一種治療出血性腦中風的藥物及其製備方法

2023-10-17 21:15:34 1

專利名稱：一種治療出血性腦中風的藥物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種治療出血性腦中風的藥物，本發明還涉及該藥物的製備方法。
背景技術：
出血性中風屬於中醫疾病的概念，又稱「中風」、「卒中」，西醫相應的病名為腦出血。腦出血是腦血管病中的一種。在世界上，腦血管病病死率居所有疾病的第三位，而腦出血佔腦血管病的10％～30％，是腦血管疾病中主要的致死原因。
出血性中風乃一急危重症，發病率、致殘率、死亡率均很高。據調查，出血性中風急性期病死率在18％～75％，其病後生存者60％～65％遺有不同程度的癱瘓、失語、痴呆等後遺症，且有40％左右的重殘者。隨著我國經濟的發展，人口老齡化的出現，人群中高血壓、肥胖、吸菸、飲酒、高血脂、糖尿病等危險因素水平上升，引起出血性中風的發病率及死亡率也與日劇增，上海市對91428人進行長達4年的疾病監測結果表明，出血性中風的死亡率為60.3％，男性發病率與死亡率均高於女性，且隨年齡的增長，其死亡率呈上升趨勢。隨著人們生活水平的提高和世界範圍的社會老齡化，其發病率有逐年增加的趨勢。
出血性中風急性期發病急驟，症見多端，變化迅捷，及時救治對提高搶救成功率和病人的生存質量，具有重要意義，醫學界一直將其列為重點研究的疾病之一。西醫學治療腦出血的方法分為手術治療和內科綜合治療兩大類，手術治療主要用於出血量較大而有手術指徵的患者，有一定的危險性。內科綜合治療除常規脫水劑減輕腦水腫、降壓藥物控制血壓、防治感染、糾正酸鹼平衡和電介質紊亂之外，加用神經細胞功能改善劑和鈣通道阻滯劑，但療效尚不能令人滿意。近年來，中醫學對出血性中風急性期的病因病機、治療方法進行了多方面的研究，目前國內專家公認西醫綜合性治療合併中醫藥療法優於單純的西醫綜合治療。因此，研製搶救出血性中風急性期的新製劑，是當前急需解決的難題。
出血性中風病理機制主要在高血壓、動脈硬化等基礎上發生的急性顱內出血，出血後形成血腫壓迫局部。而致神經功能受損同時，血腫在顱內形成佔位性病變，導致顱內壓更驟然升高腦組織局部出血，血腫形成所引起的腦水腫，腦組織受壓、推移、軟化、壞死等。目前出血性中風的西醫內科治療手段是脫水，降低顱內壓、止血、抗感染及神經營養劑，但內科保守治療病死率、致殘率均較高，西藥中尚無溶化血腫的特效藥物。外科手術清除血腫、抽吸引流等為降低病死率和致殘率起到了積極作用。但手術和麻醉本身可對機體產生負面影響。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提出了採用涼血止血、活血化瘀、瀉下通腑之藥為主，輔以清熱瀉火、行血破瘀的一種治療出血性腦中風的藥物。
本發明另一個要解決的技術問題是提出了該治療出血性腦中風的藥物的製備方法。
本發明要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的，一種治療出血性腦中風的藥物，其特點是它是由以下重量配比的原料製成的大黃160～200梔子160～200牡丹皮100～150本發明藥物的最佳重量(份)配比是大黃187.5 梔子187.5 牡丹皮125本發明所述的藥物劑型為藥劑學所述的任何劑型。其生產方法是取牡丹皮，通5％氯化鈉溶液水蒸氣蒸餾，重蒸餾，初蒸餾液與重蒸餾液合併，放置析出結晶，重結晶得到丹皮酚針晶，加濃硫酸和發煙硫酸(5∶4)至磺化完全，製成丹皮酚磺酸鈉。剩餘的牡丹皮藥渣及殘留液，與大黃、梔子一起，加水煎煮3次，濾過，水煎液濃縮，加乙醇使沉澱，濾取上清液，回收溶媒至無醇味，加1～5倍水稀釋，調pH值為7.5～8，濾過，濾液調pH值為3，用水飽和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至無醇味，乾燥得到幹浸膏，取丹皮酚磺酸鈉和幹浸膏，加入藥用輔料，製成臨床可接受的劑型。
本發明所述的藥物劑型為注射劑。其生產方法是取牡丹皮，通5％氯化鈉溶液水蒸氣蒸餾，重蒸餾，初蒸餾液與重蒸餾液合併，放置析出結晶，重結晶得到丹皮酚針晶，加濃硫酸和發煙硫酸(5∶4)至磺化完全，製成丹皮酚磺酸鈉。剩餘的牡丹皮藥渣及殘留液，與大黃、梔子一起，加水煎煮3次，濾過，水煎液濃縮，加乙醇使沉澱，濾取上清液，回收溶媒至無醇味，加1～5倍水稀釋，調pH值為7.5～8，濾過，濾液調pH值為3，用水飽和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至無醇味，乾燥得到幹浸膏，取丹皮酚磺酸鈉和幹浸膏，用100～200ml丙二醇溶解後，緩緩加入400～700ml水中，攪拌、加熱溶解，加0.8～1.2g亞硫酸鈉、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二鈉，調節pH7.5～8，濾過，濾液通過活性炭脫色，再加水稀釋至1000ml，使每ml含生藥量0.5g，濾過，灌封，滅菌，檢查，包裝，即得注射液；或取丹皮酚磺酸鈉和幹浸膏，用100～200ml丙二醇溶解後，緩緩加入400～700ml水中，攪拌、加熱溶解，加100～500g甘露醇，0.8～1.2g亞硫酸鈉、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二鈉，調節pH7.5～8，濾過，濾液通過活性炭脫色，再加水稀釋至1000ml，使每ml含生藥量0.5g，濾過，灌裝，經凍幹工序製成凍乾粉針劑。
藥學原理《內經素問·調經論》曰「血之與氣，並走於上，則為大厥，厥則暴死，氣復反則生，不反則死」，揭示了出血性中風血隨氣逆的病理基礎。本病的病機主要在於瘀血和火熱兩種致病因子的共同參與，以致瘀熱相搏，衝激上逆，損傷腦絡，絡破血溢，腦中蓄血，從而表明病證是「瘀熱阻竅」型。其特點為離經之血瘀阻腦腑，使腦髓壅滯，閉阻竅絡，元神內困，五臟失統，六腑氣閉，肢體失相。一旦發病，來勢兇險，風火相煽，氣血逆亂，升降失調，導致「血之與氣，並走於上」，衝腦損絡，絡破血溢即成「腦中蓄血」。發病過程中，風痰上擾、熱迫血行是導致出血性中風的始動因素。離經之血即為瘀血，有學者對「離經之血——腦中蓄血為瘀血」的中醫理論進行了實驗研究，發現出血性中風有明顯的血液流變學指標變化，從而認為其為出血性血瘀證或是血管性血瘀證，現代CT檢查更證實顱內有高密度出血性改變灶。
張介賓曰「治風先治血，血行風自滅」，從中西醫理論或臨床研究均角度證實了這一觀點，故出血性中風應從血論治。此外，出血性中風急性期常出現發熱，部分患者雖無體溫增高，但有明顯的熱證表現，如口苦、咽幹、煩躁，甚至譫妄、夜不安、大便秘結等而呈陽明腑實之證象。「本發明注射液」之處方依據上述理論而立法，採用涼血止血、活血化瘀、瀉下通腑之藥為主，輔以清熱瀉火、行血破瘀之品，用於治療出血性中風急性期的瘀熱阻竅證。
藥效學實驗通過主要藥效學實驗驗證本發明注射液與臨床功能主治有關的作用。
藥品及試劑本發明注射液(濃縮液)為棕紅色液體，藥液濃度2.0g/ml(按生藥量計算)，成人日用量為40g/60kg(按生藥量計算)，由江蘇中康新藥指紋圖譜開發有限公司提供，批號20010818。臨用前用無菌溶媒稀釋至所需濃度；無菌溶媒，江蘇中康新藥指紋圖譜開發有限公司提供，批號20010818；清開靈注射液，由山西太行藥業有限公司生產，批號010606-10；氯化鈉注射液，由南京小營製藥廠生產，批號010208；戊巴比妥鈉，使用前用滅菌注射用水配製成4％的水溶液；青黴素，由哈爾濱製藥廠生產，批號980726；硫酸慶大黴素，由江蘇宜興前進位藥廠生產，批號980109；2％碘酊，由江蘇省常熟市衛生化工廠生產，批號990122；無水乙醇，AR，由南京化學試劑廠生產，批號970302；牛凝血酶(bovine thrombin)，2unit/μl，pH7.0，含50μmol的脆絲鹽酸緩衝體系，批號EC3.4.21.5；伊文斯蘭，由中國醫藥集團(上海)化學試劑公司生產，批號990501；生理鹽水，由南京小營製藥廠生產，批號001209；70％乙醇，由南京化學試劑廠生產的乙醇(AR，批號990302)配製而成；鹽酸腎上腺素注射液(1mg/ml)，武漢諾佳藥業集團股份有限公司，批號010601，臨用前用生理鹽水稀釋成0.1mg/ml；烏來糖(氨基甲酸乙酯)中國醫藥(集團)上海化學試劑公司，化學純，批號C，用蒸餾水配成25％的烏來糖溶液。
實驗動物SD大鼠，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供。合格證蘇(動)質98003。
純種日本大耳白家兔，雄性，體重1.7～2.3kg，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供。蘇動(質)98003。
儀器江灣I型C腦立體固定儀，上海第二軍醫大學器材處；754紫外可見分光光度計，上海第三分析儀器廠；DKZ-2型電熱恆溫振蕩水槽，上海精宏實驗設備有限公司；DF110型電子分析天平，常熟衡器公司；YXQ-280電熱式壓力蒸汽消毒器；752紫外分光光度計，上海第三分析儀器廠；SB2200超聲波清洗器，上海必能超聲有限公司；10μl微量進樣器，上海醫用雷射儀器廠；DHJ-9076A型電熱恆溫鼓風乾燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；JA2003型電子秤，上海天平儀器廠；手術刀、止血鉗、眼科鑷、縫合針線、脫脂棉、紗布等。
實驗條件給藥前後，實驗動物均分籠飼養，餵全價顆粒飼料或青稞飼料(南京市江浦縣藥檢所實驗動物飼料加工廠提供)，自由飲水，室溫22～25℃，溼度50～70％。
統計方法本實驗採用t檢驗、x2檢驗。
對大鼠實驗性腦出血模型的影響(1)造模方法大鼠適應性餵養一周後開始造模。眼眶取血0.5ml/只，肝素抗凝；大鼠4mg/kg戊巴比妥鈉按10ml/kg體重腹腔注射麻醉，剪去頂毛，固定於立體定位儀；常規局部消毒，切開頭皮，以前囟為0點，向右旁開4mm，向後2mm，牙科鑽鑽孔，用微量注射器將自體抗凝血100μl緩慢注入尾殼核區，拔針，縫合頭皮[1]。
(2)分組給藥將造模成功的大鼠隨機分為6組，即①模型組，給予生理鹽水10ml/kg體重；②高劑量組(本發明I組)，給予本發明注射液生藥8g/kg體重；③中劑量組(本發明II組)，給予本發明注射液4g/kg體重；④低劑量組(本發明III組)，給予本發明注射液2g生藥/kg體重；⑤陽性對照組，給予清開靈注射液3.5ml/kg；⑥假手術組(手術方法相同，但不注入自體抗凝血)，給予生理鹽水10ml/kg體重。各組均腹腔注射給藥，給藥體積均為10ml/kg體重連續給藥5d。
(3)觀測指標及方法①動物一般情況及死亡數統計觀察動物造模後精神狀態、毛色、活動能力、體重和死亡數。按下式計算大鼠體重增長率大鼠體重增長率＝(造模後第4天體重-造模前體重)/造模前體重×100％②動物神經功能缺損分級動物神經功能缺損分級方案參照Bederson[2]及愛丁堡與斯堪的那維亞研究組[3]方案修訂0級正常；I級一側肢體輕度無力，略有跛行，可以直線行進或有偏行(行進打偏半徑超過1m)；II級一測肢體明顯無力，頭部輕度向另側歪斜，跛行，不能向正前方直行，偏行半徑在0.5～0.75m左右；III級一側偏癱，站立比較困難，不能行走，但可以正臥位，有顯著的歪頭、口角歪斜；IV級一側偏癱，不能正臥，呈側臥甚至仰臥，歪頭及身體扭曲明顯，或不能自主進食，神志迷濛，或抽搐頻繁(10min內2次以上)；V級昏迷或死亡。
③腦組織含水量測定脫頸椎處死大鼠，斷頭，剪開頭皮，以止血鉗小心剝離顱骨和硬腦膜，取腦於濾紙上，吸乾殘血，去除小腦和嗅球，以手術刀片從正中線分左右大腦，分別稱重，計算左右腦重量差。再將左右半腦分別置於事先已乾燥至恆重的小玻璃瓶內，於烤箱內70□下烘乾至恆重，分別稱左右半腦幹重，計算左半腦含水量。
腦幹重＝恆重後的帶瓶腦重-稱量瓶重左腦組織含水率＝(左腦溼重-左腦幹重)/左腦溼重×100％④腦指數計算腦指數＝全腦溼重(左半腦溼重+右半腦溼重)/體重×100⑥腦組織病理形態學的光鏡觀察標本福馬林固定，常規石蠟包埋，連續切片，HE染色，光鏡觀察。
(4)實驗結果①動物一般狀況及死亡數統計造模後，各組大鼠均出現不同程度的精神萎靡、行動遲緩或障礙等表現。各組大鼠在造模後均有不同程度的死亡，各給藥組動物死亡率低於模型組，但給藥組動物死亡率與模型組相比，無顯著性差異(p＞0.05)。見表1。
表1本發明注射液對實驗性腦出血大鼠死亡率的影響大鼠死亡率(％)分組動物數 劑量(g/kg)術後1d 術後2d 術後3d 術後4d假手術組20-0(0/20)0(0/20) (0/20) (0/20)模型組 25-20(5/25) 36(9/25) 36(9/25) 45.45(9/25)清開靈組253.5ml/kg 8(2/25)36(9/25) 36(9/25) 35(9/25)本發明I組 25812(3/25) 28.00(7/25) 32(8/25) 40(8/25)本發明II組 25412(3/25) 32(8/25) 32(8/25) 35(8/25)本發明III組 2528(2/25)32(8/25) 36(9/25) 35(9/25)②對大鼠體重的影響造模前各組動物體重無顯著性差異，造模後第4d，模型組大鼠體重增長率低於正常組，兩者相比，有顯著性差異(p＜0.01)。各給藥組動物體重增長率均大於模型組，其中本發明注射液中劑量組動物體重增長率與模型組兩者相比，有顯著性差異(p＜0.05)。見表2。
表2本發明注射液對實驗性腦出血大鼠體重的影響(X+S)劑量 造模前體重 造模後的體重 體重增長率分組動物數(g/kg) (g) (g) (％)假手術組20 - 299±22.3303±27.11 1.17±2.21模型組 16 - 302.33±23.15292.83±27.26-3.18±4.7□□清開靈組16 3.5ml/kg 287.75±26.57285.42±30.15-0.89±2.97本發明I組 17 8 290±13.64 284.67±14.38-1.83±2.24本發明II組 17 4 289.62±17.22290.69±21.760.24±2.9*本發明III組 16 2 300.83±27.85295.08±32.89-2.04±3.21注與假手術組比較，□□p＜0.01；與模型組比較，*p＜0.05。
③神經功能缺損評分大鼠經腦內注射自身抗凝血後，均出現較為明顯的行為體徵異常。造模後第1d，模型組與4個給藥組比較，大鼠神經功能缺損分級無顯著性差異(p＞0.05)，造模第2d後，各給藥組動物行為體徵評分均低於模型組，本發明注射液高、中劑量組行為體徵評分與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.05)。清開靈組在造模第3d後，行為體徵評分與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.05)。造模後第4d，模型組動物行為體徵評分與自身第1d比較，無顯著性差，表明動物自身恢復不顯著；本發明注射液中劑量組動物行為體徵評分造模後第4d與第1d比較，有顯著性差異。提示本發明注射液對實驗性腦出血大鼠的行為體徵異常有一定的改善作用。見表3。
表3本發明注射液對實驗性腦出血大鼠神經功能的影響(X+S)

注與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；同組第4d與第1d組比較，#p＜0.05。
④對腦指數和腦組織含水量的影響大鼠經腦內注射自身抗凝血後，左右半腦重量差、腦指數和左腦組織含水率均增大，與假手術組相比，有顯著性差異(p＜0.01)，表明動物腦內注射自身抗凝血後已造成了腦水腫。各給藥組動物左右半腦重量差和腦指數均小於模型組，與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.05或p＜0.01)，本發明注射液中劑量組動物的左腦組織含水率與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.05)。提示本發明注射液有減輕實驗性腦出血大鼠腦水腫作用。見表4。
表4本發明對實驗性腦出血大鼠左右半腦重量差、腦指數和腦組織含水量影響的比較(X+S)左右半腦重量動物腦指數左腦組織含水量組別差數 (g/100g體重) (％)(g)假手術組 11 0.015±0.004 0.429±0.024 77.62±1.87模型組 9 0.087±0.042□□0.471±0.039□□82.01±2.63□清開靈組 8 0.038±0.006**0.437±0.07*79.21±2.61本發明I組 8 0.036±0.013**0.435±0.028*78.74±2.47本發明II組 8 0.035±0**0.431±0.049*78.92±2.76*本發明III組9 0.037±0.015*0.435±0.075*81.35±3.73注與假手術組比較，□p＜0.05，□□p＜0.01；與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01。
⑤對造模大鼠血清內皮素的影響大鼠經腦內注射自身抗凝血造成實驗性出血性中風模型後，模型組動物血清內皮素含量升高，但與假手術組相比，無顯著性差異(p＞0.05)。本發明注射液高、中劑量給藥組動物血清內皮素含量均低於模型組，但與模型組相比，無顯著性差異(p＞0.05)。提示本發明注射液對造模動物血清內皮素的升高有一定的抑制作用。見表5。
表5本發明注射液對實驗性腦出血大鼠血清內皮素的影響(X+S)動物數劑量組別 ET(只)(g/kg)假手術組 11 - 85.91±60.59模型組 9- 181.16±84清開靈組 83.5ml/kg 129.93±80.05本發明I組 88 109.88±95.09本發明II組 84 109.59±74.33本發明III組92 157.33±116.91⑥腦組織病理形態學的光鏡觀察各組大鼠光鏡觀察結果如下(表6)
表6本發明對實驗性腦出血大鼠腦組織病理形態學的影響動物數 腦白質部分 腦組織膠質細胞腫脹或見胞漿中性白細 無明顯組別 劑量(g/kg)(只)區域疏鬆壞死 呈泡沫狀的格子細胞 胞集聚病變假手術組 99模型組 7 -322清開靈組 8 3.5ml/kg 2 2 1 4本發明I組 9 84 5本發明II組 9 44 1 4本發明III組7 23 4 0由表6可見a.假手術組假手術組9例，神經細胞未見胞體腫脹，胞核固縮、壞死等病理改變。未見軟化灶形成。膠質細胞無增生，間質血管無擴張充血、出血、水腫、炎細胞浸潤等；b.模型組模型組7例。3例腦白質部分區域疏鬆，其間可見大小不等的空網狀結構，並見膠質細胞增生、灶性中性白細胞浸浸潤。2例腦組織部分區域環死，膠質細胞增生。胞漿噬有脂質、呈空泡狀。其餘2例無明顯病變；c.清開靈組8例，2例腦白質部分區域疏鬆、呈空泡狀，膠質細胞腫脹，血管周圍間隙增寬。1例除上述改變外尚見胞漿呈泡沫狀的格子細胞。1例局部有大量的中性白細胞集聚，形成小膿腫。其餘4例無明顯病變；d.高劑量組高劑量組9例。3例腦白質部分區域疏鬆、呈空網狀，膠質細胞腫脹，並見胞漿呈泡沫狀的格子細胞，血管周圍間隙增寬，有省突膠質細胞形成的血管袖套現象。1例除上述病變外局部區域有大量的中性白細胞集聚，形成小膿腫。其作5例無明顯病變；e.中劑量組中劑量組9例，4例腦白質部分區域疏鬆、呈空網狀，膠質細胞腫脹，增生。除上述改變外尚見胞漿呈泡沫狀的格子細胞。1例局部有大量的中性白細胞集聚，形成小膿腫。其餘4例無明顯病變；f.低劑量組低劑量組7例。3例腦白質部分區域疏鬆呈空網狀，膠質細胞腫脹增生，並見胞漿呈泡沫狀細胞。4例局部膠質細胞增生、胞漿疏鬆淡染。
大鼠腦出血動物模型腦部病變表現為腦白質部分區域疏鬆淡染，其間可見大小不等的空網狀結構，部分區域膠質細胞增生，胞漿噬有脂體、呈空泡狀，個別動物腦組織內出現小膿腫。灰質部神經細胞基本無見胞體腫脹、胞核固縮、壞死等病理改變。經藥物治療後，各組病變程度如下模型組病變較重，中劑量組、陽性組病變較輕，假手術組未見明顯的組織病理學改變。
(5)小結①本實驗採用向大鼠腦內尾殼核區注入自體抗凝血的方法製造大鼠腦出血模型，實驗結果表明此方法能造成動物明顯的行為體徵異常和腦水腫。
②本發明注射液能改善實驗性腦出血動物的行為體徵異常，降低造模側半腦的含水率和全腦指數，降低造模後動物的死率。提示本發明注射液對實驗性腦出血大鼠有一定的治療作用。
③病理組織學檢查結果表明大鼠腦出血動物模型腦部病變表現為腦白質部分區域疏鬆淡染，其間可見大小不等的空網狀結構，部分區域膠質細胞增生，胞漿噬有脂體、呈空泡狀，個別動物腦組織內出現小膿腫。灰質部神經細胞基本未見胞體腫脹、胞核固縮、壞死等病理改變。經藥物治療後，各組病變程度如下模型組病變較重，中劑量組、陽性組病變較輕，假手術組未見明顯的組織病理學改變。
對凝血酶所致大鼠腦水腫的影響(1)造模方法手術前大鼠稱重並記錄。仿Xi Guohua[4]及Lee KR[5]方法略加改進，複製大腦水腫模型大鼠戊巴比妥鈉30mg/kg體重腹腔注射麻醉後，俯臥位固定於腦立體定位儀，常規消毒後，縱向切開頭背側中央皮膚約1.5cm，暴露前後囟，使前後囟處於同一水平，參閱大鼠腦立體定位譜，以前囟中點為原點，向後2mm，左側旁開4mm，左側尾核殼定位，以牙科鑽鑽直徑約1mm左右的小孔，用固定於立體定位儀上微量注射器，沿針孔垂直進針5mm，模型組緩慢推注10□l凝血酶生理鹽水液(含凝血酶20U)，注射時間不少於3min，緩慢退針後縫合頭皮，用消毒棉球壓迫止血；假手術組造模過程同模型組，但針刺進入尾核殼後注射10ml生理鹽水。手術後每隻大鼠大腿內側肌注青黴素2萬單位以預防感染。術後大鼠適當保暖。
(2)動物分組給藥將造模成功的大鼠隨機分為6組，即①模型組，給予生理鹽水10ml/kg體重；②本發明注射液低劑量組，給予本發明注射液2g生藥/kg體重；③本發明注射液中劑量組，給予本發明注射液4g生藥/kg體重；④本發明注射液高劑量組，給予本發明注射液8g生藥/kg體重；⑤陽性對照組，給予清開靈注射液3.5ml/kg⑥假手術組，給予生理鹽水10ml/kg體重。各組均腹腔注射給藥，給藥體積均為10ml/kg體重。
(3)觀察指標①動物一般情況及死亡數統計觀察動物造模後精神狀態、毛色、活動能力、體重和死亡數。按下式計算大鼠體重增長率大鼠體重增長率＝(造模後第4天體重-造模前體重)/造模前體重×100％②腦組織含水量測定脫頸椎處死大鼠，斷頭，剪開頭皮，以止血鉗小心剝離顱骨和硬腦膜，取腦於濾紙上，吸乾殘血，去除小腦和嗅球，以手術刀片從正中線分左右大腦，分別稱重，計算左右腦重量差。再將左右半腦分別置於事先已乾燥至恆重的小玻璃內，於烤箱內70℃下烘乾至恆重，分別稱左右半腦幹重，計算左右半腦含水量。
腦幹重＝恆重後的帶瓶腦重-稱量瓶重腦組織含水率＝(腦溼重-腦幹重)/腦溼重×100％③腦指數計算腦指數＝全腦溼重(左半腦溼重+右半腦溼重)/體重×100④動物神經功能缺損分級動物神經功能缺損分級方案參照Bederson[2]及愛丁堡與斯堪的那維亞研究組[3]方案修訂0級正常；I級一側肢體輕度無力，略有跛行，可以直線行進或有偏行(行進打偏半徑超過1m)；II級一測肢體明顯無力，頭部輕度向另側歪斜，跛行，不能向正前方直行，偏行半徑在0.5～0.75m左右；III級一側偏癱，站立比較困難，不能行走，但可以正臥位，有顯著的歪頭、口角歪斜；IV級一側偏癱，不能正臥，呈側臥甚至仰臥，歪頭及身體扭曲明顯，或不能自主進食，神志迷濛，或抽搐頻繁(10min內2次以上)；V級昏迷或死亡。
(4)實驗結果①動物一般狀況及死亡數統計造模後，各組大鼠均出現不同程度的精神萎靡、行動遲緩或障礙等表現，4d內，大鼠無一死亡。
②對造模大鼠體重的影響模型組大鼠體重增長率明顯低於假手術組，兩者相比，有顯著性差異(p＜0.01)。本發明注射液高、中、低劑量組和清開靈注射液組的大鼠體重增長率高於模型組，其中本發明注射液中劑量組體重增長率與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.05)。見表7。
表7本發明注射液對凝血酶所腦水腫大鼠體重的影響(X+S)劑量 造模前體重造模後的體重 體重增長率分組 動物數(g/kg) (g) (g)(％)假手術組 15 - 299.00±22.30 303.00±27.101.17±2.21模型組 15 - 290.43±14.43 283.64±12.34-2.30±1.62□□清開靈組 15 3.5ml/kg 292.46±10.89 287.46±10.97-1.69±2.32本發明I組 15 8 290.71±12.39 287.93±11.33-0.89±2.59本發明II組 15 4 287.0±13.28 284.57±10.65-0.72±2.49*本發明III組15 2 289.69±12.39 286.15±12.64-1.20±2.32注與假手術組比較，□□p＜0.01；與模型組比較，*p＜0.05。
③行為體徵評分動物經腦內注射凝血酶造成腦水腫，出現明為的行為體徵異常。造模第2d後，各給藥組動物行為體徵評分均低於模型組，造模後第3、4d，本發明注射液高、中、低劑量組和清開靈組行為體徵評分，與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.05或p＜0.01)。模型組大鼠行為體徵評分逐日增高，造模後第4d與第1d比較，有顯著性差異(p＜0.01)。本發明注射液低劑量組和清開靈組行為體徵評分，造模後第4d與第1d相比，無顯著性差異(p＞0.05)。提示本發明注射液對腦內注射凝血酶所造的動物行為體徵異常有一定的保護作用。見表8。
表8本發明注射液對凝血酶所腦水腫大鼠大鼠神經功能的影響(X+S)劑量 行為體徵評分分組 動物數(g/kg) 術後1d 術後2d術後3d術後4d假手術組 15 - - - - -模型組 15 - 1.14±0.772.21±1.123.43±0.76##3.54±0.96##清開靈組 15 3.5ml/kg1.23±0.691.84±0.692.00±0.91**2.11±0.93**本發明I組 15 8 1.07±0.621.93±0.621.93±0.83**1.67±0.92**本發明II組 15 4 0.86±0.661.93±0.921.79±0.58**1.85±0.73**本發明III組15 2 1.23±0.602.15±0.892.92±0.76 2.45±0.78*注與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；同組第4d與第1d組比較，##p＜0.01。
④對腦指數和腦組織含水量的影響大鼠經腦內注射凝血酶後，動物左右半腦重量差、腦指數和左腦組織含水率顯著增高，與假手術組相比，有顯著性差異(p＜0.05或p＜0.01)，表明向腦內注射凝血酶可成功造成腦水腫模型。各給藥組大鼠左右重量差、腦指數和左腦組織含水率均低於模型組，其中本發明注射液高劑量組和清開靈組動物左右半腦重量差、腦指數和腦組織含水量，與模型組比較，有顯著性差異(p＜0.05或p＜0.01)。提示本發明注射液對凝血酶所致大鼠腦水腫有一定的改善作用。見表9。
表9本發明注射液對凝血酶所腦水腫大鼠左右半腦重量差、腦指數和腦組織含水量的影響(X+S)動物 左右半腦重量差 腦指數腦組織含水率組別數(g) (g/100g體重) (％)假手術組 150.0051±0.0160.430±0.016 77.48±2.13模型組 150.0479±0.017□□0.458±0.009□□79.53±2.61□清開靈組 150.0353±0.013*0.446±0.015*77.27±2.81*本發明I組 150.0308±0.012*0.445±0.008**77.03±3.09*本發明II組 150.0261±0.014**0.447±0.010**78.82±1.87本發明III組150.0429±0.0110.449±0.010*78.55±0.87注與假手術組比較，□p＜0.05，□□p＜0.01；與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01。
(5)小結①大鼠經腦內注射凝血酶後，行為體徵出現明顯地異常，動物左右半腦重量差、全腦指數和造模側半腦組織含水率明顯增高，表明向腦內注射凝血酶可成功造成動物腦水腫模型。
②本發明注射液能改善造模後大鼠行為體徵的異常，降低左左半腦重量差、全腦指數和造模側半腦組織含水率，表明本發明注射液對凝血酶所致大鼠腦水腫有一定的治療作用。
3.對出血性大鼠腦血管通透性的影響試驗(1)造模方法大鼠適應性餵養一周後開始造模。眼眶取血0.5ml/只，肝素抗凝；大鼠4％戊巴比妥鈉按1ml/kg體重腹腔注射麻醉，剪去頂毛，固定於腦立體定位儀；常規局部消毒，切開頭皮，以前囟為0點，向右旁開4mrn，向後2mm，牙科鑽鑽孔，用微量注射器將自體抗凝血100ml緩慢注入尾殼核區，留針3min後拔針，縫合頭皮[1]。
(2)分組給藥及測定方法將造模成功的大鼠隨機分為6組，即①模型組，給予生理鹽水10ml/kg體重；②高劑量組(本發明I組)，給予本發明注射液生藥8g/kg體重；③中劑量組(本發明II組)，給予本發明注射液4g/kg體重；④低劑量組(本發明III組)，給予本發明注射液2g生藥/kg體重；⑤陽性對照組，給予清開靈注射液3.5ml/kg；⑥假手術組(手術方法相同，但不注入自體抗凝血)，給予生理鹽水10ml/kg體重。各組均腹腔注射給藥，給藥體積均為10ml/kg體重，連續給藥5d。造模後1d、2d、3d、4d，分別觀察大鼠行為體徵的變化並進行評分。於造模後第4d、末次給藥後1 h將大鼠麻醉，舌下靜脈注射伊文斯蘭50mg/kg，3h後處死，取腦，分開左右腦，分別稱重。剪碎左腦，於70％丙酮溶液中浸泡24h，3000rpm離心15min，取上清液於625nm處比色，讀取OD值。
(3)觀察指標①動物一般情況及死亡數統計觀察動物造模後精神狀態、毛色、活動能力、體重和死亡數。按下式計算大鼠體重增長率大鼠體重增長率＝(造模後第4天體重-造模前體重)/造模前體重×100％②動物神經功能缺損分級動物神經功能缺損分級方案參照Bederson[2]及愛丁堡與斯堪的那維亞研究組[3]方案修訂0級正常；I級一側肢體輕度無力，略有跛行，可以直線行進或有偏行(行進打偏半徑超過1m)；II級一測肢體明顯無力，頭部輕度向另側歪斜，跛行，不能向正前方直行，偏行半徑在0.5～0.75m左右；III級一側偏癱，站立比較困難，不能行走，但可以正臥位，有顯著的歪頭、口角歪斜；IV級一側偏癱，不能正臥，呈側臥甚至仰臥，歪頭及身體扭曲明顯，或不能自主進食，神志迷濛，或抽搐頻繁(10min內2次以上)；V級昏迷或死亡。
③腦組織含水量測定脫頸椎處死大鼠，斷頭，剪開頭皮，以止血鉗小心剝離顱骨和硬腦膜，取腦於濾紙上，吸乾殘血，去除小腦和嗅球，以手術刀片從正中線分左右大腦，分別稱重，計算左右腦重量差。再將左右半腦分別置於事先已乾燥至恆重的小玻璃瓶內，於烤箱內70℃下烘乾至恆重，分別稱左右半腦幹重，計算左右半腦含水量。
腦幹重＝恆重後的帶瓶腦重-稱量瓶重左腦組織含水率＝(左腦溼重-左腦幹重)/左腦溼重×100％④腦指數計算腦指數＝全腦溼重(左半腦溼重+右半腦溼重)/體重×100⑤對腦組織浸出液伊文斯蘭濃度的影響剪碎左腦，於70％丙酮溶液中浸泡24h，3000rpm離心15min，取上清液於625nm處比色，讀取OD值，以OD值代表浸出液伊文斯蘭的濃度。
實驗結果①動物一般狀況及死亡數統計造模後，各組大鼠均出現不同程度的精神萎靡、行動遲緩或障礙等表現。大鼠在造模後均有不同程度的死亡，造模後3d內，各給藥組動物死亡率低於模型組，造模後第4d，本發明高劑量組組動物死亡率高於模型組，但與模型組比較無顯著差異(p＞0.05)。見表10。
表10本發明注射液對實驗性腦出血大鼠死亡率的影響劑量 大鼠死亡率(％)分組(g/kg) 術後1d 術後2d 術後3d 術後4d假手術組 - 0(0/18) 0(0/18) 0(0/18) 0(0/18)模型組 - 5.56(1/18) 22.22(4/18) 44.44(8/18) 44.44(8/18)清開靈組 3.5ml/kg 5.56(1/18) 33.33(6/18) 44.44(8/18) 44.44(8/18)本發明I組 8 5.56(1/18) 22.22(4/18) 38.89(7/18) 50(9/18)本發明II組 4 11.11(2/18) 22.22(4/18) 33.33(6/18) 44.44(8/18)本發明III組2 5.56(1/18) 38.89(7/18) 38.89(7/18) 44.44(8/18)②對造模大鼠體重的影響模型組大鼠體重增長率明顯低於正常組，兩者相比，有顯著性差異。本發明注射液高、中、低劑量組和清開靈注射液組的大鼠體重增長率高於模型組，與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.05)。見表9。
表9本發明注射液對實驗性腦出血大鼠體重的影響(X+S)劑量 造模前體重 造模後的體重 體重增長率分組 動物數(g/kg) (g) (g)(％)假手術組 18 - 306.40±26.15 315.5±29.582.92±2.3模型組 10 - 300.22±24.94 292.89±27.09 -2.45±2.24□□清開靈組 10 3.5ml/kg 280.22±19.94 279.56±18.6-0.18±2.67*本發明I組 9 8 292.67±30.4 292.67±30.24 -0.5±2.45本發明II組 10 4 311.33±8.53 309.9±37.070.42±2.11*本發明III組10 2 305.4±25.24 306.3±27.340.28±3.16*注與假手術組比較，□□p＜0.01；與模型組比較，*p＜0.05。
③行為體徵評分動物經腦內自身抗凝血造成實驗性腦出血，出現明為的行為體徵異常。造模第1d後，各給藥組動物行為體徵評分均低於模型組，造模後第3、4d，本發明注射液中、低劑量組和清開靈組行為體徵評分，與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.05或p＜0.01)。模型組大鼠行為體徵評分造模後第4d與第1d比較，無顯著性差異(p＞0.05)，表明造模動物行為體徵自身改善不顯著。本發明注射液低劑量組和清開靈組行為體徵評分，造模後第4d與第1d相比，有顯著性差異(p＜0.05)。提示本發明注射液對腦內注射凝血酶所造的動物行為體徵異常有一定的改善作用。見表12。
表12本發明注射液對實驗性腦出大鼠神經功能的影響(X+S)

注與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；同組第4d與第1d組比較，#p＜0.05。
④對腦指數和腦組織含水量的影響大鼠經腦內注射凝血酶後，動物左右半腦重量差、腦指數和左腦組織含水率顯著增高，與假手術組相比，有顯著性差異(p＜0.05或p＜0.01)，表明向腦內注射凝血酶可成功造成腦水腫模型。各給藥組大鼠左右重量差、腦指數和左腦組織含水率均低於模型組，其中本發明注射液中劑量組動物左右半腦重量差、腦指數和腦組織含水量，與模型組比較，有顯著性差異(p＜0.05或p＜0.01)。各給藥組動物左右半腦重量差，與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.05或p＜0.01)。提示本發明注射液對凝血酶所致大鼠腦水腫有一定的改善作用。見表13。
表13本發明注射液對實驗性腦出血大鼠左右半腦重量差、腦指數和腦組織含水量影響(X+S)動物 左右半腦重量差 腦指數 腦組織含水率組別數 (g) (g/100g體重) (％)假手術組 180.0111±0.0163 0.416±0.05 78.62±1.6模型組 100.0544±0.0204□□0.452±0.041□81.07±2.8□清開靈組 100.0305±0.0288*0.447±0.03680.06±2.27本發明I組 9 0.015±0.0081**0.442±0.03979.7±2.96本發明II組 100.0193±0.0162**0.416±0.143*78.96±3.16*本發明III組100.0277±0.021*0.438±0.14680.86±5.62注與假手術組比較，□p＜0.05，□□p＜0.01；與模型組比較，*p＜0.05。
⑤對腦組織浸出液伊文斯蘭濃度的影響經比色法測定，模型組OD值與假手術組比較無顯著性差異(p＞0.05)，表明大鼠經腦內注射自身抗凝血造成實驗性腦出血後，動物腦血管通性無明顯改變。本發明注射液高、中劑量腦組織浸出液OD值小於模型組，與模型組比較有顯著性差異(p＜0.05)提示本發明注射液能減少腦血管的通透性。見表14。
表14本發明注射液對實驗性腦出血大鼠腦組織浸出液伊文斯蘭濃度的影響(X+S)劑量組別 動物數 OD值(g/kg)假手術組 18 3.5ml/kg 0.527±0.246模型組 10 - 0.576±0.214清開靈組 10 2 0.445±0.263本發明I組 9- 0.326±0.147*本發明II組 10 8 0.339±0.251*本發明III組10 4 0.504±0.308注與模型組比較，*p＜0.05。
對實驗性家兔腦水腫急性期的研究(1)造模方法家兔適應性餵養一周後開始造模。眼眶取血0.5ml/只，肝素抗凝；大鼠4％戊巴比妥鈉按1ml/kg體重耳緣靜脈麻醉，剪去頂毛，固定於立體定位儀；常規局部消毒，切開頭皮，以前囟為0點，向右旁開4mm，向後1mm，牙科鑽鑽孔，用微量注射器將自體抗凝血100μl緩慢注入尾殼核區，拔針，縫合頭皮[6]。
(2)分組給藥將造模成功的家兔隨機分為6組，即①模型組，給予生理鹽水1.5ml/kg體重；②高劑量組(本發明I組)，給予本發明注射液3.0g生藥/kg體重；③中劑量組(本發明II組)，給予本發明注射液1.5g/kg體重；④低劑量組(本發明III組)，給予本發明注射液0.75g生藥/kg體重；⑤陽性對照組，給予清開靈注射液2.0ml/kg⑥溶媒組給予本發明溶媒1.5ml/kg體重。另設假手術組(手術操作同模型組，但不注入血凝塊)，給予生理鹽水1.5ml/kg體重，共7組。各組均耳緣靜脈注射給藥，除⑤組外，其餘各組給藥體積均為1.5ml/kg體重。
(3)觀測指標及方法①動物一般情況及死亡數統計觀察動物造模後精神狀態、毛色、活動能力、體重和死亡數。
②動物神經功能缺損分級動物神經功能缺損分級方案參照Bederson[2]及愛丁堡與斯堪的那維亞研究組[3]方案修訂0級正常；I級一側肢體輕度無力，略有跛行，可以直線行進或有偏行(行進打偏半徑超過1m)；II級一測肢體明顯無力，頭部輕度向另側歪斜，跛行，不能向正前方直行，偏行半徑在0.5～0.75m左右；III級一側偏癱，站立比較困難，不能行走，但可以正臥位，有顯著的歪頭、口角歪斜；IV級一側偏癱，不能正臥，呈側臥甚至仰臥，歪頭及身體扭曲明顯，或不能自主進食，神志迷濛，或抽搐頻繁(10min內2次以上)；V級昏迷或死亡。
③腦組織含水量測定處死家兔，斷頭，剪開頭皮，以止血鉗小心剝離顱骨和硬腦膜，取腦於濾紙上，吸乾殘血，去除小腦和嗅球，以手術刀片從正中線分左右大腦，分別稱重，計算左右腦重量差。再將左右半腦分別置於事先已乾燥至恆重的小玻璃內，於烤箱內70□下烘乾至恆重，分別稱左右半腦幹重，計算左半腦含水量。
腦幹重＝恆重後的帶瓶腦重-稱量瓶重左腦組織含水率＝(左腦溼重-左腦幹重)/左腦溼重×100％④腦指數計算腦指數＝全腦溼重(左半腦溼重+右半腦溼重)/體重×1000⑤凝血時間的測定以4號注射針頭家兔耳緣動脈放血，滴於載玻片上，以針尖輕挑血滴，每隔15s1次，直至出現絲狀物為止，記錄出現絲狀物時間。
⑤對血液流變學的影響家兔頸動脈放血於抗凝管內，每支5ml。於自清洗施轉式粘度計上測定全血粘度和血漿粘度。
(4)實驗結果①動物一般狀況及死亡數統計造模後，各組家兔均出現不同程度的精神萎靡、行動遲緩或障礙等表現。各組家兔在造模後均有不同程度的死亡，各給藥組動物死亡率低於模型組，但給藥組動物死亡率與模型組相比，無顯著性差異(p＞0.05)。見表15。
表15本發明注射液對實驗性腦水腫家兔死亡率的影響劑量家兔死亡率(％)分組(g/kg)術後1d術後2d 術後3d 術後4d 術後5d假手術組 - 0/12 0/12 0/12 0/12 0/12模型組- 2/12(16.67)5/12(41.67) 5/12(41.67)5/12(41.67)5/12(41.67)清開靈組 2ml/kg1/12(8.33) 3/12(25) 3/12(25) 3/12(25) 3/12(25)本發明I組 3 2/12(16.67)3/12(25) 3/12(25) 3/12(25) 3/12(25)本發明II組1.5 2/12(16.67)2/12(16.67) 2/12(16.67)2/12(16.67)2/12(16.67)本發明III組 0.75 3/12(25) 4/12(33.33) 4/12(33.33)4/12(33.33)4/12(33.33)②神經功能缺損評分家兔經腦內注射自身血凝後，均出現較為明顯的行為體徵異常。造模後第1d，模型組與4個給藥組比較，家兔神經功能缺損分級無顯著性差異(p＞0.05)，造模第2d後，各給藥組動物行為體徵評分均低於模型組，本發明注射液高、中劑量組行為體徵評分與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.05)。清開靈組在造模第3d後，行為體徵評分與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.05)。造模後第4d，模型組動物行為體徵評分與自身第1d比較，無顯著性差異(p＞0.05)，表明動物自身恢復不顯著；本發明注射液中劑量組動物行為體徵評分造模後第4d與第1d比較，有顯著性差異。提示本發明注射液對實驗性腦出血家兔的行為體徵異常有一定的改善作用。見表16。
表16本發明注射液對實驗性腦水腫家兔神經功能的影響(X+S)

注與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；同組第4d與第1d組比較，#p＜0.05。
③對腦指數和腦組織含水量的影響家兔經腦內注射自身血凝塊後，腦指數和左腦組織含水率均增大，與假手術組相比，有顯著性差異(p＜0.05)，表明動物腦內注射自身血凝塊後已造成了腦水腫。各給藥組動物左右腦重量差均小於模型組，與組相比，有顯著性差異(p＜0.05)，本發明注射液中、低劑量組和清開靈組動物的腦指數與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.05)。提示本發明注射液有減輕實驗性腦出血家兔腦水腫作用。見表17。
表17本發明注射液對實驗性腦水腫家兔腦指數和腦組織含水量影響(X+S)劑量 全腦指數左腦-右腦 左腦含水率組別 動物數(g/kg)(g/1000g)(g)(％)假手術組 12 - 2.76±0.23□0.13±0.12□75.37±2.37□模型組 7 - 3.05±0.260.85±0.29 80.65±3.37清開靈組 9 0.752.90±0.11*0.54±0.26*77.77±2.88本發明I組 9 - 2.93±0.230.76±0.33*77.39±2.75本發明II組 10 3 2.92±0.21*0.45±0.21*76.36±2.13本發明III組9 1.5 2.93±0.19*0.76±0.39*77.40±2.39注與假手術組比較，□p＜0.05；與模型組比較，*p＜0.05。
④對家兔凝血時間的影響模型組凝血時間與假手術組相比，無顯著性差異(p＞0.05)，表明造模對家兔凝血時間無顯著性影響。本發明注射液各劑量組家兔凝血時間均短於模型組，與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.01)。見表18。
表18本發明注射液對實驗性腦水腫家兔對家兔凝血時間的影響(X+S)劑量 凝血時間組別 動物數(g/kg) (s)假手術組 12- 118.1±36.
模型組 7 - 125.5±44.4清開靈組 9 2ml/kg27.3±20.6**本發明I組 9 3 32.4±22.6**本發明II組 101.5 17.5±12.2**本發明III組9 0.75 36.5±19.5**注與模型組比較，**p＜0.01。
⑤對家兔血液流變學的影響模型組血液流變學各項指標與假手術組相比，均無顯著性差異(p＞0.05)，表明造模對動物血液流變學無顯著性影響。本發明注射液I組和II組全血粘度高切和低切均低於模型組，其中中切粘度與模型組相比，有顯著性差異(p＜0.05)；本發明注射液各給藥組血漿粘度均低於模型組，但與模型組相比，無顯著性差異(p＞0.05)。實驗結果表明，本發明注射液對造模動物的血液流變學有一定的改善作用。見表19。
表19本發明注射液對實驗性腦水腫家兔血液流變學的影響(X+S)

注與模型組比較，**p＜0.05。
(5)小結①通過向家兔腦內植入自身血凝塊可造成家免較為明顯的行為體徵異常，腦指數和造模側腦組織含水量顯著性增高，表明動物腦內植入自身血凝塊可成功複製動物腦水腫模型。
②本發明注射液可改善造模家兔行為體徵異常，減輕腦指數和造模側腦組織含水量，表明本發明注射液對自身血凝塊所致家兔腦水腫有一定的治療作用。
對小鼠耳廓微循環的影響(1)方法及分組給藥取ICR小鼠60隻，雌雄各半，體重20-22g，隨機分為5組。即①空白對照組溶媒10ml/kg；②清開靈組原液7ml/kg；③本發明低劑量組3.5g/kg；④本發明中劑量組7g/kg；⑤本發明高劑量組14g/kg。小鼠腹腔注射25％烏來糖2.5g/kg麻醉。
動物觀測指標及方法待小鼠麻醉後按10ml/kg靜脈注射各組藥物，並立即按方法[7]和文獻[8]將小鼠固定在觀察臺上(耳託上和耳廓表面滴加少許香柏油)(整個操作過程在2min內完成)，用顯微系統觀察小鼠耳廓微循環，同時腹腔注射鹽酸腎上腺素注射液1mg/kg，記錄注射腎上腺素前和注射後5、10、20、30min小鼠微循環細靜脈、細動脈的管徑和血流速度。
實驗結果實驗結果顯示本發明注射液低、中、高三個劑量組對血流速度無明顯影響，但均能對抗腎上腺素引起的微血管收縮，擴張小鼠微血管細靜脈和細動脈，與空白對照組比較差異顯著(p＜0.05或p＜0.01)，且呈劑量依賴性。表明本發明具有改善微循環的作用。結果見表20、21、22。
表20本發明注射液對小鼠耳廓微循環血流速度的影響(X+S)(n＝12)劑量正常值注射腎上腺素後增加百分率(％)組別(g/kg) (μm/s)5min10min20min30min空白對照組- 103.8±9.51.4±7.1 0.7±5.71.1±10.80.1±6.9清開靈組 7ml/kg104.4±10.6 0.6±7.8 2.3±7.9-1.0±8.5-0.4±10.2本發明I組 3.5 102.0±9.3-1.1±4.32.5±9.21.1±9.2 -1.6±8.1本發明II組7 101.3±7.61.2±4.3 1.0±5.6-0.2±7.34.5±8.0本發明III組 14102.9±4.62.5±8.1 3.6±8.31.0±3.6 -0.8±6.1
表21本發明注射液對小鼠耳廓微靜脈管徑的影響(X+S)(n＝12)劑量正常值注射腎上腺素後增加百分率(％)組別(g/kg)(μm) 5min 10min 20min 30min空白對照組- 11.4±1.2-27.7±10.3-33.6±9.2 -19.0±7.4 -1.5±7.2清開靈組 7ml/kg11.6±1.3-30.9±14.9-19.3±14.4**-4.8±12.1**11.2±8.3**本發明I組 3.5 11.6±0.9-23.4±7.9 -20.3±6.6**-9.4±9**8.3±11.1*本發明II組7 11.3±1.2-23.1±15.7-13.2±23.5*2.5±19.2**15.6±21*本發明III組 1411.4±1.2-27.2±13.3-21.6±14.7*-1.8±19.6**3.6±21.6注與空白對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01。
表22本發明注射液對小鼠耳廓微動脈管徑的影響(X+S)(n＝12)劑量正常 注射腎上腺素後增加百分率(％)組別(g/kg) (μm/s)5min10min20min 30min空白對照組- 9.2±1 -21.4±7.6 -24.8±8.6 -18.3±12.1 -5.3±7.8清開靈組 7ml/kg9.5±1.1-17.4±10.7 -11.2±11.9**2.9±13.1**12.6±15.8**本發明I組 3.5 9.7±1.1-19.9±11.3 -15.5±14.4 -3.6±13.4**3.4±11.7*本發明II組7 8.8±1.4-14±14.4 -9.4±14.8**4.5±18.5**18.1±30*本發明III組 149.8±1 -11.5±7.2**-2.4±18.9**16.2±15.3**22.7±17.6**注與空白對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01。
結論1.採用向大鼠腦內尾殼核區注入自體抗凝血的方法製造大鼠腦出血模型，實驗結果表明此方法能造成動物明顯的行為體徵異常和腦水腫。本發明注射液能改善實驗性腦出血動物的行為體徵異常，降低造模側半腦的含水率和全腦指數，降低造模後動物的死亡率。病理組織學檢查結果表明大鼠腦出血動物模型腦部病變表現為腦白質部分區域疏鬆淡染，其間可見大小不等的空網狀結構，部分區域膠質細胞增生，胞漿噬有脂體、呈空泡狀，個別動物腦組織內出現小膿腫。灰質部神經細胞基本未見胞體腫脹、胞核固縮、壞死等病理改變。經藥物治療後，各組病變程度如下模型組病變較重，中劑量組、陽性組病變較輕，假手術組未見明顯的組織病理學改變。提示本發明注射液對實驗性腦出血大鼠有一定的治療作用。
2.採用向大鼠腦內尾殼核區注入凝血酶的方法製造大鼠腦水腫模型，實驗結果顯示大鼠經腦內注射凝血酶後，行為體徵出現明顯地異常，動物左右半腦重量差、全腦指數和造模側半腦組織含水率明顯增高，表明向腦內注射凝血酶可成功造成動物腦水腫模型。本發明注射液能改善造模後大鼠行為體徵的異常，降低左半腦重量差、全腦指數和造模側半腦組織含水率，表明本發明注射液對凝血酶所致大鼠腦水腫有一定的治療作用。
3.採用向大鼠腦內尾殼核區注入自體抗凝血的方法製造大鼠腦出血模型，舌下靜脈注射伊文斯蘭，再通過比色測定造模大鼠腦組織浸出液中伊文斯蘭的含量，觀察本發明注射液對造模動物腦血管通透性的影響。實驗結果顯示，模型組腦組織浸出液OD值與假手術組無顯著性差異，表明大鼠經腦內注射自身抗凝血造成實驗性腦出血後，動物腦血管通性無明顯改變。本發明注射液高、中劑量腦組織浸出液OD值小於模型組，提示本發明注射液能減少腦血管的通透性。
4.通過向家兔腦內植入自身血凝塊方法造成家兔腦出血模型。實驗結果顯示此方法可造成家免較為明顯的行為體徵異常，腦指數和造模側腦組織含水量顯著性增高，表明動物腦內植入自身血凝塊可成功複製動物腦水腫模型。本發明注射液可改善造模家兔行為體徵異常，降低腦指數和造模側腦組織含水量，表明本發明注射液對自身血凝塊所致家兔腦水腫有一定的治療作用。
5.對小鼠耳廓微循環的影響試驗結果表明，本發明注射液低、中、高三個劑量組對血流速度無明顯影響，但均能對抗腎上腺素引起的微血管收縮，擴張小鼠微血管細靜脈和細動脈，與空白對照組比較差異顯著(p＜0.05或p＜0.01)，且呈劑量依賴性。表明本發明具有改善微循環的作用。
綜上所述，本發明注射液能降低急性出血性中風動物死亡率，改善行為體徵，減輕腦水腫，降低腦組織含水率，改善微循環，提示本發明注射液對出血性中風有一定的治療作用。根據中醫理論研製的本發明注射液具有高效、速效的特點，能滿足搶救病人的需要，對提高中醫藥救治急難重症的能力、降低病死率和致殘率有重要的應用價值。
具體實施例方式
下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
實施例1，一種治療出血性腦中風的藥物，它是由以下重量配比的原料製成的大黃160梔子200牡丹皮100其生產方法是取牡丹皮，通5％氯化鈉溶液水蒸氣蒸餾，重蒸餾，初蒸餾液與重蒸餾液合併，放置析出結晶，重結晶得到丹皮酚針晶，加濃硫酸和發煙硫酸(5∶4)至磺化完全，製成丹皮酚磺酸鈉。剩餘的牡丹皮藥渣及殘留液，與大黃、梔子一起，加水煎煮3次，濾過，水煎液濃縮，加乙醇使沉澱，濾取上清液，回收溶媒至無醇味，加1～5倍水稀釋，調pH值為7.5～8，濾過，濾液調pH值為3，用水飽和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至無醇味，乾燥得到幹浸膏，取丹皮酚磺酸鈉和幹浸膏，加入藥用輔料，製成顆粒劑。
實施例2，上述的實施例中，其原料重量配比也可為大黃200梔子160牡丹皮150其生產方法是取牡丹皮，通5％氯化鈉溶液水蒸氣蒸餾，重蒸餾，初蒸餾液與重蒸餾液合併，放置析出結晶，重結晶得到丹皮酚針晶，加濃硫酸和發煙硫酸(5∶4)至磺化完全，製成丹皮酚磺酸鈉。剩餘的牡丹皮藥渣及殘留液，與大黃、梔子一起，加水煎煮3次，濾過，水煎液濃縮，加乙醇使沉澱，濾取上清液，回收溶媒至無醇味，加1～5倍水稀釋，調pH值為7.5～8，濾過，濾液調pH值為3，用水飽和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至無醇味，乾燥得到幹浸膏，取丹皮酚磺酸鈉和幹浸膏，用100～200ml丙二醇溶解後，緩緩加入400～700ml水中，攪拌、加熱溶解，加0.8～1.2g亞硫酸鈉、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二鈉，調節pH 7.5～8，濾過，濾液通過活性炭脫色，再加水稀釋至1000ml，使每ml含生藥量0.5g，濾過，灌封，滅菌，檢查，包裝，即得注射液；實施例3，本發明藥物的最佳重量(份)配比是大黃187.5梔子187.5牡丹皮125其生產方法是取牡丹皮，通5％氯化鈉溶液水蒸氣蒸餾，重蒸餾，初蒸餾液與重蒸餾液合併，放置析出結晶，重結晶得到丹皮酚針晶，加濃硫酸和發煙硫酸(5∶4)至磺化完全，製成丹皮酚磺酸鈉。剩餘的牡丹皮藥渣及殘留液，與大黃、梔子一起，加水煎煮3次，濾過，水煎液濃縮，加乙醇使沉澱，濾取上清液，回收溶媒至無醇味，加1～5倍水稀釋，調pH值為7.5～8，濾過，濾液調pH值為3，用水飽和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至無醇味，乾燥得到幹浸膏，取丹皮酚磺酸鈉和幹浸膏，用100～200ml丙二醇溶解後，緩緩加入400～700ml水中，攪拌、加熱溶解，加100～500g甘露醇，0.8～1.2g亞硫酸鈉、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二鈉，調節pH 7.5～8，濾過，濾液通過活性炭脫色，再加水稀釋至1000ml，使每ml含生藥量0.5g，濾過，灌裝，經凍幹工序製成凍乾粉針劑。
用法與用量靜脈滴注。每日2次，每次4支，臨用前，用10％葡萄糖注射液(糖尿病患者改用生理鹽水)500ml稀釋。用法與用量靜脈滴注。每日2次，每次4支，臨用前，用10％葡萄糖注射液(糖尿病患者改用生理鹽水)500ml稀釋。
規格10ml/支，每支含生藥5g。
權利要求
1.一種治療出血性腦中風的藥物，其特徵在於它是由以下重量配比的原料製成的大黃 160～200梔子 160～200牡丹皮 100～150
2.根據權利要求1所述的治療出血性腦中風的藥物，其特徵在於它是由以下重量配比的原料製成的大黃 187.5梔子 187.5牡丹皮 125
3.根據權利要求1或2所述的治療出血性腦中風的藥物，其特徵在於所述的藥物劑型為藥劑學所述的任何劑型。
4.根據權利要求3所述的治療出血性腦中風的藥物，其特徵在於所述的藥物劑型的製備方法為取牡丹皮，通5％氯化鈉溶液水蒸氣蒸餾，重蒸餾，初蒸餾液與重蒸餾液合併，放置析出結晶，重結晶得到丹皮酚針晶，加濃硫酸和發煙硫酸(5∶4)至磺化完全，製成丹皮酚磺酸鈉。剩餘的牡丹皮藥渣及殘留液，與大黃、梔子一起，加水煎煮3次，濾過，水煎液濃縮，加乙醇使沉澱，濾取上清液，回收溶媒至無醇味，加1～5倍水稀釋，調pH值為7.5～8，濾過，濾液調pH值為3，用水飽和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至無醇味，乾燥得到幹浸膏，取丹皮酚磺酸鈉和幹浸膏，加入藥用輔料，製成臨床可接受的劑型。
5.根據權利要求3所述的治療出血性腦中風的藥物，其特徵在於所述的藥物劑型為注射劑。
6.權利要求5所述的治療出血性腦中風的藥物的製備方法為取牡丹皮，通5％氯化鈉溶液水蒸氣蒸餾，重蒸餾，初蒸餾液與重蒸餾液合併，放置析出結晶，重結晶得到丹皮酚針晶，加濃硫酸和發煙硫酸(5∶4)至磺化完全，製成丹皮酚磺酸鈉。剩餘的牡丹皮藥渣及殘留液，與大黃、梔子一起，加水煎煮3次，濾過，水煎液濃縮，加乙醇使沉澱，濾取上清液，回收溶媒至無醇味，加1～5倍水稀釋，調pH值為7.5～8，濾過，濾液調pH值為3，用水飽和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至無醇味，乾燥得到幹浸膏，取丹皮酚磺酸鈉和幹浸膏，用100～200ml丙二醇溶解後，緩緩加入400～700ml水中，攪拌、加熱溶解，加0.8～1.2g亞硫酸鈉、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二鈉，調節pH 7.5～8，濾過，濾液通過活性炭脫色，再加水稀釋至1000ml，使每ml含生藥量0.5g，濾過，灌封，滅菌，檢查，包裝，即得注射液；或取丹皮酚磺酸鈉和幹浸膏，用100～200ml丙二醇溶解後，緩緩加入400～700ml水中，攪拌、加熱溶解，加100～500g甘露醇，0.8～1.2g亞硫酸鈉、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二鈉，調節pH 7.5～8，濾過，濾液通過活性炭脫色，再加水稀釋至1000ml，使每ml含生藥量0.5g，濾過，灌裝，經凍幹工序製成凍乾粉針劑。
全文摘要
一種治療出血性腦中風的藥物，它是由大黃、梔子、牡丹皮等原料製成的。本發明從中西醫理論或臨床研究均角度證實，出血性中風應從血論治，此外，出血性中風急性期常出現發熱，部分患者雖無體溫增高，但有明顯的熱證表現，如口苦、咽幹、煩躁，甚至譫妄、夜不安、大便秘結等而呈陽明腑實之證象。本發明之處方依據上述理論而立法，採用涼血止血、活血化淤、瀉下通腑之藥為主，輔以清熱瀉火、行血破瘀之品，用於治療出血性中風急性期的瘀熱阻竅證。
文檔編號A61P9/10GK1565531SQ03132119
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月25日 優先權日2003年6月25日
發明者蔡寶昌, 肖偉, 戴翔翎, 金妙文, 凌婭, 潘揚, 王天山, 楊光明, 燕珂 申請人:江蘇康緣藥業股份有限公司