啟動子的中間載體pCAMBIA1304-的構建 選用特異啟動子(tdc啟動子)和？€八1^181八1304+-0為基本元件，構建中間載體
pCAMBIA1304*。
其構建流程如下HindIII和BgHI雙酶切pCAMBIA1304+-O和含有tdc啟動子基 因的pGEMT-easy vector;回收tdc啟動子基因，回收pCAMBIA1304+-O大片段；連 接這兩個回收產物，轉化DH5a，在LB/kan+平板上篩選得到單克隆，再抽提質粒， 酶切驗證(HindIII和BglII雙酶切)，即構建成功中間載體pCAMBIA1304*。
4. 植物表達載體PCAMBIA1304*+gl0h的構建
以所述的pCAMBIA130^為表達載體，用實施例1中關鍵酶glOh替換其上的 gfp+gus基因，從而獲得含轉錄因子orca3及特異啟動子(tdc啟動子)及關鍵酶gl0h 的植物表達載體pCAMBIA1304*+gl0h。
其構建流程如下BstEII和BglII雙酶切pCAMBIA130"和含有glOh基因的pGEM T-easy vector;回收gl0h基因，回收pCAMBIA130"大片段；連接這兩個回收產物， 轉化DH5a，在LB/kan+平板上篩選得到單克隆，再抽提質粒，酶切驗證(Bs伍II和 BglII雙酶切)，即構建成功植物表達載體pCAMBIA1304*+gl0h。
實施例3.髮根農桿菌介導構建包含orca3(轉錄因子)、tdc(特異啟動子)、gl0h (關鍵酶基因)的植物表達載體遺傳轉化長春花獲得轉基因毛狀根
1. 含轉錄因子orca3、 tdc啟動子及關鍵酶glOh的植物表達載體髮根農桿菌工程 菌的獲得
將實施例2中含轉錄因子orca3、 tdc啟動子及關鍵酶glOh的植物表達載體轉入發 根農桿菌C58C1。
2. 髮根農桿菌介導轉錄因子orca3、 tdc啟動子及關鍵酶glOh轉化長春花 2丄外植體的預培養
剪取實施例1中長春花無菌苗葉片(0.5 cm x 0.5 cm)和莖段(0.5 cm)外植體，接種到 預培養培養基(MS + AS 100 Wnol/L)上，25。C暗培養2 d。 2.2.農桿菌與外植體的共培養
8將所述的預培養長春花葉片和莖段外植體，放入含活化好的所述髮根農桿菌工程 菌的1/2MS懸液中浸泡5min (輕輕搖動使外植體與菌液充分接觸)後，倒出懸液， 用無菌吸水紙吸乾表面餘菌，轉到共培養培養基(1/2MS+AS 100 Wnol/L)中，暗 培養2 d。以浸泡在不帶有髮根農桿菌的1/2 MS液體培養基中的葉片和莖段外植體為 對照。
2.3.毛狀根的誘導和繼代培養
將所述的共培養2 d的長春花外植體轉入到脫菌固體培養基(1/2 MS + Cef 250 mg/L)上於25"C、 16h/8h光照培養20天左右，可從外植體邊緣切口處長出毛狀根。 剪取毛狀根(大約2-3 cm)，將起源於一個單細胞的每條根作為一個無性系，接種於脫 菌培養基(1/2MS + Cef250mg/L)中暗培養兩周，選擇生長快、分枝好的毛狀根轉 入脫菌培養基(1/2MS + Cef250mg/L)中繼代篩選，每兩周繼代培養一次，經過5-6 次繼代後即可完全脫菌。再將生長良好的長春花毛狀根轉入無抗生素的1/2MS培養 基上繼續暗培養20d左右，轉基因毛狀根生長迅速、根毛和分枝逐漸增多、向地性 喪失並可以在無植物激素的培養基上快速生長，具有典型的毛狀根特徵。獲得無性系 GK G2、 G3、 G4、 G5、 G6、 G7、 G8、 G9。
3.轉基因長春花毛狀根的PCR檢測
設計Ri質粒T-DNA區rol基因特異性引物，用PCR方法對所述毛狀根進行分子 檢測。由於目的基因glOh在植物表達載體上與潮黴素抗性基因(hpt)在同一個邊界內， 檢測hpt基因以確認轉基因毛狀根。根據目的基因gl0h序列、orca3序列(SEQ ID NO. 1)設計引物對目的基因進行檢測。結果圖1.M: DNA分子量標記；1 9依此代 表無性系G1、 G2、 G3、 G4、 G5、 G6、 G7、 G8、 G9; +表示陽性對照； 一表示 陰性對照；這表明，利用rolB、 rolC和hpt基因的PCR特異引物，能分別擴增出423 bp、 622 bp和812 bp的特異DNA片段，而以非轉化長春花普通根基因組DNA (NC) 為模板時，沒有擴增出任何片段。圖2: M: DNA分子量標記；G1 G9依此代表無 性系G1、 G2、 G3、 G4、 G5、 G6、 G7、 G8、 G9; PC表示陽性對照；NC表示陰 性對照；這表明用關鍵酶gl0h及轉錄因子orca3的PCR引物擴增轉基因長春花毛狀 根DNA，能擴增出與預期結果一致的特異目的片段。這說明誘導毛狀根形成的rolB、 rolC基因和T-DNA區的hpt和gl0h及orca3基因已經整合到長春花基因組中。實施例4.螢光定量PCR檢測轉基因長春花毛狀根中TIAs生物合成基因的表達
1. 引物的設計和合成
根據長春花中TIAs生物合成代謝途徑基因(orca3、 gl0h、 dxs、 ggpps、 as a 、 cpr、 tdc、 tdc、 sgd、 d4h和dat，共ll個)和看家基因18SrRNA全序列設計引物。引物 擴增基因片段長度在150-400 bp之間。所用引物由上海生工生物工程公司合成。
2. RNA的提取、標準品的製備和標準工作曲線
參照實施例1中所述方法，從長春花毛狀根中提取RNA，用DNaseI除去RNA中 基因組DNA，用反轉錄酶XL(AMV)進行第一鏈cDNA的合成，再以第一鏈cDNA 為模板，分別用ll對引物進行PCR擴增獲得相應的U條基因的擴增條帶。
PCR產物電泳回收，用紫外分光光度計測定所有目的基因原液的濃度和純度。標 準品用IO倍梯度稀釋法得到系列濃度的目的基因標準品。每個標準品用螢光定量 PCR方法測定，得到Ct值。以每個標準濃度的對數對它們的Ct值作圖，得到滿意的 ll個基因標準工作曲線。得到的ll個基因相關係數(斜率-3.3左右，相關係數大於 0.95)表明初始模板濃度的對數與循環閾值Ct之間存在著極強的線性關係，這為定量 的準確性提供了基礎。標準曲線同時顯示，螢光定量PCR (FQ-PCR)反應線性範圍 極寬，可達5個log值的範圍(10-9-10-5 Hg"L),敏感度高，起始濃度在10-9 fig爾L 也可獲得良好的定量效果。參照標準品工作曲線，可以準確地得到樣品中起始模板的 濃度。
3. 螢光定量PCR檢測看家基因18SrRNA基因的表達
為調整各樣品間在RNA抽提和逆轉錄過程中反應效率的差異，檢測目的基因表達 量的同時需檢測看家基因18SrRNA基因的表達。檢測18S rRNA和目的基因的螢光
定量PCR的反應體系如下 _
2 x QuantiTectTM SYBR Green Master Mix 10 PL
GSP1 0.2 ML
GSP2 0.2叱
50XcDNA 5叱 ddH20 4.6叱總體積_20叱
PCR反應條件熱啟動和變性94'C 15min, 50個循環(94匸變性15 sec， 55'C退 火30sec， 72'C延伸30sec並檢測螢光，80^20 sec並檢測螢光)。
4. 熔解曲線分析和螢光定量PCR產物的檢測
所有PCR產物經50個循環完成以後，以0.2°C/SeC的速度使溫度從72X:緩慢上升 到95'C。擴增產物雙鏈DNA隨溫度的升高逐漸變性解鏈為單鏈，SYBRGreenI染料 逐漸釋放出來，螢光信號逐漸減弱，儀器每升高0.2'C檢測一次反應管內螢光強度的 變化，最後得到擴增產物螢光信號強度對溫度變化的熔解曲線(Melting curve),定量 PCR儀自動以dF/dT對溫度T作圖。根據熔解曲線的形狀和峰值對反應管中的擴增 產物進行鑑定。為消除引物二聚體對Ct的影響，將每個循環中的讀板溫度調高到 80'C,在這一溫度下雙鏈的引物二聚體變性，釋放出結合的SYBR-Green染料，從而 消除了引物二聚體產生的螢光信號。
根據標準曲線，求出各待測樣品cDNA中各目的基因的原始濃度，然後以每份 cDNA中目的基因濃度除以每份cDNA中的看家基因18SrRNA的濃度對每個樣品中 目的基因的濃度進行校正。每份樣品目的基因的校正濃度除以非轉化對照根中該目的 基因的校正濃度，則表示樣品對非轉化對照根的相對表達量，非轉化對照根的表達量 即為1。
通過研究，本發明中提供了一種實時螢光定量PCR測定長春花TIAs生物合成基 因表達量的方法。應用本發明的方法，具有快速、準確、靈敏度高、擴增汙染小等優 點，同時，同一樣本可同時分析TIAs生物合成途徑中多個目的基因的表達，大大節 約了成本。
5. 螢光定量PCR檢測轉基因長春花毛狀根中轉錄因子orca3及關鍵酶glOh的表
達
選取實施例3轉轉錄因子orca3及關鍵酶gl0h的長春花毛狀根中無性系，用非轉 化普通根作對照，用螢光定量PCR測定轉錄因子orca3及關鍵酶gl0h的表達量。轉 錄因子orca3和關鍵酶gl0h的表達量和TIAs含量比較，結果表明，非轉化對照根 glOh基因的表達量最低，TIAs含量最高的無性系G8中gl0h基因的表達量最高，是 空白轉化對照髮根的15.5倍。TIAs含量低的無性系G2中gl0h基因表達量是空白轉對照髮根的1.8倍。glOh基因的表達量與TIAs含量之間具有顯著的相關性 (y=3.39x-1.84，r2=0.95)。
Realtime-PCR result
g的6CKG1G2G3G6G8
orca33731.6757220768.9465.8
g10h17.267.929.7156130267
6.螢光定量PCR檢測轉基因長春花毛狀根中12個基因的表達 用螢光定量PCR技術測定實施例3轉轉錄因子orca3及關鍵酶gl0h的長春花毛狀 根中TIAs生物合成基因的表達情況，結果表明，orca3基因及gl0h基因導入長春花 毛狀根可誘導初級代謝中ggpps的表達，還可誘導次級代謝中gl0h、 tdc、 tdc、 sgd 和dat的表達。
本實施例採用螢光定量PCR技術測定轉基因長春花毛狀根中TIAs生物合成相關 基因的表達，通過基因表達量的高低可以初步篩選出TIAs高產的長春花毛狀根。
實施例5.利用HPLC測定轉基因長春花毛狀根中TIAs含量
1. 毛狀根液體培養
選取實施例3中生長迅速的長春花毛狀根無性系，在超淨工作檯上取出毛狀根培 養物，無菌水衝洗掉瓊脂後，用無菌濾紙吸乾表面水分，將毛狀根切成約5cm長的 根段，放入裝有30mLl/2MS液體培養基的150mL三角瓶中，起始接種量為0.5-1.0 g鮮重/瓶。將培養瓶置於轉速為120rpm的旋轉式搖床上，於25'C黑暗下振蕩培養。 每隔3d隨機抽取毛狀根培養物5瓶，用濾紙吸乾毛狀根表面水分後，稱取鮮重，並 計算毛狀根培養物的鮮重增值倍數。
2. 色譜條件及系統適用性以及標準溶液的配製
色譜柱C-18反相矽膠柱(Di咖onsilC18， 5 pm， 250x4.6 mm， DIKMA)。長春鹼、 長春質鹼的洗脫劑為乙腈5mMNa2HP04緩衝液(用H3PO調節pH至6)。流動項 條件為:0-20min梯度洗脫60:40(v/v)到50:50(v/v);20-33min常液洗 脫，50:50(v/v);33-45min常液洗脫，60:40(v/v)。檢測波長210腿。柱溫35"C,流速1.0 mL/min，進樣量10 jiL，靈敏度(AUFS-l.O)，理論塔板數按長春鹼、長春質鹼計算不低於2000。
阿嗎鹼的的洗脫劑為水(用H3PO調節pH至2.03):乙腈。流動項條件為0-10min 梯度洗脫95:5(v/v)到80: 20(v/v)，0-40min常液洗脫80:20(v/v);45-55min常液洗脫95: 5(v/v)。檢測波長238nm。柱溫35'C,流速1.0mL/mm,進樣量10 ^L，靈敏度 (AUFS-l.O)，理論塔板數按阿嗎鹼峰計算不低於2000。
3.標準曲線的製作
將所述對照品溶液分別稀釋1、 2、 5、 10倍，在相應色譜條件下進樣，記錄圖譜 及色譜參數，分別以峰面積(Y)對標準品濃度(X，mg/L)進行回歸分析。通過研究，本 發明中長春鹼在2.5-25 mg/L、長春質鹼在2.5-25 mg/L、阿嗎鹼在2.5-25 mg/L範圍 內呈現良好的線性關係。長春鹼、長春質鹼和阿嗎鹼對照品的線性回歸方程分別為-
Yvinblastine=44.278X-30.322r=0.9972
Ycatharanthine=40.649X+24.094r=0.9974
Yajmalicine=44.262X-29.476r=0.9971
4.樣品的製備和TIAs含量的測定
收集所述液體培養30d的長春花轉基因毛狀根，用濾紙吸乾表面培養基，稱取鮮 重，於6(TC烘乾48h至恆重，稱其乾重。將毛狀根放入研缽中，加入少量石英砂， 研磨，加入95%乙醇(1:5, W/V)， 50'C超聲提取30min，冷卻至室溫，對提取液離 心(12，000rpm) 10min，吸取上清液，於12,000 rpm再離心10 min，吸取上清液， 用HPLC法測量TIAs含量。
在本發明中轉orca3基因和glOh基因顯著提高長春花毛狀根TIAs含量。轉orca3 基因及glOh基因的長春花毛狀根中長春鹼、長春質鹼和阿嗎鹼的平均含量分別為 1.324mg/gDW、 0.196mg/gDW和0.872mg/g DW，是空白轉化髮根的4.01倍、0.7倍 和3.75倍(0.329mg/g DW長春鹼、0.249 mg/g DW長春質鹼和0.233 mg/g DW阿嗎鹼)。 轉orca3基因及glOh基因毛狀根總TIAs含量為2.392mg/g DW，是空白轉化髮根的 2.9倍(0.812 mg/g DW)。在所測試的轉orca3基因及glOh長春花毛狀根無性系中， G8中TIAs含量最高(4.315 mg/g DW)。
本實施例採用HPLC法測定了轉基因長春花毛狀根TIAs含量，採用轉orca3基因及glOh基因的代謝工程策略獲得了 TIAs高產的長春花毛狀根，證明了本發明的可 行性，為利用生物工程技術調節植物代謝產物含量提供了一種新的方法
技術領域：
本發明的範圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只欲作為闡明本發明 各個方面的單個例子，本發明範圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本 文所述的內容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發明的 多種改進。所述改進也落入所附權利要求書的範圍之內。序列表
上海海泰藥業有限公司
—種植物重組表達載體及其包含該載體的轉化體
2008-05-18
3
Patentln version 3.1
1
1494
DNA
長春花(Catharanthus roseus)

柳tctatggattaccttaccataatattaactttactatttgccttgactctctatg肌60
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1權利要求
1.一種植物重組表達載體，包含轉錄因子、啟動子和關鍵酶基因的的融合序列，所述的啟動子為包含對轉錄因子特異響應元件的啟動子。
2. 如權利要求1所述的植物重組表達載體，其特徵在於所述啟動子可為 組成型、誘導型或組織特異性表達啟動子。
3. 如權利要求1所述的植物重組表達載體，其特徵在於所述啟動子為帶 有jere元件的啟動子。
4. 如權利要求3所述的植物重組表達載體，其特徵在於所述啟動子為tdc 啟動子。
5. 如權利要求1所述的植物重組表達載體，其特徵在於所述轉錄激活因 子可為orca2、 orca3、 PAP1、 PAP2、 0SB1、 TTG1、 anl、 an2、 anll、 jafl3、 del、 antl、 Lc、 TT16、 B、 Sn、 Hopi、 Cl、 Pl、 ANL2、 TTG2、 ttl、 tt2、 CPRF、 Ntliml、 MybA中之一。
6. 如權利要求1所述的植物重組表達載體，其特徵在於所述轉錄激活因 子為具有與orca3相同或相似功能的所有具有DNA結合蛋白區AP2結構域和轉錄激活結構域的轉錄激活因子。
7. 如權利要求6所述的植物重組表達載體，其特徵在於所述轉錄激活因 子為orca3。
8. 如權利要求l所述的植物重組表達載體，其特徵在於所述關鍵酶基因 可包括一個目的基因或多個相同或不同的目的基因。
9. 如權利要求1所述的植物重組表達載體，其特徵在於所述關鍵酶基因 為gl0h基因，該基因具有SEQ1DNO. 1所述的序列。
10. 如權利要求l所述的植物重組表達載體，其特徵在於所述植物重組 表達載體可含有篩選標記。
11. 如權利要求l所述的植物重組表達載體，其特徵在於所述篩選標記 為潮黴素(hygromicin)和卡鈉黴素(kanamycin)。
12. —種包含1-ll任一項所述植物重組表達載體的轉化體。
全文摘要
一種植物重組表達載體，屬於基因工程技術領域，其特徵在於，所提供的植物重組表達載體，包含轉錄因子、啟動子和關鍵酶基因的的融合序列，所述的啟動子為包含對轉錄因子特異響應元件的啟動子。所述啟動子可為組成型、誘導型或組織特異性表達啟動子，優選為帶有jere元件的啟動子，最優選為tdc啟動子。提供包含上述植物重組表達載體的轉化體。其中轉化體的製備方法，包括以下步驟製備植物重組表達載體；轉化植物材料；篩選轉基因植物材料。
文檔編號C12N15/82GK101613713SQ200810039590
公開日2009年12月30日 申請日期2008年6月26日 優先權日2008年6月26日
發明者唐克軒, 宇 孫, 磊 張, 平 方, 瑩 肖, 鵬 邸, 陳軍峰, 龔一富 申請人:上海海泰藥業有限公司;中國人民解放軍第二軍醫大學