幹的顆粒狀細胞培養基的製作方法與工藝

2023-10-17 16:43:54 1

幹的顆粒狀細胞培養基本發明涉及不包含蛋白腖或胰蛋白腖的幹的顆粒狀細胞培養基，尤其涉及支持哺乳動物和/或昆蟲和/或植物細胞生長的幹的顆粒狀細胞培養基製劑。本發明還涉及這些幹的顆粒狀細胞培養基的生產及其用途。發明背景細胞培養基在人工環境中支持並維持細胞的生長。取決於生長將受到支持的生物的類型，細胞培養基可以包含10種以上，有時100種以上的不同組分。哺乳動物、昆蟲或植物細胞的增殖所需的培養基通常比足以支持細菌和酵母生長的基本培養基更複雜。細胞培養的早期研究使用由未確定成分的組分，例如血漿、血清、胚胎提取物、其他未確定成分的生物提取物或蛋白腖組成的培養基。因此，在化學上確定成分培養基的發展成為了主要的進步。在化學上確定成分的培養基通常包含但不是排他地限於胺基酸、維生素、金屬離子、抗氧化劑、螯合劑、生長因子、緩衝劑、激素、氯化物和本領域技術人員已知的許多其他物質。將一些細胞培養基提供為無菌的水成液。液體細胞培養基的缺點是其貨架期縮短，並且運輸和貯藏困難。因此，現在許多細胞培養基都提供為細磨乾粉混合物。生產所述細磨乾粉混合物的目的是通常將其與其他補充物一起在水和/或水溶液中以所設計的溶解狀態溶解，以給生物細胞提供用於生長和/或從相同的所述細胞中產生生物藥物的基本營養基礎。細磨粉末的處理具有明顯的缺點。例如，處理它們時粉塵很大，量大時更是如此，特別是在一些個別原料對健康有害的情況下，這可以導致處理該物質的工人的健康問題。即使個別組分並非是直接有毒的，但通過可呼吸的空氣本身中高的粉塵水平也可以引起工人的健康問題，並且由於該問題，在許多國家中都嚴格規定了空氣中的粉塵量。此外，如果量過多，並且沒有採取足夠的警戒措施防止火花點燃，那麼有機物質的粉塵，更特別地細粉塵可以容易地導致爆炸。此外，在不利的運輸條件下，例如在長期運輸條件期間，乾粉培養基的一種或多種較輕的各個組分朝表面移動或者一種或多種較重的組分朝原包裝的底部移動。這種局部較高濃度或者在疏鬆材料的物理中心，某些個體組分消耗的結果會以許多方式負面地影響培養基的產品質量。此外，分層對每批次的靶生物藥物分子的產生量或者更精細地對生物藥物自身的寡糖模式的影響遠遠超過物理消耗和各個組分的濃度，使得培養基質量對直到患者使用之前生物藥物的質量絕對是關鍵的。另一方面是當使用細磨乾粉培養基時，難以在水溶液中溶解細粉末，來製備最終的含水的細胞培養基。潤溼細磨粉末並將其溶解在水成液中是非常困難的。因此，粉末培養基的處理及其應用是相當複雜的。由於乾粉培養基在穩定性、混合和溶解方面的局限，所以通常以乾燥形式生產的培養基不具有一些關鍵的補充物，例如碳酸鹽、水解產物、生長因子和其他微量元素，當最終用戶將乾粉培養基製備成液體時，他們將補充這些補充物。額外的處理和補充將增加發生昂貴錯誤以及勞動力的可能性。已知通過將粉末擠壓成小顆粒可以使粉末狀細菌細胞培養基粒化。該結果是小顆粒在安全性、處理和性能方面更有優勢。對於細菌細胞培養基可以容易地實現該步驟，因為它們包含在化學上成分不完全確定的蛋白腖或胰蛋白腖或者等同的肽組分，其支持通過自身固有粘性粘附培養基組分。哺乳動物和/或昆蟲和/或植物細胞培養基通常不含有蛋白腖或其等同物，因此更難以該方式處理。InvitrogenCorporation的US6,383,810B2公開了產生團集的真核細胞培養基粉末的方法。該方法包括用溶劑潤溼乾粉細胞培養基，然後重新乾燥溼潤的培養基，以獲得幹的團集細胞培養基。該方法的最大缺點是整個培養基組分都需要與水接觸，並且然後需要將它們加熱以除去水的事實。這可能在培養基的組分之間引起相當多的副反應，或者破壞或修飾敏感性組分，對培養基質量造成不可預測的結果。因此，存在發現哺乳動物和/或昆蟲和/或植物細胞培養基的新形式的明確需求，所述形式容易處理，並可以在培養基組分之間不引起破壞和/或副反應的情況下生產。發明簡述已經發現，通過壓實幹燥培養基組分的混合的細磨粉末，可以以幹的顆粒形式產生無蛋白腖的在化學上確定成分的哺乳動物和/或昆蟲和/或植物細胞培養基。通過在輥式壓製機中擠壓團聚可以實現壓實。不需要將任何添加劑用於輔助該處理。根據本發明的幹的顆粒狀細胞培養基具有長的貨架期、易於處理並可以在非常溫和的條件下生產，以至於在生產過程中，所述培養基組分不會由於被潤溼或被加熱而發生副反應。因此，本發明涉及產生並不包含蛋白腖或胰蛋白腖的幹的顆粒狀細胞培養基的方法，其包括a)以培養基組分的混合粉末形式提供細胞培養基，其中該混合的粉末不包含蛋白腖或胰蛋白腖；b)在輥式壓製機中壓實所述混合的粉末。在優選的實施方案中，在步驟a)中提供的細胞培養基是哺乳動物細胞培養基。在優選的實施方案中，在步驟a)中提供的細胞培養基包含一種或多種糖類組分、一種或多種胺基酸、一種或多種維生素、一種或多種鹽、一種或多種緩衝劑組分、一種或多種輔因子以及一種或多種核酸組分。在非常優選的實施方案中，步驟b)通過如下步驟實施b1)在輥式壓製機中壓實所述混合的粉末；b2)將在步驟b1)中獲得的具有小於0.2mm顆粒大小的經壓實的細胞培養基的所有部分，以待填充到輥式壓製機中的培養基組分的混合粉末形式再引入到細胞培養基中。在優選的實施方案中，輥式壓製機的擠壓能力在30至80kN/cm輥寬之間。本發明還涉及可以根據本發明的方法製備的不含蛋白腖或胰蛋白腖的幹的顆粒狀細胞培養基。在優選的實施方案中，顆粒狀細胞培養基的80%以上的顆粒具有大於0.5mm的大小。在非常優選的實施方案中，顆粒狀細胞培養基的90%以上的顆粒具有大於0.5mm的大小。在另一個優選的實施方案中，不含蛋白腖或胰蛋白腖的幹的顆粒狀細胞培養基是在化學上確定成分的哺乳動物細胞培養基。在另一個優選的實施方案中，不含蛋白腖或胰蛋白腖的幹的顆粒狀細胞培養基包含一種或多種糖類組分、一種或多種胺基酸、一種或多種維生素、一種或多種鹽、一種或多種緩衝劑組分、一種或多種輔因子以及一種或多種核酸組分。本發明還涉及通過以下步驟將不含蛋白腖或胰蛋白腖的幹的顆粒狀細胞培養基用於培養根據本發明的細胞的用途，所述步驟包括：a)在溶劑中溶解不含蛋白腖或胰蛋白腖的幹的顆粒狀細胞培養基，以形成液體細胞培養基；b)將所述液體細胞培養基與待培養的所述細胞接觸。在優選的實施方案中，待培養的所述細胞是哺乳動物細胞。在優選的實施方案中，步驟a)中的溶劑是水。除上述本發明的單個實施方案和方面外，本發明還實現並實踐了兩個或兩個以上所公開的實施方案或方面的每一組合。發明詳述圖1顯示適合於本發明的幹壓實設備的示意圖。根據本發明的幹法制粒在不添加水或其他溶劑的情況下，通過在壓力下壓實粉末產生顆粒或微粒。通常，根據本發明所使用的輥式壓製機還產生了更大的壓實物或薄片。通常例如通過振動篩溫和地打碎如此形成的這些壓實物，以產生顆粒狀的微粒（團塊）。根據本發明，粉末或細磨粉末是顆粒的組合物，其中80%以上的所述顆粒大小（直徑）小於0.2mm。優選地，粉末是幹的且自由流動的。表述「自由流動的粉末」指的是其中的顆粒並不相互粘著的粉末（通過研磨、微制粒或相似的技術製備）。通常，表現出低於約50度靜止角的全部粉末都顯示出合適的流動性質，但如本文中所用，術語幹的且自由流動的還應當指粉末的肉眼觀（意為粉末看起來是幹的且自由流動的）。根據本發明細胞培養基是維持和/或支持細胞體外生長的組分的任意混合物。細胞培養基可以包含維持和/或支持細胞體外生長所需的全部組分或者僅一些組分，以便分開地加入其它組分。根據本發明細胞培養基的實例是包含維持和/或支持細胞體外生長所需的全部組分、培養基補充物或進料的完全培養基。在優選的實施方案中，細胞培養基是完全培養基。通常，將根據本發明的細胞培養基用於維持和/或支持細胞在生物反應器中的生長。哺乳動物細胞培養基是維持和/或支持哺乳動物細胞體外生長的組分的混合物。哺乳動物細胞的實例是人類或動物細胞，優選地CHO細胞、COS細胞、IVERO細胞、BHK細胞、AK-1細胞、SP2/0細胞、L5.1細胞、雜交瘤細胞或人類細胞。待用根據本發明培養基培養的細胞可以是正常細胞、患病細胞、經轉化的細胞、突變細胞、體細胞、生殖細胞、幹細胞、前體細胞或胚胎細胞，所述任一細胞可以是建立的或者經轉化的細胞系或者獲自天然來源的細胞。不含蛋白腖或胰蛋白腖的細胞培養基是不含任何蛋白腖或胰蛋白腖或者通過蛋白的部分水解產生的其他肽的細胞培養基。在優選的實施方案中，不含蛋白腖或胰蛋白腖的細胞培養基也不包含任何蛋白質或其他天然來源的聚合物如瓊脂。在非常優選的實施方案中，不含蛋白腖或胰蛋白腖的細胞培養基是在化學上確定成分的細胞培養基。在化學上確定成分的細胞培養基是不含任何在化學上未確定成分的物質的細胞培養基。這指的是在化學上確定成分的培養基中所使用的化學組成和全部化學品的結構都是已知的。在化學上確定成分的培養基不含任何酵母、動物或植物組織；它們不含飼養細胞、血清、提取物或消化物或者可能有助於將在化學上未確定成分的蛋白質引入至培養基中的其他組分。在化學上未確定或未完全確定的化學結構是化學組成和結構未知的那些化學結構，或者只能用大量的實驗嘗試確定的化學結構，與蛋白質如白蛋白或酪蛋白的化學組成和結構的評定相當。在一個實施方案中，根據本發明不含蛋白腖或胰蛋白腖的細胞培養基僅含有一種或多種糖類組分、一種或多種胺基酸、一種或多種維生素、一種或多種鹽、一種或多種緩衝劑組分、一種或多種輔因子以及一種或多種核酸組分。顆粒大小指的是顆粒的平均直徑。顆粒直徑通過在矽油中的雷射散射測定。糖類組分是全部單糖或二糖，如葡萄糖、半乳糖、核糖或果糖（單糖的實例）或者蔗糖、乳糖或麥芽糖（二糖的實例）。根據本發明胺基酸的實例是蛋白（proteinogenic）胺基酸，特別是必需胺基酸，亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸，以及非蛋白胺基酸如D-胺基酸。維生素的實例是維生素A（視黃醇、視黃醛、多種類視黃醇和四種類胡蘿蔔素）、維生素B1（硫胺素）、維生素B2（核黃素）、維生素B3（煙酸、煙醯胺）、維生素B5（泛酸）、維生素B6（吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛）、維生素B7（生物素）、維生素B9（葉酸、亞葉酸）、維生素B12（氰鈷氨素、羥鈷胺素、甲基鈷胺素）、維生素C（抗壞血酸）、維生素D（麥角鈣化醇、膽鈣化醇）、維生素E（生育酚、生育三烯酚）和維生素K（葉綠醌、甲基萘醌類）。還包括維生素前體。鹽的實例是包含無機離子的組分例如碳酸氫鹽、鈣鹽、氯化物、鎂鹽、磷酸鹽、鉀鹽和鈉鹽或者包含微量元素如Co、Cu、F、Fe、Mn、Mo、Ni、Se、Si、Ni、Bi、V和Zn的組分。緩衝劑的實例是CO2/HCO3、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPS和TRIS。輔因子的實例是硫胺素衍生物、生物素、維生素C、NAD/NADP、鈷胺素、黃素單核苷酸及衍生物、穀胱甘肽、血紅素核苷酸磷酸及衍生物。根據本發明的核酸組分是核鹼基，如胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，核苷如胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和胸苷，以及核苷酸如腺苷一磷酸或腺苷二磷酸或腺苷三磷酸。穩定的細胞培養基是指這樣的培養基，與用相同配方的新鮮製備的培養基相比較，在貯藏一段時間後的所述培養基仍顯示出至少80%，優選地至少90%，更優選地至少97%，最優選地相同的生物學和生物化學活性。本發明基於如下發現：也可以以幹的顆粒狀形式提供不含蛋白腖或胰蛋白腖或者相似組分的培養基。這是非常出乎意料的，因為到目前為止，只有具有蛋白腖或胰蛋白腖的細胞培養基可以是幹的顆粒狀。認為蛋白腖或胰蛋白腖的粘著性質對於幹的顆粒狀培養基的產生是必需的。已經發現，特定的壓實方法使得也能產生不含蛋白腖或胰蛋白腖的幹顆粒狀培養基。根據本發明的壓實方法以兩個基本步驟實施：a)以培養基組分的混合粉末形式提供細胞培養基；b)在輥式壓製機中壓實所述混合的粉末。在步驟a)中，提供了培養基組分的細磨乾粉。徹底混合全部組分，以使粉末混合物的所有部分都具有幾乎相同的組成。就組成的均一性而言，該混合物應當具有與商品化的乾粉細胞培養基相同的品質。就均一的細胞生長而言，組合物的均一性越高，得到的幹顆粒狀培養基的品質越好。適合於產生細磨粉末的研磨機例如是球磨機、臥式研磨機、噴射式磨機或旋轉式葉片篩磨機（rotatingbladesievemill）。粉末的顆粒大小通常低於500μm，優選地低於200μm。為了提供培養基組分的混合粉末，可以例如首先將組分混合，然後細磨成混合物，或者可以將它們單獨地或者以亞組研磨，然後組合和混合。優選地，混合物的全部組分都是幹的。這意味著，如果它們包含水，那麼它們僅包含結晶的水，並且按未結合的或者未配位的（uncoordinated）水分子的重量計，不超過5%，優選地不超過2%，最優選地不超過1%。如果一種或多種混合物組分對氧化是敏感的，那麼可以在惰性保護氣體下進行混合和研磨在第二步（步驟b)）中，粉末混合物是在輥式壓製機中壓實的。輥式壓製機，也稱為輥式壓實機，是本領域技術人員已知的。通常，輥式壓製機包含兩個反向旋轉的輥，其位於相互約0.5-3mm，優選地1-2mm的小距離。合適的輥式壓製機通常具有10至50cm之間寬度的輥，導致輥之間的空隙具有10至50cm的長度。然而，取決於輥式壓製機的大小，輥的大小和由此導致的輥之間的空隙的長度可以變化。在優選的實施方案中，該空隙具有10至15cm之間的長度。將混合的粉末物質在反向旋轉的輥之間抽出，並在輥之間的空隙中壓實。輥與其表面結構之間的距離對得到的顆粒狀微粒的最終大小和結構具有影響。輥的表面優選地是槽溝狀的。槽溝幫助使粉末與輥粘著，並通過擠壓將其拉伸。輥式壓製機的擠壓能力通常在20至150kN/cm輥寬之間，優選地用30至80kN之間，最優選地在40至60kN之間的力一起擠壓輥。如果細胞培養基的組分是非常敏感的，那麼可以在惰性保護氣體環境下進行壓實步驟。此外，因為一些組分通常是熱敏感的，並且將經受不住由於壓實可能產生的輕微增高的溫度，所以通常冷卻輥式壓製機的輥，以維持恆定的溫度。在優選的實施方案中，直接測量從輥式壓製機中釋放的經壓實的細胞培養基的大小。這可以例如通過，如用一個或多個振動篩來篩濾進行。篩子中孔的直逕取決於待收集的顆粒的大小。對於根據本發明的方法，一般的直徑在0.5-5mm之間，優選地約1-3mm。特別地，如果輥式壓製機中的幹顆粒形成了更大的壓實物或者薄片，優選地將篩磨機（sievemill）用於使壓實物或薄片成為合適大小的顆粒。一種合適的篩磨機是具有1-3mm篩眼孔徑的振動篩磨機，型號FC200、BepexGmbH。適合於根據本發明方法的輥式壓製機可以例如購自Alexanderwerk，SahutCoreur，Hosokawa或Fitzpatrick公司。如已說明，幹的顆粒狀細胞培養基的顆粒大小取決於處理從輥式壓製機中出來的經壓實培養基的方式。如果從輥式壓製機中直接收集培養基，那麼其通常包含較大的壓實物或薄片。如果篩濾培養基，那麼可以通過篩孔大小測定顆粒大小。但是，進一步的處理如包裝通常也會影響平均顆粒大小，因為顆粒狀細胞培養基的一些顆粒可能破裂成碎片。在優選的實施方案中，在壓實和篩濾後，顆粒狀細胞培養基的80%以上的顆粒具有大於0.5mm的大小。在非常優選的實施方案中，顆粒狀細胞培養基的90%以上的顆粒具有大於0.5mm的大小。已經發現，如果將從輥式壓製機中釋放的具有小於0.5，優選地小於0.2mm的顆粒大小的經壓實的培養基的級分連續地再引入到輥式壓製機的進料物中，以再次與粉末混合物再混合併再擠壓，那麼可以進一步改善根據本發明顆粒狀細胞培養基的質量。這減少了最終的幹的顆粒狀細胞培養基的粉末部分，並額外地改善了產品的均一性。圖1給出了一種可能的生產組裝的示意圖。輥式壓製機顯示為輥R1和輥R2。將粉末混合物P1從儲罐進料到輥式壓製機中。用篩子S篩分從輥式壓製機中釋放的經壓實的混合物。移除產物級分，用於進一步的處理和包裝，將具有低於0.2mm顆粒大小的粉末級分P2連續地再引入到輥式壓製機的進料中。已經發現，可以在不添加增加混合物的粘性的物質的情況下進行根據本發明的幹顆粒形成。然後可以進一步加工得到的幹的顆粒狀細胞培養基。可以包裝和/或滅菌培養基。合適的容器是本領域技術人員已知的。實例是袋子、盒子、瓶子、硬紙盒、真空包裝形式等。可以在滅菌之前或之後進行包裝。優選地是在合適的包裝後進行γ-照射。還可以有利地將根據本發明幹的顆粒狀細胞培養基用於生產其他經壓實的培養基形式（如片劑或較大的薄片）。為此，將根據本發明幹的顆粒狀細胞培養基在合適的擠壓機，例如壓片機中進一步壓實。可以在不添加其他組分的情況下使用顆粒狀培養基，或者可以將其與其他組分如壓片輔助劑混合，或者與例如對緩釋片劑特定的組分混合或隨後用所述組分包衣。另一方面，可以將幹的顆粒狀細胞培養基與支持片劑快速溶解的組分，如碳酸氫鈉混合。根據本發明的方法成為幹的顆粒狀或者經壓實的細胞培養基通常包含至少一種或多種糖類組分、一種或多種胺基酸、一種或多種維生素或者維生素前體、一種或多種鹽、一種或多種緩衝劑組分、一種或多種輔因子以及一種或多種核酸組分。培養基還可以包含脂肪酸和/或脂肪酸衍生物和/或普盧蘭尼克酸（pluronicacid）和/或表面活性組分如以化學方法製備的非離子型表面活性劑。合適的非離子型表面活性劑的一個實例是終止於伯羥基的雙功能嵌段共聚物表面活性劑，其例如是以來自BASF，德國的商標名稱pluronic可得到的。可以將根據本發明幹的顆粒狀培養基用於與本領域已知的粉末培養基或液體培養基相同的目的。因為可以容易地處理大量的顆粒狀培養基，而沒有所討論的粉末培養基的缺點，所以所述幹的顆粒狀培養基可以優選地用於生物藥物生產。為了使用，將溶劑，優選地水（最特別地蒸餾水和/或去離子水或者純化的水或用於注射的水）或者含水緩衝液加入到幹的顆粒狀培養基中，並混合組分，直到培養基完全溶解於溶劑中。溶劑還可以包含鹽水、提供1.0-10.0的pH範圍的可溶性酸離子或鹼離子、穩定劑、表面活性劑、防腐劑和醇或者其他極性有機溶劑。還可能將其他物質，如用於調整pH的緩衝物質、胎牛血清、糖等加入到細胞培養基和溶劑的混合物中。然後將得到的液體細胞培養基與待生長或者待維持的細胞接觸。根據本發明幹的顆粒狀培養基是容易處理的。與粉末培養基相比較，當處理所述培養基時，顯著降低了其所形成的粉塵的量。根據本發明的培養基可以容易地溶解於溶劑中。重構是快速的，優選地少於30分鐘，更優選地少於15分鐘。甚至在運輸期間搖動或者振動的情況下，根據本發明幹的顆粒狀培養基的組合物仍是均一的。此外，與溼的顆粒狀培養基相反，更溫和的幹顆粒條件允許直接且容易地處理這樣的培養基，其甚至包含熱敏感和/或氧化敏感物質如維生素（例如維生素B1）、葡萄糖、硫胺素、鐵鹽或包含二硫鍵的組分。通過以下附圖和實施例進一步說明了本發明，而並非限制本發明。將以上和以下引用的所有申請、專利和出版物，以及在2010年12月16日提交的相應美國臨時申請61/423,700的全部公開內容併入本文作為參考。實施例以下實施例代表了本發明的實際應用。1.Dulbecco改良的Eagle培養基的幹壓實Dulbecco改良的Eagle培養基也稱為DMEM，是通常用於使動物細胞生長的培養基。DMEM的成分為（以mg/l計）：無機鹽：CaCl2（無水）：200.00Fe(NO3)·9H2O：0.10KCl：400.00MgSO4（無水）：97.67NaCl：6400.00NaH2PO4·H2O：125.00其他組分：D-葡萄糖：4500.00酚紅：15.00丙酮酸鈉（Natriumpyruvat）：110.00胺基酸：L-精氨酸HCl：84.00L-半胱氨酸2HCl：63.00L-穀氨醯胺：584.00甘氨酸：30.00L-組氨酸HClH2O：42.00L-異亮氨酸：105.00L-亮氨酸：105.00L-賴氨酸HCl：146.00L-甲硫氨酸：30.00L-苯丙氨酸：66.00L-絲氨酸：42.00L-蘇氨酸：95.00L-色氨酸：16.00L-酪氨酸2Na·2H2O：104.33L-纈氨酸：94.00維生素：D-泛酸鈣：4.00氯化膽鹼：4.00葉酸：4.00i-肌醇：7.20煙醯胺：4.00核黃素：0.40硫胺素HCl：4.00混合DMEM的全部成分，並在臥式研磨機中研磨，以產生均一的乾粉末。將30kg粉末進料到具有以下特徵的輥式壓製機中:-凹平面輥-輥間距離：1.5mm-輥間空隙的長度：10cm-擠壓力：50kN得到的物質顯示出較大壓實物的更百分比。在具有3mm篩眼孔徑的振動篩磨機（型號FC200，BepexGmbH）中篩濾得到的物質。將具有低於0.2mm大小（直徑）的顆粒級分再引入到輥式壓製機中。獲得具有大於75%的顆粒具有1-3mm大小的幹顆粒狀DMEM培養基。