用鱗翅目粘蟲卵巢細胞製備流行性乙腦疫苗的方法及疫苗的製作方法
2023-10-17 12:20:14 1
專利名稱：用鱗翅目粘蟲卵巢細胞製備流行性乙腦疫苗的方法及疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種製備流行性乙型腦炎疫苗的方法及由此方法製得的疫苗。尤其涉及一種利用鱗翅目粘蟲(Spodoptera frugiperda)的卵巢細胞製備流行性乙型腦炎疫苗的方法及由此方法製得的疫苗。
流行性腦炎病毒又稱日本乙型腦炎病毒(JEV)，可引起流行性乙型腦炎。自1935年日本學者從病死者腦組織分離並確定乙腦病毒以來，各國學者一直在致力於JEV疫苗的研究製備工作，先後經歷了用鼠腦、雞胚、地鼠腎等生產基質製備滅活疫苗、減毒活疫苗等階段。目前我國使用的是用原代地鼠腎細胞製備的滅活疫苗和減毒活疫苗，日本、美國、臺灣等地使用的是鼠腦提純疫苗。此外，重組基因工程疫苗正處於研究之中，但至今尚無重大突破。
現有技術中生產JEV疫苗主要存在的問題是，疫苗生產方法中因使用原代細胞或動物組織培養使得動物的飼養、繁殖、無菌條件的控制及解剖均存在著諸多不便，從而限制了生產規模。因此使用一種既對乙腦病毒敏感又可用於懸浮培養的傳代細胞基質是解決問題的途徑之一。vero細胞被證明可作為疫苗生產的基質(WHO Tech.Rep.Ser.，1987，71)，同時也是乙腦病毒的敏感細胞，用其製備乙腦疫苗的研究工作也正在進行，但該細胞為錨著依賴性細胞，培養時需藉助於微載體，培養條件複雜；由於培養液中含有血清，須經純化徹底去除以避免臨床中出現副反應；此外，所有來源於嚙齒類動物的傳代細胞都存在致腫瘤性的危險，而vero細胞屬哺乳類動物，較高代次的vero細胞已被證明存在致腫瘤性。
近年來，一種屬鱗翅目粘蟲(Spodopterafrugiperda)的卵巢細胞，例如Sf9細胞已被廣泛應用於重組杆狀病毒的表達系統上表達各種外源蛋白，Sf9細胞由IPL41-SF21AE細胞系中克隆篩選而來(Vaughn，J.L.et al，In Vitro 13213-217)，為非錨著依賴性細胞，其培養條件為28℃無需二氧化碳。
因此，本發明的目的在於提供一種製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，該方法利用鱗翅目粘蟲(Spodopterafrugiperda)的卵巢細胞工業化大規模生產流行性乙型腦炎疫苗，培養過程中可不必藉助於微載體等附著物，培養條件簡單，因而降低生產成本，簡化工藝，而且用WHO規程規定的細胞致腫瘤檢測方法證明Sf9細胞無致腫瘤原性。
本發明的另一目的在於提供一種利用本發明的方法製成的流行性乙型腦炎疫苗。
為克服現有技術的不足，完成上述發明目的，本發明採用如下技術方案本發明涉及一種製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，其特徵是包括下述步驟在pH為6.1-7.6的培養液中懸浮或靜止培養細胞基質鱗翅目粘蟲(Spodoptera frugiperda)的卵巢細胞，使細胞濃度達到105-107/ml；
以感染劑量(M.O.I.)為0.01-1.0將流行性乙型腦炎病毒接種到具有上述細胞濃度的細胞基質培養液中，培養3-5天後得細胞培養懸液；低速離心部分細胞培養懸液，取上清過濾收穫病毒；可用新鮮培養液補足剩餘的細胞培養懸液繼續傳代培養，3-5天後離心收穫病毒；超速離心去除殘餘小牛血清；用福馬林滅活收穫的病毒製備滅活疫苗或不經滅活病毒製備減毒活疫苗。
按照本發明方法，感染病毒後的細胞基質培養液為有血清培養液。
本發明涉及一種利用上述本發明方法製得的流行性乙型腦炎疫苗。
另外，本發明還涉及一種製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，其特徵是包括下述步驟在pH為6.1-7.6的培養液中懸浮或靜止培養細胞基質鱗翅目粘蟲(Sodoptera frugiperda)的卵巢細胞，使細胞濃度達到105-107/ml；以感染劑量(M.O.I.)為0.01-1.0將流行性乙型腦炎病毒接種到具有上述細胞濃度的細胞基質培養液中，培養3-5天後得細胞懸液；將上述感染病毒後的細胞懸液在無血清培養液中經逐步適應傳代至其培養液中的血清含量低於0.
1％；低速離心部分適應後的無血清培養細胞懸液，取上清液過濾收穫病毒；
用新鮮無血清培養液補足剩餘的細胞培養懸液繼續傳代培養，3-5天後離心收穫病毒；用福馬林滅活收穫的病毒製備滅活疫苗或不經滅活病毒製備減毒活疫苗。
本發明還涉及一種利用上述本發明方法製得的流行性乙型腦炎疫苗。
本發明與現有技術相比其優點在於首先，本發明細胞基質具有傳代細胞的優點，即可以事先被檢定不帶任何可查出的細菌、病毒、致癌物質等外源致病因子。
其次，本發明所採用的細胞基質為非錨著依賴性細胞，其可以不需要載體大量懸浮培養，且培養條件要求較低，這就簡化了錨著依賴性細胞(如vero細胞)深層培養所必不可少的微載體帶來的諸多不便。
再者，目前認為哺乳動物傳代細胞都存在致腫瘤性的危險，傳代次數越高其危險性越大，而對昆蟲細胞，一般認為人源性遠，致腫瘤的危險性小，且用WHO規程規定的細胞致癌檢測方法證明72代Sf9細胞無致腫瘤原性。
另外，利用乙腦病毒對Sf9細胞持續性感染的特性，一次種毒後細胞可連續產毒、連續收穫病毒，而且感染乙腦病毒後的細胞可在液氮中冷凍保存。
本發明的最重要的優點在於，持續感染JEV的本發明的細胞基質在無血清培養液中可利用發酵罐大規模繁殖病毒，因此既解決了現有技術中純化病毒時難以去除殘餘牛血清的問題，又避免了臨床接種帶來的副反應。
附圖的簡要說明
圖1、圖2及圖3分別示出了實驗例1中用P3、SA14、SA14-14-2分別感染Sf9細胞10-12周內培養物上清液和細胞溶解物的病毒滴度和傳代時間之間的曲線。
為了進一步理解本發明的技術方案，以下詳細描述之。
本發明實質上涉及一種製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，其特徵是包括下述步驟1)在pH為6.1-7.6的培養液中靜止或懸浮培養細胞基質鱗翅目粘蟲(Spodoptera frugiperda)的卵巢細胞，使細胞濃度達到105-107/ml；其中，所述的鱗翅目粘蟲(Spodoptera frugiperda)的卵巢細胞可以是例如Sf9細胞(ATCC CRL1711)，它由IPL41-SF21AE細胞系中克隆篩選而來，為非錨著依賴性細胞，可以不需載體大量懸浮培養。本發明採用的Sf9細胞僅為所述的鱗翅目粘蟲的卵巢細胞的一株，本文中僅作為實施例而用之，並非有限定本發明之意。另外，本發明採用的培養液可以為市售的有血清培養液，如GIBCO的IPL-41。培養溫度為本領域技術人員所熟知，通常為28℃。
2)以感染劑量(M.O.I)為0.01-1.0將流行性乙型腦炎病毒接種到具有上述細胞濃度的細胞基質培養液中，培養3-5天後得細胞培養懸液；按照本發明，所述的JEV病毒可以是野毒株，例如P3株和SA14株；也可以是減毒株，例如SA14-14-2株。其中野毒株感染後3-5天，細胞出現以一定數量細胞增大3-5倍為特徵的細胞病變(CPE)，減毒株感染細胞後無此病變，但兩種病毒均可造成Sf9細胞的持續感染。
3)低速離心部分上述細胞培養懸液，取上清液過濾收穫病毒；按照本發明，此步驟中對用於離心的培養懸液量無特殊的限制，只要剩餘的細胞量足以在經補充新鮮培養液培養3-5天後細胞培養懸液又能達到可以收穫的病毒滴度即可，例如實施例1中用於離心的培養懸液量為50-75％。
4)可用新鮮培養液補足剩餘的培養懸液繼續傳代培養，3-5天後離心收穫病毒；此步驟中補加的新鮮培養液量與步驟3)中用於離心的培養懸液量相等。所述的培養液可以是市售的有血清培養液，例如本發明所採用的GIBCO的IPL-41。根據本發明，細胞的傳代培養時間可多達26周而保持所製得的疫苗的效力實驗符合中華人民共和國《生物製品規程》中規定的標準。
5)超速離心去除殘餘小牛血清；6)用福馬林滅活收穫的病毒或不經滅活病毒製得疫苗。
根據本發明生產JEV滅活疫苗時所採用的福馬林滅活病毒的技術為公知技術，生產減毒活疫苗時不需此滅活步驟。滅活前後均需按常規方法取樣進行無菌實驗、測定病毒滴度以及滅活後需進行病毒滅活實驗。
本發明實質上還涉及一種製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，其特徵是包括下述步驟
1)在pH為6.1-7.6的培養液中靜止或懸浮培養細胞基質鱗翅目粘蟲(Spodoptera frugiperda)的卵巢細胞，使細胞濃度達到105-107/ml；其中，所述的鱗翅目粘蟲(Spodoptera frugiperda)的卵巢細胞可以是例如Sf9細胞(ATCC CRL1711)，它由IPL41-SF21AE細胞系中克隆篩選而來，為非錨著依賴性細胞，可以不需載體大量懸浮培養。本發明採用的Sf9細胞僅為所述的鱗翅目粘蟲的卵巢細胞的一株，本文中僅作為實施例而用之，並非有限定本發明之意。另外，本發明採用的培養液可以為市售的有血清培養液，如GIBCO的IPL-41。培養溫度為本領域技術人員所熟知，通常為28℃。
2)以感染劑量(M.O.I.)為0.01-1.0將流行性乙型腦炎病毒接種到具有上述細胞濃度的細胞基質培養液中，培養3-5天後得細胞培養懸液；按照本發明，所述的JEV病毒可以是野毒株，例如P3株和SA14株；也可以是減毒株，例如SA14-14-2株。其中野毒株感染後3-5天，細胞出現以一定數量細胞增大3-5倍為特徵的細胞病變(CPE)，減毒株感染細胞後無此病變，但兩種病毒均可造成Sf9細胞的持續感染。
3)將上述感染病毒後的細胞懸液在無血清培養液中經逐步適應傳代至其培養液中的血清含量低於0.1％；按照本發明，在每次傳代時需按一定比例(細胞懸液/新鮮培養液)逐步加入無血清培養液，直至細胞培養液中的血清含量低於0.1％，此時則視為細胞在無血清培養液中完全適應，此後傳代時可使用無血清培養液。所述的細胞懸液與培養液的比例可以為本領域人員常用的比例，例如本發明實施例2中採用的1∶1的比例。
4)低速離心部分適應後的無血清培養細胞懸液，取上清液過濾收穫病毒；按照本發明，此步驟中對用於離心的培養懸液量無特殊的限制，只要剩餘的細胞量足以在經補充新鮮培養液培養3-5天後細胞培養懸液又能達到可以收穫的病毒滴度即可，例如實施例1中用於離心的培養懸液量為50-75％。
5)用新鮮無血清培養液補足剩餘的細胞培養懸液繼續傳代培養，3-5天後離心收穫病毒；此步驟中補加的新鮮培養液量與步驟3)中用於離心的培養懸液量相等。所述的培養液可以是市售的無血清培養液，例如本發明所採用的GIBCO的SF900II。細胞需經過傳代逐步在無血清培養液中適應生長。由無血清培養液培養收穫的病毒的滴度比有血清培養的病毒的滴度略低，純化病毒時不需經超速離心去除牛血清的步驟，從而既簡化了生產疫苗的工藝又避免了疫苗中殘餘牛血清易引起臨床副反應。
6)用福馬林滅活收穫的病毒製備滅活疫苗或不經滅活病毒製備減毒活疫苗。
根據本發明生產JEV滅活疫苗時所採用的福馬林滅活病毒的技術為公知技術，生產減毒活疫苗時不需此滅活步驟。滅活前後均需按常規方法取樣進行無菌實驗、測定病毒滴度以及滅活後需進行病毒滅活實驗。
本發明採用的細胞基質例如Sf9細胞是一類昆蟲細胞，其人源性比現行生產JEV疫苗用的地鼠腎細胞遠，其致腫瘤的危險性也較小。另外免疫螢光實驗及電鏡觀察均表明該細胞被JEV病毒感染後不出現致死病變，而是能夠繼續傳代並繁殖病毒，造成細胞的持續感染，如圖1-3所示，Sf9細胞在感染病毒後仍可傳代培養，並且病毒滴度基本保持不變。其中由野毒株P3或SA14感染的細胞出現以細胞增大3-5倍為特徵的CPE，這種大細胞的數量在全部傳代過程中始終保持在10-20％。由減毒株SA14-14-2感染的細胞在感染和傳代的全部過程中未見明顯的CPE。
根據本發明方法製得的疫苗經哺乳動物實驗證明各項檢定均能達到和超過生產規程要求的標準。其中無血清培養液繁殖JEV製備的疫苗其病毒量雖低於現行原代地鼠腎疫苗，但疫苗同樣能達到原代地鼠腎疫苗的效力實驗標準。
以下結合實施例和實驗例進一步描述本發明。實施例1有血清培養生產JEV疫苗在0.5L懸浮培養瓶中以400ml有血清培養液IPL-41(GIBCO)加入適量牛血清等成分，調pH為6.2於28℃培養Sf9細胞達5×105/ml，用鼠腦來源的JEVP3株以M.O.I.為0.01接種感染Sf9胞，培養4天後出現CPE，第五天收集50-75％的培養懸液，1000rpm離心該培養懸液5分鐘後取上清過濾收穫病毒，密度梯度離心除去殘餘的牛血清，同時補充50-75％的新鮮的IPL-41培養液到剩餘的細胞懸液中，每隔3-4天傳代一次並收穫病毒。按常規方法取樣進行無菌實驗、檢測病毒滴度，用福馬林滅活病毒製得疫苗。
實施例2無血清培養生產JEV疫苗採用如實施例1所述的方法，只是在感染病毒後第五天將Sf9細胞傳代，傳代時按1∶1(細胞培養懸液/新鮮培養無血清培養液)加入無血清培養液SF900II(GIBCO)，此後每3天按上述方法傳代一次，經8次傳代後使牛血清含量低於0.1％，在以後的傳代中使用無血清培養液。隨後按實施例1的方法在SF900II中傳代培養細胞收穫病毒。
實驗例1JEV感染S9細胞10-12周病毒滴度的測定。在15cm2組織培養小瓶中以IPL-41於28℃培養Sf9細胞達105/ml(5ml/瓶)，分別用P3、SA14、SA14-14-2三株JEV感染上述Sf9細胞，M.O.I為0.01，二個對照組為Sf9正常細胞及JEV感染IPL-41。每周傳代一次，連續傳代10-12周，蝕斑法測定每次傳代時的病毒滴度，結果見圖1、圖2及圖3。
實驗例2 Sf9細胞致腫瘤原性實驗實驗動物為3-5克三日齡的昆明鼠，每組十隻，設定的陽性細胞對照為Hela細胞(來源於北京生物製品研究所小兒麻痺室，71代，細胞濃度為106/ml)，實驗組為Sf9細胞(來源於ATCC，72代，細胞濃度為107/ml)。
按照Van Steenis，G.等人的方法(Use of ATG-treated ne wborn rat for in vivo tumorigenicity，1982)，於0天分別在各組乳鼠背部皮下注射上述各種細胞，注射劑量為0.1ml，於0、2、7、14天四次分別腹腔注射兔抗小鼠胸腺血清(ATS)(來源於北京生物製品研究所小兒麻痺室，94-4批，2單位/ml)，注射劑量為每克乳鼠0.04ml。連續觀察三周。實驗結果為，三周後Hela細胞組的乳鼠背部注射部位出現結節，組織切片顯示Hela細胞瘤節有骨質化生現象並可見核分裂像，肝、肺組織也見異常；而Sf9細胞組的乳鼠三周內始終未觸摸到結節，注射部位及肝、肺組織切片未見異常。由此可證明72代Sf9細胞無致腫瘤原性。
比較實驗例來源於鼠腦或原代地鼠腎細胞和Sf9細胞的JEV蝕斑的比較。其中實驗用病毒為分別來源於鼠腦和感染病毒的Sf9細胞培養7周後上清液的P3株、SA14株以及來源於原代地鼠腎細胞的SA14-14-2株。按照公知方法測定上述來源的病毒在BHK21細胞上形成的蝕斑，其結果為來源於鼠腦和感染後的Sf9細胞培養物七周上清液的P3、SA14株JEV所形成的蝕斑直徑均為3-6mm，兩者無本質區別。
來源於原代地鼠腎細胞和感染後的Sf9細胞培養物七周上清液的SA14-14-2株JEV所形成的蝕斑直徑均為1-2mm，兩者無本質區別。
權利要求
1.一種製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，其特徵是包括下述步驟在pH為6.1-7.6的培養液中靜止或懸浮培養細胞基質鱗翅目粘蟲(Spodoptera frugiperda)的卵巢細胞，使細胞濃度達到105-107/ml；以感染劑量(M.O.I.)為0.01-1.0將流行性乙型腦炎病毒接種到具有上述細胞濃度的細胞基質培養液中，培養3-5天後得細胞培養懸液；低速離心部分細胞培養懸液，取上清液過濾收穫病毒；可用新鮮培養液補足剩餘的細胞培養懸液繼續傳代培養，3-5天後離心收穫病毒；超速離心去除殘餘小牛血清；用福馬林滅活收穫的病毒製備滅活疫苗或不經滅活病毒製備減毒活疫苗。
2.根據權利要求1所述的製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，其中所述的鱗翅目粘蟲的卵巢細胞為Sf9細胞(ATCC CRL1711)。
3.根據權利要求1或2所述的製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，其中流行性乙型腦炎病毒株為P3株或SA14株。
4.根據權利要求1或2所述的製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，其中流行性乙型腦炎病毒株為SA14-14-2株。
5.根據權利要求1或2所述的製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，其中所述的培養液為有血清培養液。
6.根據權利要求1或2所述的方法製備的流行性乙型腦炎疫苗。
7.一種製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，其特徵是包括下述步驟在pH為6.1-7.6的有血清培養液中靜止或懸浮培養細胞基質鱗翅目粘蟲(Spodoptera frugiperda)的卵巢細胞，使細胞濃度達到105-107/ml；以感染劑量(M.O.I.)為0.01-1.0將流行性乙型腦炎病毒接種到具有上述細胞濃度的細胞基質培養液中，培養3-5天後得細胞懸液；將上述感染病毒後的細胞懸液在無血清培養液中經逐步適應傳代至其培養液中的血清含量低於0.1％；低速離心部分適應後的無血清培養細胞懸液，取上清液過濾收穫病毒；用新鮮無血清培養液補足剩餘的細胞培養懸液繼續傳代培養，3-5天後離心收穫病毒；用福馬林滅活收穫的病毒製備滅活疫苗或不經滅活病毒製備減毒活疫苗。
8.根據權利要求7所述的製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，其中所述的鱗翅目粘蟲的卵巢細胞為Sf9細胞(ATCC CRL1711)。
9.根據權利要求7或8所述的製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，其中流行性乙型腦炎病毒株為P3株或SA14株。
10.根據權利要求7或8所述的製備流行性乙型腦炎疫苗的方法，其中流行性乙型腦炎病毒株為SA14-14-2株。
11.根據權利要求7或8所述的方法製備的流行性乙型腦炎疫苗。
全文摘要
本發明涉及一種製備流行性乙腦疫苗的方法，它包括在培養基中靜止或懸浮培養鱗翅目粘蟲(spodoptera frugiperda)的卵巢細胞，將該細胞感染乙腦病毒繼續培養得培養懸液，可部分補充培養液連續培養，得到的病毒滅活或不滅活製備疫苗。本方法中可使用無血清培養基。
文檔編號A61K39/12GK1124163SQ9411948
公開日1996年6月12日 申請日期1994年12月6日 優先權日1994年12月6日
發明者張鵬飛, 傅大衛 申請人:衛生部北京生物製品研究所