利用植物病毒密碼子偏愛性設計用於在植物中的多肽表達的核酸分子的方法和組合物的製作方法
2023-09-23 09:08:45
專利名稱：：利用植物病毒密碼子偏愛性設計用於在植物中的多肽表達的核酸分子的方法和組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及設計核酸的方法以提高植物中所編碼的多肽的表達。因此，被表達的核酸分子的至少一個密碼子將被更改為另一種密碼子，其具有的在植物病毒中的密碼子使用頻率將比為更改的密碼子要高。優選的是，與由未被改變的核酸分子所編碼的多肽相比，本發明的核酸分子將提高所編碼的多肽的表達。在一個實施方式中，故更改的密碼子已改變為在植物病毒中的密碼子使用頻率大於0.09的密碼子。在另一個實施方式中，淨皮更改的密碼子已被改變為另一種密碼子，其具有的在植物病毒中的密碼子使用頻率等於或者大於由被更改的密碼子所編碼的特定胺基酸的密碼子使用頻率中值。該密碼子使用頻率中值是在植物病毒中對特定胺基酸進行編碼的所有密碼子的密碼子使用頻率的中值。在優選實施方式中，所編碼的多肽影響所述植物的表型。在具體實施方式中，所述被編碼的多肽是殺蟲性多肽，包括但不限制於來自蘇雲金桿菌的437N和Cry多肽以及來自米根黴殺蟲性脂肪酶多肽。本發明還涵蓋含有本發明的方法所製造的核酸分子的載體、宿主細胞、轉基因植物及其後代。本發明進一步涉及被轉化植物的植物繁殖材料，包括但不限制於種子、塊莖、球莖、鱗莖、葉子以及根和芽的切割部分。圖1A~1B顯示了抵抗歐洲玉米螟的葉圓盤試驗的結果。用密碼子經最優化的蘇雲金桿菌殺蟲性多肽473N轉化的calli的葉圓盤與歐洲玉米螟幼蟲一同溫育48小時。還包括來自非轉基因植物的對照葉圓盤以比較葉消耗量。(A)在對照孔中的葉圓盤被完全消耗僅殘餘下葉圓盤曾放置其上的過濾紙圓盤(見第1行)。用密碼子經最優化的473N轉化的葉圓盤僅被消耗很少(見第2行)。(B)其他具有用密碼子經最優化的473N的轉化事例顯示非常少的葉消耗。圖2顯示用密碼子經最優化的蘇雲金桿菌殺蟲性多肽473N轉化的植物的免疫印跡分析。採用抗-473N抗體對轉基因植物多肽提取物進行免疫印跡分析。重組純化473N顯示在道1中。對照非轉基因植物樣品顯示與轉基因樣品相同的非-437N交叉反應性帶。在葉圓盤測試中顯示了有效性的事例的樣品中，存在對應於437N的帶(道2、3、4和7)。圖3顯示用來自米根黴的密碼子經最優化的殺蟲性脂肪酶轉化的植物的免疫印跡分析。用抗Rolipase抗體對來自於(A)葉組織和(B)根組織的轉基因植物多肽提取物進行免疫印跡分析。純化重組Rolipase前體蛋白(ROL,42kD)在免疫印跡分析中保溫作為正對照。在根培育林分析中為正反應的植物中觀察到與成熟Rolipase(31kD)對應的帶(道1~6)。具體實施方式生物系統在確定指定類型的胺基酸的特定密碼子的使用中顯示出特徵性的使用頻率(即密碼子使用頻率)。所述密碼子頻率在物種間可顯著不同，此現象已知為"密碼子偏好"。密碼子偏好的物種差異可能歸因於遺傳密碼的兼併，並已很好地記錄在密碼子使用頻率表的形式中。特定核酸分子的密碼子偏好很大程度上將決定所編碼的多肽在特定類型的細胞內表達的效率。密碼子偏好對表達效率的影響是轉基因表達非常重要的考慮。在將作為表達宿主的物種內不經常使用的含有許多密碼子的mRNA序列不太可能有效地進行翻譯。相反，由宿主生物體頻繁使用的密碼子構成的mRNA序列4艮可能高效地進行翻譯。本發明涉及設計核酸分子的方法以提高所編碼的多肽在植物中的表達，所述方法通過構建其密碼子偏好於在植物病毒的核酸分子編碼序列中頻繁使用的密碼子的核酸分子實現核酸分子的設計。已知的高效利用植物宿主翻譯機制的植物病毒的密碼子偏好對比原生植物宿主染色體序列的密碼子偏好更可能是植物宿主翻譯優選性的反映。因此，被表達的核酸分子的至少一個密碼子被更改為另一種密碼子，其具有在植物病毒、植物病毒組或源自其的一組核酸分子中比未更改的密碼子更高的使用頻率。優選的是，與由未被改變的核酸分子所編碼的多肽相比，本發明的核酸分子將提高所編碼的多肽的表達。本發明的方法包括生成來自感興趣的植物病毒、植物病毒組或源自其的一組核酸分子的密碼子使用頻率表以確定在植物病毒中高使用頻率的密碼子。這些高使用頻率密碼子可用於替代將在植物中進行表達的核酸分子中存在的低使用頻率密碼子。在所述替代中用到的具有更高使用頻率的密碼子被稱為"更改密碼子，，。具有至少一個更改密碼子的核酸分子及其編碼的多肽被稱之為"密碼子經最優化"的。對於核酸分子或多肽，並沒有要求所有或者大多數密碼子必須是更改密碼子才能稱為密碼子經最優化的分子。確定密碼子使用頻率為改變核酸分子使得被更改的密碼子是那些具有在植物病毒中較高使用頻率的密碼子，必須首先決定所述植物病毒的密碼子使用頻率。在一個實施方式中，所述密碼子使用頻率是基於由所述病毒核酸分子所編碼的所有多肽。在另一個實施方式中，所述密碼子使用頻率是基於由所述病毒核酸分子所編碼的功能相近的一部分多肽(例如，外殼多肽、轉錄或翻譯機制多肽、膜多肽等)。所述密碼子使用頻率可基於一種植物病毒或多種植物病毒。在採用多種植物病毒計算密碼子使用頻率的實施方式中，所述病毒優選感染相同類型的植物(例如單子葉、雙子葉、玉米、大豆等)根據以下方法計算核酸分子編碼序列的密碼子使用頻率。首先，通過計算在一個或多個核酸分子編碼序列中的出現確定編碼特定類型的胺基酸的所有密碼子(或終止密碼子)的總數。其次，確定同一核酸分子編碼序列的每種編碼特定胺基酸的密碼子(或終止密碼子)的出現總數。再三，將該密碼子出現總次數除以與該密碼子編碼相同類型的胺基酸的密碼子出現的總次數從而確定每種密碼子的密碼子使用頻率。在節5丄1、5丄2和5.2中披露的表格可用於選擇密碼子作為更改密碼子。作為另外一種選擇，有經驗的技術人員可採用此處描述的方法對感興趣的病毒生成截然不同的表格。單子葉植物病毒密碼子偏好在一些實施方式中，感染單子葉植物的一種病毒或多種病毒被用於生成密碼子使用頻率。作為非限制性實施例，為來自單子葉植物病毒的173個核酸分子編碼序列確定了單子葉植物病毒密碼子使用頻率(列子表l中)。如表2所示，所使用的序列包括由從表l中列出的單子葉病毒的核酸分子編碼序列確定的密碼子使用頻率。在表2中列出的單子葉植物病毒密碼子使用頻率可用於指導密碼子的選擇以用於設計對在植物中進行表達的多肽進行編碼的具有植物病毒密碼子偏好的核酸分子。病毒序列可得自任何來源，例如Genbank和NCBI分類資料庫(NCBItaxonomydatabase)。如果由含有更改密碼子的核酸分子編碼的多肽需要在單子葉植物中表達，優選為使用感染單子葉植物的植物病毒生成所述密碼子使用頻率(例如在表2中所列)。表1:單子葉植物病毒和來自用於密碼子使用頻率計算的每種病毒的序列數tableseeoriginaldocumentpage18tableseeoriginaldocumentpage19tableseeoriginaldocumentpage20在具體實施方式中，密碼子使用頻率是基於單子葉植物病毒或者感染特定單子葉植物類型(例如，玉米)的病毒。在一個具體實施方式中，利用來自玉米病毒的核酸分子編碼序列計算密碼子使用頻率，其中所述核酸分子具有以下登記編號CAA68570、CAA68567、CAA68566、CAA68568、CAA68569、CAA12314、CAA12315、CAA12316、CAA12317、CAA12318、CAA12319、CAA12320,NP—115454、NP—115455、AAB22541、AAB22542、AAB26111、AAP80680、AAP80681、AAA46635、AAA46636、AAA46637、NP—569138、NP—619717、NP—619718、NP—619719、NP619720、NP—619721、NP—619722、AAB50194、AAB50195、CAA39227和CAA39228(表3)。在另一具體實施方式中，對一種或多種來自玉米特異性病毒的一組核酸分子進行計算密碼子使用頻率。編碼玉米特異性病毒外殼多肽的核酸分子(具有編號CAA68566、AAP80681、AAA46637和NP—619722)用於生成表4。如果希望在玉米中表達由包含更改密碼子的核酸分子編碼的多肽，優選使用感染玉米的病毒以生成所述密碼子^f吏用頻率(例如在表3和4中)。表3:玉米特異性病毒密碼子使用頻率tableseeoriginaldocumentpage21頁表4:玉米特異性病毒衣殼/外殼多肽密碼子使用頻率tableseeoriginaldocumentpage22雙子葉植物病毒密碼子偏好在一些實施方式中，感染雙子葉植物的一種或多種植物病毒用於生成密碼子使用頻率。作為非限制性例子，由321種來自於雙子葉植物病毒的核酸分子編碼序列確定雙子葉植物病毒密碼子使用頻率(列在表5中)。表6顯示由列在表5中的所述雙子葉植物病毒的核酸分子解碼序列確定的密碼子使用頻率。列在表6中的雙子葉植物病毒密碼子使用頻率可用於指導密碼子的選擇以用於設計對在植物中進行表達的多肽進行編碼的具有植物病毒密碼子偏好的核酸分子。如果希望在雙子葉植物中表達由包含更改密碼子的核酸分子編碼的多肽，優選使用感染雙子葉植物的病毒以生成所述密碼子使用頻率(例如在表6中)。在一個具體實施方式中，由一種或多種雙子葉植物病毒的一組核酸分子計算密碼子使用頻率。來自大量不同的雙子葉植物病毒(列在表7中)的編碼外殼多肽的核酸分子用於生成表8。在另一個具體實施方式中，密碼子使用頻率是基於感染特定雙子葉植物類型(例如，大豆)的一種或多種雙子葉植物病毒。如果希望在特定類型的植物(例如大豆)中表達由包含更改密碼子的核酸分子編碼的多肽，優選使用感染所述類型植物的病毒(例如大豆特異性病毒)以生成所述密碼子使用頻率。表5:雙子葉植物病毒和來自用於密碼子使用頻率計算的每種病毒的序列數tableseeoriginaldocumentpage24tableseeoriginaldocumentpage25tableseeoriginaldocumentpage26表6:雙子葉植物病毒密碼子使用頻率tableseeoriginaldocumentpage27表7:雙子葉植物病毒和來自用於密碼子使用頻率計算的衣殼/外殼tableseeoriginaldocumentpage28草木樨壞死花葉病毒1菸草黃矮縮病毒1西紅柿金花葉病毒1西紅柿巻葉馬裡病毒1西紅柿斑駁泰諾病毒1西紅柿斑馬爻病毒1Tomatospottedwiltvirus1西紅柿黃巻葉中國病毒1西紅柿黃葉巻曲病毒北碧府病毒-[泰國Kan2]1西紅柿黃巻葉馬4i加病毒1西紅柿黃巻葉病毒蕪菁皺縮病毒1西紅柿金花葉病毒1表8:雙子葉植物病毒衣殼/外殼多肽密碼子使用頻率tableseeoriginaldocumentpage30密碼子選擇標準—定對於特定病毒、病毒組，或源自其的一組核酸分子計算了密碼子使用頻率，可利用多種標準選擇密碼子作為更改密碼子。應當理解還有其他並非基於密碼子使用頻率的條件能影響所述核酸分子的最終設計(參見節5.3)。提高的頻率值標準在一種實施方式中，相比在祐沒計的核酸分子中的密碼子，在用於創建所述密碼子使用頻率表的一種或多種植物病毒或源自其的一組核酸分子中具有更高使用頻率的任何密碼子闢皮選作更改密碼子。例如，根據本發明的植物病毒密碼子偏好法進行設計的核酸分子含有由GCG密碼子編碼的丙氨酸，該密碼子能被更改為在病毒中使用更頻繁的密碼子。例如，利用表2，本領域技術人員能夠看出丙氨酸的其他三種密碼子(例如，GCA、GCC或GCT)中的任一種在植物病毒中使用的更加頻繁，因此可用作更改密碼子。應當理解的是並非必須選4李在植物病毒中使用最頻繁的密碼子作為所述更改密碼子。更準確地是，僅僅要求所述更改密碼子相比在所述核酸分子中原先存在的密碼子，在所述一種或多種植物病毒，或源自其的核酸分子中具有更高的使用頻率。中值標準在其他實施方式中，更改密碼子在用於創建所述密碼子使用頻率表的一種或多種植物病毒或源自其的一組核酸分子中具有的密碼子使用頻率等於或大於對於該特定胺基酸的密碼子使用頻率的中值。對於指定類型的胺基酸的密碼子使用頻率的中值可通過首先將對所述特定胺基酸的所有密碼子按使用最頻繁至使用最不頻繁進行排序而確定。對於其中有偶數個密碼子對特定類型的胺基酸進行編碼的時候，所述密碼子使用頻率中值是比其使用更頻繁的密碼子數目和比其使用更不頻繁的密碼子數目相同的那一個。例如，異亮氨酸由三個密碼子編碼。為找出密碼子使用頻率的中值，將找出比其使用更頻繁的密碼子數目和比其使用更不頻繁的密碼子數目相同的那個密碼子(在該情況下，當使用在表2中所列的頻率時為ATA)。當設計核酸分子時，可選擇對於異亮氨酸使用頻率為0.3或0.3以上的更改密碼子。對於其中由偶數個密碼子對特定類型的胺基酸進行編碼的情況下，所述密碼子使用頻率中值是比其使用更頻繁的密碼子數目和比其使用更不頻繁的密碼子數目相同的兩個密碼子的密碼子使用頻率的中值。例如，丙氨酸由四種密碼子編碼。為找出密碼子使用頻率的中值，將所述密碼子按照使用最頻繁至使用最不頻繁進行排序(在該情況下，使用表2中所列的頻率時為GCT、GCA、GCC、GCG)。由於GCA和GCC具有相同數目的比其使用更頻繁的密碼子和比其使用更不頻繁的密碼子，它們的頻率值的平均值是所述密碼子使用頻率中值(即0.31和0.21的平均值是0.26)。當設計核酸分子時，可以選擇對於丙氨酸使用頻率為0.26或0.26以上的更改密碼子。該方法偏好於使所述核酸分子編碼序列採用在植物病毒核酸分子編碼序列中更頻繁使用的密碼子，儘管並非必須是最頻繁使用的密碼子，同時儘可能不使用較不頻繁的密碼子(即那些密碼子使用頻率在特定胺基酸的密碼子使用頻率中值以下的密碼子)表9顯示列在表2中的單子葉才直物病毒密碼子4吏用頻率的中值，以及對於每種類型的胺基酸而言，根據其使用頻率滿足該標準的密碼子。表10顯示列在表3中的玉米特異性病毒密碼子使用頻率的中值，以及對於每種類型的胺基酸而言，根據其使用頻率滿足該標準的密碼子。表11顯示列在表4中的玉米特異性病毒外殼/衣殼多肽密碼子使用頻率的中值，以及對於每種類型的胺基酸而言，根據其使用頻率滿足該標準的密碼子。表12顯示列在表6中的雙子葉植物病毒密碼子使用頻率的中值，以及對於每種類型的胺基酸而言，根據其使用頻率滿足該標準的密碼子。表13顯示列在表6中的雙子葉植物病毒外殼/衣殼多肽密碼子使用頻率的中值，以及對於每種類型的胺基酸而言，根據其使用頻率滿足該標準的密碼錶9:根據單子葉植物病毒密碼子使用頻率中值的可能可選擇的密碼子tableseeoriginaldocumentpage33tableseeoriginaldocumentpage34表10:根據玉米特異性病毒密碼子使用頻率中值可能可選擇的密碼子tableseeoriginaldocumentpage34tableseeoriginaldocumentpage35表11:根據玉米特異性病毒外殼/衣殼多肽密碼子使用頻率中值可能可選擇的密碼子tableseeoriginaldocumentpage36tableseeoriginaldocumentpage37表12:根據雙子葉植物病毒密碼子使用頻率中值可能可選擇的密碼子胺基酸密碼子雙子葉糹直物病毒密碼子頻率雙子葉植物病毒中值可供選擇的密碼子tableseeoriginaldocumentpage37tableseeoriginaldocumentpage38表13:根據雙子葉植物病毒外殼/衣殼多肽密碼子使用頻率中值可能可選擇的密碼子tableseeoriginaldocumentpage39tableseeoriginaldocumentpage40頻率匹配標準在另一實施方式中，更改密碼子可經選擇使得所得包含更改密碼子的核酸分子具有的特定類型的胺基酸的使用頻率與在所述用於創建所述密碼子使用頻率表的一種或多種植物病毒，或源自其的一組核酸分子中的該胺基酸的密碼子使用頻率相同或者基本相似(例如諸如在表2、3、4、6或8所示)。例如，根據本發明的方法"^殳計的核酸分子可包括更改密碼子使得特定的胺基酸(例如甘氨酸)全部由其頻率與植物病毒密碼子使用頻率類似或者基本類似的密碼子所編碼(例如，使用表2,甘氨酸分別由GGA、GGT、GGC、GGG以0.37、0.28、0.20和0.14的頻率進行編碼)。對於一種或多種類型的胺基酸，密碼子使用頻率可按此方式與所述用於創建所述密碼子使用頻率表的一種或多種植物病毒，或源自其的一組核酸分子中的密碼子使用頻率相匹配。任何多種類型的胺基酸可更改為與植物病毒密碼子頻率相同或者基本相似。在具體實施方式中，至少2種類型的胺基酸、至少5種類型的胺基酸、至少8種類型的胺基酸、至少12種類型的胺基酸、至少18種類型的氨基或者所有20種類型的生物存在胺基酸可由與在一種或多種植物病毒，或源自其的一組核酸分子中的頻率相似或基本相似的密碼子進^f亍編碼。最小閾值標準在另一實施方式中，在所述用於創建所述密碼子使用頻率表的一種或多種植物病毒，或源自其的一組核酸分子中的使用頻率為0.09或0.09以下的植物病毒密碼子^^去掉不可選作更改密碼子。經考慮該步驟去掉在植物病毒中使用頻率太低(0.09或0.09以下)而不可能在植物中有效翻譯的密碼子。任何具有0.09以上的使用頻率的對相同胺基酸進行編碼的密碼子可用作更改密碼子以取代低頻率密碼子。在具體實施方式中，餘下的使用頻率高於0.09的密碼子以保持餘下的密碼子的比例性的方式進行替代。表14顯示單子葉植物病毒的密碼子使用頻率，其中對於每種胺基酸類型，頻率在0.09或0.09以下(根據表2)的密碼子已被去掉，而餘下的密碼子已成比例地進行調整。表15顯示玉米特異性病毒的密碼子使用頻率，其中對於每種胺基酸類型，頻率在0.09或0.09以下(根據表4)的密碼子已被去掉，而餘下的密碼子已成比例地進行調整。表16顯示雙子葉植物病毒的密碼子使用頻率，其中對於每種胺基酸類型，頻率在0.09或0.09以下的密碼子(根據表6)已被去掉，而餘下的密碼子已成比例地進行調整。表16顯示雙子葉植物病毒外殼/衣殼多肽的密碼子〗吏用頻率，其中對於每種胺基酸類型，頻率在0.09或0.09以下的密碼子(根據表8)已被去掉，而餘下的密碼子已成比例地進行調整。例如，在表14中，對於胺基酸精氨酸，有一個密碼子CGG,其原始密碼子使用頻率不大於0.09。因此CGG的密碼子使用頻率被設為0.00，而所述值0.09則在餘下的密碼子AGA、AGG、CGA、CGC和CGT的頻率之間，根據顯示的它們的原始密碼子使用頻率進行重新分配。在表3中列出的玉米特異性病毒核酸分子編碼序列的所有密碼子使用頻率大於0.09,因此在所述0.09標準下，玉米特異性病毒核酸分子編碼序列的密碼子使用頻率保持相同。表14:在去掉使用頻率<0.09的密碼子和按比例調整餘下密碼子使用頻率之後的單子葉植物病毒密碼子使用頻率tableseeoriginaldocumentpage42tableseeoriginaldocumentpage43tableseeoriginaldocumentpage44tableseeoriginaldocumentpage45tableseeoriginaldocumentpage46表17:在去掉使用頻率《0.09的密碼子和按比例調整餘下密碼子使用頻率之後的雙子葉植物病毒衣殼/外殼密碼子使用頻率tableseeoriginaldocumentpage46tableseeoriginaldocumentpage47tableseeoriginaldocumentpage48中值閾值截止標準在另一實施方式中，在所述用於創建所述密碼子使用頻率表的一種或多種植物病毒，或源自其的一組核酸分子中的使用頻率小於密碼子使用頻率中值的植物病毒密碼子被去掉不可作為更改密碼子(使用頻率中值的計算參見節5.2.2)。對於特定胺基酸使用頻率等於或者大於所述中值的任何對相同胺基酸進行編碼的密碼子可用作更改密碼子以取代所述密碼子。在具體實施方式中，餘下的使用頻率等於或者大於所述中值的密碼子以保持餘下的密碼子之間的比例性的方式進行替代。表18顯示單子葉植物病毒的密碼子使用頻率，其中對於每種胺基酸類型，頻率在中值以下(根據表2)的密碼子已被去掉，而餘下的密碼子已成比例地進行調整。表19顯示玉米特異性病毒的密碼子使用頻率，其中對於每種胺基酸類型，頻率在中值以下(根據表3)的密碼子已被去掉，而餘下的密碼子已成比例地進行調整。表20顯示玉米特異性病毒外殼/衣殼多肽的密碼子使用頻率，其中對於每種胺基酸類型，頻率在中值以下(根據表4)的密碼子已被去掉，而餘下的密碼子已成比例地進行調整。表20顯示雙子葉植物病毒的密碼子使用頻率，其中對於每種胺基酸類型，頻率在中值以下(根據表6)的密碼子已被去掉，而餘下的密碼子已成比例地進行調整。表22顯示雙子葉植物病毒外殼/衣殼多肽的密碼子使用頻率，其中對於每種胺基酸類型，頻率在中值以下(根據表8)的密碼子已被去掉，而餘下的密碼子已成比例地進行調整。表18:在去掉使用頻率小於中值的密碼子和按比例調整餘下密碼子使用頻率之後的單子葉植物病毒密碼子使用頻率tableseeoriginaldocumentpage49tableseeoriginaldocumentpage50表19:在去掉使用頻率小於中值的密碼子和按比例調整餘下密碼子使用頻率之後的玉米病毒密碼子使用頻率tableseeoriginaldocumentpage50tableseeoriginaldocumentpage51tableseeoriginaldocumentpage52表20:在去掉使用頻率小於中值的密碼子和按比例調整餘下密碼子使用頻率之後的玉米病毒衣殼/外殼密碼子使用頻率tableseeoriginaldocumentpage52tableseeoriginaldocumentpage53表21:在去掉使用頻率小於中值的密碼子和按比例調整餘下密碼子使用頻率之後的雙子葉植物病毒密碼子使用頻率tableseeoriginaldocumentpage54tableseeoriginaldocumentpage55表22:在去掉使用頻率小於中值的密碼子和按比例調整餘下密碼子使用頻率之後的雙子葉植物病毒衣殼/外殼密碼子使用頻率tableseeoriginaldocumentpage55tableseeoriginaldocumentpage56基於非植物病毒密碼子偏好的修飾在根據本發明設計植物病毒密碼子偏好的核酸分子編碼序列中，在根據上述標準選擇密碼子之後，可進行其他核苷酸序列修飾以l)減少所述核酸分子所具有的不利的特性和/或il)進一步提高由植物病毒密碼子偏好的核酸分子編碼序列編碼的多肽的表達。因此，雖然由於以下考慮採用本發明的方法所設計的核酸分子並不包括所有經優化的密碼子，但其仍富含與在未更改的核酸分子中相比在植物病毒中使用更加頻繁的密碼子。優選為，所述基於非密碼子偏好的修飾不改變任何由所述核酸分子編碼的胺基酸。在由於所述核酸分子中基於非密碼子偏好的修飾而改變胺基酸的實施方式中，這樣的更改應優選至少保留原始胺基酸的一些性質(例如電荷、尺寸等)。在一個實施方式中，Kozakcontext發生變化。所述Kozakcontext是在起始密碼子ATG附近的核苷酸序列。在玉米和許多穀物中，優選的Kozakcontext是ATGG。所述核酸分子編碼序列的第四個鹼基是由所編碼的第二個胺基酸所指示。如果已經存在，則無需變化。然而如果不存在，為新建ATGGKozakcontext(Kozak優化)則要求改變第二胺基酸。在多肽中，這發生在N端，例如將其N-端的轉運肽移除，這將不影響成熟多肽的功能。將所述第二個胺基酸更改為密碼子由G開頭並且在這些密碼子由G開頭的胺基酸中與之化學上最相似的胺基酸則是優選的方案，然而，在其中第二個胺基酸被更改的實施例中，重要的是確保所述多肽保留關鍵性質(例如酶活性、抗原性等)。在另一實施方式中，由加入更改密碼子產生的類似內含子的序列被廢棄。在選擇用於植物病毒密碼子偏好核酸分子編碼序列的密碼子時，可能不利地引入一個或多個潛在的功能性內含子序列。所編碼的轉錄產物在細胞中表達時，這些內含子可能被排除在外，導致一部分編碼區域的內部缺失或者閱讀框架的移動。結果，所希望的是去掉任何高度類似於內含子的位點。內含子移接供體位點通常遵從GT-AG規則。在指定的核酸分子編碼序列，可存在很多GT和AG位點，因此有許多潛在的內含子。然而，不是所有這些GT-AG組合都表現為功能性的內含子。已開發出採用精密複雜的試探法的基因預測軟體以判定是否有任何潛在的GT-AG組合代表著可能的內含子移接供體位點。例如參見BrendelWa/.(2004)Bzo/"/c^ma"(^.20(7):1157-69;Hermannef〃/.(1996)AW.Jc^y腦.24(23):4709-4718;Brendel"(1998)AW.jc油M26(20):4748-4757;Usuka"a/.(2000)5她/畫ato16(3),203-211;Usuka"a/.(2000)J.A/o/.Bio/.297(5):1075-1085，以引用的方式在此處引入。程序例如GeneSeqr特別有用。GeneSeqr由ISU的VolkerBrendel開發。所述GeneSeqr程序的輸出指出在所述核酸分子編碼序列中是否有任何高度可能的內含子位點。有關所述GeneS叫r程序的信息及其輸出的解釋可在本領域內找到「辦如SchlueterWa/.，2003,Nucl.AddsRes.31:3597-3600)。另一個可用於該目的的程序是FgenesH。通過使用一個以上的程序可更大可能地除掉所有隱蔽的移接位點。可通過改變內含子邊界的GT或AG序列從而去掉這些潛在的內含子。如果可能，這可在不影響胺基酸使用的情況下完成。另一個影響移除這些隱蔽移接位點的方法是改變在所推定的隱蔽移接位點邊界的推定內含子一側的邊界核普酸。在另一實施方式中，對推定的聚腺苷酸化信號進行編碼的序列被改變以防止在所述核酸分子編碼序列內的假聚腺普酸化。這樣的位點包括以下序列AATAAA、ATAAAA和AATAAT。在另一實施方式中，二級RNA結構;波減少或者消除。形成發卡RNA結構的轉錄物更可能成為降解和/或tmnslationalarrest的目標。因此，希望將所述核酸分子編碼序列經二級RNA結構預測程序處用任何在本領域內已知的RNA二級結構預測程序。通常使用的一個程序是GCG威斯康星打包程序(GCGWisconsinpackageprogmm)STEMLOOP。該程序是理想的，因為它將stem-loop結構按照形成二級結構可能性從高到低進行排列(基本按照長度和性質)，並且給出其在序列中的坐標。在輸出結果中，可找出任何完美預測的具有非同尋常的長度和高質量的RNA結構。這些RNA結構通過通常在密碼子的第三個位置("wobble"位置)進行的鹼基變化被破壞，但不改變胺基酸序列。在另一實施方式中，降低RNA穩定性的序列被改變。已知某些基序使mRNA不穩定，因此將被挑出並儘可能地去掉。在具體實施方式中，"AUUUA"序列導致mRNA降解速率提高。同樣，將檢查本發明的植物病毒密碼子偏好核酸分子編碼序列尋找任何的"ATTTA"序列，並儘可能地對其進行更改而不改變胺基酸序列。在另一具體實施方式中，"下遊元素"(DST)mRNA不穩定化位點的存在可使mRNA轉錄物傾向於降解或高turnover。所述DST元素跟隨常見序列式樣ATAGAT-N(15)-GTA。序列式樣ATAGAT-N(10-20)-GTA後跟隨的序列可一皮去掉。在另一具體實施方式中，長的聚-A或聚-T序列可使mRNA不穩定。因此，一個核苷酸的長序列，尤其是A或T的長序列將被改變。同一核苷酸的三個或三個以上的延伸序列被找出並緩解該情況，然而，更優選的是改變四個或四個以上的延伸序列。此外，富含AT序列的延伸序列也可一皮改變。在另一實施方式中，所述核酸分子經修飾使得感興趣的多肽是由所述核苷酸分子表達的唯一多肽。希望的是轉基因僅僅從開放解讀碼組(ORF)中表達所希望的基因產品，這將是組1翻譯。由任一其他5組翻譯得到的假多肽產品是不希望的，因此本發明的核酸分子將被改變使得假ORF翻譯的可能性降低。利用本發明的方法設計的核酸分子經6-組ORF預測分析。在不用於編碼多肽的五組中的ORF的長度得以測量。這些ORF,尤其是具有潛在的甲硫氨酸起始密碼子(即與Kozak適合序列相近)的ORF,以及在組2和3中特別長(例如超過50~100個密碼子或者任何希望的截止闊值)的ORF將通過引入終止密碼子或者去掉潛在的起始密碼子被縮短。在另一實施方式中，限制性酶識別位點可4皮加入到所述核酸分子中。密碼子偏好核酸分子的設計本發明包括根據本發明的方法設計的核酸分子。對在植物中進行表達的感興趣的多肽進行編碼的核酸分子可根據本發明的方法進行設計以提高表達。一旦對於感興趣的特定病毒、病毒組或源自其的一組核酸分子建立起密碼子使用頻率表，原先在所述核酸分子中存在的密碼子可對比植物病毒對其頻率進行評估。節5.2的標準可用以選擇哪一個密碼子能被改變，哪一個密碼子可用於對其進行取代(例如更改密碼子)。相對於未更改的(原始)核酸分子，含有更改密碼子的核酸分子包括5%、10%、20%、30%、50%、75%、85%、95%的更改密碼子。然而，密碼子使用頻率並非進行核酸分子修改的唯一標準(見節5.3)。所述核酸分子中的任何密碼子都可^L在植物病毒中具有更高使用頻率的更改密碼子進行替換。在一些實施方式中，所述更改密碼子是"前置"的，即在所述核酸分子的第一部份中的更改密碼子的數目比第二部份多，其中所述第一部份在所述第二部分的5，一側。在更具體的實施方式中，所述核酸分子的第一部分和第二部分是相等的，因此在所述核酸分子的5，側的一半有更多的更改密碼子。在另一具體實施方式中，所述第一部分為所述核酸分子的三分之一，而含有與佔所述核酸分子三分之二的第二部分相等或者更多的更改密碼子。因此，所述核酸分子的5，端的三分之一部分含有與3，端的三分之二部分相等或者更多的更改密碼子。在另一具體實施方式中，所述第一部分為所述核酸分子的四分之一，並含有與佔核酸分子四分之三的第二部分相等或者更多的更改密碼子。因此，所述核酸分子的5，端的四分之一部分含有與3，端的四分之三部分相等或者更多的更改密碼子。優選為，含有更改密碼子的核酸分子對多肽進行編碼，所述多肽具有的序列與未更改的核酸分子所編碼的多肽的序列相同。在所述含有更改密碼子的核酸對與未更改的多肽的序列不相同的多肽進行編碼的實施方式中，被更改的胺基酸優選為保守取代。本領域技術人員已知的標準技術可用於分析在由於密碼子改變而含有胺基酸替代物的多肽和由為改變的核酸分子編碼的多肽之間在多肽功能上的任何差異。優選為，多肽功能沒有任何變化。然而，如果這些多肽具有基本相似的功能，則輕微的功能變化也是可以忍受的(例如在相互的一個標準偏差之內)。在具體實施方式中，本發明的核酸分子編碼殺蟲性多肽。在更具體的實施方式中，所述殺蟲性多肽來自于于蘇雲金桿菌05flc,〃MAw〃'"g/em/力或米根黴。在更具體的實施方式中，來自蘇雲金桿菌的殺蟲性多肽是437N和Cry多肽。在另一更具體的實施方式中，來自米根黴的殺蟲性多肽是殺蟲性脂肪酶多肽。本發明包括根據本發明的方法設計的核酸分子，其中包括但不限制於分別對密碼子優化的437N和殺蟲性脂肪酶進4亍編碼的SEQIDNO:l和3。由本發明的核酸分子編碼的多肽也包括在本發明中，其中包括但不限制於分別對密碼子優化的437N和殺蟲性脂肪酶進行編碼的SEQIDNO:2和4。本發明還包括的是含有根據本發明的方法製得的核酸分子的載體、宿主細胞、轉基因植物及其後代。本發明不包括對天然形成的核酸分子(例如天然發現的或者由非轉基因生物體的基因組表達的)進行編碼的核酸分子。本發明也不包括SEQIDNO:7~16的核酸分子。密碼子偏好核酸分子的構建由本領域中任何已知的方法可以得到根據本發明的方法改變的核酸分子，並確定其核苷酸序列。如此的核酸可由化學合成的寡聚核苷酸組裝而成(例如在Kutmeier"/，1994,5&7>c/z",々wes17:242中所述)，簡言之，其涉及的合成包括將含有對所述多肽進行編碼的序列的一部分的寡聚核普酸搭接，並將這些寡聚核苷酸退火和連接，然後通過PCR將這些連接的寡聚核苷酸擴增。作為另外一種選擇，也有由來自於適宜來源的核酸分子生成核酸分子。如果不能提供含有對特定多肽進行編碼的核酸分子的克隆，但所述多肽的序列是已知的，對所述多肽進行編碼的核酸分子可化學合成或者從合適的來源獲得(例如由表達所述感興趣的多肽的組織或細胞生成的cDNA庫，或者從中分離的核酸分子，優選為poly-A+RNA),這是通過使用能與所述序列的3'和5'端進行雜交的引物所進行的PCR增殖，或者通過克隆，所述克隆使用對特定序列具有特異性的寡聚核苷酸探針以例如從對所述感興趣的多肽進行編碼的cDNA中鑑別出cDNA克隆。隨後可以使用本領域內任何已知的方法將PCR產生的增殖核酸分子克隆進入可複製的克隆載體。—旦獲得核酸分子，可採用本領域內已知的核苷酸序列操作對其進行操作處理，例如重組DNA技術、定點突變、PCR等(例如參見在Sambrook""/'1990，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dEd.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY;Ausubele/1a/,eds.,1998,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY;美國專利第5,789,166號和第6,391,548號中描述的技術)以生成含有更改密碼子的核酸分子。本領域技術人員已知的標準技術可用於在核普酸序列或其片段中引入突變，例如定點突變和PCR調節的突變，從而將密碼子更改為在植物病毒中使用頻率更高的那些密碼子。優選為，相對於未更改(原始)的核酸分子，所述含有更改密碼子的核酸分子包括5%、10%、20%、30%、50%、75%、85%、95%的更改密碼子。優選為，含有更改密碼子的核酸分子對多肽進行編碼，所述多肽具有的序列與未更改的核酸分子所編碼的多肽的序列相同。在所述含有更改密碼子的核酸對與未更改的多肽的序列不相同的多肽進行編碼的實施方式中，被更改的胺基酸優選為保守取代。本領域技術人員已知的標準技術可用於分析在由於密碼子改變而含有胺基酸替代物的多肽和由為改變的核酸分子編碼的多肽之間在多肽功能上的任何差異。優選為，多肽功能沒有任何變化。然而，如果這些多肽具有基本相似的功能，則輕微的功能變化也是可以忍受的(例如在相互的一個標準偏差之內)。—旦設計並得到核酸分子，含有所述核酸分子的載體可通過採用本領域內已知技術的重組DNA技術進行製造。本領域內技術人員已知的方法可用於構建載體，包括表達載體，其中包含有含更改密碼子的核酸分子，所述載體與適當的轉錄和翻譯調控信號可操作地相連。在一些實施方式中，本發明的核酸分子在表達載體中。在其他實施方式中，本發明的核酸分子位於可助於集成入植物DNA之中的載體之中。含有本發明的核酸分子的載體也可包含能引發活終止轉錄和/或翻譯的區域。這些區域的元素可以是天然生成的(與植物宿主細胞或者是異源或者同源)或者合成的。在本發明的實踐中可使用大量啟動子。例如，本發明的核酸分子可以與在宿主有機體表達的組成型、組織優選的、誘導型或其他啟動子相結合。在一個實施方式中，所述啟動子是組成型啟動子，包括但不限制於Rsyn7的核心啟動子和其他在WO99/43838和美國專利第6,072,050號中披露的組成型啟動子；核心CaMV35S啟動子(OdellWa/.(1985)淑騰313:810-812);水稻肌動蛋白(McElroy"(1990)屍/朋Ce〃2:163-171);泛素(Chnstensenef(1989)屍/虛M/.編.12:619-632andChnstensen"a/.(1992)屍/aWA^/.Szo/.18:675-689);pEMU(Lasteto/.(1991)772eor.j/^/.Ge"W.81:581-588);MAS(Velteneto/.(1984)EMBa/.3:2723-2730);ALS啟動子(美國專利第5,659,026號)等。其他組成型啟動子包括例如在美國專利第5,608,149號；第5,608,144號；第5,604,121號；第5，569,597號；第5,466,785號；第5,399,680號；第5,268,463號；第5,608,142號和第6,177,611號中所討論的那些啟動子。在另一實施方式中，所述啟動子是誘導型啟動子，包括但不限制於損傷誘導型啟動子(諸如與例如馬鈴薯多肽抑制劑基因、wunl、wun2、winl、win2、系統素、WIP1、MPI基因相關的啟動子)；病原體誘導型啟動子(諸如與例如致病相關多肽、SAR多肽、beta-l,3-葡聚糖酶、殼多糖酶、PRms基因相關的那些啟動子(參見Redolfie^/.(1983)A^/z.屍/朋f屍"Ao/.89:245-254;Uknes"a/.(1992)屍/a加Ce〃4:645-656;andVanLoon(1985)屍&wA/o/.Fzra/.4:111-116,WO99/43819,Corderoeto/.(1992)屍/z",'o/.A/o/.屍/朋f屍a仇41:189-200,美國專利第5,750,386));化合物調節啟動子(諸如與例如玉米In2-2啟動子、玉米GST啟動子、菸草PR-la啟動子相關的那些啟動子(也參見Schena"/.(1991)屍roc.iVw/.U&488:10421-10425;McNeillseto/.(1998)屍/朋f丄14(2):247-257);Gatz"a/.(1991)A/o/.227:229-237，和美國專利第5,814,618號和第5,789,156號))。在另一實施方式中，所述啟動子是組織優選啟動子，包括但不限制於在Kawamata"a/.(1997)屍/a"fCe〃屍/z",。/.38(7):792-803;Hanseneto/.(1997)M/.G匿[254(3):337-343;Russell"a/.(1997)7>a/^ge/c6(2》157-168;RinehartWa/.(1996)屍/aw/1屍/zjas7'o/.112(3):1331-1341;VanCampWa/.(1996)屍/2少wo/.112(2):525-535;Canevascinie,a/.(1996)屍/a/7/屍Ajas7'o/.112(2):513-524;Yamamotoeta/.(1994)屍/a",Ce〃屍/^wo/.35(5):773-778;Lam(1994)尺^w/"iVo6/.Ce〃D,，20:181-196;Orozco她/.(1993)屍taM/腸/.23(6):1129-1138;Matsuoka"(1993)屍rac淑/.爿c^/.Sc,.園90(20):9586畫9590;和Guevara-GarciaWa/.(1993)屍/"W丄4(3):495-505中所描述的啟動子。在另一實施方式中，所述啟動子是組織特異性啟動子，包括但不限制於葉特異性啟動子(Yamamoto^a/.(1997)屍/"W丄12(2):255-265;Kwon"a/.(1994)屍/am1屍—o/.105:357-67;Yamamoto"a/.(1994)屍/a^Q〃屍/zj^,0/.35(5):773-778;GotorWa/.(1993)屍/aw/1丄3:509畫18;Orozco"a/.(1993)屍/",A/o/.Sz'o/.23(6):1129-1138;andMatsuokae,a/.(1993)Ato/.」c^/.U&490(20):9586-9590);才艮特異性啟動子(HireWa/.(1992)屍/aw,A/o/.S/o/.20(2):207-218,KellerandBaumgartner(1991)屍/a^Ce〃3(10):1051-1061,Sanger"(1990)屍/aw,A/o/.Ao/.14(3):433-443,Miao"a/.(1991)屍/耐Ce〃3(1):11-22,Bogusz"a/.(1990)屍/a^Q〃2(7):633-641,Kuster"a/.(1995)屍/a^A^/.29(4):759-772,Capanae.(1994)屍to編.腸/.25(4):681畫691,美國專利第5,837,876號；第5,750,386號；第5,633,363號；第5,459,252號；笫5,401，836號；第5,110,732號和第5,023,179號)；種子特異性啟動子(例如包括Ciml、cZ19Bl、肌醇-1磷酸酯合成酶、Gama-玉米蛋白、Glob-l、celA、菜豆p-菜豆蛋白、napin、p-伴大豆球蛋白、大豆凝血素、十字花科蛋白、玉米15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、27kDa玉米蛋白、g-玉米蛋白、waxy、shrunken1、shrunken2、和球蛋白1的啟動子(也參見Thompson"a/.(1989)Bzo&wa"10:108,WO00/12733，WO00/11177))。在另一實施方式中，所述啟動子是低水平表達啟動子卩辨如，引起約1/1000~約/100,000~約/500,000的轉錄物表達)，包括但不限制於WO99/43838,美國專利第6,072,050號;第美國專利第5,608,149號；第5，608,144號;第5,604,121號;第5,569,597號;第5,466,785號；第5,399,680號;第5,268,463號;第5，608,142號;和第6,177，611本發明的多肽採用本發明設計對多肽進行編碼的核酸分子可以在植物中表達本領域內已知的任何多肽。所述多肽可以是天然產生的，是天然產生的多肽的人工修飾物，是完全重新設計的多肽或者上述的組合。在優選實施方式中，由本發明的核酸分子編碼的多肽的表達改變表達所述多肽的植物的至少一個表型。在具體實施方式中，表達所述多肽的植物表型與對照植物相比發生變化。所述對照植物或者i)不含有和/或表達對感興趣的多肽進行編碼的核酸分子或者11)含有和/或表達不含有任何更改密碼子的對感興趣的多肽進行編碼的核酸分子。通過表達由本發明的核酸分子所編碼的多肽而改變的表型的例子包括但不限制於抗蟲性/耐蟲性(例如通過表達蘇雲金桿菌437N或Cry多肽或者根黴抗蟲性脂肪酶多肽)，抗病性/耐病性(例如通過表達Pps-AMP1)，抗線蟲性/耐線蟲性(例如通過表達cyclostine),抗旱性/耐旱性(例如通過表達IPT),耐鹽性、耐重金屬性和重金屬解毒性，抗除草劑性和耐除草劑性(例如通過表達草甘膦乙醯轉移酶或乙醯乳酸合成酶)，低肌醇六磷酸含量、高效氮利用、產率提高、提高的產量穩定性、改善的營養含量、提高的糖含量、提高生長和活力、改善的消化性、治療性多肽的表達、非多肽藥物的合成、選擇性標記多肽的表達(例如GAT),報導多肽的表達(例如GUS)和雄性不育。在具體實施方式中，由植物病毒密碼子偏好核酸分子編碼的殺蟲性多肽來自蘇雲金桿菌或^旅#。在更具體的實施方式中，所述蘇雲金桿菌殺蟲性多肽是437N或者CRY多肽。在另一更具體的實施方式中，所述^旅#多肽是殺蟲性脂肪酶多肽。植物採用本發明的方法設計的核酸分子可用於任何植物物種的轉化，包括但不限制於單子葉植物和雙子葉植物。感興趣的植物的例子包括j旦不限制於玉米fZ^mqy^、芸苔sp.「辦如,S.憩/叫5.ra戸，B,"ce力，尤其是那些用作植物油來源的芸莒，紫花苜蓿(Me^c'flgo加"va」,水稻fO，asa/7va」，黑麥(S"eca/ecerea/e,，高粱(^Sorg/z謂6z'co/or,5V屍g/mwvw/gare義粟(i"列A口^^珠粟(^屍ewwJWwmg/flwc'ww義小米fP顯/'cwm脂/zaceww」，穀子(^eton'aito/Zc^),fingermilletfE7e廳力ec'(9n2c'aq|j,向日蔡f7/e/z.(2/^/zw's1<2"ww^,鄉工花("C"rt/zawws/7wc/^n'w^，'J、麥(Tn',zcwmae、W/vwm),大豆fG(ycz力emax),步因草fV7co〃awato6acwm,，馬鈴薯fSo/twwm化6en^ww義花生(^n2c/n's/^/ogaea)，才帛花(UoMy/7/w附6ar6a(ie朋e，GtLwy//w附/z/rvw/^m,，衝樂才閭f"E7aez'5gw/wwew'^,亞麻fi/ww附wz'Wa/7557'wwm」，蓖麻(7/"力wscowwwm'^，瓜爾豆(^Aa附(3/7;7^w'cw/a,，小扁豆cw/Zwa/^,,葫,巴(Tn'gcwe〃acorm.c'w/a/^，甜馬鈴薯f7p謂oea6atoft^),木薯f^Wam./zo/1escw/ew/1^),叻口p非fCq^Teaspp.),鬥耶子(^Cocas1"wci/fera),蔽蘿f^"(2wtwcomc^w^，片甘橘(U"rw5spp.),可可豆(T77eo6廠o附(2cacao),茶(tTa附e〃/aw力e/M7、),香;^、fA/wsaspp.),逢f梨〈屍ewe〃amen'ctmaj,無花果("F/cwcaWca),番石4留fPw'&'wm芒果fMa，/erazW/ca」，椒攬fD/eaewra戶ea」，木瓜卩Ca"'ca戸戸，」，腰果fPn^7ws鬥唐用舌甘菜fSefavw/ga廠z、,，甘覆fS^cc/zarwmspp.),麥，大麥，蔬菜，觀賞植物和松類。蔬菜的例子包括但不限制於，西紅柿fZ^co戸m'co"wc'w/e/7fwm乂萬宮fZa"wcasa/7va義青豆fP/z(xyeo/wsvw/gan'5^，利馬豆卩屍/^eo/z^/zmem7:仏婉豆fZa—myspp.),槐豆卩Ceratow'(2W/z々認」，虹豆麗gwzcw/(3to」，綠豆Wg朋rat/z'ato」，香豆Wcza/Ma,,鷹嘴豆("CVc'er"n'e""wm,，和Cwcwm's屬的成員,例如黃瓜「C犯"vws」，香瓜「CC(3wto/w/e朋&」，和甜瓜卩C.me/o」。觀賞植物的例子包括但不限制於杜鵑花(A/zo^Aw^ywspp.),八仙花fMacro//^〃"/z>y/ra"gea」,芙蓉花(^/z力&cmsmsma"e腦j,,3文J鬼(7cw(3spp.),省卩金香(Tw/z/aspp.),7JOf山花(7V(3n:/mwaspp.),4委牽牛花/^n'卻，康乃馨fD/'"w/1/22^c"^yo//z_y〃—，猩猩木iw//zc^/a/7w/c/ze"/w4),和菊花。松類的例子包括但不限制於，松樹諸如火炬松(P/m^toec/a)，沼'澤^Y屍z"w、s'e〃/o〃仏美國黃^>fP/力ws/cwflferos"4),黑+〉(T^/7z^cowto廠,4)，和福射^Y屍/"wsracZ/'a,a人花期^Y屍《ewt/o"'wgamewz7'w/",'美國西部糹失杉(T5wgaca/(2(iem'/W,'美國雲杉卩屍z'ceag/awca人紅木(5"e《wo/(3semperWrewW,'真片》諸^口4艮批(C4Zn'esawaZ//,'^禾口月交私人(C46z'esZw/s(2附ea人禾口雪+》諸^口大1"則4白(T/^/a///c",4)禾口黃扁一白(^C72(3附aecy/arz、優選為，本發明的植物是穀物(例如玉米、紫花苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、粟、菸草、水稻等)。本發明還包括的是含有根據本發明的方法製得的核酸分子的轉基因植物及其後代。本發明進一步涉及被轉化植物的植物繁殖材料，包括但不限制於種子、塊莖、球莖、鱗莖、葉子以及根和芽的切割部分。植物的轉化任何本領域內已知的方法可用於利用本發明的方法設計的核酸分子轉化植物或植物細胞。核酸分子可整合入植物DNA(例如基因組DNA葉綠體DNA)或保持完整也不插入到植物DNA中(例如通過利用人造染色體)。將核酸序列引入植物細胞的合適方法包括微注射(Crossway"(1986)i^o/^c/m^wes4:320-334);電芽孑L(Riggsefa/.(1986)屍亂淑/.爿cg6/.t/&483:5602-5606;D'Halluin"a/.(1992)屍taCe〃4:1495-1505);土壤桿菌-調節的轉化(美國專利第5,563,055號和第5,981,840號，Osjoda"a/.(1996)淑廳Aofec/wo/ogy14:745-750);直接基因轉移(Paszkowski"(1984)E緒OZ.3:2717-2722);彈道微粒加速(Sanford"美國專利第4,945，050;TomesWW,美國專利第5,879,918號；Tomes美國專利第5,886，244號；BidneyW"/，美國專利第5,932,782號；Tomes"a/.(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment,in屍/tmfO//,77^we,a"t/(9rg朋Cw/fwre..Fw/7t/謂e齒/ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag,Berlin);andMcCabe"a/.(1988)腸紅/mo/ogy6:923國926));病毒調節的轉化(美國專利第5,889,191號，第5,889,190號，第5,866,785號，第5,589,367號和第5,316,931號)；花粉轉化(DeWet"a/,(1985)in77ze￡"jc/m'me/7to/A/am^w/Wow77^wes，ed.ChapmanWa/.(Longman,NewYork),pp.197-209);Lee1轉化(U.S.PatentApplicationSer.No.09/435,054,WO00/28058);whisker畫調節的轉化(Kaeppler"(1990)屍/a//1Ce〃9:415-418andJCaepplere/1a/.(1992)TTzeor.J///.Gewef.84:560-566);和葉綠體轉化技術(Bogorad,2000,7>e"A,力B/o^c/wo/ogy18:257-263;RameshWa/,2004,A/W/zoA7Vfo/S/o/.274:301-7;HouWa/,2003,rram'gemc/&s'.12(1):11-4;Kindle"a/，1991,屍A^AS"88(5):1721-5;BatemanandPurton,2000,M/GewGe威263(3):404-10;Sidorovetal.,1999,屍/朋L/.19(2):209畫216)根據被選作進行轉化的植物或植物細胞的類型，即單子葉或雙子葉，對用於製造轉基因植物和植物細胞的轉化方案的選擇可不同。對特定植物類型而言特別適合的轉化方案的例子包括為以下類型的植物進行轉化的方案洋蔥(Weissinger"a/.(1988)j朋.Wev.22:421-477;SanfordWa/.(1987)屍aW,cw/""Sc,e"ce鼎drec/wo/ogy5:27-37);potato(Tu"a/.(1998)屍taM/簡/w5油gy37:829-838andChong"(2000)7>7ms*gemci^ean:力9:71-78);大豆(Christou"a/.(1988)屍/"w屍/zjwo/.87:671-674,McCabe"a/.(1988)Ao/rec/mo/ogy6:923-926,FinerandMcMullen(1991)/"Ce〃Dev.B/o/.27P:175-182,andSinghWa/(1998)77zeor^c^/.96:319-324);水稻(DattaWa/.(1990)腸"c/wo/ogy8:736-740,Li"a/(1993)屍』Ce〃鄉om12:250-255,andChristouandFord(1995)」畫/s75:407-413》玉米(Klemeto/.(1988)屍亂淑/.加t/.Sc.固85:4305-4309,A7"力eto/(1988)S/o/^c'/mo/ogy6:559-563,Klein(1988)P/a加屍/zjwo/.91:440-444,F誦m"a/(1990)S她c/mo/ogy8:833-839,andTomes"a/.(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment,"in屍/朋/1Ce〃，Tlwwe，"《<iCw/,wre:F麗由mewto/她Ao(is1,ed.Gamborg(Springer-Verlag,Berlin);穀類(Hooykaas誦VanSlogteren"a/(1984)A^wrefZo"cfo"」311:763-764,美國專利第5,736,369號);百合(Bytebier"(1987)屍roc.淑/.爿c"dSc,'.園84:5345-5349)。在一些實施方式中，在轉基因植物和植物細胞的產生中，多個構建體可用於轉化。多重構建體可包括在順式或反式位置中。在優選實施方式中，每個構建體具有啟動子和其他調節序列。已被轉化的細胞可根據本領域內任何已知的方法培育植物(例如，McCormicke,"/.(1986)屍/0〃^^0廠&5:81-84)。可培育這些植物用相同轉化的品系或不同的品系進行授粉。可培育兩代或兩代以上的植物以確保所需核酸分子、多肽和/或表型特徵的表達被穩定保留並遺傳。表達的測定本領域內任何已知的方法可用於測定植物中本發明的核酸或其編碼的多肽的表達水平。例如，在植物中本發明的核酸所編碼的多肽的表達水平可由免疫分析、定量凝膠電泳等確定。另外，在植物中本發明的核酸分子所編碼的多肽的表達水平可由所述植物表型改變的程度來確定。可由整抹植物、其組織或植物細胞培養物進行測定。在一實施方式中，在用含有一個或多個更改密碼子的核酸分多肽表達水平的比較，其中兩種核酸分子編碼相同或者基本相同的多肽。在另一實施方式中，在用含有一個或多個更改密碼子的核酸分子進行轉化的植物和非轉基因植物之間進行了多肽表達水平的比較。此處引用的所有專利、專利申請、已公開的PCT申請和文章、書籍、參考、參考說明書和摘要的內容在此以引用的方式整體引入更完整地描述本發明所屬領域的現狀。由於在不背離本發明的範圍和精神的情況下可在上述主體內容中做出各種變化，因此以上描述的，或在所附權利要求中包含的所有主體內容均被視為本發明的描述和說明。根據上述教學，本發明的許多修改和變化是可能的。實施例此處提出的以下實施例旨在描述和例舉實現本發明的各個方面，而並非以任何方式限制本發明。實施例1對蘇雲金桿菌殺蟲性多肽473N的變種進行編碼的單子葉植物病毒密碼子偏好核酸分子編碼序列的設計根據列在表14中的0.09閾值單子葉植物病毒密碼子使用頻率進行初步選擇對473N的胺基酸序列進行編碼的核酸分子的密碼子，隨後進行Kozak-共有序列優化，並進行編輯以去掉隱蔽拼接位點、可導致mRNA快速降解的序列，假聚腺苷酸化信號序列以及長替代性閱讀框。另外，具有更高植物病毒密碼子使用頻率的密碼子放置在所述編碼序列的5，端。SEQIDNO:l編碼Kozak-473N。SEQIDNO:2是Kozak-473N的胺基酸序列。密碼子優化前的473N是SEQIDNO:15。下表顯示列在SEQIDNO:l中的單子葉植物病毒密碼子偏好核酸分子編碼序列的密碼子使用頻率與列在表14中的單子葉植物病毒密碼子使用頻率的比較。tableseeoriginaldocumentpage70tableseeoriginaldocumentpage71實施例2植物病毒密碼子偏好473N的組裝通過DNA2.0(Menk)Park,CA)合成所述473N基因(SEQIDNO:l)的合成版本。將限制性酶位點BamHI和Hpal分別加到所述基因的5'和3'端以協助克隆入轉化載體。實施例3473N植物轉化載體的構建在用BamHI和Hpal消化質粒後，從DNAIO載體中分離對應於473N基因的ilkb片段。該片段亞克隆入中間載體，pSKNA-Ubi，利用BamHI和Hpal得到pSKNA-Ubi:473N。pSKNA-Ubi:473N含有在玉米Ubi啟動子-5，UTR-Ubi內含子1組合所調控的473N基因並由位於473N基因緊鄰3，側的pinll終止序列所終止。pSKNA-Ubi:473N用AscI和NotI消化釋放表達盒(UbiPro-5'UTR'Ubi內含子l:473N:pin11),該片段亞克隆入最終轉化載體的相應位點將其放置在標記基因上遊，並處於與選3奪標記基因相反的取向。在轉化前核對LB和RB之間的完整基因框的序列。實施例4通過粒子轟擊進行的玉米轉化和轉基因植物的再生來自溫室供體植物的未成熟玉米胚胎用與泛素啟動子和選擇標記基因諸如PAT(Wohllebenetal,1988,Gene70:25-37)可操作地相連的含有植物病毒密碼子偏好核酸分子編碼序列的DNA分子進行轟擊，該選擇標記基因使之具有對除草劑雙丙氨醯膦(Bialaphos)的抵抗力。作為另外一種選擇，所述選擇標記基因可以單獨的DNA分子提供。如下進行所述轉化。培養基配方如下。準備輩巴組織將穗去殼並在30%010!"0乂，漂白劑+0.5%微去汙劑中滅菌表面20分鐘，並用無菌水清洗兩次。所述未成熟的胚胎一皮切開並將胚胎軸側向下放置(胚子葉側向上)，每塊板上25個胚胎，在560Y培養基中4小時然後排列在2.5cm的靶區域以準備進行轟擊。準備DNA分離含有與泛素啟動子可操作地相連的植物病毒密碼子偏好核酸分子的質粒載體。例如，合適的轉化載體含有來自於玉米(zeama，)的Ubil啟動子，來自Ubil的5'UTR和Ubil內含子，以及PinII終止子。所述載體另外含有由玉米UbiI啟動子/內含子/5，UTR驅動的選擇標記基因諸如GAT和3x35S增強子以及PmII終止子。可選地，所述可選擇標記可位於單獨的質粒中。利用如下CaCl2沉澱過程將含有植物病毒密碼子偏好核酸分子編碼序列以及可選l奪標記諸如GAT的DNA分子沉澱到1.1jum(平均直徑)鎢球上100jul在水中製備好的鵠顆粒10ju1(1yg)在TrisEDTA緩沖液中的DNA(1ng總DNA)100nl2.5MCaCl210jul0.1M亞精胺保持在多管式漩渦振動器上時，將每種試劑順序加入鎢微粒懸浮液。最終混合物經短暫超聲波處理並在恆定漩渦振動下溫育10分鐘。在沉澱期之後，短暫離心試管，棄去液體，用500mll00Q/乙醇洗滌，並離心30秒。再次棄去液體，並向最終鎢孩i粒球中加入105jul100%乙醇。對於微粒槍轟擊，所述鎢/DNA微粒經短暫超聲波處理後，以lOyl的量點擊在每個巨大載體的中心並在轟擊前乾燥約2分鐘。微粒槍處理在微粒槍HE34-1或HE34-2中以水平#4對樣品板進行轟擊。所有樣品接受650PSI的單次射擊，從每管制備好的微粒/DNA中取出共IO份等分樣品。在轟擊後，所述胚胎保持在560Y培養基上兩天，然後轉移到含有3mg/升3mM草甘膦的560R選4奪培養基，並每兩個星期進行傳代培養。在大約選擇10周後，選擇抗性愈傷組織克隆轉移至288J培養基以啟始植物再生。在體細胞胚胎成熟(24周)後，良好發育的體細胞胚胎轉移至用於萌芽的培養基上並轉移至有光照的培養室內。大約7~IO天以後，發育的植物苗轉移至試管中不含激素的272V培養基7-10天直至植物苗良好發育。然後將植物轉移至含有盆栽土壤的平板上的嵌入物(等同於2.5"盆)並在生長箱中生長1星期，然後在溫室中再生長1~2星期，然後轉移至標準600盆中(1.6加侖)並生長至完全成熟。通過本領域內已知的分析手段監測植物並對由所述植物病毒密碼子偏好核酸分子編碼的多肽的表達進行評分，諸如例如，用與所述編碼的多肽結合的抗體進行的免疫分析和蛋白質印跡法。也可在選擇10周之後監測抗性愈傷組織(resistantcallus)的多肽表達以評價這些多肽的水平。轟擊和培養基轟擊培養基(560Y)含有4.0g/1N6鹼性鹽(SIGMAC-1416),1.0ml/1Eriksson維生素混合物(1000xSIGMA-1511),0.5mg/1維生素B1HC1，120.0g/l蔗糖，1.0mg/12,4-D,和2.88g/1L-脯氨酸(在用KOH調節至pH5.8之後用dlH20補足體積)；2.0g/1Gelnte(在用dlH20補足體積後加入)；和8.5mg/1硝酸銀(在對所述培養基滅菌並冷卻至室溫後加入)。選才奪培養基(560R)含有4.0g/1N6鹼性鹽(SIGMAC-1416),1.0ml/1Eriksson維生素混合物(1000xSIGMA-1511)，0.5mg/1維生素BIHCI,30.0g/l蔗糖，和2.0mg/12,4-D(在用KOH調節至pH5.8之後用dlH20補足體積)；3.0g/lGelrite(在用dlH20補足體積後加入)；和0.85mg/1硝酸銀和3.0mg/1雙丙氨醯膦(在對所述培養基滅菌並冷卻至室溫後加入)。植物再生培養基(288J)含有4.3g/lMS鹽(GIBCO11117-074),5.0ml/1MS維生素儲備溶液(O.IOOg/l煙酸，0.02g/l維生素BlHCl，0.10g/l維生素B6HC1，和0.40g/l甘氨酸，用精製D-IH20補足體積)(MurashigeandSkoog(1962)屍—。/.屍/滅.75:473),100mg/1肌醇，0.5mg/1玉米素，60g/l蔗糖，和1.0ml/1的0.1mM脫落酸(在調節至pH5.6之後用精製dlH20補足體積)；3.0g/lGelnteTM(在用dlH20補足體積後加入)；和1.0mg/1卩引哚乙酸和3.0mg/1雙丙氨醯膦(在將所述培養基滅菌並冷卻至60。C之後加入)。無激素培養基(272V)含有4.3g/lMS鹽(GIBCO11117-074),5.0ml/1MS維生素儲備溶液(0.100g/l煙酸，0.02g/l維生素BIHCI,0.10g/l維生素B6HC1，和0.40g/l甘氨酸，用精製DlH20補足體積)，0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在調節至pH5.6之後用精製dlH20補足體積)；和6g/lBacto畫agar(在用dlH20補足體積後加入)，滅菌並冷卻至6(TC。實施例5土壤桿菌調節的玉米的轉化和轉基因植物的再生用Zhao的方法用含有植物病毒密碼子偏好473N基因的載體對玉米進行轉化(美國專利第5,981,840號和PCT專利公開W098/32326;其中每件的內容在此以引用的方式引入)。土壤桿菌在800培養基的母板上生長並在28°C,黑暗中培養3天，之後在(C保存達一個月。土壤桿菌的工作板在810培養板上生長，並在28。C,黑暗中溫育12天。簡言之，從新鮮無菌玉米穗中切下胚胎並保持在561Q培養基中直至收集到所有必需的胚胎。然後將胚胎與由工作板所得的土壤桿菌懸浮液接觸，其中所述土壤桿菌含有含所述實施方式的473N基因的質粒。所述胚胎與土壤桿菌在562P培養基上共培養，所述胚胎軸向下放置在板上，正如'840專利方案。在562P培養基上1周以後，將所述胚胎轉移至5630培養基。以2周的間隔在新鮮5630培養基上對胚胎進行傳代培養並在相同條件下繼續溫育。在選擇6~8周後出現愈傷組織事件(Callusevents)。在愈傷組織長至合適尺寸之後，在再生(288W)培養基中培養所述愈傷組織並保持在黑暗中2~3周以啟始植物再生。在體細胞胚胎成熟之後，良好發育的體細胞胚胎被轉移至用於萌芽的培養基(272V)並轉移至有光照的培養室。大約710天以後，發育的植物苗轉移至試管中不含激素的272V培養基710天直至植物苗良好發育。然後將植物轉移至含有盆栽土壤的平板上的嵌入物(等同於2.5"盆)並在生長箱中生長l星期，然後在溫室中再生長1~2星期，然後轉移至標準600盆中(1.6加侖)並生長至完全成熟。在土壤桿菌調節的轉化和轉基因玉米植物再生中使用的培養基561Q培養基含有4.0g/LN6鹼性鹽(SIGMAC-1416),1.0mL/LEriksson維生素混合物(IOOOxSIGMA-1511)，0.5mg/L維生素BlHC1,68.5g/L蔗糖,36.0g/L葡萄糖，1.5mg/L2,4-D,和0.69g/LL-脯氨酸(在用KOH調節至pH5.2後用dlH20補足體積)；2.0g/1Gelnte(在用dlH20補足體積後加入)；和8.5mg/L硝酸銀(在對所述培養基滅菌並2令卻至室溫後加入)。800培養基含有50.0mL/L儲備溶液A和850mLdlH20，並用dlH20補充至離滿體積差100ml/L,然後加入9.0g的phytagar。在滅菌和冷卻後，加入50.0mL/L儲備溶液B,以及5.0g的葡萄糖和2.0mL的50mg/mL奇黴素儲備溶液。儲備溶液A含有60.0g的二鹼價K2HP04和20.0g的一鹼價磷酸鈉，溶解在950mL的水中，並用KOH調節至pH7.0,用dlH20補足至1.0L體積。儲備溶液B含有20.0gNH4C1，6.0gMgS04.7H20,3.0g氯化鉀,0.2gCaCl2,和0.05g的FeS04.7H20,用dlH20補足體積並滅菌冷卻。810培養基含有5.0g酵母提取物(Difco),10.0g蛋白腖(Difco),5.0gNaCl，溶解在dlH20中，並在調節pH至6.8之後補足體積，然後加入15.0g的bacto-agar,所述溶液經滅菌並冷卻，然後加入1.0mL的50mg/mL奇黴素儲備溶液。562P培養基含有4.0g/LN6鹼性鹽(SIGMAC-1416),1.0mL/LEriksson維生素混合物(1000xSIGMA-1511),0.5mg/1維生素BlHC1,30.0g/1蔗糖，和2.0mg/12,4-D(在用KOH調節至pH5.8之後用dlH20補足體積)；3.0g/1Gelrite(在用dlH20補足體積後加入)；和0.85mg/l硝酸銀和1.0mL的100mM乙酸丁香酮(acetosyringone)儲液(均在所述培養基經滅菌，冷卻至室溫以後加入)。5630培養基含有4.0g/LN6鹼性鹽(SIGMAC-1416),1.0mL/LEriksson維生素混合物(1000xSIGMA-1511),0.5mg/L維生素BlHC1,30.0g/L蔗並唐，1.5mg/L2,4-D,0.69gL-月甫氨酉臾禾口0.5gMES糹爰沖液(在用KOH調節至pHi8之後用dlH20補足體積)。然後加入6.0g/LUltrapureTM瓊脂-瓊脂(EMScience),然後所述培養基經滅菌和冷卻。然後，加入0.85mg/L硝酸4艮，3.0mL的1mg/mL雙丙氨醯膦儲備液和2.0mL的50mg/mL羧T青黴素儲備液。288W培養基含有4.3g/LMS鹽(GIBCO11117-074),5.0mL/LMS維生素儲備溶液(0.100g/1煙酸，0.02g/L維生素BlHC1,0.10g/L維生素B6HC1,和0.40g/L甘氨酸，用精製dlH2〇補足體積)(MurashigeandSkoog(1962)屍/z"w/屍/a^.100mg/L肌醇，0.5mg/L玉米素和60g/L蔗糖，在調節至pH5.6之後用dl&0補足體積。隨後，加入6.0g/LofUltrapureTM瓊脂-瓊脂(EMScience),所述培養基經滅菌和冷卻。然後加入1.0mL/L的0.1mM脫落酸；1.0mg/L卩引咮乙酸和3.0mg/L雙丙氨醯膦，以及2.0mL的50mg/mL羧千青黴素儲備液。無荷爾蒙培養基(272V)含有4.3g/lMS鹽(GIBCOllin-074),5.0ml/1MS維生素儲備溶液(O.IOOg/1煙酸，0.02g/1維生素BlHC1,0.10g/1維生素B6HC1，和0.40g/1甘氨酉臾，用津青制DIH20誶卜足體積)，0.1g/1肌醇和40.0g/1蔗糖(在調節至pH5.6之後用精製dlH20補足體積)；和6g/lBacto-agar(在用dlH20補足體積後加入)，滅菌並冷卻至60。C。實施例6轉基因473N表達愈傷組織的昆蟲生物測試在表達泛素啟動子控制下的473N的轉基因愈傷組織上，對昆蟲進行生物測試以判斷在此階段是否表達足夠的473N毒素以提供殺蟲活性。該測試與蛋白質印跡分析共同提供了所述對殺蟲性多肽進行編碼的植物病毒密碼偏好473N基因在植物組織中表達程度的測量標準。在之前用95%乙醇噴霧進行消毒的Pitman盤上進行愈傷組織分析。按照製造商的說明書製備瓊脂(Serva),並補充含有青黴素、鏈黴素和amphoterinB的三重抗生素溶液(70mis/500ml瓊脂)加入到每個孔中並冷卻。在每個孔中，將無菌過濾紙圓盤放置在瓊脂上並將200jul的滅菌水灑在過濾紙上。將愈傷組織(~lcm的尺寸)放在過濾紙上並在每個孔中放入2條歐洲玉米蛀蟲(ECB)幼蟲。將所述分析板在27。C下溫育並在加入昆蟲後72~96小時對昆蟲的死亡率、發育不全和行為變化打分。所述分析重複2次以確認得分。所述分析結果顯示在30%的測試孔中，ECB幼蟲嚴重發育不全或者死亡。兩次重複之間的活性相關性為100%。在非轉基因對照愈傷組織上沒有觀察到死亡或發育不全。該分析表明473N在一定比例的不同愈傷組織中以殺蟲性劑量表達，並支持所述植物病毒密碼偏好的有效性。實施例7ECB和CEW的葉圓盤功效測試轉化愈傷組織經再生為植物並送至溫室中進行ECB和棉鈴蟲(CEW)的TO有效性測試。在V6發育階段對所有事件進行葉圓盤分析以評估48小時以後在昆蟲幼蟲消耗的葉區域的植物保護。測試如下進行，即對每個轉基因事件打孔獲得多個葉圓盤並在24孔板的每個孔中放入一片葉圓盤。在測試分析中，每種昆蟲每個事件取4片葉圓盤(總數為8)。將所述葉圓盤放置在與孔直徑相同的潮溼過濾紙盤上。在放入昆蟲後在每塊板上加蓋以放置昆蟲從孔中逃出。也包括來自非轉基因植物的對照葉圓盤以比較葉消耗量。測試在27。C進行。該分析的結果總結在以下的表24中。在45。/。的所測試的事件(event)中觀察到葉保護。在顯示出抗ECB的保護效果的事件中也顯示出抗CEW的保護效果。在對照孔和其他"無效"事件中的葉圓盤^R完全消耗。所述葉圓盤分析測試的例子顯示在圖1中。這些結果證實了利用植物病毒密碼偏好設計的殺蟲水平473N基因的表達。表24:表達植物病毒密碼優化473基因的事件的葉圓盤分析結果tableseeoriginaldocumentpage77實施例8來自473N轉基因事件的葉樣品的免疫印跡分析通過收集來自V6階l殳植物的4片葉圓盤(~100mg)》文入1.2mlraptor試管進行植物多肽提取。對於每份樣品將兩顆鋼製磨珠和77200jul的提取緩衝液(100mM磷酸鉀，pH7.8,lmMEDTA,K)o/o丙三醇，l%Tnton,7mMP-巰基乙醇(BME)和蛋白酶抑制劑混合物)加入。將試管蓋上並放置在Geno/Grinder(BT&C/OPSDiagnostics,NewBridgewater,NJ)中,並在1650的速度下進行兩次30秒鐘mpetted。在4°C,4000rpm下離心15分鐘，將上清液轉移至新試管並在4°C,13,000下再次離心5分鐘。將上清液轉移至新試管並在-20。C保存直至使用。通過加入5ju1的4x加樣緩沖液(lnvitrogen,Carlsbad,CA)和3.5|a1的BME並在IO(TC加熱5分鐘製備用於SDS-PAGE凝膠電泳的樣品。用合適的分子量標記在4~16%的NuPAGE預製凝膠(Invitrogen)上裝樣，在MES跑膠緩沖液中在125V下跑膠90分鐘。通過從架子上取下凝膠並放置在由兩層海綿層、印跡紙(切割至所述凝膠的大小)、凝膠、預潤溼的膜、印跡紙和兩層海綿構成的印跡夾心結構中進行免疫印跡分析。將所述夾心結構放置在含有轉印緩沖液的轉印箱中，在30伏下進行6090分鐘。在轉印後，從所述夾心結構中取出膜並放置在容器中，向其中加入1xPBST(10mM磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.4,1。/。Tween20)和5%脫脂幹牛奶。輕微攪動在室溫下進行1小時的封閉。在一'J、時後封閉液被15mL含有經恰當稀釋的473N—抗的IXPBST+5。/。幹牛奶所置換並在4"C下輕樣吏晃動溫育過^^。在溫育後，移除一抗並用1xPBST+5。/。幹牛奶洗滌膜三次(每次5分鐘)。在25ml1xpBST+5。/。幹牛奶中稀釋的1/5000的二抗與所述膜在室溫下輕禍:晃動溫育1小時。從所述膜上移除二抗，用lxPBST+5幹牛奶洗滌膜三次(每次5分鐘)，然後用1x分析緩沖液(在WesternLightKitTM中提供，AppliedBiosystems,FosterCity,CA)洗滌三次(每次5分鐘)。從膜上移除過量的緩衝液，並將所述膜放在塑料包裝膜上5分鐘，在黑暗中向其加入3ml的底物溶液(CSPDTM-在試劑盒中提供)，其中補充150ju1的Nitro-BlockIlTM增強子(在試劑盒中提供)。通過除去過量溶液並將所述膜曝光於BiomaxLightX-射線膠片(EastmanKodakCo.NewHaven,CT)下不同的曝光時間以進行顯影。然後通過傳統方法對所述膠片進行顯影。來自473N轉基因事件的葉組織的蛋白質印跡分析顯示出一種尺寸上與純化473N蛋白對照相類似的針對抗體的免疫活性帶(參見圖2)。在葉圓盤分析中表現出有效性的事件的葉樣品中存在該帶進一步證實植物病毒密碼優化473N基因在抗蟲性水平的表達。在非轉基因對照中沒有此帶。其他交叉反應帶在轉基因樣品和非轉基因對照中是相同的。實施例9對來自於米根黴的殺蟲性脂肪酶(RoLipase)進行編碼的單子葉植物病毒密碼子偏好核酸分子編碼序列的設計根據列在表14中的0.09閾值單子葉植物病毒密碼子使用頻率初步選擇對帶有大麥cx澱粉酶信號肽的RoLipase的胺基酸序列進行編碼的核酸分子的密碼子。隨後進行Kozak-共有序列優化，並進行編輯以去掉隱蔽拼接位點、可導致mRNA快速降解的序列，假聚腺苷酸化信號序列以及長替代性閱讀框。另外，具有更高植物病毒密碼子使用頻率的密碼子放置在所述編碼序列的5，端。SEQIDNO:3編碼密碼子優化RoLipase。SEQIDNO:4是密碼子優化RoLipase的胺基酸序列。SEQIDNO:5和6是加入到所述密碼子優化RoLipase序列中並用於所有描述的試驗的大麥a澱粉酶信號肽(分別是核酸序列和肽序列)。密碼子優化前的脂肪酶是SEQIDNO:16。實施例10植物病毒密碼子偏好BAA-RoLipase的組裝。通過DNA2.0(Menl。Park，CA)合成所述R0L1pase(SEQIDNO:3)的合成版本。將限制性酶位點BamHI和HpaI分別加到所述基因的5'和3'端以協助克隆入植物轉化載體。實施例11BAA-RoLipase植物轉化載體的構建在用BamHI和Hpal消化質粒後，從提供的DNA2.0載體中分離對應於BAA-RoLipase基因的1.2kb片段。將該片段亞克隆入中間載體，pSKNA-Ubi,利用BamHI和Hpal得到pSKNA-Ubi:BAA-RoUpase。pSKNA-Ubi:BAA-RoLipase含有在玉米Ubi啟動子-5,UTR-Ubi內含子1組合所調控下的BAA-RoLipase基因並由位於Lipase基因緊鄰3，側的pinll終止序列所終止。pSKNA-Ubi:BAA-RoLipase用Ascl和Notl消化釋放表達盒(UbiPro-5'UTR'Ubi內含子l:BAA-RoLipase:pinII),該片段亞克隆入最終轉化載體的相應位點將其放置在選擇標記基因上遊，並處於與選一奪標記基因相反的取向。在轉化前核對LB和RB之間的完整盒的序列。通過土壤桿菌調節的轉化，所述BAA-RoLipase植物轉化載體用於轉化玉米，並按照實施例5中詳細描述的過程再生植物。實施例12Rohpase轉化事件的玉米食蟲分析試驗(CRW)採用根培育林分析對45個RoLipase轉化事件進行CRW評估。經轉化的Rolipase植物苗移栽至根培育株(roottrainers)中並在V3~V4階段感染100個CRW卵。在感染後15~17天對植物根破壞進行評價並根據根評分標準對比非轉基因對照植物。根據根破壞程度將11抹植物評定為陽性結果，代表了24%的保存率(表25)。這些植物中的一部分被選用於RoLipase表達的蛋白質印跡分析。表25:通過CRW分析測試的RolipaseTO事件tableseeoriginaldocumentpage80實施例13來自BAA-RoLipase轉基因事件的葉樣品和根樣品的免疫印跡分析通過收集來自V6-V8階段植物的根部分和葉部分(100mg)放入1.2mlraptor試管進行植物多肽提取。對於每份樣品將兩顆鋼製磨珠和200jj1的提取緩衝液(100mM磷酸鉀，pH7.8,lmMEDTA,10%丙三醇，1%Triton,7mMP-巰基乙醇(BME)和蛋白酶抑制劑混合物)加入。將試管蓋上並放置在Geno/Gnnder(BT&C/OPSDiagnostics,NewBndgewater,NJ)中，並在1650的速度下進行兩次30秒鐘rapetted。在4°c,4000rpm下離心樣品15分鐘，將上清液轉移至新試管並在4°c，13,000下再次離心5分鐘。所述上清液轉移至新試管中並將所述樣品在-2(tc保存直至使用。通過加入5)ul的4x加樣緩沖液(Invitrogen，Carlsbad,CA)和3.5ju1的BME並在100。C加熱5分鐘製備用於SDS-PAGE凝膠電泳的樣品。用合適的分子量標記在4~16。/。的NuPAGE預製凝膠(Invitrogen)上裝樣，在MES跑膠緩沖液中在125V下跑膠90分鐘。通過從架子上取下凝膠並放置在由兩層海綿層、印跡紙(切割至所述凝膠的大小)、凝膠、預潤溼的膜、印跡紙和兩層海綿構成的印跡夾心結構中進行免疫印跡分析。將所述夾心結構放置在含有轉印緩衝液的轉印箱中，在30伏下進行60-90分鐘。在轉印後，從所述夾心結構中取出膜並放置在容器中，向其中加入1xPBST(10mM磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.4，1。/。Tween20)和5%脫脂幹牛奶。輕樣t攪動在室溫下進行1小時的封閉。在一小時後封閉液一皮15mL含有1:1000RoLipase—抗稀釋液的IXPBST+5。/。幹牛奶所置換並在4。C下輕微晃動溫育過夜。在溫育後，移除一抗並用lxPBST+5。/。幹牛奶洗滌膜三次(每次5分鐘)。在25ml1xPBST+5。/。幹牛奶中稀釋的1/5000的二抗與所述膜在室溫下輕微晃動溫育1小時。從所述膜上移除二抗，用lxPBST+5。/。幹牛奶洗滌膜三次(每次5分鐘)，然後用1x分析緩沖液(在WesternLightKitTM中提供，AppliedBiosystems，FosterCity,CA)洗滌三次(每次5分鐘)。從膜上移除過來的緩衝液，並將所述膜放在塑料包裝膜上，在黑暗中向其加入3ml的底物溶液(CSPDTM-在試劑盒中提供)和150]u1的Nitro-Block1iTM增強子(在試劑盒中提供)5分鐘。通過除去過量溶液並將所述膜曝光於BiomaxLightX畫射線膠片(EastmanKodakCo.NewHaven,CT)下不同的曝光時間以進行顯影。然後通過傳統方法對所述膠片進行顯影在所述根培育抹分析試馬全中呈陽性或陰性的RoLipase轉基因事件中的一部分進行葉和根組織的蛋白質印跡分析。這些分析的結果顯示，在所述分析中顯示陽性的事件中，存在對應於成熟RoLipase預期大小(31kD)的免疫反應性帶(參見圖3)。在所述蛋白質印跡分析中包括純化的Rolipase前體蛋白(ROL~42kD)作為陽性對照。在所測試的事件中根保護和RoLipase成熟形式的存在之間的相關性證實植物病毒密碼子優化RoLipase基因的成功表達。權利要求1.一種設計核酸分子的方法，所述核酸分子對多肽進行編碼以在植物中表達所述多肽，所述方法包括將核酸分子的至少一個密碼子更改為更改的密碼子，其中所述更改的密碼子選自在一種或多種植物病毒中的使用頻率大於所述核酸分子的所述密碼子的使用頻率的密碼子。2.如權利要求1所述的方法，其中所述更改的密碼子在一種或多種植物病毒中的使用頻率大於0.09。3.如權利要求1所述的方法，其中所述更改的密碼子在一種或多種植物病毒中使用頻率等於或大於在所述一種或多種植物病毒中所述更改的密碼子編碼的胺基酸的密碼子使用頻率中值，其中所述密碼子使用頻率中值是在一種或多種植物病毒中對所述胺基酸進行編碼的所有密碼子的密碼子使用頻率的中值。4.如權利要求1所述的方法，其中在所述含有至少一個更改密碼子的核酸分子中，至少30%的密碼子是更改的密碼子。5.權利要求1所述的方法，其中在含有至少一種更改密碼子的核酸子的第二部分中的數目，其中所述第一部分位於所述第二部分的5'。6.如權利要求5所述的方法，其中所述第一部分構成所述核酸分子的三分之一，所述第二部分構成所述核酸分子的三分之二。7.如權利要求5所述的方法，其中所述第一部分構成所述核酸分子的四分之一，所述第二部分構成所述核酸分子的四分之三。8.如權利要求5所述的方法，其中所述核酸分子的所述第一部分和第二部分在長度上相同，所述第一部分具有更多數目的所述更改密碼子。9.如權利要求1所述的方法，其中與沒有表達所述多肽的植物相比，由含有至少一個更改密碼子的核酸分子編碼的所述多肽在植物中的表達導致所述植物表型的變化。10.如權利要求1所述的方法，其中與表達不含有至少一個更改密碼子的核酸分子的植物相比，含有至少一個更改密碼子的核酸分子的表達導致所述植物表型的變化，其中所述核酸分子編碼相同的多肽。11.如權利要求9或10所述的方法，其中所述表型選自由抗昆蟲性、耐昆蟲性、抗疾病性、耐疾病性、抗線蟲性、耐線蟲性、耐旱性、耐鹽性、耐重金屬性、重金屬解毒性、低肌醇六磷酸含量、高效氮利用、產率提高、提高的產量穩定性、改善的營養含量、提高的糖含量、改善的生長和活力、改善的消化性、治療性多肽的表達、非多肽藥物的合成、對選擇劑的抗性、螢光、發光、重組酶活性和雄性不育組成的組。12.如權利要求9或10所述的方法，其中所述表型是所述多肽在所述植物中提高的表達。13.如權利要求l所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。14.如權利要求13所述的方法，其中所述單子葉植物選自由大麥、玉米、粟、燕麥、水稻和小麥組成的組。15.如權利要求14所述的方法，其中所述單子葉植物是玉米。16.如權利要求1所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。17.如權利要求16所述的方法，其中所述雙子葉植物選自由馬鈴薯、大豆、菸草和西紅柿組成的組。18.如權利要求17所述的方法，其中所述雙子葉植物是大豆。19.如權利要求1或13所述的方法，其中所述一種或多種植物病毒是單子葉植物病毒。20.如權利要求19所述的方法，其中所述至少一個密碼子編碼a)丙氨酸而所述更改的密碼子選自由GCA和GCT組成的組；b)精氨酸而所述更改的密碼子選自由AGA、AGG和CGT組成的組；c)天冬醯胺而所述更改的密碼子是AAT;d)天冬氨酸而所述更改的密碼子是GAT;e)半胱氨酸而所述更改的密碼子是TGT;f)穀氨醯胺而所述更改的密碼子是CAA;g)穀氨酸而所述更改的密碼子是GAA;h)甘氨酸而所述更改的密碼子選自由GGA和GGT組成的組；i)組氨酸而所述更改的密碼子是CAT;j)異亮氨酸而所述更改的密碼子選自由ATA和ATT組成的組；k)亮氨酸而所述更改的密碼子選自由CTT、TTA和TTG組成的組；1)賴氨酸而所述更改的密碼子是AAA;m)苯丙氨酸而所述更改的密碼子是TTT;n)脯氨酸而所述更改的密碼子選自由CCA和CCT組成的組；0)絲氨酸而所述更改的密碼子選自由AGT、TCA和TCT組成的組；p)蘇氨酸而所述更改的密碼子選自由AGA和ACT組成的組；q)酪氨酸而所述更改的密碼子是TAT;或者r)纈氨酸而所述更改的密碼子選自由GTG和GTT組成的組。21.如權利要求19所述的方法，其中所述一種或多種單子葉植物病毒是玉米特異性病毒。22.如權利要求21所述的方法，其中所述至少一個密碼子編碼a)丙氨酸而所述更改的密碼子選自由GCA和GCC組成的組；b)精氨酸而所述更改的密碼子選自由AGA、AGG和CGC組成的組；c)天冬醯胺而所述更改的密碼子是AAT;d)天冬氨酸而所述更改的密碼子是GAT;e)半胱氨酸而所述更改的密碼子是TGT;f)穀氨醯胺而所述更改的密碼子選自由CAA和CAG組成的組；g)穀氨酸而所述更改的密碼子是GAA;h)甘氨酸而所述更改的密碼子選自由GGA和GGT組成的組；1)組氨酸而所述更改的密碼子是CAT;j)異亮氨酸而所述更改的密碼子選自由ATC和ATT組成的組；k)亮氨酸而所述更改的密碼子選自由CTT、CTC和TTG組成的組；1)賴氨酸而所述更改的密碼子是AAG;m)苯丙氨酸而所述更改的密碼子是TTC;n)脯氨酸而所述更改的密碼子選自由CCA和CCT組成的組；o)絲氨酸而所述更改的密碼子選自由TCC、TCA和TCT組成的組；p)蘇氨酸而所述更改的密碼子選自由AGA和ACT組成的組；q)酪氨酸而所述更改的密碼子是TAT;或者r)纈氨酸而所述更改的密碼子選自由GTG和GTT組成的組。23.如權利要求21所述的方法，其中所述在一種或多種植物病毒中的使用頻率是基於編碼玉米病毒外殼多肽和衣殼多肽的核酸分子。24.如權利要求23所述的方法，其中所述至少一個密碼子編碼a)丙氨酸而所述更改的密碼子選自由GCA和GCT組成的組；b)精氨酸而所述更改的密碼子選自由AGA、AGG和CGA組成的組；c)天冬醯胺而所述更改的密碼子是AAC;d)天冬氡酸而所述更改的密碼子是GAT;e)半胱氨酸而所述更改的密碼子是TGC;f)穀氨醯胺而所述更改的密碼子是CAA;g)穀氨酸而所述更改的密碼子是GAG;h)甘氨酸而所述更改的密碼子選自由GGA和GGG組成的組；i)組氨酸而所述更改的密碼子是CAT;j)異亮氨酸而所述更改的密碼子選自由ATC和ATT組成的組；k)亮氨酸而所述更改的密碼子選自由CTG、CTC和TTG組成的組；1)賴氨酸而所述更改的密碼子是AAG;m)苯丙氨酸而所述更改的密碼子是TTC;n)脯氨酸而所述更改的密碼子選自由CCA和CCT組成的組；o)絲氨酸而所述更改的密碼子選自由TCC、TCA和AGC組成的組；p)蘇氨酸而所述更改的密碼子選自由ACA和ACT組成的組；q)酪氨酸而所述更改的密碼子是TAT;或者r)纈氨酸而所述更改的密碼子選自由GTC、GTG和GTT組成的組。25.如權利要求1或16所述的方法，其中所述一種或多種植物病毒是雙子葉植物病毒。26.如權利要求25所述的方法，其中所述一種或多種雙子葉病毒是大豆特異性病毒。27.如權利要求25所述的方法，其中所述在一種或多種植物病毒中的使用頻率是基於編碼雙子葉植物病毒外殼多肽和衣殼多肽的核酸分子。28.如權利要求27所述的方法，其中所述至少一個密碼子編碼a)丙氨酸而所述更改的密碼子選自由GCC和GCT組成的組；b)精氨酸而所述更改的密碼子選自由AGA、AGG和CGT組成的組；c)天冬醯胺而所述更改的密碼子是AAT;d)天冬氨酸而所述更改的密碼子是GAT;e)半胱氨酸而所述更改的密碼子是TGT;f)穀氨醯胺而所述更改的密碼子是CAA;g)穀氨酸而所述更改的密碼子是GAA;h)甘氨酸而所述更改的密碼子選自由GGA和GGT組成的組；i)組氨酸而所述更改的密碼子是CAT;j)異亮氨酸而所述更改的密碼子選自由ATA和ATT組成的組；k)亮氨酸而所述更改的密碼子選自由CTT、TTA和TTG組成的組；1)賴氨酸而所述更改的密碼子是AAG;m)苯丙氨酸而所述更改的密碼子是TTT;n)脯氨酸而所述更改的密碼子選自由CCA、CCC和CCT組成的組；o)絲氨酸而所述更改的密碼子選自由AGT、TCA和TCT組成的組；p)蘇氨酸而所述更改的密碼子選自由ACA、ACC和ACT組成的組；q)酪氨酸而所述更改的密碼子是TAT;或者r)纈氨酸而所述更改的密碼子選自由GTG和GTT組成的組。29.如權利要求l所述的方法，其中含有至少一個更改密碼子的核酸分子所具有的至少一種類型的胺基酸的所有胺基酸殘基的密碼子使用頻率與在一種或多種病毒中的使用頻率相同或者基本相似。30.如權利要求29所述的方法，其中所述一種或多種病毒是單子葉植物病毒。31.如權利要求30所述的方法，其中所述胺基酸類型是a)丙氨酸而所述密碼子使用頻率是GCA(0.31)、GCC(0.21)、GCG(0.14)和GCT(0.34);b)精氨酸而所述密碼子使用頻率是AGA(0.32)、AGG(0.17)、CGA(0.14)、CGC(014)、CGG(0.09)和CGT(0.16);c)天冬醯胺而所述密碼子使用頻率是AAC(0.42)和AAT(0.58);d)天冬氨酸而所述密碼子使用頻率是GAC(0.38)和GAT(0.62);e)半胱氨酸而所述密碼子使用頻率是TGC(0.44)和TGT(0.56);f)穀氨醯胺而所述密碼子使用頻率是CAA(0.58)和CAG(0.42);g)穀氨酸而所述密碼子使用頻率是GAA(0七0)和GAG(0.40);h)甘氨酸而所述密碼子使用頻率是GGA(0.37)、GGC(0.20)、GGG(0.14)和GGT(0.28);i)組氨酸而所述密碼子使用頻率是CAC(0.43)和CAT(0.57);J)異亮氨酸而所述密碼子使用頻率是ATA(0.30)、ATC(0.29)和ATT(0.41);k)亮氨酸而所述密碼子使用頻率是CTA(0.13)、CTC(0.14)、CTG(0.13)、CTT(0.18)、TTA(0.21)和TTG(0.21);1)賴氨酸而所述密碼子使用頻率是AAA(0.53)和AAG(0.47);m)苯丙氨酸而所述密碼子使用頻率是TTC(0.46)和TTT(0.54);n)脯氨酸而所述密碼子使用頻率是CCA(0.38)、CCC(0.17)、CCG(0.14)和CCT(0.31);o)絲氨酸而所述密碼子使用頻率是AGC(0.13)、AGT(0.18)、TCA、(0.24)、TCC(0.14)、TCG(0.IO)和TCT(0.21);p)蘇氨酸而所述密碼子使用頻率是ACA(0.30)、ACC(0.20)、ACG(0.16)和ACT(0.34);q)酪氨酸而所述密碼子使用頻率是TAC(0.43)和TAT(0.5";或者r)纈氨酸而所述密碼子使用頻率是GTA(0.19)、GTC(0.21)、GTG(0.25)和GTT(0.36)。32.如權利要求30所述的方法，其中所述單子葉植物病毒是玉米特異性病毒。33.如權利要求32所述的方法，其中所述胺基酸的類型是a)丙氨酸而所述密碼子使用頻率是GCA(0.31)、GCC(0.30)、GCG(O.ll)和GCT(0.28);b)精氨酸而所述密碼子使用頻率是AGA(0.27)、AGG(0.17)、CGA(0.12)、CGC(0.19)、CGG(0.12)和CGT(0.13);c)天冬醯胺而所述密碼子使用頻率是AAC(0.44)和AAT(0.56);d)天冬氨酸而所述密碼子使用頻率是GAC(0.41)和GAT(0.59);e)半胱氨酸而所述密碼子使用頻率是TGC(0.42)和TGT(0.58);f)穀氨醯胺而所述密碼子使用頻率是CAA(0.50)和CAG(0.50);g)穀氨酸而所述密碼子使用頻率是GAA(0.S2)和GAG(0.48);h)甘氨酸而所述密碼子使用頻率是GGA(0.36)、GGC(0.23)、GGG(0.17)和GGT(0.24);i)組氨酸而所述密碼子使用頻率是CAC(0.45)、CAT(0.55);j)異亮氨酸而所述密碼子使用頻率是ATA(0.27)、ATC(0.30)和ATT(0.43);k)亮氨酸而所述密碼子使用頻率是CTA(0.12)、CTC(0.22)、CTG(0.16)、CTT(0.19)、TTA(0.14)和TTG(0.18);1)賴氨酸而所述密碼子使用頻率是AAA(0.49)和AAG(0.51);m)苯丙氨酸而所述密碼子使用頻率是TTC(0J6)和TTT(0.44);n)脯氨酸而所述密碼子使用頻率是CCA(0.31)、CCC(0.20)、CCG(0.17)和CCT(0.32);o)絲氨酸而所述密碼子使用頻率是AGC(0.12)、AGT(0.12)、TCA(0.22)、TCC(0.21)、TCG(0.IO)和TCT(0.22);p)蘇氨酸而所述密碼子使用頻率是ACA(0.32)、ACC(0.26)、(0.13)和ACT(0.29);q)酪氨酸而所述密碼子使用頻率是TAC(O.M)和TAT(0.54);或者r)纈氨酸而所述密碼子使用頻率是GTA(0.16)、GTC(0.25),GTG(0.26)和GTT(0.33)。34.如權利要求32所述的方法，其中所述在一種或多種植物病毒中的使用頻率是基於編碼玉米病毒外殼多肽和衣殼多肽的核酸分子。35.如權利要求32所述的方法，其中所述胺基酸類型是a)丙氨酸而所述密碼子使用頻率是GCA(0.38)、GCC(0.22)、GCG(O.M)和GCT(0.26);b)精氨酸而所述密碼子使用頻率是AGA(0.30)、AGG(0.18)、CGA(0.18)、CGC(0.16)、CGG(0.11)和CGT(0.07);c)天冬醯胺而所述密碼子使用頻率是AAC(0.53)和AAT(0.47);d)天冬氨酸而所述密碼子使用頻率是GAC(0.45)和GAT(0.55);e)半胱氨酸而所述密碼子使用頻率是TGC(0.53)和TGT(O.47);f)穀氨醯胺而所述密碼子^f吏用頻率是CAA(0.52)和CAG(0.48);f)穀氨醯胺而所述密碼子使用頻率是GAA(0.44)和GAG(0.56);h)甘氨酸而所述密碼子使用頻率是GGA(0.42)、GGC(0.18)、GGG(0.23)和GGT(0.18);i)組氨酸而所述密碼子使用頻率是CAC(0.35)和CAT(0.65);j)異亮氨酸而所述密碼子使用頻率是ATA(0.24)、ATC(0.36)和ATT(0.40);k)亮氨酸而所述密碼子使用頻率是CTA(0.12)、CTC(0.18)、CTG(0.25)、CTT(0.12)、TTA(0.10)和TTG(0.23);1)賴氨酸而所述密碼子使用頻率是AAA(0.48)和AAG(0.52);m)苯丙氨酸而所述密碼子使用頻率是TTC(0.57)和TTT(0.43);n)脯氨酸而所述密碼子使用頻率是CCA(0.32)、CCC(0.24)、CCG(0.12)和CCT(0.32);o)絲氨酸而所述密碼子使用頻率是AGC(0.19)、AGT(0.13)、TCA(0.21)、TCC(0.26)、TCG(0.06)和TCT(0.15);p)蘇氨酸而所述密碼子使用頻率是ACA(0.36)、ACC(0.27)、ACG(0.06)和ACT(0.31);q)酪氨酸而所述密碼子使用頻率是TAC(041)和TAT(0.59》或者r)纈氨酸而所述密碼子使用頻率是GTA(0.15)、GTC(0.26),GTG(0.36)和GTT(0.23)。36.如權利要求29所述的方法，其中所述一種或多種植物病毒是雙子葉植物病毒。37.如權利要求36所述的方法，其中所述胺基酸類型是a)丙氨酸而所述密碼子使用頻率是GCA(0.33)、GCC(0.21)、GCG(0.13)和GCT(0.33);b)精氨酸而所述密碼子使用頻率是AGA(0.34)、AGG(0.23)、CGA(0.11)、CGC(0.09)、CGG(0.08)和CGT(0.15);c)天冬醯胺而所述密碼子使用頻率是AAC(0.41)和AAT(0.59);d)天冬氨酸而所述密碼子使用頻率是GAC(0.37)和GAT(0.63);e)半胱氨酸而所述密碼子使用頻率是TGC(0.41)和TGT(0.59);f)穀氨醯胺而所述密碼子使用頻率是CAA(0.60)和CAG(0.40);g)穀氨酸而所述密碼子使用頻率是GAA(0石1)和GAG(0.39);h)甘氨酸而所述密碼子使用頻率是GGA(0.35)、GGC(0.18)、GGG(0.18)和GGT(0.29);i)組氨酸而所述密碼子使用頻率是CAC(0.43)和CAT(0.57);j)異亮氨酸而所述密碼子使用頻率是ATA(0.31)、ATC(0.28)和ATT(0.41);k)亮氨酸而所述密碼子使用頻率是CTA(0.12)、CTC(0.14)、CTG(0.12)、CTT(0.19)、TTA(0.22)和TTG(0.21);1)賴氨酸而所述密碼子使用頻率是AAA(0.54)和AAG(0.46);m)苯丙氨酸而所述密碼子使用頻率是TTC(0.44)和TTT(0.56);n)脯氨酸而所述密碼子使用頻率是CCA(0.38)、CCC(0.18)、CCG(0.12)和CCT(0.31);o)絲氨酸而所述密碼子使用頻率是AGC(0.14)、AGT(0.20)、TCA(0.23)、TCC(0.14)、TCG(0.08)和TCT(0.21);p)蘇氨酸而所述密碼子使用頻率是ACA(0.36)、ACC(0.20)、ACG(0.14)和ACT(0.31);q)酪氨酸而所述密碼子使用頻率是TAC(0.41)和TAT(0.59》或者r)纈氨酸而所述密碼子使用頻率是GTA(0.19)、GTC(0.21),GTG(0.25)和GTT(0.35).38.如權利要求36所述的方法，其中所述在一種或多種植物病毒中的使用頻率是基於編碼雙子葉植物病毒外殼多肽和衣殼多肽的核酸分子。39.如權利要求38所述的方法，其中所述胺基酸類型是a)丙氨酸而所述密碼子使用頻率是GCA(0.24)、GCC(0.27)、GCG(0.15)和GCT(0.34);b)精氨酸而所述密碼子使用頻率是AGA(0.24)、AGG(0.22)、CGA(0.12)、CGC(O.IO)、CGG(0.1l)和CGT(0.21);c)天冬醯胺而所述密碼子使用頻率是AAC(0.44)和AAT(0.56);d)天冬氨酸而所述密碼子使用頻率是GAC(0.32)和GAT(0.68);e)半胱氨酸而所述密碼子使用頻率是TGC(0.25)和TGT(0.75);f)穀氨醯胺而所述密碼子使用頻率是CAA(0.59)和CAG(0.41);g)穀氨酸而所述密碼子使用頻率是GAA(0.61)和GAG(0.39);h)甘氨酸而所述密碼子使用頻率是GGA(0.32)、GGC(0.20)、GGG(0.18)和GGT(0.30);i)組氨酸而所述密碼子使用頻率是CAC(0.35)和CAT(0.65);j)異亮氨酸而所述密碼子使用頻率是ATA(0.39)、ATC(0.26)和ATT(0.35);k)亮氨酸而所述密碼子使用頻率是CTA(O.IO)、CTC(O.B)、CTG(0.12)、CTT(O.M)、TTA(0.28)和TTG(0.23);1)賴氨酸而所述密碼子使用頻率是AAA(0.45)和AAG(0.55);m)苯丙氨酸而所述密碼子使用頻率是TTC(0.47)和TTT(0.53);n)脯氨酸而所述密碼子使用頻率是CCA(0.27)、CCC(0.27)、CCG(O.M)和CCT(0.33);o)絲氨酸而所述密碼子使用頻率是AGC(0.15)、AGT(0.19)、TCA(0.18)、TCC(0.14)、TCG(0.11)和TCT(0.24);p)蘇氨酸而所述密碼子使用頻率是ACA(0.25)、ACC(0.25)、ACG(0.16)和ACT(0.34);q)酪氨酸而所述密碼子使用頻率是TAG(0.37)和TAT(0.63);或者r)纈氨酸而所述密碼子使用頻率是GTA(0.17)、GTC(0.23)、GTG(0.25)和GTT(0.35)。40.如權利要求36所述的方法，其中所述一種或多種雙子葉植物病毒是大豆特異性病毒。41.如權利要求l所述的方法，其中所述多肽是殺蟲性多肽。42.如權利要求41所述的方法，其中所述殺蟲性多肽是基於來自於蘇雲金桿菌(5ac說w"/w"'"gr'e"化')或米根黴(w^flre)的多肽進行過密碼子優化的多肽。43.如權利要求42所述的方法，其中所述殺蟲性蘇雲金桿菌多肽是437N。44.如權利要求43所迷的方法，其中所述密碼子優化的多肽殺蟲性蘇雲金桿菌多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。45.如權利要求42所述的方法，其中所述殺蟲性^旅#多肽是殺蟲性脂肪酶。46.如權利要求45所述的方法，其中所述密碼子優化殺蟲性^旅#多肽包含SEQIDNO:4的胺基酸序列。47.含有至少一個更改密碼子的核酸分子，其中所述核酸分子根據權利要求1所述的方法進行設計。48.如權利要求47所述的核酸分子，其中所述核酸分子編碼殺蟲性多肽。49.如權利要求48所述的核酸分子，其中所述殺蟲性多肽是基於來自於蘇雲金桿菌或米根黴的多肽進行過密碼子優化的多肽。50.如權利要求49所述的核酸分子，其中所述殺蟲性蘇雲金桿菌多肽是437N。51.如權利要求50所述的核酸分子，其中所述密碼子優化的殺蟲性蘇雲金桿菌多肽包含SEQIDNO:l的序列。52.如權利要求49所述的核酸分子，其中所述殺蟲性末旅#多肽是殺蟲性脂肪酶。53.如權利要求52所述的核酸分子，其中所述密碼子優化殺蟲性^孩#多肽包含SEQIDNO:3的序列。54.含有序列SEQIDNO:l或其互補物的核酸分子。55.含有序列SEQIDNO:3或其互補物的核酸分子。56.包含權利要求53或54中任一項所述的核酸分子的載體。57.含有權利要求56所述的核酸分子的轉基因植物及其後代。58.如權利要求57所述的轉基因植物，其中所述後代是種子。59.如權利要求57所述的轉基因植物，其中所述轉基因植物是單子葉植物。60.如權利要求59所述的轉基因植物，其中所述轉基因植物選自由大麥、玉米、粟、燕麥、水稻和小麥組成的組。61.如權利要求57所述的轉基因植物，其中所述轉基因植物是雙子葉才直物。62.如權利要求61所述的轉基因植物，其中所述轉基因植物選自由馬鈴薯、大豆、菸草、棉花和西紅柿組成的組。全文摘要本發明涉及設計核酸的方法以提高植物中所編碼的多肽的表達。在所述方法中，密碼子使用頻率偏好於植物病毒、植物病毒組或源自其的一組核酸分子的密碼子使用頻率。在優選實施方式中，所編碼的多肽影響所述植物的表型。本發明還涉及對殺蟲性多肽進行編碼的核酸分子，其中所述核酸分子經設計是植物病毒密碼子偏好的。本發明還涉及具有提高的殺蟲性多肽表達的轉基因植物及其後代以具有對昆蟲或其他害蟲的提高的抵抗力，所述昆蟲或其他害蟲對具有農業價值的植物有害。文檔編號C12N15/67GK101238215SQ200680019920公開日2008年8月6日申請日期2006年4月4日優先權日2005年4月5日發明者A·R·阿巴德,B·F·麥卡琴,R·D·弗蘭納根,R·赫爾曼,卡爾·R·西蒙斯,盧偉柏申請人:先鋒高級育種國際公司;納幕爾杜邦公司