乙偶姻高耐受性菌株的選育和用該菌株發酵生產乙偶姻的製作方法

2023-10-17 12:52:24

乙偶姻高耐受性菌株的選育和用該菌株發酵生產乙偶姻的製作方法
【專利摘要】本發明闡述了乙偶姻高耐受性菌株的選育和用該菌株發酵生產乙偶姻，屬於生物工程【技術領域】(微生物領域)。本發明包括如下過程：(1)亞硝基胍誘變：將本實驗室篩選並保藏的解澱粉芽孢桿菌Bacillus?amyloliquefaciens?FMME044作為出發菌株製備菌懸液，並將其與不同濃度的亞硝基胍反應，一段時間後，終止反應再進行後培養。(2)馴化：在馴化培養基裡添加不同濃度的乙偶姻，製成不同濃度的乙偶姻發酵液，逐步提高乙偶姻濃度進行馴化培養。將上述馴化所得的菌懸液直接塗布到含高濃度乙偶姻的平板上。(3)篩選：在高濃度乙偶姻平板上能夠長出的單菌落即為能耐高濃度乙偶姻的菌株。然後，挑取單菌落進行發酵驗證並將高產菌株進行二次驗證，篩選出一株比出發菌株產更高濃度乙偶姻的菌株，命名為B.amyloliquefaciens?E-11。本發明同時公開一種採用該菌株生產乙偶姻的方法，採用本方法發酵40h乙偶姻產量為63g/L。
【專利說明】乙偶姻高耐受性菌株的選育和用該菌株發酵生產乙偶姻
【技術領域】
[0001]乙偶姻高耐受性菌株的選育和用該菌株發酵生產乙偶姻，屬於生物工程領域。
【背景技術】
[0002]3-羥基丁酮(乙偶姻)是一種應用廣泛、令人喜愛的食用香料，是國際上常用的香料品種，主要用作奶油、酸奶等香料的生產，國家標準GB2760-86規定其為允許使用的食品香料。80%含量的3-羥基丁酮俗稱"醋嗡"，是酒類調香中一個極其重要的品種。在製藥工業中，3-羥基丁酮作為具有手性的化合物可以用來合成稀有藥物和藥物中間體，如4-氯-4，5-二甲基-1，3 二氧雜環戊烷-2-酮(CDMDO)和倫氨苄西林鹽酸鹽。CDMDO是一種重要的醫藥中間體，主要用於青黴素、氨苄青黴素等抗生素類藥物的修飾，以合成具有光學活性的手性藥物，從而較大程度地提高藥效，減輕藥物的副作用。另外，含有3-羥基丁酮和2，3- 丁二酮的混合物還可以用來治療乳腺炎。
[0003]3-羥基丁酮生產方法有:化學合成法、酶轉化法和微生物發酵法，目前主要通過化學合成生產，已經實現工業化；化學合成法雖然操作簡單易行，但汙染重、成本高、原料受石油制約、產品質量難以達到食用香料的要求。微生物發酵法生產3-羥基丁酮的還未見工業化生產的報導。3-羥基丁酮是多種微生物的糖代謝的中間代謝產物，以糖質為原料利用微生物發酵可以生產3-羥基丁酮，與化學合成法及酶轉化法相比，微生物發酵法具有生產成本低廉、對環境友好、產品純度高、反應條件溫和等優勢，能解決化學合成法和酶轉化法所面臨的環境、資源、產品質量等問題受到越來越多的關注。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供乙偶姻高耐受性菌株的選育和用該菌株發酵生產乙偶姻。
[0005]本發明技術方案:
[0006]1、乙偶姻高耐受性菌株的選育:
[0007](I)亞硝基胍誘變
[0008]將本實驗室篩選並保藏的解澱粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensFMME044作為出發菌株製備菌懸液，並將其與不同濃度的亞硝基胍反應，一段時間後，終止反應再進行後培養。
[0009]⑵馴化
[0010]在馴化培養基裡添加不同濃度的乙偶姻，製成不同濃度的乙偶姻發酵液，將上述後培養的菌懸液添加到含有低濃度乙偶姻的培養基中，培養一段時間後再轉接到相同乙偶姻濃度的培養基中，每個濃度轉接三次之後，再轉接到含有高濃度乙偶姻的培養基中，重複此操作，直到培養基中乙偶姻濃度達到80g/L。將上述馴化所得的菌懸液直接塗布到含高濃度乙偶姻的平板上。
[0011](3)篩選並鑑定
[0012]，在高濃度乙偶姻平板上能夠長出的單菌落即為能耐高濃度乙偶姻的菌株。然後，挑取單菌落進行發酵驗證並將高產菌株進行二次驗證，篩選出一株比出發菌株高產且能耐受高濃度乙偶姻的菌株，經生理生化鑑定並命名為B.amyloliquefaciens E-1l0
[0013]2、根據權利要求1所述乙偶姻高耐受性菌株的選育，其篩選得到耐高濃度乙偶姻並高產乙偶姻菌株的鑑定方法如下:
[0014]I)形態學鑑定
[0015]菌落形態、細胞形態、革蘭氏染色、芽孢染色；
[0016]2)生理生化鑑定
[0017]接觸酶試驗，V.P.及M.R.試驗，明膠液化及澱粉水解，耐鹽耐酸試驗，硝酸鹽還原試驗；
[0018]通過形態學、生理生化鑑定確定該菌株為解澱粉芽孢桿菌，並命名為B.amyloliquefaciens E—11。
[0019]3、本發明公開的一種乙偶姻的生產方法,其特徵是採用B.amyloliquefaciensFMME044為出發菌株，經過亞硝基胍誘變，馴化，篩選和發酵培養。以篩選固體培養基，篩選液體培養基，種子培養和液體發酵進行篩選和發酵生產乙偶姻。
[0020](I)篩選固體培養:
[0021]固體培養基以g/L 計:乙偶姻濃度 30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L 和 80g/L,葡萄糖20g/L，大豆蛋白腖10g/L，牛肉膏10g/L，氯化鈉，5g/L，瓊脂，20g/L，初始pH7.0 ;
[0022]培養條件:恆溫培養箱中37°C培養1-3天。
[0023](2)篩選液體培養基:
[0024]篩選培養基以g/L計:乙偶姻濃度30、40、50、60、70和80，葡萄糖130，大豆蛋白腖12.5，酵母粉 12.5，KH2P043, K2HP043, MgSO4 ? 7H200.4 ；
[0025]培養條件:溫度37°C、搖床轉速200rpm條件下，培養12_14h。
[0026](3)種子培養:
[0027]種子培養基以g/L計:葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白腖5，初始pH7.0 ;
[0028]培養條件:溫度37°C、搖床轉速200rpm條件下，培養10_12h ；
[0029](4)液體發酵培養:
[0030]發酵培養基以g/L計:葡萄糖140，蛋白腖12.5，酵母粉12.5，KH2P043, K2HP043，MgSO4 ? 7H200.4，初始 pH7.0 ；
[0031]發酵條件:接種量10% (v/v)，溫度37°C、搖床轉速200rpm條件下，發酵60_72h。
[0032](5) 7L發酵罐發酵培養:
[0033]發酵培養基以g/L計:葡萄糖140，蛋白腖12.5，酵母粉12.5，KH2P043，K2HP043，MgSO4 ? 7H200.4，初始 pH7.0 ；
[0034]7L發酵罐中發酵培養基裝液量為4L，接種量10% (v/v)，溫度為37°C，攪拌轉速為400r/min，通氣量為1.0vvm，過程中控制pH6.5，培養時間60h。
[0035]3、乙偶姻產量的測定
[0036]取發酵液 1000Orpm離心lOmin，收集上清液，並以乙偶姻作為標準品，配製1、2、3、
4、5、6、7g/L的標準溶液。將上清液與標準溶液經0.45 ii m微孔濾膜過濾後，用高效液相色譜法測定乙偶姻的含量。
[0037]色譜條件:[0038]色譜柱:AminexHPX-87H ；
[0039]流動相:5mmol/L稀硫酸,用0.45 ii m濾膜過濾；
[0040]柱溫:60°C；
[0041]檢測波長:290nm;
[0042]進樣量:20U L
[0043]流速:0.6ml/min。
[0044]標準曲線在l_7g/L之間呈現良好的線性關係(圖1)，回歸方程:y = 0.3517x, R2=0.9992。據此得到40h乙偶姻的產量為63g/L，如圖1。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1乙偶姻標準曲線
[0046]圖2色譜檢測結果，A3g/L乙偶姻標樣，B40h發酵液【具體實施方式】
[0047]以下是乙偶姻高耐受性菌株的選育和用該菌株發酵生產乙偶姻的實施例。
[0048]實施例1
[0049](I)亞硝基胍誘變:
[0050]①製備菌懸液·
[0051]將原始菌株Bacillus amyloliquefaciens FMME044 取 0.2mL 接入 50mL 種子培養基中，37°C搖床培養14h至對數中後期，再以30%接種量接入新的培養基6h，使細胞同步培養。分別取培養液IOmL於50mL離心管中，離心收集菌體，用0.lmol/LpH6.0的磷酸緩衝液洗滌3次，最後加入7mL緩衝液，重懸菌體。取菌懸液0.7mL添加到5mL的離心管中，共8支，備用。
[0052]②誘變反應
[0053]吸取0.3mLNTG母液分別加入5mL含有0.1mL菌懸液的離心管中混勻，靜置30min、45min。
[0054]③終止反應
[0055]將含有處理液的離心管在10000r/min離心5min,倒掉上清液,再加入3mL的生理鹽水，10000r/min離心5min，倒掉上清液，重複以上操作2次，最後加入3mL種子培養基振蕩混勻。
[0056]④後培養
[0057]將混合均勻的菌懸液轉入含有50mL的種子培養基，37°C、200r/min振蕩培養12h，經細胞分裂，使突變性狀能穩定遺傳。
[0058](2)馴化。
[0059]①將上述後培養的菌液取5mL轉接到含50mL馴化培養基的500mL搖瓶中(乙偶姻濃度為Og/L)，37°C、200r/min培養12h後，再取5mL菌液轉接到含50mL馴化培養基的500mL搖瓶中(乙偶姻濃度為30g/L)，37°C、200r/min培養12h，重複轉接乙偶姻濃度為30g/L的馴化培養基3次，再取第三次培養12h後的菌液5mL轉接到含50mL馴化培養基的500mL搖瓶中(乙偶姻濃度為40g/L)，重複轉接乙偶姻濃度為40g/L的馴化培養基3次。重複此操作，逐步提高培養基中乙偶姻的濃度，分別為50、60、70和80g/L進行培養。
[0060]②將經過逐級馴化後得到的菌液稀釋塗布於選擇培養基上(乙偶姻濃度分別為
O、30、40、50、60、70 和 80g/L)，37°C培養箱培養 1-3 天。
[0061](3)篩選
[0062]①從含有不同濃度乙偶姻的平板上挑取單菌落，然後進行搖瓶驗證，選取乙偶姻聞廣菌株進行保減。
[0063]②初次篩選得到的菌株經過發酵驗證後，挑選產量比出發菌株高的菌株再次進行搖瓶發酵驗證，篩選出產量較高的菌株。
[0064]③將上述分離純化得到的菌種接種於種子培養基中，然後轉接到發酵培養基中，培養48h後離心收集發酵液，發酵液經過預處理並採用內標法經高效液相色譜進行定性分析，使得乙偶姻標準品峰聞增聞的菌株即為廣乙偶姻的解澱粉芽抱桿菌。篩選出35株聞廣乙偶姻的菌株，其中菌株E-1l產乙偶姻的能力最強。
[0065]實施例2
[0066]對篩選的FMME044菌株按《微生物分類學》進行生理生化特性鑑定(見下表1、2):
[0067]表1菌株(FMME044)與枯草芽孢桿菌菌落形態特徵對比
【權利要求】
1.乙偶姻高耐受性解澱粉芽孢桿菌的選育，包括以下步驟: (I)亞硝基胍誘變 將本實驗室篩選並保藏的解澱粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens FMME044作為出發菌株製備菌懸液，並將其與不同濃度的亞硝基胍反應，一段時間後，終止反應再進行後培養； ⑵馴化 在馴化培養基裡添加不同濃度的乙偶姻，製成不同濃度的乙偶姻發酵液，將上述後培養的菌懸液添加到含有低濃度乙偶姻的培養基中，培養一段時間後再轉接到相同乙偶姻濃度的培養基中，每個濃度轉接三次之後，再轉接到含有相對高濃度乙偶姻的培養基中，重複此操作，直到培養基中乙偶姻濃度達到80g/L ;將上述馴化所得的菌懸液直接塗布到含高濃度乙偶姻的平板上； (3)篩選 在高濃度乙偶姻平板上能夠長出的單菌落即為能耐高濃度乙偶姻的菌株；然後，挑取單菌落進行發酵驗證並將高產菌株進行二次驗證，篩選出35株比出發菌株高產且能耐受高濃度乙偶姻的菌株，其中菌株E-1l生產乙偶姻的能力最強。
2.根據權利要求1所述，其篩選得到生產乙偶姻菌株，經形態學、生理生化鑑定為解澱粉芽抱桿菌，並命名為B.amy1liquefaciens E-1l0
3.—種乙偶姻的生產方法,其特徵是採用B.amyloliquefaciens E_ll為出發菌株，以種子培養和液體發酵生產乙偶姻； 1)種子培養: 種子培養基以g/L計:葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白腖5，初始PH7.0 ; 培養條件:溫度37°C、搖床轉速200rpm條件下，培養12h ； 2)液體發酵培養: 發酵培養基以g/L計:葡萄糖140，蛋白腖12.5，酵母粉12.5，NaCl 5，K2HP043，MgSO4 ? 7H200.4，初始 pH7.0 ； 發酵條件:接種量10% (v/v)，溫度37°C、搖床轉速200rpm條件下，發酵60_72h ； 3)7L發酵罐發酵培養: 發酵培養基以g/L計:葡萄糖140，蛋白腖12.5，酵母粉12.5，NaCl 5，K2HP043，MgSO4 ? 7H200.4，初始 pH7.0 ； 7L發酵罐中發酵培養基裝液量為4L，接種量10% (v/v)，溫度為37°C，攪拌轉速為400r/min，通氣量為1.0vvm，過程中不控制pH，培養時間32_48h。
【文檔編號】C12N1/20GK103627698SQ201310658954
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】吳靜, 羅秋玲, 鄔敏辰 申請人:江南大學