局部應用基因載體的疫苗接種的製作方法

2023-10-17 18:03:19

專利名稱：局部應用基因載體的疫苗接種的製作方法
本申請要求1997年8月13日提交的美國臨時申請第60/055,520號和1998年2月11日提交的美國臨時申請第60/075,113號的優先權。
背景技術：
發明領域本發明一般涉及免疫學和疫苗技術學領域。更具體地講，本發明涉及皮膚定向的非侵襲性基因傳遞以引發免疫應答的技術及其用途。
相關領域的描述脊椎動物免疫系統的激活是保護動物抗病原體和惡性腫瘤的重要機理。免疫系統由包括體液和細胞分枝的許多互作組分組成。體液免疫涉及直接結合抗原的抗體。B淋巴細胞分泌作為體液免疫效應物的抗體分子。細胞免疫涉及識別並殺傷產生非自身抗原的其它細胞的特化的細胞毒T淋巴細胞(CTL)。CTL對降解的肽片段產生應答，所述肽片斷出現於結合MHC(主要組織相容性複合體)I類分子的靶細胞表面。當然，在所述細胞中產生的蛋白作為細胞代謝的組成部分不斷降解成為肽。這些片段結合到所述MHC分子並轉運到所述細胞表面。因此，細胞免疫系統恆定地監測在機體細胞中產生的蛋白譜，並準備著消除任何產生非自身抗原的細胞。
疫苗接種是引發動物對抗原產生應答的方法。給予的抗原可以是蛋白質(經典型)或隨後表達所述抗原的基因(基因免疫)。所述方法涉及T和B淋巴細胞、其它類型的淋巴樣細胞以及特異性抗原提呈細胞(APC)，所述抗原提呈細胞可以加工所述抗原並以可激活免疫系統的形式提呈該抗原。給予基因疫苗的現有方式集中於侵襲性方法，所述侵襲性方法包括針注射、劃痕和基因槍介導的穿透。以侵襲性方式接種疫苗需要設備和經特殊醫療訓練的人員，並且常常伴隨不舒適和潛在危害(出血、感染)。目前有證據顯示，以侵襲性方式接種疫苗可能是非必要的(Tang等，1997；Glenn等，1998)。因為所述皮膚直接與外界環境接觸並不斷與潛在病菌原體接觸，所以，免疫系統必須恆定地沿所述皮膚邊緣保持一個流動生物部隊以防止潛在感染。因此，所述皮膚外表層本質上是免疫活性組織。存在於皮膚以引發體液和細胞毒性細胞免疫應答的免疫組分，包括表皮朗格漢斯細胞(它是MHC II類陽性的抗原提呈細胞)、角質細胞以及CD4+和CD8+T淋巴細胞。這些組分使得所述皮膚成為給予疫苗的理想部位。皮膚的大量可用面積和其持久性是將疫苗應用於該組織的其它優勢。在皮膚外表層表達小量抗原而不需要物理穿刺由此使所述免疫監視機制警戒，從而引發有效的免疫應答。
用隨後對腫瘤或病原體攻擊的保護程度測定疫苗的效力。有效疫苗是在最小量接種後可誘導高滴度和持久免疫的免疫原，以用於定向幹預疾病。例如，基因免疫是通過在動物自身細胞中表達編碼所述蛋白的基因從而引發針對特定蛋白的免疫應答的方法。大量抗原的擴增和體內持續抗原提呈產生的免疫刺激可以誘導抗所述抗原的穩固免疫。基因免疫使針對特定蛋白產生免疫應答的接種方案簡化，因為它去除了疫苗研製均常規需要而通常麻煩的蛋白純化和與佐劑結合的步驟。因為基因免疫不需要分離蛋白質，所以它對生化純化時可能喪失構象表位的蛋白質特別重要。基因疫苗也可以組合給予而不產生幹擾或影響效力(Tang等，1992；Barry等，1995)，它可以使針對多種抗原的接種方案簡化。如本申請所介紹的一樣，已經證實，基因疫苗可以以皮膚定向非侵襲性疫苗的新方式接種。基因疫苗與非侵襲性傳送方式結合，可以產生新類型的不需要特殊使用技能和裝置給予的「平民」疫苗。
儘管已經研究了局部應用基於蛋白的疫苗，但是其用途可能是有限的。雖然可以以已經說明(Tang等，1997)的皮膚定向非侵襲性基因疫苗相同的非侵襲方式(Glenn等，1998)，局部應用基於蛋白的疫苗和霍亂毒素也可以免疫動物，但是，這兩種類型的疫苗通過不同的機制激活免疫系統。此外，由於類似於自然感染的從新合成抗原，使得基因疫苗的效力一般高於蛋白疫苗(McDonnell和Askari，1996)。儘管美國專利第3,837,340號描述了用乾燥的病毒接觸皮膚接種動物的方法，但是他們所用的病毒不是能夠表達轉基因的基因載體。另外，所述免疫原可能是病毒外殼蛋白，而不是由在動物自身細胞中表達病毒基因產生的蛋白。
現有的接種技術通常需要設備(例如注射針或基因槍)和給予疫苗的特殊技能。該領域極其需要和希望通過非醫療訓練人員且不需要裝置從而接種疫苗。因為所述方法是簡單、有效、經濟、無痛和潛在安全的，所以，通過非侵襲性接種到所述皮膚(NIVS)的發展可潛在地針對許多疾病進行免疫。因此，NIVS可以在醫療資源短缺的發展中國家以及由於病人舒適性從而在發達國家增加疫苗覆蓋範圍。可以用不需要特殊的裝置和醫療人員的皮膚定向非侵襲性疫苗，預防或治療所有由病毒(包括AIDS和流感)、細菌(包括破傷風和TB)、寄生蟲(包括瘧疾)引起的傳染病和惡性腫瘤(包括各種癌症類型)。本發明滿足所述領域中長期存在的需要和希望。
發明概述因為皮膚是免疫活性組織並且該非侵襲性方法不需要特殊訓練的人員，所以非侵襲性接種到所述皮膚(NIVS)可以改善接種方法。皮膚定向非侵襲性基因傳遞可以達到在所述皮膚中定位的轉基因表達並引發免疫應答(Tang等，1997)。這些結果表明，NIVS是一種傳送疫苗的新的有效方法。本發明簡單、有效、經濟和無痛的免疫方案應該使得接種較少依賴醫療資源，並由此增加接種的年使用率。
本發明提供免疫動物的方法，包括以下步驟皮膚定向非侵襲性傳遞包含基因載體的製劑，因此所述載體被表皮細胞攝取，並對脊椎動物具有免疫效應。也提供通過傳遞裝置免疫動物的方法，包括以下步驟將基因載體配置在所述傳遞裝置中，並用限定在所述裝置中的均勻劑量的遺傳物質接觸脊椎動物的裸露皮膚，由此所述載體被表皮細胞攝取用於在所述免疫活性皮膚組織中表達特定抗原。所述基因載體可以是腺病毒重組體、DNA/腺病毒複合體、DNA/脂質體複合體或能夠在脊椎動物皮膚中表達抗原的任何其它基因載體。
在本發明的一個實施例方案中，提供了誘導免疫應答的方法，包括以下步驟通過局給予所述皮膚免疫有效濃度的編碼目的基因的基因載體，從而接觸需要這種治療的個體或動物的皮膚。
在本發明的另一個實施方案中，提供了在需要這種治療的個體或動物中誘導保護性免疫應答的方法，包括以下步驟通過局部給予所述皮膚免疫有效濃度的編碼基因的基因載體，從而接觸所述動物的皮膚，所述基因編碼在給予後在所述個體或動物中誘導保護性免疫效應的抗原。
在又一實施方案中，本發明提供通過用DNA/腺病毒複合體接觸裸露皮膚從而在同一細胞中共表達轉基因的方法。該方案使得可以通過在相同細胞環境中與抗原一起共同產生細胞因子、共同刺激分子或其它免疫調節劑，從而操縱免疫系統。
本發明還包括傳遞皮膚定向非侵襲性疫苗的傳遞裝置(繃帶、粘性敷料等)的應用。
本發明包括在本文所述方法中設想的所有用途的所有基因載體。從以說明為目的本發明現有優選實施方案的以下描述，可明顯看出本發明的其它以及另外的方面、特徵和優勢。
附圖簡述為了實現並詳細了解本發明上述特徵、優勢和目的以及清楚明顯的其它方面，參照在附圖中說明的某些實施方案，可以更具體描述以上簡要概述的本發明。這些附圖組成本說明書的一部分。然而，值得注意的是，所述


本發明的優選實施方案，而不應認為是限制其範圍。
圖1顯示在局部應用所述載體的皮膚中腺病毒重組體的轉基因表達；圖2a和2b顯示由局部應用的腺病毒重組體轉導的潛在靶細胞的特徵鑑定；圖3a和3b顯示在腺病毒介導的NIVS免疫小鼠血清中的特異性抗體的檢測；圖4顯示用致死劑量的腫瘤細胞攻擊的對照小鼠與免疫小鼠的百分存活率；圖5顯示腫瘤浸潤的T淋巴細胞的特徵鑑定；圖6顯示腫瘤浸潤的CTL的特徵鑑定；圖7顯示抗體與用疫苗繃帶局部應用免疫小鼠中的人CEA蛋白的蛋白質印跡分析；圖8a顯示DNA/腺病毒介導的NIVS免疫小鼠血清中的特異性抗體的檢測；圖8b顯示DNA/脂質體介導的NIVS免疫小鼠血清中的特異性抗體的檢測；圖9顯示DNA編碼的轉基因和腺病毒編碼的轉基因在靶細胞中的共表達；圖10顯示局部應用的腺病毒重組體、DNA/腺病毒複合體和DNA/脂質體複合體的相對的轉基因表達；圖11顯示給予皮膚定向非侵襲性疫苗的裝置。
發明詳述本發明涉及誘導免疫應答的方法，包括以下步驟用免疫有效濃度的包含目的基因的基因載體與需要這種治療的個體或動物皮膚外表層發生非物理侵襲的接觸，所述接觸時間適合對其引發免疫應答。採用本發明方法，可以用來產生免疫應答的抗原的典型實例包括人癌胚抗原、HIVgp120、破傷風毒素C片段和流感HA和NP等。最優選的是，所述免疫應答產生抗腫瘤或感染性病原體的保護效應。
實施本發明需要用非侵襲性方法將操作性編碼多肽的基因載體傳遞到脊椎動物皮膚外表層，以用於免疫所述動物。這些基因載體可以通過直接將遺傳物質轉移到所述皮膚而不用任何裝置，或者採用繃帶或繃帶樣裝置接觸裸露的皮膚，從而給予所述脊椎動物。在優選應用中，所述基因載體為水溶液。由凍乾粉重新配製的載體也是可接受的。所述載體可以編碼表達所必需的轉錄/翻譯信號一起、與免疫調節序列(諸如遍在蛋白或富含CpG的合成DNA)融合的完整基因、基因片段或者幾種基因、幾種基因片段。
在本發明另一實施方案中，所述載體還包含選自共同刺激基因和細胞因子基因的基因。在該方法中，所述基因選自GM-CSF基因、B7-1基因、B7-2基因、白介素-2基因、白介素-12基因和幹擾素基因。
在需要使用腺病毒重組體的本發明實施方案中，它可包括E1-缺陷型、E3-缺陷型和/或E4-缺陷型腺病毒載體，或其中所有病毒基因缺失的「無內容的」腺病毒載體。因為E1缺陷型腺病毒突變體不能在非容許細胞中複製，所以E1突變提高了所述載體的安全範圍。所述E3突變通過破壞腺病毒向下調節MHC I類分子的機制而提高所述抗原的免疫原性。所述E4突變通過抑制所述晚期基因表達從而降低所述腺病毒載體的免疫原性，由此使得可以用同一載體重複再接種。所述「無內容的」腺病毒載體是腺病毒載體家族中的最新模式。其複製需要輔助病毒和表達Ela和Cre兩者的特殊人293細胞系、天然環境中不存在的條件；所述載體失去了所有病毒基因，因此所述載體作為疫苗載體是無免疫原性並可以接種以用於多次再接種。所述「無內容的」腺病毒載體還含有36kb的空間用於容納轉基因，由此使得可以將大量抗原基因共同傳遞入細胞。可以將諸如RGD基元的特殊序列基元插入腺病毒載體的H-I環，以增強其感染性。將特定轉基因或轉基因片段克隆入任何諸如上述的腺病毒載體中從而構建腺病毒重組體。所述腺病毒重組體用來以非侵襲方式轉導脊椎動物的表皮細胞，以用作免疫劑。
在需要使用DNA/腺病毒複合體的本發明實施方案中，它需要利用或者PEI(聚乙烯亞胺)或聚賴氨酸與腺病毒載體複合的質粒DNA。在所述複合體中的腺病毒載體可以是「活的」或用UV輻射「殺死的」。作為受體結合配體和用於促進DNA介導的轉染的內滲劑(Cotton等，1992)的UV失活的腺病毒載體，可以提高所述疫苗載體的安全範圍。所述DNA/腺病毒複合體用來以非侵襲方式轉染脊椎動物的表皮細胞，以用作免疫劑。
在需要使用DNA/脂質體複合體的本發明實施方案中，它需要形成脂質體的材料，並由需要這些材料製備DNA/脂質體複合體。所述DNA/脂質體複合體用來以非侵襲方式轉染脊椎動物的表皮細胞，以用作免疫劑。
本發明提供的基因載體也可以編碼免疫調節分子，所述分子可以用作佐劑以誘發體液和/或細胞免疫應答。這類分子包括細胞因子、共同刺激分子或可以改變免疫應答過程的任何分子。人們可以設想其中該技術可以修改以進一步增強抗原的免疫性的途徑。
用於NIVS的基因載體可以採取任何數目的形式，而本發明不限於任何編碼任何特定多肽的特定基因材料。包括病毒載體、細菌載體、原生動物載體和DNA載體的所有形式的基因載體，當這些基因載體用作皮膚定向非侵襲性疫苗的載體時，均在本發明設想的方法以內。
所述基因可以用各種方法傳遞，所述方法包括不用裝置的局部應用或用諸如墊片或繃帶(例如粘性繃帶)的裝置將所述基因塗抹在所述皮膚表面。參照圖11，顯示用於非侵襲性接種的裝置。該疫苗傳遞裝置包括其中配置小泡的非過敏性皮膚粘性貼劑。在一個實施方案中，所述貼劑還包含約1cm直徑的塑料。所述疫苗配置在所述泡中。在另一實施方案中，所述泡含有約1mL的疫苗(為液體、帶有重新配製的凍乾粉、和其變異體)。在一個優選實施方案中，與所述皮膚接觸的泡表面強度有意地較其相對面弱，使得當施加壓力到所述相對面時，強度較弱的一面破裂並釋放出所述泡內的疫苗內容物到所述皮膚。所述塑料貼劑將所述疫苗貼於皮膚表面。
局部給予本發明基因載體和目的基因的劑型包括液體、軟膏劑、粉劑和噴霧劑。所述活性組分可以在無菌條件下與生理可接受載體和任何防腐劑、緩衝劑、噴射劑或可能需要的吸收增強劑混合。
按照本文所用的術語學，免疫有效量為編碼所述目的基因的基因載體當給予動物時、對所述目的基因產物產生免疫應答的量或濃度。
各種抗原可以以不同濃度局部給予。一般而言，腺病毒載體的用量至少約100pfu，而質粒DNA至少約1ngDNA。
本發明方法可適當地用於預防接種以預防疾病或用於治療接種以治療疾病。
本發明的疫苗可以單獨或者作為免疫組合物的一部分給予動物。
除了上述人用疫苗外，本發明方法可用來免疫動物牲畜。術語動物是指包括人類的所有動物。動物實例包括人類、乳牛、狗、貓、山羊、綿羊和豬等。因為所有脊椎動物的免疫系統運行相似，所以所述應用可以在所有脊椎動物系統中實施。
給出以下實例為的是說明本發明各種實施方案，而不是以任何方式限制本發明。方法小鼠和細胞培養物近交小鼠保持在Birmingham的Alabama大學。細胞培養在含2％胎牛血清和6％小牛血清的RPMI 1640或DMEM培養基中。基因載體的局部應用麻醉小鼠，並用脫毛劑(例如NAIR)去除腹部或頸部有限範圍皮膚上覆蓋的毛和角質化上皮。將基因載體吸取到預先剃刮並用NAIR處理的皮膚上，使其與裸露皮膚接觸不同時間(例如1-8小時)。載體可以直接吸取到裸露皮膚上或吸入粘附到所述皮膚上的圓筒中。腺病毒載體的製備從特定腺病毒重組體感染的人293細胞製備高滴度的腺病毒母液。裂解液通過氯化銫梯度進行超速離心。取出病毒帶並對10mMTris(pH7.5)/135mM NaCl/5mM KCl/1mM MgCl2進行透析。純化的病毒與加至10％的甘油一起過濾除菌，並等份貯藏於-80℃。用噬菌斑測定檢測腺病毒母液的滴度。螢光素酶測定如前所述(Tang，1994)測定所述皮膚中的螢光素酶的量。簡而言之，用Kontes玻璃組織研磨器在裂解緩衝液中勻漿切取的皮膚片。在離心去除組織碎片後，在存在過量ATP和螢光素的情況下用發光計通過測量總光發射，檢測所述皮膚提取物中的螢光素酶活性。β-半乳糖苷酶測定將切取的皮膚片快速冷凍於液氮中的Tissue-Tek O.C.T.化合物(Miles Laboratories Inc.)中並貯存於-80℃待用。所述冷凍組織以4μm橫切切片，固定於4％低聚甲醛中，如前所述(Tang，1994)通過在X-gal染色液中溫育染色以檢測β半乳糖苷酶活性。切片用蘇木精和伊紅復染。DNA/腺病毒複合體的製備在存在凝聚劑聚賴氨酸的情況下混合100μg質粒DNA和1×1011腺病毒顆粒，製備DNA/腺病毒複合體用於各種用途。用吸光度檢測定腺病毒的滴度。DNA/脂質體複合物的製備通過混合100μg質粒DNA和100μg DOTAP/DOPE(1∶1；Avanti)，從而製備DNA/脂質體複合體以用於各種用途。用QiagenPlasmid Maxi試劑盒製備質粒。蛋白質印跡分析將鼠尾血的血清1∶250至1∶500稀釋，與已經在SDS-聚丙烯醯胺凝膠中分離的純化蛋白反應，並轉移到Immobilon-P膜(Millipore)。用ECL試劑盒(Amersham)進行顯色反應。
實施例1本發明證實，不用複雜的設備，通過皮膚定向非侵襲性傳遞基因載體，可以使抗原基因以簡化的形式傳遞到小鼠皮膚中。圖1表明，傳遞有限量的AdCMV-luc(編碼熒火蟲螢光素酶的腺病毒載體)(Tang等，1994)到所述皮膚後產生大量螢光素酶。Ad，腺病毒；pfu，蝕斑形成單位；LU，光單位。結果為平均值log[LU/cm2皮膚]±SE(n標示於每個柱頂端)。用不編碼螢光素酶的腺病毒載體模擬使用或塗抹的小鼠，在所述皮膚中不產生可檢測的螢光素酶活性。腺病毒載體在所述皮膚中的轉基因表達水平看來與所述病毒滴度無關。有可能的是，僅皮膚有限亞群中的少量細胞被所述病毒轉導，而108蝕斑形成單位(pfu)的腺病毒重組體可能已經飽和了所述靶細胞。該變異性也可能部分是由各個小鼠的變異引起的。另外，某些變異性可能是由仍未標準化的去除角質上皮的方法(Johnston和Tang，1994)引起的。通過將更多的載體接種到更大面積皮膚，可以潛在增加所產生的抗原量。
實施例2正如皮膚定向非侵襲性傳遞編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因(AdCMV-βgal)的腺病毒載體(Tang等，1994)後，用X-gal底物染色的冷凍切片所示，看來非侵襲性接種到所述皮膚的主要靶細胞是毛囊中的毛母質細胞(圖2a)和表皮最外層的角質細胞(圖2b)。在經受所述處理的皮膚組織中未發現物理性擦傷，並沒有誘發的炎症。吸取108pfu AdCMV-βgal到所述皮膚後1天，從動物切取經受非侵襲性基因傳遞的皮膚組織，橫向切片，固定，並如所述用X-gal底物染色(Tang等，1994)。圖2a顯示毛囊中的腺病毒轉導的毛母質細胞(×150)。圖2b顯示錶皮最外層中腺病毒轉導的角質細胞(×150)。在用AdCMV-luc或者模擬使用或者塗抹的對照動物中未發現藍色細胞。
實施例3腺病毒介導的NIVS誘發體液免疫應答NIVS是一種接種動物的新方法。為了證實所述方法可以對所述載體編碼的抗原誘發特異性免疫應答，將AdCMV-hcea[編碼人癌胚抗原(CEA)的腺病毒載體]吸取到C57BL/6株小鼠的皮膚上。將皮膚定向非侵襲性傳遞108pfu AdCMV-hcea後1個月的接種小鼠的血清1∶500稀釋，與已經在5％SDS-聚丙烯醯胺凝膠中分離的純化人CEA蛋白(T.Strong提供)和腺病毒蛋白反應，並轉移到Immobilon-P膜(Millipore)上。參照圖3a，泳道1，0.5μg人CEA；泳道2，0.5μg BSA；泳道3，107pfu腺病毒。圖3a顯示，接種動物的測試血清在蛋白質印跡分析中與純化人CEA蛋白反應，但是不與牛血清白蛋白(BSA)反應，它支持這樣的結論由於皮膚定向非侵襲性基因傳遞的結果，已經產生抗腺病毒載體編碼的外源蛋白的特異性抗體。
為了測試該技術是否可以普遍應用，把AdCMV-hgmcsf[編碼人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF)的腺病毒載體]接種到所述皮膚。為了檢測抗人GM-CSF蛋白的抗體，皮膚定向非侵襲性傳遞108pfu AdCMV-hgmcsf從而接種所述動物。將在15％SDS-聚丙烯醯胺凝膠中分離的純化人GM-CSF蛋白(CalBiochem)轉移到膜，並讓其與稀釋的血清反應。如圖3a中所述進行其它處理。參照圖3b，泳道1，0.25μg人GM-CSF；泳道2，0.25μg BSA；泳道3，107pfu腺病毒。在人293細胞中產生複製缺陷型人腺病毒血清型5衍生的AdCMV-hcea和AdCMV-hgmcsf。插入含有人CEA基因或人GM-CSF基因、由所述巨細胞病毒(CMV)早期增強子-啟動子元件驅動的盒以替代所述Ela缺失。因為所述Ela區中的序列缺失，所以這些病毒在非容許細胞中的自主複製能力受損。
結果(Tang等，1997)表明，96％(23/24)的C57BL/6株小鼠在皮膚定向非侵襲性傳遞AdCMV-hcea後一個月產生抗人CEA蛋白的抗體，43％(6/14)的相同株小鼠在皮膚定向非侵襲性傳遞AdCMV-hgmcsf後產生抗人GM-CSF蛋白的抗體。在NIVS前收集的免疫前血清和首次用於實驗的動物的血清均不能與人CEA和GM-CSF蛋白反應。消除了通過餵食(grooming)經攝食載體的口服接種的可能性，因為(1)在動物從麻醉狀態甦醒前從所述皮膚上衝洗掉載體，(2)將吸取載體到未剃刮皮膚上，和(3)混合同一個籠中的首次用於實驗的動物和接種動物。在首次用於實驗的小鼠和接種小鼠之間未觀察到交叉接種，推測由於沿剃刮路徑機械性去除了角質化上皮，因此看來剃刮是NIVS的基本組成部分。因此，腺病毒介導的NIVS能夠引發抗所述載體編碼的抗原的體液免疫應答。
實施例4為了證實本發明技術可以引發保護性抗腫瘤免疫應答，把表達人癌胚抗原(CEA)基因(MC38-CEA-2)(Conry等，1995)的同源腫瘤細胞接種到首次用於實驗的C57BL/6株小鼠和已經局部應用編碼人CEA基因(AdCMV-hcea)的腺病毒載體的相同株的小鼠。觀察經受腫瘤攻擊的動物存活率(圖4)。在對照組中，90％(9/10)動物產生可觸知的腫瘤小結並在腫瘤細胞移植後30天內死亡。在接種組中，僅10％(1/10)的所述動物死亡，其中70％(7/10)保持完全無腫瘤。當所述腫瘤直徑超過1cm時無痛處死小鼠。注射腫瘤細胞與無痛處死之間的時間用作所述個體的存活時間。參照圖4，對照小鼠(未給予疫苗)和NIVS免疫動物(一個月前局部應用107pfu AdCMV-hcea)經受腫瘤攻擊。括號內數字表示每個處理組的動物數。結果表明，非侵襲性傳遞基因疫苗到所述皮膚能夠引發抗表達特定抗原的腫瘤細胞的保護性免疫應答。
實施例5編碼細胞因子基因和共同刺激基因的重組腺病毒載體的構建構建用於共同傳遞這些免疫調節調節基因和抗原基因到皮膚細胞的編碼共同刺激基因和細胞因子基因的腺病毒載體，以試圖在接種動物中控制所述免疫分布型。按照產生新腺病毒載體的標準方法(Gomez-Foix等，1992)，通過在人293細胞的兩種轉染質粒之間的同源重組，構建編碼鼠B7-1基因的腺病毒載體AdCMV-mB7.1和構建編碼鼠GM-CSF基因的腺病毒載體AdCMV-mgmcsf。在這些載體中的所有轉基因均由CMV早期增強子-啟動子元件驅動轉錄。通過用抗CD80抗體(PharMingen)染色轉導的人肺癌SCC-5細胞，然後進行流式細胞分析，從而特徵鑑定AdCMV-mB7.1。通過用ELISA試劑盒(Amersham)檢測轉導的SCC-5細胞分泌的鼠GM-CSF，從而特徵鑑定AdCMV-mgmcsf。
實施例6用體內細胞毒性分析檢測抗腫瘤免疫開發了體內細胞毒性分析，其中靶細胞以單層植入到小鼠的肌肉組織上(Tang等，1996)。靶細胞以單層植入使得可以有效重新取出靶細胞，用於評估體內生長數天後的結果。該分析法特別用於檢測不足以有效消除靶細胞的弱免疫應答。所述植入床的組織學分析可以特徵鑑定免疫應答。如果無免疫應答，靶細胞就會生長。如果是強力免疫應答，在所述植入床存在大量免疫效應細胞的情況下，應該可以消除靶細胞，所述免疫效應細胞可能是遷移到植入床部位和在生長的靶細胞周圍原位致敏而產生。如果是弱免疫應答，生長的靶細胞將與所述植入床中的浸潤的免疫效應細胞摻雜。以單層植入5×105RM1-luc細胞[表達所述螢光素酶基因的RM1前列腺腫瘤細胞]到首次用於實驗的C57BL/6小鼠，使得因體內RM1-luc細胞增殖產生腫瘤層，而無免疫幹預的證據。與對照動物相反，在通過皮膚定向非侵襲性傳遞AdCMV-luc接種的動物中，RM1-luc細胞與所述植入床中的大量免疫效應細胞摻雜。
實施例7腫瘤細胞募集的免疫效應細胞的特徵鑑定所述體內細胞毒性分析通過以單層植入少量靶細胞到肌肉中，能夠在所述植入床部位集中大量免疫效應細胞。在所述植入床的特異性免疫效應細胞的特徵鑑定，可以提供是否已經引發殺傷靶細胞的細胞介導的免疫應答的證據。為了特徵鑑定在皮膚定向非侵襲性傳遞AdCMV-luc接種的動物中由螢光素酶表達腫瘤細胞募集的T細胞，用抗CD3單克隆抗體(mAb)染色所述植入床的組織切片。通過脂質轉染pHBA-luc DNA入RM1前列腺腫瘤細胞(由Baylor College ofMedicine的T.Thompson提供)，然後在含G418的培養液中選擇，從而產生RM1-luc細胞。用螢光素酶分析特徵鑑定表達螢光素酶的克隆。以單層植入5×105RM1-luc細胞到小鼠，所述小鼠已經通過皮膚定向非侵襲性傳遞108pfu AdCMV-luc接種。植入後5天，在O.C.T.中冷凍所述植入床，並以4μm切片，在100％丙酮中乾燥，通過用二氨基聯苯胺作色原的ABC免疫過氧化物方法，用抗CD3 mAb(克隆F500A2，由UAB的P.Bucy提供)染色。
如圖5所示，在RM1-luc細胞在皮膚定向非侵襲性傳遞AdCMV-luc(x150)接種的小鼠中體內生長5天後，大量T細胞浸潤入所述植入床，而在首次用於實驗的動物僅發現少量T細胞。看來相同數目的RM1-luc靶細胞在接種動物中較在首次用於實驗的動物中可以募集更多的T淋巴細胞到所述植入床。
為了特徵鑑定由靶細胞募集的CTL，用反義粒酶A RNA分子作探針使所述植入床的冰凍切片經受原位雜交。以單層植入5×105RM1-luc細胞到或者首次用於實驗的C57BL/6小鼠或者已經通過皮膚定向非侵襲性傳遞108pfu AdCMV-luc接種的小鼠。植入後5天，將所述植入床在O.C.T.中冷凍，並以4μm切片。冷凍切片在3％低聚甲醛中固定，在0.2M HCl中溫育以抑制內源性鹼性磷酸酶活性，並與熱變性的反義粒酶A RNA探針雜交。原位雜交的探針是從含噬菌體啟動子的質粒轉錄產生的單鏈RNA分子。在轉錄期間，洋地黃毒苷-UTP直接摻入所述序列。有義序列探針用作陰性對照。與探針雜交後，洗滌切片並與鹼性磷酶綴合的抗洋地黃毒苷抗體溫育，然後在NBT/BCIP酶底物溶液中溫育。
表達粒酶A的CTL是活化的CTL並已經用作移植期間的組織排斥的預測標記。僅在已經通過皮膚定向非侵襲性傳遞AdCMV-luc接種的動物中的RM1-luc植入床中發現粒酶陽性的CTL(圖6)。它們在所植入述床的存在提示，已經由NIVS誘導了抗表達特定抗原的腫瘤細胞的細胞介導的免疫應答。
實施例8用粘性繃帶局部應用基因疫苗首次證實，繃帶可以用於給予疫苗。該研製使得未經醫療訓練的人可以傳遞均一劑量的非侵襲性疫苗到所述皮膚。為了由繃帶轉導皮膚，吸取50μl的實施例7中所述AdCMV-luc載體到粘性繃帶的墊片(Johnson Johnson)。隨後將含載體的繃帶粘著到預先剃刮的小鼠皮膚。所述載體與裸露皮膚接觸18小時。為檢測繃帶傳遞的基因載體的轉基因表達，檢測所述皮膚的螢光素酶(表1)。儘管所述結果顯示相當大的變異，但是用粘性繃帶可以達到在所述皮膚中的轉基因表達。
為了證實可以用非侵襲性粘性繃帶接種動物，將含AdCMV-hcea的繃帶粘到所述小鼠皮膚後2個月，檢測尾血血清的抗CEA抗體。如圖7所示，在100％通過粘性繃帶接受非侵襲疫苗的小鼠中檢測到抗CEA抗體。
實施例9DNA/腺病毒介導的NIVS通過將質粒DNA結合到腺病毒的外部，可以製備更多用途的基於腺病毒的載體。所產生的載體系統介導更高效地將基因傳遞到各種靶細胞。該方法使得在外源基因的大小和設計方面的適應性大大增加。因此DNA/腺病毒複合體能夠通過具有更高適應性的相同腺病毒受體介導的胞吞途徑將抗原基因傳遞到所述皮膚。
為了證實DNA/腺病毒介導的NIVS的可行性，將編碼人生長激素(pCMV-GH)(Tang等，1992)的質粒DNA與E4缺陷型腺病毒複合。通過使DNA/腺病毒複合體與裸露的皮膚接觸1天從而接種小鼠(C57BL/6株)。隨後通過分析尾血血清，監測免疫動物的抗人生長激素蛋白(hGH)的抗體的產生。如圖8a所示，泳道1，hGH(0.5μg)；泳道2，BSA(0.5μg)，在蛋白質印跡分析中所述測試血清與純化的hGH反應，但是不與無關蛋白反應。在接種DNA/腺病毒複合體的10隻小鼠中，8隻(80％)在3個月內產生抗hGH抗體，表明能夠產生抗質粒DNA編碼的外源蛋白的特異性抗體，所述質粒DNA與腺病毒複合並以非侵襲性方式給予。處理前收集的免疫前血清、未處理動物血清和用無關載體接種的動物血清均不能與hGH反應。因此，DNA/腺病毒複合體象腺病毒重組體一樣，是用於NIVS的合理載體系統。實施例10DNA/脂質體介導的NIVS除了研製包含作為非侵襲性疫苗載體的腺病毒的基因載體外，也已經證實局部應用無病毒元件的DNA/脂質體複合體可以接種小鼠。顯而易見的是，許多不同的載體可以以創造性方式用於給予皮膚定向非侵襲性疫苗。如圖8b所示，泳道1，hGH(0.5μg)；泳道2，BSA(0.5μg)，局部應用編碼hGH的DNA/脂質體複合體免疫的小鼠的測試血清與hGH反應，但是不與BSA反應。在接種DNA/脂質體複合體的10隻小鼠中，在5個月內其中9隻(90％)處理動物的試驗血清與純化的hGH反應。因此，所述DNA/脂質體複合體象所述腺病毒和DNA/腺病毒複合體一樣，是用於NIVS的另一個合理的載體系統。
實施例11DNA編碼的轉基因和腺病毒編碼的轉基因的共表達增強免疫系統的應答的策略可能潛在地改善疫苗的臨床結果。局部產生涉及淋巴細胞群的活化和擴增的免疫調節分子，可以顯著改善所述接種的效果。已經製備了編碼鼠B7-1和GM-CSF基因的腺病毒載體。因此，局部應用DNA/腺病毒複合體可以在各個皮膚細胞中共表達DNA編碼的抗原或免疫調節分子和腺病毒編碼的抗原或免疫調節分子，以增強抗所述抗原的免疫應答。
圖9表明，在靶細胞中的質粒DNA的轉基因的表達取決於腺病毒的存在，因此使得質粒編碼的轉基因和腺病毒編碼的轉基因可以在相同細胞中共表達。如所述圖中所示，以特定比率混合pVR-1216質粒DNA(Vical提供)、AdCMV-βgal顆粒和聚賴氨酸。所述複合體施加於孔中的2×105SCC-5細胞並溫育2小時。然後去除所述複合體，第二天收集細胞用於螢光素酶和β-半乳糖苷酶分析。空心柱螢光素酶活性；實心柱β-半乳糖苷酶活性。結果表明，DNA編碼的轉基因在缺乏腺病毒的情況下不能在靶細胞中表達，而腺病毒編碼的轉基因可以在DNA存在的情況下表達。也可能的是，DNA可以凝聚在其它病毒表面以用於靶向不同細胞類型。因此，該方法提供簡單但是通用的基因傳遞系統，該系統使得可以同時表達來自病毒重組體和外部結合的質粒的轉基因。
實施例12局部應用的不同基因載體在所述皮膚中的相對的轉基因表達已經表明，腺病毒重組體、DNA/腺病毒複合體、DNA/脂質體複合體和許多其它可能的基因載體均可用作非侵襲性疫苗的載體。可以想像的是，轉基因表達的效率越高，所述載體的效能越大。為了確定所用載體的相對效率，使腺病毒重組體、DNA/腺病毒複合體或DNA/脂質複合體通過局部應用與小鼠皮膚接觸18小時。隨後從所述動物取出所述處理的皮膚，通過用Promega螢光素酶分析系統檢測2分鐘總的光發射，用發光計測定螢光素酶活性，並從所述讀數減去本底。如圖10所示，發現腺病毒重組體是用於皮膚定向非侵襲性基因傳遞的最高效載體系統。模擬處理小鼠在所述皮膚中未產生可檢測的螢光素酶活性。LU，光單位；Ad，AdCMV-luc；DNA/Ad，與Ad d11014複合的pVR-1216 DNA；DNA/脂質體，與DOTAP/DOPE複合的pVR-1216 DNA。結果為平均log[LU/cm2皮膚]±SE(n標示於每個柱的頂部)。儘管DNA/腺病毒複合體的效率低於腺病毒重組體，但是它顯著高於DNA/脂質體複合物。此外，在與DNA複合之前可用UV輻射使腺病毒失活，以防止活的病毒顆粒傳播。因此，當在配製新一代疫苗中把效力和安全因素均考慮在其中時，DNA/腺病毒複合體可能是最有希望用於傳遞非侵襲性疫苗的載體系統。
在本說明書中提及的任何專利或出版物是說明本發明涉及領域技術人員的水平。這些專利和出版物通過引用結合到本文中，其引用程度與每個出版物具體、單獨表明的引用結合程度相同。
所述領域技術人員應該容易認識到，可以很好修改本發明以實施所述目標，並實現所述的以及其固有目的和優勢。所述實施例與本文所述方法、步驟、處理、分子和特定化合物是當前典型的優選實施方案，是典型的實施方案，其目的不是限制本發明範圍。按所述權利要求書的範圍限定，對於本領域技術人員對其進行的修改和其它應用均包括在本發明的精神範圍內。
參考文獻以下是本文引用的參考文獻Barry，MA.等，採用表達文庫免疫的抗支原體感染的保護作用。Nature 377，632-635(1995).
Conry，R.M.等，用於人類臨床用途的癌胚抗原多核苷酸疫苗。Cancer Gene Ther.2，33-38(1995).
Cotton，M.等，採用缺陷失活或化學失活的腺病毒顆粒的內體破壞活性高效受體介導的小和大(48千鹼基)基因構成物的傳遞。Proc.Natl.Acad.Sci USA 89，6094-6098(1992).
Glenn，G.M.等，用霍亂毒素可能進行的皮膚免疫。Nature 391，851(1998).
Gomez-Foix等，腺病毒介導的將肌糖原磷酸化酶基因轉移入肝細胞提供改變的糖原代謝的調節。J.Biol.Chem.，267，25129-25134(1992).
Johnston，S.A.Tang，D.-c動物細胞的基因槍轉染和基因免疫。Meth.Cell Biol.43，353-365(1994).
McDonnell，W.M.Askari，F.K.DNA疫苗。New Engl.J.Med.334，42-45(1996).
Tang，D.-c.等，基因免疫是誘發免疫應答的簡單方法。Nature356，152-154(1992).
Tang，D.-c等，腺病毒載體的丁酸誘導型和限制於腫瘤的基因的表達。Cancer Gene Ther.1，15-20(1994).
Tang，D.-c等，用於評估免疫的體內細胞毒性測定。J.Immunol.Methods 189，173-182(1996).
Tang，D.-c.等，在裸露皮膚上的疫苗接種。Nature 388，729-730(1997).
表權利要求
1.一種非侵襲性誘導免疫應答的方法，包括以下步驟通過將免疫有效量的編碼目的轉基因的基因載體局部應用到所述皮膚，從而使其接觸需要這種治療的動物的皮膚。
2.權利要求1的方法，其中所述基因載體包括能夠表達轉基因的基因載體。
3.權利要求2的方法，其中所述基因載體選自病毒載體和質粒DNA。
4.權利要求2的方法，其中所述基因載體是腺病毒。
5.權利要求1的方法，其中所述轉基因編碼抗原或其片段。
6.權利要求5的方法，其中所述抗原或其片段可用來產生抗病原體或腫瘤的免疫應答。
7.權利要求5的方法，其中所述抗原基本上選自人癌胚抗原、HIV gp120抗原、破傷風毒素C片段和流感NP抗原和HA抗原。
8.權利要求1的方法，其中所述基因載體的免疫有效量對於腺病毒載體至少約100個蝕斑形成單位(pfu)，而對於質粒至少為1ngDNA。
9.權利要求2的方法，其中所述載體編碼免疫調節基因。
10.權利要求9的方法，其中所述載體還編碼共同刺激基因和細胞因子基因。
11.權利要求9的方法，其中所述免疫調節基因選自GM-CSF基因、B7-1基因、B7-2基因、白介素-2基因、白介素-12基因和幹擾素基因。
12.權利要求4的方法，其中所述腺病毒載體是其E1區缺陷型。
13.權利要求4的方法，其中所述腺病毒載體是其E4區缺陷型。
14.權利要求4的方法，其中所述腺病毒載體是其E3區缺陷型。
15.權利要求4的方法，其中所述載體缺失所有病毒基因。
16.權利要求3的方法，其中所述載體包括DNA/病毒複合體。
17.權利要求16的方法，其中所述DNA是質粒形式的DNA。
18.權利要求3的方法，其中所述載體包括DNA/脂質體複合體。
19.權利要求3的方法，其中所述載體包括編碼抗原或其片段的重組腺病毒。
20.權利要求1的方法，其中所述免疫應答產生抗感染性病原體或腫瘤的保護性效應。
21.權利要求1的方法，其中所述接觸步驟還包括在傳遞裝置中配置含有目的基因的基因載體，並將其中具有含所述目的基因的基因載體的裝置用於所述動物皮膚。
22.權利要求21的方法，其中所述裝置包括墊片。
23.權利要求21的方法，其中所述裝置包括粘性繃帶樣裝置。
24.在需要這種治療的動物中非侵襲性誘導抗腫瘤免疫應答的方法，包括以下步驟通過局部應用免疫有效濃度的含轉基因的載體到所述皮膚，從而使其接觸所述動物的皮膚，所述轉基因編碼抗原或其片段，所述抗原或其片段給予後在所述動物中誘導抗腫瘤效應。
25.權利要求24的方法，其中所述基因載體包括能夠表達轉基因的基因載體。
26.權利要求25的方法，其中所述基因載體選自病毒載體和質粒DNA。
27.權利要求25的方法，其中所述基因載體是腺病毒。
28.權利要求24的方法，其中所述轉基因編碼抗原或其片段。
29.權利要求28的方法，其中所述抗原或其片段可以用來產生抗腫瘤的免疫應答。
30.權利要求28的方法，其中編碼所述抗原的轉基因包括癌基因、腫瘤抑制基因和腫瘤相關基因。
31.權利要求24的方法，其中所述基因載體的免疫有效量對於腺病毒載體來說，至少約100個蝕斑形成單位(pfu)，而對於質粒至少為1ng DNA。
32.權利要求25的方法，其中所述載體編碼免疫調節基因。
33.權利要求32的方法，其中所述載體還編碼共同刺激基因和細胞因子基因。
34.權利要求32的方法，其中所述免疫調節基因選自GM-CSF基因、B7-1基因、B7-2基因、白介素-2基因、白介素-12基因和幹擾素基因。
35.權利要求27的方法，其中所述腺病毒載體是其E1區缺陷型。
36.權利要求27的方法，其中所述腺病毒載體是其E4區缺陷型。
37.權利要求27的方法，其中所述腺病毒載體是其E3區缺陷型。
38.權利要求27的方法，其中所述載體缺失所有病毒基因。
39.權利要求26的方法，其中所述載體包括DNA/病毒複合體。
40.權利要求39的方法，其中所述DNA是質粒形式的DNA。
41.權利要求26的方法，其中所述載體包括DNA/脂質體複合體。
42.權利要求27的方法，其中所述載體包括編碼抗原或其片段的重組腺病毒。
43.權利要求24的方法，其中所述免疫應答產生抗腫瘤效應。
44.權利要求24的方法，其中所述接觸步驟還包括在傳遞裝置中配置含有目的基因的基因載體，並將其中具有含所述目的基因的基因載體的裝置用於所述動物皮膚。
45.權利要求44的方法，其中所述裝置包括墊片。
46.權利要求44的方法，其中所述裝置包括粘性繃帶樣裝置。
47.形成DNA/病毒複合體的方法，所述方法包括以下步驟提供合適的病毒載體；提供待與所述病毒載體複合的DNA樣品；和在存在聚賴氨酸的情況下一起混合所述病毒載體和DNA樣品。
48.權利要求47的方法，其中所述病毒載體是腺病毒。
49.權利要求47的方法，其中所述DNA樣品包括目的基因。
50.權利要求49的方法，其中所述基因編碼抗原或其片段。
51.權利要求47的方法，其中所述聚-L-賴氨酸(PLL)與DNA樣品的比率範圍為約0.9μgPLL1.0μg DNA至9.0μg PLL1ug DNA
52.權利要求47的方法，其中所述聚-L-賴氨酸(PLL)與腺病毒載體的比率範圍為約6.0μg PLL108pfu腺病毒至6.0μg PLL1010pfu腺病毒。
53.傳遞基因載體到動物皮膚表面的裝置，所述裝置包括皮膚接觸裝置包括具有第一面和第二面的第一片材料，將所述第一面用於接觸所述動物皮膚表面；和第一面置於所述第一片材料的所述第一面對面的第二片材料；所述第一片材料和所述第二片材料在其外緣部分周圍結合在一起，以其間限定一個密封的中央空間，用於在其中裝置基因載體；和構成所述第一片的材料在結構上弱於構成所述第二片的材料，由此當所述基因載體放置於所述空間中，並施加外力於所述第二片的第一面時，所述第一片在所述第二片之前破裂，使得所述基因載體接觸所述動物的皮膚。
54.按照權利要求53的裝置，其中所述第一片材料的所述第一面包括沿其外周配置的膠粘劑，以將所述裝置固定於所述動物皮膚的表面，其中疊於所述空間的所述第一片材料的部分基本上無膠粘劑。
55.按照權利要求53的裝置，其中所述材料片由不滲透載體的材料構成。
56.按照權利要求53的裝置，其中所述材料片由高分子材料構成。
全文摘要
本發明提供以非侵襲方式誘導免疫應答的方法,包括以下步驟:通過給所述皮膚局部應用免疫有效濃度的基因載體,從而使其接觸需要這種治療的個體的皮膚,其中所述基因載體編碼目的基因。也提供在需要這種治療的動物中誘導抗腫瘤免疫應答的方法,包括以下步驟:通過給所述皮膚局部應用免疫有效濃度的編碼基因的載體,從而使其接觸所述動物的皮膚,其中所述基因編碼抗原,所述抗原給予後在所述動物中誘導抗腫瘤效應。所述基因載體可包括腺病毒重組體,DNA/腺病毒複合體,DNA/脂質體複合體或能夠表達轉基因的任何其它載體。基因載體的局部應用優選包括本文設計的裝置。
文檔編號A61P37/00GK1274290SQ98809932
公開日2000年11月22日 申請日期1998年8月13日 優先權日1997年8月13日
發明者D·C·C·湯, D·H·馬克斯, D·T·庫裡爾, Z·史 申請人:Uab研究基金會