通過在早期胚胎發育期間生長和/或發育相關基因的轉基因過量表達來增加種子大小和...的製作方法
2023-10-17 09:31:24 4
專利名稱：：通過在早期胚胎發育期間生長和/或發育相關基因的轉基因過量表達來增加種子大小和...的製作方法通過在早期胚胎發育期間生長和/或發育相關基因的轉基因過量表達來增加種子大小和種子數目與相關申請的交叉引用本申請要求於2005年12月15日提交的美國專利申請號60/750，991的優先權，所述專利對於所有目的通過提及而整體合併入本文。
背景技術：
：作為農作物改良的目標的最重要性狀是產量。通過開發新的植物品種來改善農作物產量的努力可以分成2種方法。一種是通過培育或改造具有增加的對於非生物應激條件例如乾旱、寒冷或鹽或者由害蟲或致病病原體引起的生物應激條件的抗性的農作物品種來減少農作物產量損失。雖然這種方法有價值，但它在不存在應激條件的情況下不提供根本改善的農作物產量。第二種方法是培育或改造新的農作物品種，其中基本生產能力得到增加。傳統育種程序最初在改善各種農作物的產量方面產生了實質的進步。通常經歷的模式雖然最初在產量方面具有實質進步，但隨後為變得更小且更難以獲得的增加的進一步改善。最近開發的基於分子生物學技術的方法原則上已提供了這樣的潛力，即通過改變在植物生長和/或發育中起作用的植物基因表達的時機、位置或水平來達到農作物產量方面的實質改善。在過去的20年中，在鑑定在植物生長和/或發育中起作用的植物基因方面已取得重大進展。由於植物生長調節和它最終如何涉及產量性狀的複雜性，這些基因中的哪一些(如果有的話)將是改善農作物產量的明確候選物仍不明了。為了鑑定具有生長和/或發育功能的植物基因而進行的許多工作已在模型植物系統擬南芥(^ra6/i/o;^/sWs/2's/s)中完成。稱為i^WZra(REV)的一種此類基因最初被鑑定為擬南芥屬物種(^"a6/cTo;^")中的功能喪失突變，稱為reW(Talbert等人，"eFe/o/7/ze/^121:2723-2735，1995)。這種突變對植物生長和形態具有多效效應。感興趣的reW突變的一種表型是明顯更大的種子。這種表型是農業上可能需要的，但不幸的是，它伴隨著不希望的性狀例如減少的花和種子數目、不育和改變的葉形態。除了更大的種子外，reW突變體還顯示出更大的葉、莖和花。通過作圖克隆方法(在W001/33944中描述，該文獻通過提及而整體合併入本文)而鑑定出REV基因，並且它被證明是屬於轉錄因子的同源域-亮氨酸拉鏈(homedomain-leucinezipper,HD-ZIP)家族的轉錄因子。在植物中，HD-Zip基因參與許多發育途徑，包括維管組織發育、毛狀體(trichome)和根毛髮育、以及光調節應答。因為reW可能是功能喪失突變，所以試圖通過表達反向重複REV(REV-IR)構建體或者通過由REV基因的強過量表達所觸發的共抑制來敲除轉基因擬南芥屬物種中的REV功能(W001/33944)。REV-IR構建體產生弱的reW表型。reW表型包括更大、更重的種子，這也在REV過量表達品系中觀察到，其中REV轉基因遍及植物的強組成型表達由組成型35S啟動子驅動。有趣的是，這種效應與增加的REVmRNA水平相關，這表明這不是由於內源性REV基因的共抑制。REV過量表達而非抑制導致了增加的種子大小這一事實是重要的發現，因為使用reW突變體的先前工作這是未曾預料到的。REV轉基因遍及植物的強組成型表達模擬了reW突變體的大種子表型，但它還複製了使用reW突變體時可見的不希望的表型。儘管通過REV轉基因的組成型過量表達的技術上直捷的方法來獲得更大的種子大小表型的能力顯示出具有前景，但不希望的表型意味著這種方法對於商業化農業應用將是不可行的。對於許多農作物種類，農業上相關的植物部分是種子。如果可以獲得大種子性狀而沒有普遍組成型REV過量表達的有害副作用，那麼它將具有潛在極大的農業價值。克服這個問題的一種可能途徑是將過量表達特異地局限於種子。儘管許多種子特異性啟動子是已知的並且具有可以潛在地用於驅動^T轉基因表達的特徵，但沒有證據暗示，原則上，局限於種子的REV過量表達將實際導致增加的種子大小。種子中植物的內源性A57基因的天然功能已知是在分生組織起始和近軸細胞命運決定方面(0tsuga等人，屍/a/,/.25:223-236,2001;McConnell和Barton,齡e/o/邁加"25:2935-2942(1998);McConnel1等人，^""re411:709-713，2001;E邁ery等人，&〃.A/o人13:1768-1774，2003)而不是在細胞生長或分裂方面。此外，還不知道，在35S/REV過量表達的植物中的大種子大小表型是由於種子中或正在發育的胚胎中REV的過量表達，還是由於由遍及植物組織的REV過量表達所引起的對植物的總體生長和發育的影響。除了缺乏REV在種子中對種子大小決定具有影響的任何已知生物功能外，也沒有信息表明，在種子的哪個部分中或在種子發育期間的哪個階段時嘗試過量表達REV轉基因以達到種子大小的增加可能是最佳的。本發明提供了在胚胎發育的早期階段期間生長和/或發育相關基因的胚胎特異性過量表達，當與不過量表達該基因的野生型植物相比較時，這導致種子大小的增加。在一個具體實施方案中，使用早期胚胎特異性啟動子來過量表達y^「基因。達到了增加的種子大小性狀而沒有釆用遍及植物的REV組成型過量表達時可見的有害副作用。此外，當與野生型植物相比較時，REV的胚胎特異性過量表達產生了關於"種子總數目/植物"的增加方面的未預測到的結果。種子總數目的增加起因於種子數目/莢的增加、總狀花序數目/植物的增加、莢數目/總狀花序的增加、種子敗育率的減少，或者這些效應的組合。總之，由於REV在正在發育的胚胎中的過量表達而引起的增加的種子大小和增加的種子數目導致與野生型植物相比較而言總產量的大量增加，並且證實與植物生長和/或發育相關的基因可以與早期胚胎特異性啟動子相結合地過量表達，以增加植物產量。發明概述本發明提供了用於增加轉基因植物中的種子大小和/或種子數目的方法和組合物。特別地，本發明涉及與基因有效地結合的早期特異性胚胎啟動子用於在轉基因植物的正在發育的種子中過量表達該基因和/或由該基因編碼的蛋白質的用途，所述基因與植物生長和/或發育相關。當與野生型植物相比較時，在轉基因植物中在種子發育的這個早期階段期間所述基因的過量表達在轉基因植物中提供了增加的種子產生和/或增加的種子大小。在本發明的一個具體實施方案中，將^T基因與早期特異性胚胎啟動子有效地結合，以提供REV蛋白在轉基因植物的正在發育的種子中的過量表達。REV在種子發育的這個早期階段期間的過量表達令人驚訝地導致在轉基因植物中增加的種子大小和增加的種子產生，而沒有當遍及植物地過量表達REV時可見的有害副作用。還提供了用於增加植物中的種子大小的方法，其包括在早期胚胎發育期間在種子中過量表達與植物生長和/或發育相關的基因。特別地，該方法包括在早期特異性胚胎啟動子的控制下在種子中表達所述生長和/或發育相關基因。所述早期特異性胚胎啟動子對於所述植物來說可以是異源的或同源的。在本發明的某些實施方案中，所述啟動子是與胺基酸通透酶基因例如AAP1、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因、脂肪酸延長酶(fattyacidelongase)基因例如FAE1或葉狀子葉基因(leafycotyledongene)相關的早期特異性啟動子。在本發明中有用的具體啟動子包括來自擬南芥的AAP1啟動子、來自Zes。were//a屍eicT/er/的油酸12-幾化酶去飽和酶基因啟動子(LFAH12)、來自擬南芥的2S2基因啟動子或葉狀子葉基因LEC2啟動子。在本發明的一個具體實施方案中，AiT基因與早期特異性胚胎啟動子有效地結合。在這種方法中，i^r基因在種子的早期發育中過量表達，並導致與野生型植物相比較而言種子大小和種子數目的增加。本發明的方法可以用於增加被表徵為單子葉植物或雙子葉植物的植物中的種子大小和/或種子數目。特別地，該方法可以用於增加植物中的種子大小和/或種子數目，所述植物是十字花科(Sra"/cacea(Cri/c/ferae))、禾本科(Cr緒/z2eae)、錦葵科(他/raceae)或豆科-蝶形花亞科(Ze^//ff//701sae-P<3////o/o/tfe(3e)的成員。對於本發明方法的使用來說感興趣的具體植物包括卡諾拉油菜(canola)、玉米、亞麻薺、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。本發明還提供了遺傳構建體，其包含關於與一種或多種控制序列有效地連接的與植物生長和/或發育相關的基因的核酸序列，其中所述一種或多種控制序列能夠促進所述基因在胚胎發育期間的表達。特別地，本發明的遺傳構建體包含控制序列，所述控制序列包括早期特異性胚胎啟動子。早期特異性胚胎啟動子可以包括與胺基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長酶基因(FAE1)或葉狀子葉基因(LEC2)相關的啟動子。本發明的典型遺傳構建體包含來自擬南芥的AAP1啟動子、來自力es^/ere/"/e/7cr/er/'的油酸12-羥化酶去飽和酶基因啟動子(LFAH12)、來自擬南芥的2S2基因啟動子、來自擬南芥的脂肪酸延長酶基因啟動子、或來自擬南芥的葉狀子葉基因2啟動子。具體的本發明的遺傳構建體包含與來自擬南芥屬物種的iiT基因有效地結合的早期特異性胚胎啟動子。所述遺傳構建體還可以包括有效地結合的polyA序列。本發明還提供了用於產生具有增加的種子大小和/或種子數目的轉基因植物的方法，所述方法包括(a)將如上所述的遺傳構建體引入植物或植物細胞內，和(b)在促進再生和成熟植物生長的條件下培養包含所述遺傳構建體的所述植物或植物細胞。通常，該方法產生當與相應的野生型植物相比較時具有增加的種子大小和/或種子數目的轉基因植物。包含所述遺傳構建體的轉基因植物可以是單子葉或雙子葉植物，特別地其中所述單子葉植物是禾本科的成員。特別感興趣的來自禾本科的植物包括稻、燕麥、玉米或小麥。此外，本發明的轉基因植物是十字花科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的植物。特別地，其中轉基因植物是大豆、棉花、亞麻薺、苜蓿或卡諾拉油菜。本發明還提供了用於選擇當與早期特異性胚胎啟動子功能性地相結合時增加植物產量的基因的方法，其包括構建表達載體，所述表達栽體包含與早期特異性胚胎啟動子功能性地相結合的與植物生長和/或發育相關的基因；用所述表達載體轉染植物細胞以形成轉基因植物；培養所述轉基因植物；和選擇具有增加的產量的那些轉基因植物。選擇出產生具有增加的產量的轉基因植物的基因以用於轉基因植物的進一步開發。可以在本方法中使用的基因包括，例如但不限於，W(環化酶相關蛋白)基因、稻組蛋白脫乙醯酶l基因、f2屍c基因、AAT基因、Sii7基因、^Z(Argos-Like)基因、6/7/(油菜素類固醇激素感受(brassinosteroidhormoneperception))基因、/^7!5基因、Pepino基因、A6^(G蛋白信號傳導調節齊寸(regulatorofGproteinsignaling))基因、77/7基因、A"(BigBrother)基因、RHD2基因、/y^M基因、VA7基因、WA^基因、W^/基因、J/^基因等。附圖簡述圖1描述了胚胎特異性啟動子在早期胚胎發育期間的表達鐠。擬南芥屬物種胚胎發育中的近似階段早期球狀=2天的授粉後天數(daysafterpollination,DAP)、心形=4DAP、魚雷形=6DAP、手杖形=7DAP、早期成熟胚胎-8DAP。圖2描述了REVOLUTA和非REV0LUTAHD-ZIPIII類轉錄因子的區域的胺基酸序列的比對。胺基酸序列的這個區域包含有在胺基酸序列中的特徵性差異，所述特徵性差異將HD-ZIPIII蛋白質定義為屬於REV0LUTA或非REV0LUTA類蛋白質。所述序列的加框部分標明了定義非REVOLUTAHD-ZIPIII蛋白質的胺基酸序列插入的位點。通過缺乏胺基酸序列插入來定義REVOLUTA蛋白質。Athb-9(擬南芥屬物種；SEQIDNO:2);Athb-14(擬南芥屬物種；SEQIDNO:3);REV(擬南芥屬物種；SEQIDNO:4);BnLfREV(歐洲油菜(Aw/ca加p/";SEQIDNO:5);OsREVl(水稻(&，sa〃ra);SEQIDNO:6);ZmRLDl(玉蜀黍(Zea邁a/es);SEQIDNO:7);OsREV2(水稻；SEQIDNO:8);Athb-15(擬南芥屬物種；SEQIDNO:9);和Athb-8(擬南芥屬物種；SEQIDNO:10)。發明詳述本發明提供了用於產生當與野生型植物相比較時具有增加的種子大小和/或增加的種子數目的植物的方法和組合物。特別地，所述方法包括在植物的胚胎中過量表達參與植物生長和/或發育的基因，其中轉基因的過量表達導致植物中的種子大小的增加和/或增加的種子數目。在一個具體實施方案中，過量表達^T。Zra基因。在本發明的方法中的iiT轉基因處於啟動子的調節下，所述啟動子在胚胎發育期間起始表達，並且特別地在早期特異性胚胎發育期間起始表達。出乎意料地，在早期階段胚胎發育中^^K轉基因的過量表達導致更大的和/或更多的種子。作為確定是否能夠通過參與植物生長和/或發育的基因的過量表達來增加種子大小的第一種嘗試，將Afr基因耙向種子，測試包含驅動REV表達的胚胎特異性啟動子的iiT轉基因構建體。在擬南芥屬物種胚胎發育期間具有經良好表徵的表達i瞽的許多胚胎特異性啟動子的可用性使得能夠製備轉基因植物，其中REV過量表達被耙向幾個不同但重疊的胚胎發育階段。將擬南芥屬物種WiT轉基因構建體引入卡諾拉油菜中以用於測試。關於直接轉到卡諾拉油茱的根本原因是擬南芥屬物種基因組與卡諾拉油菜非常緊密相關，因此在擬南芥屬物種中測定的啟動子的已知表達特徵將可能延續至卡諾拉油菜，並且卡諾拉油菜是農作物種類。卡諾拉油菜中對種子大小的影響的證實將具有直接的農業關聯性。在第二個例子中，擬南芥屬物種REV如本文所使用的，植物生長和/或發育相關基因是這樣的基因，其在決定植物的生長率、總體大小、組織大小或組織數目中起作用，或者在植物發育程序中起作用，導致組織身份和形態的決定。當通過突變、過量表達、或表達的抑制來修飾其功能而導致改變的植物生長率、總體植物大小、組織大小或數目、或改變的發育時，這樣的生長和發育相關基因得到鑑定。植物和生長相關基因可以通過許多機制發揮其效應，其中一些包括細胞周期的調節、植物激素合成/分解途徑、對植物激素的敏感性、細胞壁生物合成、細胞身份決定等。通過過量表達或抑制分析，許多植物基因已顯示在生長和/或發育中起作用。已知參與生長和/或發育並且可以在本發明的方法中使用或測試的基因的一些但並非所有例子在下文中討論。擬南芥屬物種"戶基因編碼參與Ras-cAMP信號傳導和肌動蛋白細胞骨架的調節的環化酶相關蛋白。由於表皮和葉肉細胞的延伸減少，"戶在糖皮質激素誘導型啟動子下的過量表達引起肌動蛋白絲的喪失和葉大小的減少(Barrero等人，J/7/zah"o"/2y91:599—603,2003)。棉花中的蔗糖合酶基因表達的抑制導致減少的細胞纖維長度以及更小和更少的纖維細胞(Yong-LingRuan等人，戶/a/2"e/715:952-964，2003)。使用ABA誘導型啟動子的稻組蛋白脫乙醯酶1基因在轉基因稻中的過量表達導致獲得與野生型相比較而言具有生長率的增加以及異常的枝條和根組織發育的植物(In-CheolJang等人，戶7a/^/.33:531-541，2003)。在擬南芥屬物種中經由RNAi對於E2Fc的抑制增加了葉、分生組織和中柱鞘細胞中的增殖活性。器官中的細胞比野生型更小但更眾多，並且在葉中存在減少的倍性水平(delPozo等人，戶/az^CW/I8:2224-2235，2006)。經由RNAi對於AT/基因的抑制導致具有增加的下胚軸長度的幼苗，並且說7的過量表達產生矮化植物(Xuelu和Chory，5We/ce313:1118-1122，2006)。表達部分地組成性的類固醇受體BRI1的轉基因植物具有更長的下胚軸(Wang等人，"er.CW/8:855-865，2005)。擬南芥屬物種中Argos-Like(ARL)的抑制產生更小的子葉、葉和其他側生器官，而過量表達產生相反的效應。器官大小的變化可以歸因於細胞大小而不是細胞數目(Hu等人，屍/a/^/.47:1-9，2006)。對於具有導致改變的生長和/或發育表型的突變的植物所進行的分析已鑑定出了許多在植物生長和發育中起作用的基因。影響油菜素類固醇激素感受bril-5的突變導致矮化植物(Wang等人，"er.CW/8:855-865，2005)。在編碼醯基-醯基栽體蛋白硫酯酶的擬南芥屬物種"7^基因中的T-DNA插入(敲除)導致減少的生長率、減少的鮮重和低種子活力(Bonaventure等人，戶/a/^6W/15:1020-1033，2003)。Pepino(推定的抗-磷酸酶)中的功能喪失突變在枝條頂端分生組織處顯示出腫瘤樣細胞增殖並且產生多餘的異常葉(Haberer等人，Zer.Ce"e51212:542-550,2002)。擬南芥屬物種W6^基因(G蛋白信號傳導調節劑)具有G蛋白偶聯受體(GPCR)的結構並且包含RGS盒。RGS蛋白質加速Gct亞基的失活並因此降低GPCR信號傳導。無效WS突變體在黑暗中生長時在下胚軸中具有增加的細胞延長，和在光中生長時在根中具有增加的細胞產生(Chen等人，5^/e/3ce301:1728-1731，2003)。擬南芥屬物種77屍7基因在根毛髮育中以及還在細胞生長中起作用。"W-2突變體具有更小的蓮座型葉叢、減少的高度和更短的節間(Ryan等人，^e『Z^^oA138:49-58，1998;和Hemsley等人，戶/aWCe〃17:2554-2563，2005)。產生極少或不產生BigBrothermRNA的"ro^er(基周的突變體(染色體重排或T-DNA插入)發育出更大的花器官、更多的花生物量和更粗的莖。相反地，BigBrother的過量表達導致更小的花器官、更少的花生物量、更細的莖和減少的葉大小。BB可以改變細胞數目(Disch等人，Ci/rr.16:272-279，2006)。iiW^基因編碼對於活性氧種類在根毛中的積聚和鉀通道的隨後活化而言重要的NADPH氧化酶。r力W突變體在根的尖端生長細胞的細胞擴展方面具有缺陷(Foreman等人，iV""re422:442-446,2003)。玉米中的孩t小突變引起由JiVCM基因表達的細胞壁轉化酶的喪失。/ZW7突變體的細胞比野生型更小，和咖J種子突變體僅具有野生型種子的胚乳重量的20%。擴展可以在咖J胚乳的周圍層的細胞中受到損害，並且可以導致這些細胞的減少的有絲分裂活性(Vilhar等人，戶7a/^戶力"/o人129:23-30，2002)。WAK2的T-DNA插入突變體，附U-7，在根中具有減少的細胞延長。WAK2可以通過調節液泡的轉化酶活性來控制細胞擴展。在植物中WAK2或WAK4的可誘導反義的表達阻止了細胞延長並產生矮化植物(Wagner和Kohorn，戶/a/^Ce/Z13:303—318，2001;Lally等人，戶/a/^Ce//13:1317-1331，2001;和Kohorn等人，戶/a/7"46:307-316,2006)。擬南芥屬物種基因J/^在花器官身份中和在花分生組織身份的建立中起作用。與野生型相比較，J戶2中的功能喪失突變產生增加的種子質量(Masa-0hto等人，屍roc.y"〃.^ca^/.Sc/.〃W102:3123-3128，2005)。"6突變體具有短小的根、鋸齒狀的葉和扁化。它們顯示出在細胞分裂方面的缺陷，這可能是由於在G2/M細胞周期進展方面的缺陷而引起的(Inagaki等人，戶/aWCe//18:879-892，2006)。術語"生長和/或發育基因"或"生長和/或發育轉基因"在本文中用於指任何這樣的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼或促進由該基因編碼的核苷酸或蛋白質的表達和/或產生。因此，術語"生長和/或發育基因"或"生長和/或發育轉基因"可以包括位於核苷酸和/或蛋白質編碼序列側翼的序列。例如，所述序列可以包括那些核苷酸序列，所述核苷酸序列為蛋白質編碼序列(外顯子)、間插序列(內含子)、包含對於該基因正常表達而言所需的序列的側翼5'和3'DNA區域(即，務別為啟動子和polyA添加區，以及任何增強子序列)。術語"生長和/或發育蛋白質"、"生長和/或發育同系物"或"生長和/或發育相關直向同源物"在本文中用於指這樣的蛋白質，所述蛋白質具有調節植物的生長率、總體大小、組織大小或組織數目或者調節植物發育程序(其導致組織身份和形態的決定)的能力(當在本發明方法的實踐中使用時)，並且具有與對於該基因而言的胺基酸序列有著至少約70%同一性、更通常地至少約75%同一性、和更通常地至少約80%同一性的胺基酸序列。如本文所使用的，"胚胎特異性基因"是在植物中的胚胎發育期間優先表達的基因。對本公開內容而言，胚胎發育從合子中的第一次細胞分裂開始，並繼續至胚胎發育的晚期(特徵在於成熟、乾燥、休眠)，並且以產生成熟且乾燥的種子作為結束。胚胎特異性基因可以進一步分類為"早期特異性的"和"晚期特異性的"。早期特異性基因是直至胚胎形態發生結束時在胚胎中表達的那些基因。晚期特異性基因是在從成熟直到產生成熟且乾燥的種子這一過程中表達的那些基因。在早期胚胎發育期間起始表達並且為早期特異性的胚胎特異性基因的例子呈現於圖1中。"異源序列"是來源於不同物種的寡核苷酸序列，或者如果來自相同物種，則由其最初形式在實質上進行了修飾。例如，與結構基因有效地連接的異源啟動子來自與該結構基因所源自的物種不同的物種，或者如果來自相同物種，則由其最初形式在實質上進行了修飾。術語"載體"指通常為雙鏈的DNA片段，其可以在其內插入外源DNA片段。載體或複製子可以例如具有質粒或病毒來源。載體包含有助於載體在宿主細胞中自主複製的"複製子"多核苷酸序列。在本公開內容的情況下，術語"複製子"還包括靶向或者以其他方式促進載體序列重組入宿主染色體中的多核苷酸序列區域。此外，雖然可以在最初時將外源DNA插入到例如DNA病毒載體中時，但是將病毒載體DM轉化到宿主細胞中可以導致病毒DNA轉化成病毒RM載體分子。外源DNA^f皮定義為異源DNA,其是在宿主細胞中未天然發現的DM,其例如複製載體分子、編碼可選擇或可篩選標記或者轉基罔。載體用於將外源或異源DNA運輸到合適的宿主細胞內。一旦在宿主細胞中，載體就可以獨立於宿主染色體DNA或與宿主染色體DNA同時進行複製，並且可以產生載體及其插入的DNA的幾個拷貝。備選地，栽體可以將外源或異源DM耙向插入至宿主染色體中。此外，載體還可以包含必需元件，所述元件允許所插入的DM轉錄成mRNA分子，或者以其他方式引起所插入的DNA複製成多個拷貝的RNA。某些表達載體另外還包含與所插入的DNA鄰近的序列元件，其允許mRNA翻譯成蛋白質分子。因此，可以快速合成許多由所插入的DNA編碼的mRNA和多肽分子。術語"轉基因載體"指包含所插入的DNA區段(即"轉基因")的載體，所述DNA區段在宿主細胞內轉錄成mRNA或複製為RNA。術語"轉基因"不僅指所插入的DNA的被轉化成RNA的那個部分，還指載體的對於RNA的轉錄或複製而言所必需的那些部分。此外，轉基因不一定包含這樣的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含能夠產生蛋白質的開放讀碼框。術語"轉化的宿主細胞"、"轉化的"和"轉化"指將DNA引入細胞中。該細胞稱為"宿主細胞"，並且它可以是原核或真核細胞。典型的原核宿主細胞包括大腸桿菌(Aco//)的各種菌林。典型的真核宿主細胞是植物細胞(例如，卡諾拉油菜、棉花、亞麻齊、苜蓿、大豆、稻、燕麥、小麥、大麥或玉米細胞等)、酵母細胞、昆蟲細胞或動物細胞。引入的DM通常為包含插入的DNA片段的載體形式。引入的DNA序列可以來自與宿主細胞相同的物種或者來自與宿主細胞不同的物種，或者它可以是包含一些外源DNA和一些源自宿主物種的DNA的雜合DNA序列。術語"植物"包括全植物、植物器官(例如，葉、莖、花、根等)、種子和植物細胞(包括組織培養細胞)及其後代。可以在本發明方法中使用的植物類別一般與順應於轉化技術的高等植物類別一樣廣泛，包括單子葉和雙子葉植物，以及某些低等植物如藻類。它包括各種倍性水平的植物，包括多倍體、二倍體和單倍體。"異源序列"是來源於外來物種的序列，或者如果來自相同物種，則由其最初形式在實質上進行了修飾。例如，與結構基因有效地連接的異源啟動子來自與該結構基因所源自的物種不同的物種，或者如果來自相同物種，則由其最初形式在實質上進行了修飾。術語"Wfrai^7^基因"或"W^raZ^^轉基因"在本文中用於指編碼或促進REVOLUTA蛋白質的表達和/或產生的任何多核苷酸序列。因此，術語"A5T^^7^基因"或"^TWy7^轉基因"可以包括位於REVOLUTA蛋白質編碼序列側翼的序列。例如，所述序列可以包括那些核苷酸序列，所述核苷酸序列為蛋白質編碼序列(外顯子)、間插序列(內含子)、包含對於REV0LUTA基因正常表達而言所需的序列的側翼5'和3'DM區域(即，分別為啟動子和polyA添加區，和任何增強子序列)。術語"REV0LUTA蛋白質"、"REV0LUTA同系物"或"REV0LUTA直向同源物"在本文中用於指這樣的蛋白質，所述蛋白質具有調節植物細胞分裂的能力(當在本發明方法的實踐中使用時)，並且具有與在W001/33944(通過提及而整體合併入本文)中所描述的REV0LUTA的胺基酸序列有著至少約70%同一性、更通常地至少約75%同一性、和更通常地至少約80%同一性的胺基酸序列。備選地，術語"REVOLUTA蛋白質，，、"REVOLUTA同系物"或"REVOLUTA直向同源物"在本文中用於指被鑑定為與HD-ZIPIII類別的植物轉錄因子的非REVOLUTA成員不同的REVOLUTA蛋白質。HD-ZIPIII類別的蛋白質的REVOLUTA成員的特徵在於，在W001/33944中描述且如圖2存在特徵性的胺基酸序列插入，其存在於非REVOLUTAHD-ZIPIII蛋白質中。在圖2中，命名為athb-8、athb-9、athb-14和athb-15的來自擬南芥的同源異型框轉錄因子是非REVOLUTAHD-ZIPIII蛋白質，並且全部在REVOLUTA胺基酸序列的胺基酸殘基146和147之間具有特徵性的胺基酸序列插入。圖2中的5個REVOLUTA序列全部在REVOLUTA胺基酸序列中的這個位置處缺乏胺基酸插入。這個胺基酸序列插入的缺乏是REVOLUTA蛋白質的區別性和定義性的特徵。術語"同一性百分比"是指當使用電腦程式例如下文鑑定的程序來並排比對2個胺基酸序列或2個核酸序列時，佔據相同的相對位置的胺基酸或核苷酸的百分比。術語"相似性百分比"是2個所比較的蛋白質序列的親緣關係程度的統計學量度。相似性百分比通過電腦程式來進行計算，所述電腦程式基於化學相似性(例如，所比較的胺基酸是否是酸性的、鹼性的、親水性的、芳香族的等)和/或進化距離(如通過對於使編碼所比較的胺基酸對的一個成員的密碼子轉變成編碼該對的另一個成員的密碼子而言所需的最低數目的鹼基對改變所測量的)對每個所比較的胺基酸對分派一個數值。在已通過迭代比較所有可能的比對而憑經驗進行2個序列的最佳擬合比對後，進行計算(參見例如，Henikoff等人，屍roc.胞〃.JcacT.Sc/.89:10915-10919，1992)。多核苷酸序列的"基本同一性(substantialidentity)"這一術語是指，當使用下文描述的程序並使用標準參數與參考序列相比較時，多核苷酸包含具有至少60%序列同一性、通常地至少70%同一性、更通常地至少80%同一性和最通常地至少90%同一性的序列。技術人員應認識到，這些值可以進行適當調整以確定由2個核苷酸序列編碼的蛋白質的相應同一性，其中考慮了密碼子簡併性、胺基酸相似性、讀碼框定位等。胺基酸序列同一性可以例如以下述方式進行測定。由生長和/或發育相關基因例如REVOLUTA編碼的蛋白質的胺基酸序列的部分，可以用於搜索核酸序列資料庫，例如GenBanl^資料庫，其中使用程序BLASTP版本2.0.9(Atschul等人，細7.25:3389-3402,1997)。2個(或更多)多核苷酸或多肽之間的序列比較通常通過在"比較窗"上比較2個序列的序列來進行，以鑑定並比較序列相似性的局部區域。如本文所使用的，"比較窗"指至少約20個鄰接位置、通常地約50-約200個鄰接位置、更通常地約100-約150個鄰接位置的區段，其中在2個序列進行最佳比對後，可以將序列與具有相同數目的鄰接位置的參考序列相比較。用於比較的序列最佳比對可以通過下述方式來進行局部同一性或相似性算法例如在Smith等人，^/A2:482，1981中描述的那些；Needleman等人，/.MAA/o7.48:443-453，1970的同源性比對算法；Pearson等人，/Voc.Jca^ScA^S^85:2444-2448，1988的相似性搜索法；這些算法的計算機化實現(WisconsinGeneticsSoftwarePackage，GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA);或目視檢查。有用的算法的一個例子是PILEUP。PILEUP使用漸進的成對比對而由一組相關序列產生多重序列比對，以顯示相互關係和序列同一性百分比。它還繪製顯示出用於產生比對的聚類關係的樹或樹狀圖。PILEUP使用簡化的Feng等人，/.iVo人35:351-360，1987的漸進比對方法。所使用的方法類似於由Higgins等人，C^/05:151-153，1989描述的方法。該程序可以比對高達300個序列，每個序列的最大長度為5，00Q個核苷酸或胺基酸。多重比對過程從2個最相關序列的成對比對開始。這個聚簇(cluster)隨後與下一個最相關序列或經比對的序列的聚蔟進^f亍比對。2個序列聚蔟可以通過2個獨個序列的成對比對的簡單延伸來進行比對。最終比對通過一系列漸進的成對比對來完成。該程序通過指定序列比較區域的特定序列及其核苷酸或胺基酸坐標(coordinate)和通過指定程序參數來運行。例如，可以將參考序列與其他測試序列進行比較以測定序列同一性百分比關係，使用下述參數預設缺口權重(3.00)、預設缺口長度權重(0.10)、和加權末端缺口。適合於測定序列同一性和序列相似性百分比的算法的另一個例子是BLAST算法，其在Altschul等人，/.脂.A/oA215:403-410,1990中得到描述。用於進行BLAST分析的軟體可通過國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公開獲得。這種算法包括，首先通過在查詢序列中鑑定長度W的短字(word)來鑑定高得分序列對(HSPs)，當與資料庫序列中相同長度的字進行比對時，所述HSPs匹配或滿足某一正值閾值得分T。T稱為鄰近字得分閾值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschul等人，同上)。這些最初鄰近字的命中用作起始搜索的種子，以找到包含它們的更長HSPs。隨後，字命中(wordhits)沿著每個序列在2個方向上進行延伸，遠至可以增加累積比對得分。在下列情況時，停止字命中在每個方向上的延伸累積比對得分比其達到的最大值減少X量；由於一個或多個負得分殘基比對的積聚，累積得分變成零或零以下；或達到任一序列的末端。BLAST算法參數W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用使用下列作為預設值字長(W)為11、BL0SUM62評分矩陣(參見，Henikoff等人，^"/.5W.〃W89:10915-10919，1992)比對(B)為50、期望值(E)為10、M=5、N=-4以及2條鏈的比較。除了計算序列同一性百分比外，BLAST算法還進行兩個序列之間的相似性的統計分析(參見，例如Karlin等人，/VocJcad.iW.90:5873-5877,1993)。由BLAST算法提供的相似性的一種量度是最小加和概率(P(N))，它提供了對兩個核苷酸或胺基酸序列之間的匹配偶然發生的概率指示。例如，如果比較測試中的最小加和概率小於約0.1、更優選地小於約0.01、和最優選地小於約0.001，那麼核酸被視為與參考序列類似。用於序列比對和序列相似性分析的另外方法和算法是技術人員眾所周知的。在所插入的多核苷酸序列進行轉錄和翻譯以產生功能性多肽的情況下，技術人員會認識到，由於密碼子簡併性，許多多核苷酸序列將編碼相同的多肽。這些變體特別地由術語"生長和/或發育基因"和"生長和/或發育轉基因"，以及具體地由"Afra力^x基因"和轉基因"所包括。此外，這些術語特別地包括那些全長序列，所述序列與基因序列基本上同一併且編碼保留了該基因產物例如的功能的蛋白質。如果如上所述就最大一致進行比對時，兩個序列中的核苷酸或胺基酸殘基的序列分別相同時，那麼這兩個核酸序列或多核苷酸被說成是"同一的"。術語"與……互補"在本文中用於指，互補序列與參考多核苷酸序列的全部或部分是同一的。生長和/或發育相關基因和生長和/或發育相關蛋白質，例如酉raz^4基因和REVOLUTA蛋白質序列的胺基酸序列中的變異和改變在WO01/33944中得到描述，所述專利通過提及而合併入本文。目的基因例如mrazya基因、多核苷酸或多核苷酸序列可以從任何植物物種中進行分離或獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所使用的MWi^W基因序列是來自擬南芥的那種，但也可以使用來自其他感興趣物種的iiT^^7^基因。例如，來自玉米(玉蜀黍(Zea邁a/s))的REV0LUTA的核苷酸序列和胺基酸序列在W02004/063379(通過提及而整體合併入本文)中得到描述。術語"生物學活性"、"生物學上具有活性的"、"活性"、"具有活性的"、"生物學功能"、"REV生物學活性"和"功能上具有活性的"指目的蛋白質例如REV0LUTA蛋白質進行二聚化(或以其他方式裝配成蛋白質寡聚體)的能力，或者調節或以其他方式影響天然野生型(例如，內源的)REVOLUTA蛋白質二聚化的能力。然而，所述術語還意欲包括目的蛋白質例如REVOLUTA蛋白質與其他分子結合和/或相互作用的能力，所述其他分子包括例如但不限於，包含由該蛋白質例如REVOLUTA蛋白質所識別的在啟動子區中的特異性核苷酸序列的DNA，所述結合和/或相互作用事件介導植物細胞分裂並最終賦予表型；;或相互作用j能力:所^結合;、/或相互;用^件介導植物細胞分裂並最終賦予與該目的基因相關的表型。如本文所使用的，REV表型意指由REV核酸或蛋白質所賦予的表型，並且特別包括其中展示出種子大小或種子數目的特性。通常，REV表型通過檢查在早期特異性胚胎發育期間過量表達REV的植物來確定，其中可以將來自所述植物的種子數目和大小與在親本或野生型植物的相應組織中的種子數目和大小進行比較。在具有代表性的數目的植物群體內，具有REV表型的植物在種子數目和/或大小方面具有統計上顯著的變化。適合於與植物生長和/或發育相關基因有效地連接並使用所描述的本發明方法表達的啟動子通常在胚胎中具有更大的表達，和在其他植物組織中具有更低的表達或無表達。特別感興趣的是在早期特異性胚胎發育中起始表達的那些啟動子序列。早期特異性啟動子是在擬南芥屬物種中在授粉後第7天(手杖形)前或者在另一個植物物種中的等價階段起始蛋白質表達的啟動子。特別感興趣的啟動子序列的例子包括用於胺基酸通透酶基因(APP1)的啟動子(例如，來自擬南芥的AAP1啟動子)(Hirner等人，P7a/^/.14:535-544,1998)，用於油酸12-羥化酶去飽和酶基因的啟動子(例如，來自Ze^"ere/7a屍e/zc^er/的被命名為LFAH12的啟動子)(Broun等人，/VaW/.13:201-210,1998)，用於2S2白蛋白基因的啟動子(例如，來自擬南芥的2S2啟動子)(Guerche等人，戶h/^2:469-478，1990)，脂肪酸延長酶基因啟動子(FAE1)(例如，來自擬南芥的FAE1啟動子)(Rossak等人，A/o/.46:717-715,2001)，和葉狀子葉基因啟動子(LEC2)(例如，來自擬南芥的LEC2啟動子)(Kroj等人，"ep^7o/7/z/e/^130:6065-6073，2003)。其他感興趣的早期胚胎特異性啟動子包4舌但不限於，Seedstick(Pinyopich等人，iVa"re424:85-88,2003)，Fbp7和Fbpll(矮牽牛Seedstick)(Colombo等人，屍/aWCW/.9:703-715，1997)，Banyuls(Devic等人，屍/aW/.19:387-398，1999)，agl-15和agl-18(Lehti-Shiu等人，屍7aWi2'o/.58:89—107，2005),Phel(Kohler等人，6^"eir/ere/op.17:1540—1553，2003)，Perl(Haslekas等人,戶/a/^36:833—845，1998;Haslekas等人，戶/a/^"/o人53:313-326，2003),embl75(Cushing等人，/Va/"221:424-436，2005),Lll(K醒g等人，15:5-18，2003)，Lecl(Lotan等人，Ce//93:1195-1205，1998)，Fusca3(Kroj等人，Zere/o;邁e/^130:6065-6073，2003),ttl2(Debeaujon等人，CW713:853-871,2001)，ttl6(Nesi等人，戶/s/z,CW/14:2463-2479,2002)，A-RZf(Zou和Taylor,Ce力e196:291-295，1997)，TtGl(Walker等人，戶/a^Ce//11:1337-1350,1999;Tsuchiya等人，屍/a/j〃.37:73-81，2004)，Ttl(Sagasser等人，Cs版16:138-149，2002)，TT8(Nesi等人，/Vfl/^CW/12:1863-1878，2000)，Gea-8(胡蘿蔔)(Un和Zi咖erman，/.f早^a/^50:1139-1147，1999)，Knox(稻)(Postma-Haarsma等人，戶7fli^oA39:257-271，1999)，Oleosin(Plant等人，戶/fl/^脫Wo7.25:193-205，1994;Keddie等人，戶/s/^^o厶A/oA24:327-340，o/.54:25-38，2004;Parcy等人，戶/a;^6:1567-1582,1994)，等等。適合於在本發明中使用的啟動子可以來自與待轉化的植物相同的物種或可以來自異源物種。此外，啟動子可以來自與對於待使用的轉基因而言相同的物種，或者它可以來自異源物種。在本發明的方法中使用的啟動子還可以包括嵌合啟動子，其可以包括與上述那些中的一種或多種具有相同的表達譜的啟動子組合。在本發明的一個實施方案中，將來自擬南芥的AAP1基因啟動子與擬南芥;^T基因相組合，並用於構建轉基因卡諾拉油菜(歐洲油菜)。此外，在本發明的另外一個實施方案中，來自Ze^were/"/*e/7f//er/的油酸12-羥化酶去飽和酶基因啟動子LFAH12與擬南芥REV基因有效地連接，並用於構建轉基因卡諾拉油菜(歐洲油菜)。上述轉基因植物中的每一種顯示了本發明方法的)^r表型特徵，其中REV在早期胚胎發育中過量表達，從而導致增加的種子大小和/或種子數目。應當指出，上述的早期特異性啟動子僅僅是可以在本發明的方法中使用的代表性啟動子。用於鑑定和表徵植物基因組DM中的啟動子區的方法是技術人員眾所周知的，並且包括例如，由Jordano等人，/Va/^Ce"l:855-866，1989;Bustos等人，屍/ai^Ce/71:839-854，1989;Green等人，蕭0/.7:4035-4044，1988;Meier等人，/VaWCe//3:309-316，1991;和Zhang等人，戶/aW戶力j^/o人110:1069-1079，1996描述的那些。在早期胚中過量表達REV的轉基因植物可以例如通過將轉基因載體(例如，質粒、病毒等)轉移至植物中來獲得，所述轉基因載體編碼與編碼REVOLUTA的基因有效地連接的早期特異性胚胎啟動子。通常，當載體是質粒時，栽體還包括選擇標記基因，例如編碼對於卡那黴素的抗性的卡那黴素基因。如Hoeckeme等人(Y"wre303:179-181，1983)中所描述的，最常見的植物轉化方法通過下列方式來進行將靶轉基因克隆到植物轉化載體中，隨後將所述植物轉化載體轉化到包含輔助Ti-質粒的根瘤土壤桿菌(J^ro6a"er/咖f咖Z/ac/e/^)中。另外的方法例如描述在Maloney等人，屍/aWCe〃)印or^8:238，1989中。如由An等人(？/a/^腳Wo/.81:301-305，1986;Hooykaas，戶7aWM/.5io/.13:327-336，1989)所描述的，可以將包含轉基因載體的土壤桿菌細胞與待轉化的植物的葉切片一起溫育。如上所述，培養的植物宿主細胞的轉化通常通過根瘤土壤桿菌來完成。通常使用磷酸鉤法來轉化不具有堅硬的細胞膜屏障的宿主細胞的培養物，所述磷酸鉤法由Graham等人(Wro/o^r52:546,1978)最初描述，並如Sambrook等人(//0/ecu7arC7o/7//2《力Za6orafor/i^s/zwa/(第2版，1989ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,NY)中所述進行修改。然而，也可以使用用於將DNA引入細胞內的其他方法，例如Polybrene(Kawai等人，M/,CW/.S/o/.4:1172，1984)，原生質體融合(Schaffner，/Voc.JcaA5W.77:2163，1980),電穿孔(Neumann等人，/.1:841,1982)，和直接顯微注射到核內(Capecchi，Ce//22:479，1980)。可以通過選擇標記經由在培養基上生長細胞來選擇出經轉化的植物愈傷組織，所述培養基包含例如卡那黴素以及合適量的植物激素例如萘乙酸和千基腺噪呤以用於愈傷組織和幼芽誘導。隨後，可以使用本領域技術人員眾所周知的技術來再生植物細胞，並將所得到的植物轉移至土壤中。除了上述方法外，大量關於將經克隆的DM轉移到廣泛多樣的植物物種內的方法是本領域眾所周知的，所述植物物種包括棵子植物、被子植物、單子葉植物和雙子葉植物(參見例如Glick和Thompson,CRCPress,BocaRaton,Florida,1993;Vasil，屍/fl/7t肌^/o/.，25:925—937，1994;和Komai等人，Ci/rre/7f0;i'//o/7S戶/a/z"/0/.1:161-165，1998(綜合性的綜述)；Loopstra等人，"2'o人15:1-9，1990;和Brasileiro等人，/7fl/zfWo厶5/o/.17:441-452，1990(樹的轉化)；Eimert等人，戶7a/^Wo/.19:485-490,1992(芸苔的轉化)；Hiei等人，/Va/f/6:271-282，1994;Hiei等人，戶/a^嵐5/。/.35:205—218，1997;Chan等人，屍/a/3fA/o人22:491-506,1993;美國專利號5，516，668和5，824，857(稻的轉化);以及美國專利號5，955，362(小麥的轉化)；5,969,213(單子葉植物的轉化)；5，780，798(玉米的轉化)；5，959，179和5,914,451(大豆的轉化)。代表性的例子包括由電穿孔促進的原生質體對於DNA的攝取(Rhodes等人，5We/ce240:204-207，1988;Bates,#eW.5/o人111:359—366，1999;D'Halluin等人，淑力.#o/.A/oA111:367-373，1999;美國專利號5,914,451);用聚乙二醇處理原生質體(Lyznik等人，戶7a/^^o入Wo/.13:151-161，1989;Datta等人，汐/o人，111:335-334，1999);和用裝載有DNA的微粒轟擊細胞(Klein等人，屍7a/7f腳".0入91:440-444，1989;Boynton等人，5We膨240:1534-1538，1988;Register等人，戶/a/^淑.25:951-961，1994;Barcelo等人，戶/a/f/.5:583-592，1994;Vasil等人，5/'o入111:349-358，1999;Christou，戶/a/^"/o/.35:197-203，1997;Finer等人，Cwrr.7b/.#/cro6/o/./邁細o厶240:59-80,1999)。另外，植物轉化策略和技術在Birch,她紐/Va/^戶力/義/Va/2f#o/.^/o/.48:297，1997;Forester等人，jgr/c.33:15-33，1997中進行了綜述。較小的變化使得這些技術可應用於廣泛範圍的植物物種。在單子葉植物轉化的情況下，粒子轟擊通常是所選擇的方法。然而，單子葉植物例如玉米也可以通過使用在美國專利5，591，616中所述的土壤桿菌轉化法來進行轉化。實現單子葉植物例如玉米的轉化的另一種方法將來自胚胎發生懸浮培養物的細胞與纖維(5。/。w/v，SilarSC-9須晶)和質粒DNA(1yg/u1)的懸浮液相混合，並且隨後垂直置於VortexGENIEII渦旋'混合器(ScientificIndustries,Inc.,Bohemia,NY，USA)上的多樣品頭中，或水平置於MIXOMAT牙科汞合金混合器(DegussaCanadaLtd.,Burlington,Ontario,Canada)的固定器中。然後，可以通過以全速混合約60秒(例如，用VortexGENIEII)或以固定速度振蕩1秒(MIXOMAT)來進行轉化。這個過程導致產生可以從其中選擇出穩定轉化體的細胞群體。從經穩定轉化的愈傷組織中再生出植物，並且這些植物及其後代可以通過Southern雜交分析顯示為轉基因的。該方法的主要優點是其簡單性和低成本。與粒子轟擊不同，不需要昂貴的設備和供應。對於轉化植物細胞特別是玉米而使用須晶例如在美國專利5,464,765中得到描述。美國專利5，968，830描述了用於轉化和再生大豆的方法。美國專利5，969，215描述了用於產生轉化的甜菜(ra^ar")植物例如糖用甜菜的轉化技術。上述轉化技術中的每一種均具有優點和缺點。在每種技術中，對來自質粒的DNA進行遺傳改造，從而使得它不僅包含目的基因，還包含可選擇和可篩選標記基因。可選擇標記基因用於僅選擇出具有該質粒的整合拷貝的那些細胞(構建是這樣的，即使得目的基因以及可選擇和可篩選基因作為一個單元進行轉移)。可篩選基因對於僅成功培養攜帶目的基因的那些細胞提供了另一種檢查。具有抗生素抗性選擇標記的常規的土壤桿菌轉化可能是有問題的，因為對於此類植物引起將抗生素抗性散布至動物和人的過度風險存在著公眾反對意見。此類抗生素標記可以通過使用類似於在美國專利5,731,179中描述的那些的土壤桿菌技術轉化植物而從植物中消除。抗生素抗性問題還可以通過使用bar或pat編碼序列而有效地避免，例如在美國專利號5,712,135中所描述的。這些優選的標記DMs編碼第二種蛋白質或多肽，所述第二種蛋白質或多肽抑制或中和穀氨醯胺合成酶抑制性除草劑膦絲菌素(草銨膦)和草銨膦鹽(Basta，Ignite)的作用。通過任何前述技術將包含一種或多種這些基因的質粒引入植物原生質體或愈傷組織細胞中。如果標記基因是可選擇基因，那麼只有已合併入了所述DM包的那些細胞在使用合適的植物毒性試劑進行選擇的條件下存活。一旦合適的細胞得到鑑定並繁殖後，就再生出植物。來自轉化的植物的後代必須進行測試，以確保所述DM包已成功地整合到植物基因組中。存在影響轉化的成功的許多因素。外源基因構建體及其調節元件的設計和構建影響外源序列整合到植物細胞核的染色體DM內，和轉基因被細胞表達的能力。用於以非致死方式將外源基因構建體引入植物細胞核內的合適方法是必需的。重要的是，如果待恢復全植物，那麼將構建體引入其中的細胞的類型必須是順應於再生的類型，其中考慮了合適的再生方案。原生生物也可以用作宿主細胞以用於本發明的初始克隆步驟。可以用於這些初始克隆和擴展步驟的方法、載體、質粒和宿主細胞系統是技術人員眾所周知的，並且在本文中不進行描述。在本發明的另一個實施方案中，可以使用技術人員眾所周知的方法插入早期特異性胚胎啟動子，以便在待轉化的植物中與編碼植物生長和/或發育相關基因例如REV的基因有效地連接。啟動子的插入將允許基因例如REV在轉基因植物的正在發育的種子中的早期胚胎表達。在本發明的方法中特別感興趣的轉基因植物包括但不限於，特別是來自十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的單子葉植物和雙子葉植物。在這些科中特別感興趣的植物包括但不限於，卡諾拉油菜、玉米、亞麻齊、棉花、小麥、稻、大豆、大麥及其他產生種子的植物，以及具有農業利益的其他植物，包括但不限於苜蓿等，其在本發明的一個具體實施方案中包含有在早期特異性胚胎啟動子的控制下的^^T轉基因。轉基因可以來自與轉基因植物相同的物種，或者轉基因可以來自異源植物。特別感興趣的是包含來自擬南芥的y^r轉基因的轉基因植物。早期特異性胚胎啟動子也可以來自與轉基因植物相同的物種，或者來自異源植物。例如，早期特異性胚胎啟動子可以來自與REV轉基因相同的植物物種，或甚至來自另一個植物物種。特別感興趣的是來自擬南芥屬物種或Ze^were77a/e/^/er/的早期特異性胚胎啟動子，但早期特異性啟動子可以得自另一個植物物種。已發現適合於本發明方法的早期特異性啟動子和W^r轉基因的特定組合包括但不限於，(a)Ze《^/ere//a/e/cf/er/LFAH12啟動子/擬南芥屬物種REV;(b)擬南芥屬物種AAP1啟動子/擬南芥屬物種REV;(c)擬南芥屬物種LEC2啟動子/擬南芥屬物種REV;和(d)擬南芥屬物種2S2啟動子/擬南芥屬物種REV。在本發明的一個具體實施方案中，這些轉基因構建體已用於轉化卡諾拉油菜，但可以用於轉化其他植物物種。特別地，它們可以用於在大豆、玉米、棉花、亞麻齊、稻、小麥、大麥、苜蓿和其他具有農業利益的農作物中產生具有增加的種子大小和/或種子數目的轉基因植物。本發明還提供了用於選擇增加植物產量的生長和/或發育相關基因的方法。在該方法中，目的基因在表達質粒或載體中與早期特異性胚胎啟動子功能性地結合。使用本領域已知的方法將包含目的基因的表達質粒或載體轉染到植物細胞中，以形成轉基因細胞。通過已知方法(包括上文公開的那些)使包含轉基因的細胞長大並再生成轉基因植物，直至獲得轉基因植物。就與野生型植物相比較而言增加的產量來觀察轉基因植物，並選擇用於獲得具有增加的產量的轉基因植物的那些生長和/或發育相關基因以用於進一步發展。包含所選擇的生長和/或發育相關基因的轉基因植物可以進一步發展，以提供具有比野生型植物更高的產量的具有農業重要性的植物。僅作為本發明的各個方面的舉例說明提供了下述實施例，它們不應解釋為以任何方式限制了本發明。實施例下述實施例描述了各種表達載體的構建，所述表達載體包含早期特異性胚胎啟動子和在植物生長和/或發育中具有作用的基因，特別地，將胚胎特異性啟動子(a)Ze^"ere/7a屍加cr/er/LFAH12;(b)擬南芥屬物種AAP1;(c)擬南芥屬物種LEC2;(d)擬南芥屬物種2S2;和(e)擬南芥屬物種FAE1，與擬南芥屬物種yfWi^7^(A五H基因有效地結合，並用於產生轉基因卡諾拉油菜植物。實施例1:轉基因卡諾拉油菜植物，其表達被設計為賦予REV0LUTA的胚胎特異性表達的轉基因構建體。相對於非轉基因野生型擬南芥屬物種植物，擬南芥屬物種i^^基因在轉基因擬南芥屬物種植物中的組成型過量表達導致增加的種子大小，但這個性狀伴隨著負面的多效性效應。這些效應包括擬南芥屬物種中改變的葉形態和減少的腋生枝形成。改變的葉形態和總體遲緩的植物生長是在以高組成性水平遍及植物地過量表達iiT基因的轉基因卡諾拉油菜中觀察到的負面效應。為了獲得增加的種子大小性狀並同時避免在非種子組織中的不希望的效應，可以採取將iiT轉基因的過量表達特異性地靶向種子中的正在發育的胚胎這樣的策略。這可以通過使用轉基因表達構建體來完成，其中胚胎特異性啟動子驅動^f「基因的表達。還可以合理地預期，參與植物發育和生長過程的其他植物基因如)^T的組成型過量表達將會對轉基因植物具有負面的多效性效應。胚胎特異性啟動子用於評估在發育和生長中具有作用的植物基因例如可能的產量增加基因的應用提供了就在增加農作物產量方面的功效來評估此類植物基因的一般方法。選擇賦予胚胎特異性表達的5種啟動子以用於在表達構建體中使用，所述表達構建體被設計為在早期胚胎發育期間在卡諾拉油菜胚胎(歐洲油菜)中產生REV的轉基因表達。這些啟動子包括AAP1(來自擬南芥的胺基酸通透酶基因)(Hirner等人，PlantJ.14:535-544，1998)，GGTTGCATCTTTGAATACCTTTTTCTCATTTAGGCATAACAATATAATAATttgttTTTTgttttcattttcttttggtgtcatcttcaaaaatctgtaaacccaaaagtttgtataacttgtttattaagatatttttaattaaattttTTTTTTTGACATTTTTAAAAAATTATAAAGTGTTTTATGAATTTAAGGAGTAAATAATATTTATTTAGAACACTATAAATTAGTTTTACAAGTTCTTAGAAATGTATCTGTAAATTTCAAAAAGGAAAAATATAGCATTTAATTTTGAAGATTTTTTTCTACATTATATATATGATAAAAATATTGTATTTTGTACTTTGTAGTTACAAAAAGTCATTATATCAACAAATCTAAATATAAAATATTTTTC200680052853.3說明書第26/47頁TATATATTACTCCAAATTAACTGTCAGAATAAAAAAGAAGAATAATTATTACAGAATCTGAACATTAAAATCGTCCCTCCATATGTGGTCTCTGTCTAGTCCAAAAGCAATTTACACATCCCAAGCCGAAACTATATTAAATAAACATTTTTTTT丁GTTTAACTAAAACATTTATAACATTTAACAATAAAAGTTAAAAATCGAACACGTATAACGTATTTTTTTACGTATACGTCTTGTTGGCATATATGCTTAAAAACTTCATTACATACATATACAAGTATGTCTATATATATGATATTATGCAAACACAAATCTGTTGACTATAATTAGACTTCTTCATTTACTCTCTCTCTGACTTAAAACATTTATTTTATCTTCTTCTTGTTCTCTCTTTCTCTTTCTCTCA(SEQIDNO:11);LFAH12(來自Ze^"ere//a屍e/c/ei7的油酸12-羥化酶::去飽和酶基因)(Broun等人，/Va/7f/.13:201-210，1998)，TCAGGAAGATTAAGTCTTTGCTTGTTGTCTGATTTTCTTTAAATACATTAAGAAATCGGTTATGAAGCTTCGTTTTTTGTGTTTTGGGATTATGAAGCTGTCTTTGGATATTAGTTGCGGTTATTAGCATGCTTCTCTTTTGTGTTTTGGGGATGATGAAGCAGGGTCTCTCTATGTAATGCATTTTGTTTGAAAACTCAGCTAATGCTAATGCAATTTCTTTTGAAACCTTTGTTATGTTTTCAAAAATATTGAATAGGTTCTGTTATGGATTTATTTGCAAAAGCCATTGATTAAATCAAACCATTACATAAGAACAACATTCATTATTAACTAATTAGAGATGCAAAACACAACATTACATACAACATCAGTGACTAATTATTGAGACAAAACAACATCACAGACACAAACATTCATCTCATACATCACTTAGAGAGACACAAAAAGCAACCAAACACAACTATTCCGCCAACAACAATTAGCTTCATACGTTTTGCTTCTCCTTTCAAGCCTTCAATCATCTTCTCACAGCCACGAATCTGAGCCTTCAATAATAACATTTCTTCATCGTGACACTTCTCACGGTTATGAATGCAAGCCTTTATGTCCTCTACTTCTTCTACTAAAGACACATCGGTCCACTTCCAGGTGTGGAATCCTCCTCTTTTGAAATTTTTCTCACAGGTATGGAATAATCTACCTGGGTTTTTTGGAGTTCTTGAGGTTCTGATCACAACACGGCATCCACATCGACAGGTCTTAGGAAAACCACGAAGGTTATGATCTTCAAGCTCACTGTCAAAAGATAAAAACGAGTTTGAAGAAGAAGAAGGCATTATCAATTTCAGAGAATTTTGGAGAATTTTGAGAGATTGAGAATTGGGAAATAAGAACCCTAATCCCCAATTTATGAGATTGAAAATATATCCGTTAGAGAAGAAACATAATGTTGTGCGTTTTAATTAGAAAAAATAGAGATGGGCTTTATCTTTTGTTAAGAGTTTTGGGCTTGGGCTTGGGTTTTTGATAAAAAAATTAATTAAACCAAAACGACGTCGTTTGGTTTAATTGTTGTTAAAAAAAAATTAAAACACCAAAACGACGTCGTTTTGGTGTTATTAACGGCCTTAAAACGGATTAAATCCATAATCCGTCAGTCAACTAGGGTTACGGATGGTCAACGGCGTTTTTGCATAACGGAGGCACAGTTCAGGCTTAACGGAGTGGACGGAATGGCTTTTTAGGAAGTTTGTAACCGGGGTCTTTTGTTTATGATGTATTTGTCCCCGTCGGCTATTGTTCAGGCCGTTTAGGCCTTTTTCCTATATACTGGAAATAACTATTGTCCAGACGAGTTACTTCTCCAACATATCAAGAAGTGTTACAAAGATGTGTTACGAAGCCATAAAACTCAAAACCCTAAGCCTAAACCCTAGAACTTTCTAGCACGTTTATACCTTCTCCTTTCTTTAGTTTCCTTTAAAGGCCTTCGTATCATAAGTTTTATTTTTGCTTAATACTAACACTAGAAAAAAACAATAATCAACATAAACTAGGTTAAGTCGTGGATCTAATTTTATTGTGAAAATGTAATTGCTTCTCTTAAGAAAAGATTCATAGCAAAATATTCGCATCTTTCTTGTGAATCATCTTTTGTTTTTGGGGCTATTAAAGAAAAATTGAACTCATGAAATGGTGACAACTTTATTCTAGAGGTAACAGAACAAAAATATAGGAACAACACGT「TTGTTCATAAACTACACGTATAATACTCAAGAAGATGAATCTTTATAAGAATTTAGTTTTCTCATGAAAACATAAAAAGTTTTGTCAATTGAAAGTGACAGTTGAAGCAAAGGAACAAAAGGATGGTTGGTGATGATGCTGAAATGAAAATGTGTCATTCATCAAATACTAAATACTACATTACTTGTCACTGCCTACTTCTCCTCTTTCCTCCGCCACCCATTTTGGACCCACGAGCCTTCCATTTAAACCCTCTCTCGTGCTATTCACCAGAATAGAAGCCAAGAGAGAGAGAGAGATTGTGCTGAGGATCATTGTCTTCTTCATCGTTATTAACGTAAGTTTTTTTTTGACCACTTATATCTAAAATCTAGTACATGCAATAGATTAATGACTGTTCCTTCTTTTGATATTTTCAGC(SEQIDNO:12);2S2(來自擬南芥的2S2白蛋白基因)(Guerche等人，/Vfli^Ce7/2:469-478，1990)，FAE1(來自擬南芥的脂肪酸延長酶基因)(Rossak等人，屍7a/,#oA"/oA46:717-725，2001)，和LEC2(來自擬南芥的葉狀子葉基因)(Kroj等人，/ere/o;/z/e/^130:6065-6073，2003)。CTTTGTTTTGTAGAGTGTTCTATGGGTTATGATTTCGAAAAGAAAAAAAATTGTGAGACACTTAATAAAATTATTTCGACAAAAAAAGTAGCTTGTATAAAAAAATCAGATTTTAATTTATGTAAGAACAAATTCCAATATCCAATAGTTAAAAATAATTATTTGTTCCGATTAATCGAGTTTTGCAAAATATGCACAAAATCTATCATGTACCATTTCTAAGACTATATATTTGGTTATATATTTTATGCCGTGTGTTCTGATTCCAATAAATTTTAGCGCATAGTAAATTTTCTAAAAAGCAAAATTTTCTCAAAAGTGTACTAATGACAATTAATTGAGTTTCTACAAAATAAGAATAACTATTGACTCGATTTTCACAAAACTAGTATGCTAAATATCACATTACTTTTAAAATTAAATGGAATTATCTTTTTCAATATTGGATACGAATAATTTTTACACTAAAGTTATTTTAATAAAATAACCGTTTATTCAAAATATGTAAAGACGACAAAAATATATATTAAATGGAAAAACGACTAACTTAGTTTTTGCAAAATTAAATGGATTTGTCCTTTTCAATGTTTGAATACAAAAAAAAATCTATAATAAGTTTATTATATTAAAATAACCCGTTTTTTCAGAATACGCAAAAACGACAAAAAAATATTAATTACAAAGAAATTTAGTTTATACAAAAATATGAATGGCTATTAATGGTGTTTACTCTAAATTTAATTATTATGCATTTATGCTAAATCTTTCTAAAGGTACAAAGATTCGTTTTTTCAATGTTTGAACTGCATATTAAGGTATAGATTTGGACCTTAACAGAGTTAATATATAAGGAAGAGAGCCAAGGAACTCCAAAATAAAATAAAGAGCCTTCTCTCTCTCTCTCTGAGAAAAAACACATATAGCCAATGACCTTCTCGTGGTCTTCTGTGCCATAAAAGCCATTATATACATTCAAACACAATCTGGCGCCACATATACACATGTACTAGTGTATGTATATGTCCTAACCTCTGTATTCATATCTCTCTCCTTGTCTGAGTGGTGCGATGGGTATCCCCATAAGCTGCAAACATTGAACCATCTGCAACATTTTGACTCGTTTTCTTTTGTGTTTTTCCAACATCTGTCTCTTCTTCACTCGCTCTCTCCTAATCAATCTCCCCAACGACCTCTCTTTTTT丁TTGTTTCTTCACTCAGATCTCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCGGGAAAA(SEQIDNO:13)所有5種啟動子在擬南芥屬物種中產生早期胚胎表達。這5種啟動子在早期胚胎發育期間的表達鐠在圖1中示意性地顯示。AAP1、LFAH12、2S2和FAE1啟動子在胚胎發育的最早階段中是不工作的。它們在發育中漸進地在更晚階段時變得具有轉錄活性，從AAP1開始，隨後為LFAH12、2S2，再隨後為FAE1。然後，所有這4種啟動子保持具有活性直至更遲的胚胎發育階段。LEC2啟動子具有相反的表達i脊，在非常早期胚胎發育中是具有活性的，隨後活性逐漸降低直至更遲的階段。將AAP1、LFAH12、2S2、FAE1和LEC2啟動子在^T轉基因表達構建體中與REV編碼區序列的2種構造之任一相組合。將AAP1、LFAH12、2S2、FAE1和LEC2啟動子與A^T基因編碼序列(包括存在於i^T基因中的所有內含子)相組合。還將AAP1和LFAH12啟動子與衍生自缺乏內含子的ASTcDNA的REV編碼區序列相組合。擬南芥REV(AtRev)cDNAATGGAGATGGCGGTGGCTAACCACCGTGAGAGAAGCAGTGACAGTATGAATAGACATTTAGATAGTAGCGGTAAGTACGTTAGGTACACAGCTGAGCAAGTCGAGGCTCTTGAGCGTGTCTACGCTGAGTGTCCTAAGCCTAGCTCTCTCCGTCGACAACAATTGATCCGTGAATGTTCCATTTTGGCCAATATTGAGCCTAAGCAGATCAAAGTCTGGTTTCAGAACCGCAGGTGTCGAGATAAGCAGAGGAAAGAGGCGTCGAGGCTCCAGAGCGTAAACCGGAAGCTCTCTGCGATGAATAAACTGTTGATGGAGGAGAATGATAGGTTGCAGAAGCAGGTTTCTCAGCTTGTCTGCGAAAATGGATATATGAAACAGCAGCTAACTACTGTTGTTAACGATCCAAGCTGTGAATCTGTGGTCACAACTCCTCAGCATTCGCTTAGAGATGCGAATAGTCCTGCTGGATTGCTCTCAATCGCAGAGGAGACTTTGGCAGAGTTCCTATCCAAGGCTACAGGAACTGCTGTTGATTGGGTTCAGATGCCTGGGATGAAGCCTGGTCCGGATTCGGTTGGCATCTTTGCCATTTCGCAAAGATGCAATGGAGTGGCAGCTCGAGCCTGTGGTCTTGTTAGCTTAGAACCTATGAAGATTGCAGAGATCCTCAAAGATCGGCCATCTTGGTTCCGTGACTGTAGGAGCCTTGAAGTTTTCACTATGTTCCCGGCTGGTAATGGTGGCACAATCGAGCTTGTTTATATGCAGACGTATGCACCAACGACTCTGGCTCCTGCCCGCGATTTTTTGTGGTTTTGCTTCAGCTTAATAAGGCCCTTAATCTTGGTCATCCAAATCAGGCAATTAGGCAGCCTGCAATGATGCGGTGATGGAGCAATAATATTTGGCTTCAATGTTAGAGAGCAGCTGCTACACAAGATTCACTACGAAGAAATGAAGATGCATGATTGACGAGTTAATGAGATGTCATACCCGTAATCACCGTTGAGAATGCTTCACTATCGCGCTGGTATGGTGTTGCAATGAATTGTCCCCCAAAGTTACTTGGAAGCGAATCCTGTGTTCTGGACCCTGGTGAGAGGTCTCTCAGTTTGTTGTGATGGTAGGCTTGGAGGTCGTTGCACAGCCCAAGAGCTGTTCTTAGGTTAATGGGTGGAAGATATTCTAATTCTCTCTTCTCCAAATCGATCTGAGTTAAAGCTGGGGGAGTCAGAGCTAGAAGTTTTATGTCACGAATGCCGTTGGTTCCCGGATTTGATGCTAAACACTAGACTTCTGGAAACTGTTTCAATTCCTTGTCAGTAGCGATCTCACAGGATCTCCTAGTCATCACTCGACTCGGTAGCTCATTAAAAGATACACAAGCTATCTGGCTGAGAGCAGAGGTGGTTCTATGTTCCGGATAAAAAATGACTCTAATGGTGAACCTTTAGCTTGGTGACGAATCGTTGCTATTCGTTCCTTATGTTCCTCCTGGGCTGATTTAGCTTTGCTTCATAATGCCGTTAGACTGGGGATGTCCATGAGCTTGTTCGATGCTCCACAACGGGAGATTAACTTCTAGCTTTTTCTAGCCTTTTGAAATGTGAGGAGCCGTCTGGGATGAAGCTGTTATAGGCTCGGACTAAAACTTCGCCACAGCCACGAGCCTCGATCTGGAGCTGAATGCTTTCTTTATTCACATGTGCTTCGACCATTTCCGCGAAGTAGTGTACAAAGATTAACGGGTGGTCTTTAACTCTACGGAGGCGTGCTGCGGTTTTGTCAATGTTGATATCCGGGAAACTAGGACATAAGGTCATTCCTCCTTCAGATGAACTGATATTGTTCCCTCGTACAAGATCCCTTGAAGTCGCTCAAGCTCGACAACTTGCAGTGATCTCATAAGCCCGAGTCTCTTGCTCAGTTGCTGACGTATGGGATCAGTGTTCATGTCAATGGGAGTGGCCTAATGCAGTGGGTATTTGTCGATCACCCCTTTATGATTGCGGTATATGGATTAGGAGCAGGGGCTTACGATGCATTAAAGCATTTGTCTGTGCCAAATCCGGTTCCTGCATATTCCTGAGACCAACACAATTGAACTCTTGCTCAATTTGTACCGGTTTGCTCCGATGGATTCCGATGTTAACCGCGTCCATCACCAGATGTATTCAGAAAATGTTCAGTTCAACGCTGGGCTCCAGTGGATCTCTATTGATTCACCCAAGATGCCTTGCGAACCAAGCTGGTCTAGACATGCTAGAGACAACACTTGTAGCCTTACAAGATATAACACTCGAAAAGATATTCGATGAATCGGGTCGTAAGGCTATCTGTTCGGACTTCGCCAAGCTAATGCAACAGGGATTTGCTTGCTTGCCTTCAGGAATCTGTGTGTCAACGATGGGAAGACATGTGAGTTATGAACAAGCTGTTGCTTGGAAAGTGTTTGCTGCATCTGAAGAAAACAACAACAATCTGCATTGTCTTGCCTTCTCCTTTGTAAACTGGTCTTTTGTGTGA(SEQIDNO:1)。^T轉基因構建體LFAH12-At鮮基因-rev3，UTR用AcoAI-LFAH12(GAATTCTCAGGAAGATTAAGTCTTTGCTTG;SEQIDNO:14)和5^cI-LFAH12(GAGCTCGCTGAAAATATCAAAAGAAGGAACA;SEQIDNO:15)引物從力e^were7/a屍e/^7eW基因組DNA中擴增出LFAH12啟動子的2170鹼基對(bp)區域。這些引物分別從離公開的LFAH12序列((GenBank⑧標號AF016103.1或GI:3452128)(Broun等人，屍/a/r/.13:201-210(1998))的5'和3'末端24個核苷酸和15個核苷酸處開始。將幾個獨立的PCR反應產物克隆到pCR-Blunt(Invitrogen)中並進行測序。所有序列彼此相同(SEQIDN0:12)，並且與公開的LFAH12序列具有97%同一性。差異可能是由於用於取回啟動子的Z./e/^f/er/的特定的添加物。用fcoWI將LFAH12移至pBluescript質粒，並且將啟動子在pBluescript中的定向確定為在啟動子的5'側和在啟動子的3'側(pTG143)。作為來自pTG95(在pCGN1547中的35S-At^^F基因-rev3，UTR,專利W001/33944A1)的^el-iT;w31片段獲取AtiiT基因-rev3，UTR盒，並連同LFAH12啟動子(來自pTG143的J/wI-^el片段)一起以三路連接(three-wayligation)方式連接到已用if/wl進行切割的pCGN1547二元載體(McBride等人，戶7a/^5/o人14:269-276,1990)中，以形成與植物NPTII表達盒處於尾對尾定向的LFAH12啟動子-AtAfF基因-rev3，UTR。AAPl-At鮮基因-rev3'UTR用AAP1(GAATTCGGTTGCATCTTTGAATACCTTTTT;SEQIDNO:16)和AAPl(GAGCTCTGAGAGAAAGAGAAAGAGAGAACAA;SEQIDNO:17)引物從擬南芥(哥倫比亞生態型)基因組DNA中擴增出AAPl啟動子的809鹼基對(bp)區域。Sacl-AAP1引物從離公開的AAPl序列(GenBank⑧保存號X95622.1;GI:1566687)(Hirner等人，/Va/^/.14:535-544，1998)的3'末端6個核苷酸處開始。所有PCR產物的序列彼此相同，與公開的C24生態型AAPl序列具有98%同一性，和與經注釋的Col生態型AAPl序列(GenBank⑧名稱AC008051.3;GI:7462019)(SEQIDNO:11)具有100%同一性。用將AAPl移至質粒pBluescript，並且將啟動子在pBluescript中的定向確定為//wl在啟動子的5'側和5>el在啟動子的3'側(pTG145)。作為來自pTG95(在pCGN1547中的35S-At^T基因-rev3，UTR，參見專利W001/33944A1)的5^el-r/wI片段獲取At^T基因-rev3，UTR盒，並連同AAP1啟動子(來自pTG145的&/2l-5>eI片段)一起以三路連接方式連接到已用進行切割的pCGN1547二元載體(McBride等人，屍/a/fA/o/.14:269-276,1990)中，以形成與植物NPTII表達盒處於頭對尾定向的AAP1啟動子-Ati^K基因-rev3'UTR。LFAH12-At^57cDM-rev3，UTR從合成自總RM的cDNA中擴增出AtcDNA，所述總RNA分離自Columbia生態型的擬南芥屬物種的葉。所使用的引物在ATG處摻入^c(I位點和在終止密碼子後摻入^3邁肌位點WcoI-ATGrevCCATGGAGATGGCGGTGGCTAAC(SEQIDNO:18)和A邁肌-TGArevGGATCCTCACACAAAAGACCAGTTTACAAAGGA(SEQIDNO:19)。將所得到的AtcDNAPCR產物克隆到質粒pCR-Blunt中並進行測序(pTG230)。使用pTG95作為模板，用引物擴增Aer3，UTR，所述引物在5'末端處摻入Aco^V位點，和在3'位點處摻入iV^I/i^/zI:化(iVrev證GATATCTTCGATTGACAGAAAAAG(SEQIDNO:20)和revUTRGCGGCCGCGGTACCCTCAACCAACCACATGGAACCA(SEQIDNO:21)。將所得到的AtAfiT3'UTR克隆到質粒pCR-Blunt中並進行測序。使用A"i7V和位點將RevUTR移至質粒pBluescript(pTG234)。然後使用fc(7)V和iVon位點從pTG234中獲取Rev3，UTR，並連接到pTG230中(pTG239)。作為來自pTG239的5>el-r;7/2l片段獲取AtW^TcDNA-rev3，UTR盒，並連同LFAH12啟動子(來自pTG143的iTp/7l-5^el片段)一起以三路連接方式連接到pCGN1547二元載體中，以形成與植物NPTII表達盒處於頭對尾定向的LFAH12-AtW^TcDNA-rev3，UTR(pTG241)。AAP1-At縦c腿-rev3，UTR作為來自pTG239的S/7el-iT/7/71片段獲取At)^TcDNA-rev3，UTR盒，並連同AAP1啟動子(來自pTG145的^w7l-&el片段)一起以三路連接方式連接到pCGN1547二元載體中，以形成與植物NPTII表達盒處於頭對尾定向的AAP1-AtAfiTcDNA-rev3，UTR(pTG242)。FAE1-At，基因-rev3，UTR使用//wl和S/el位點從CD載體中擴增出933bpFAE1啟動子，克隆到質粒pCR-Blunt中，並進行測序(pTG238)。然後，用fcoWI將FAE1啟動子移至質粒pBluescript中(pTG243)。作為來自pTG95的&el->5>2l片段獲取AtiiT基因-rev3，UTR盒，並連同FAE1啟動子(來自pTG243的^wl-^el片段)一起以三路連接方式連接到已用//wl進行切割的pCGN1547二元載體(McBride等人，/Va/f#o/.A/o/.14:269-276,1990)中，以形成與植物NPTII表達盒處於頭對尾定向的FAE1啟動子-AtA^r基因-rev3'UTR。2S2-At鮮基因-rev3，UTR從CD質粒p4163(2S2-AtAiTS附I片段)中切出1379bp2S2啟動子，並在^0^V位點處連接到pBluescript中。啟動子在pBluescript中的定向被確定為f//I在啟動子的5'側和As邁肌在啟動子的3'側(pTG251)。作為來自pTG138(在T0P0中的35S-Ati^T基因-rev3，UTR)的As邁肌-^wl片段獲取AtA5T基因-rev3，UTR盒，並連同2S2啟動子(來自pTG251的//7/71-^2歷肌片段)一起以三路連接方式連接到已用/jwzl進行切割的pCGN1547二元載體(McBride等人，戶/a/2r船/.A/o/.14:269-276，1990)中，以形成與植物NPTII表達盒處於頭對尾定向的2S2啟動子-Ati^F基因-rev3'UTR。LEC2-At鮮基因-rev3，UTR用和戶WI從CD質粒p5217中切出1256bpLEC2啟動子，並且在相同位點處克隆到質粒pBluescript中(pTG252)。然後，作為J/7/2l-^邁肌片段將該啟動子置於在相同位點處線性化的pTG112(在質粒pCR-Blunt中的At)iT基因)中以產生pTG280，這是在pCR-Blunt質粒中的LEC2-AtiSF基因。使用pTG234作為模板，用引物擴增出Rev3'UTR，所述引物在5'末端處摻入位點，和在3'末端處摻入Won/j^/2l:^糹REVUTRstartGCGGCCGCTTCGATTGACAGAAAAAG(SEQIDNO:22)和淑^RevUTRGCGGCCGCGGTACCCTCAACCAACCACATGGAACCA(SEQIDNO:23)。將所得到的AtREV3，UTR克隆到質粒pCR-Blunt中並進行測序(pTG281)。然後，使用位點將Rev3，UTR移至pTG280，並就正確定向進行篩選。所得到的質粒是在質粒pCR-Blunt中的LEC2-AtREV基因-rev3'UTR(pTG283)。作為)T/7/zI片段將LEC2-AtREV基因-rev3，UTR移至用i^/I線性化的pCGN1547質粒，並就與植物NPTII表達盒的頭對尾定向進行篩選(pTG288)。卡諾拉油菜(歐洲油菜)的轉化用i五K轉基因表達構建體轉化雙單倍體卡諾拉油菜變種DH12075，其中使用基於Maloney等人(Maloney等人，P7aWAe;or"8:238，1989)的那種的土壤桿菌介導的轉化方法。使經滅菌的種子在15X60mm培養皿中在含有1%蔗糖的1/2MS(Murashige&Skoog)培養基上發芽5天，其中每個平板大約40-大約60粒種子。對於每個轉化構建體，使總共約1500粒種子發芽。種子並不完全浸入發芽培養基中。使發芽的幼苗在組織培養室中於25r進行生長，採用16小時光/8小時暗循環。正好在頂端分生組織上切割子葉，而不獲得任何分生組織。這通過用鑷子緊在頂端分生組織區域上輕輕夾住2個葉柄來完成。小心不要用鑷子壓碎葉柄。使用鑷子的尖端作為引導，使用具有鋒利號(sharpNo.)為12的刀片的解剖刀切割葉柄。將子葉放到15mmX100mm的共培養培養基平板上。經正確切割的子葉容易地分開。如果它們不是這樣，那麼非常可能已獲得了分生組織，並且不使用這樣的子葉。每個平板容納約20片子葉。在每製備少數平板後用土壤桿菌接種子葉外植體以避免萎寫，所述萎蔫將對該方案的隨後階段產生負面影響。通過電穿孔將REV轉化構建體引入根瘤土壤桿菌中。具有REV轉化構建體的土壤桿菌在含有合適抗生素的AB培養基中於281C搖動生長2天。為了接種子葉外植體，將少量土壤桿菌培養物加入至10mmx35mm培養皿中。將每個外植體的葉柄浸泡在土壤桿菌培養物中，並且將切割末端放入培養皿中的共培養培養基內。將平板密封，並在組織培養室中於25匸、16小時光/8小時暗下放置3天。3天後，將外植體以每組IO個的方式轉移到包含幼芽誘導培養基的新鮮的25mmx100mra培養皿。這種培養基包含選擇試劑(20mg/l卡那黴素)和激素(4.5mg/l油菜素類固醇(BA))。只轉移看上去健康的外植體。使外植體在幼芽誘導培養基上保持14-21天。在這時，;匕的幼芽。通過其白色:紫色而容:地識別出未轉化的幼芽。^那黴素敏感性幼芽通過將其切掉來去除，並且將所有看上去健康的愈傷組織轉移至新鮮的幼芽誘導培養基平板中。使外植體在這些平板上再保持14-21天。2-3周後，將顏色為深綠色的幼芽轉移至包含幼芽伸長培養基的平板。這種培養基包含選擇試劑(20mg/1卡那黴素)，但不包含任何激素。每個平板轉移5個幼芽。將平板密封並送回組織培養室。將看起來有活力的轉化的幼芽轉移至包含間苯三酚(150mg/1)的幼芽伸長培養基。將變得健康和綠色的幼芽返回至幼芽伸長培養基平板。轉移，以獲得外表正常的幼芽將具有正常形態的幼芽轉移到具有生根培養基的4盎司嬰兒食品罐中，所述生根培養基含有0.5mg/1吲哚丁酸。當將幼芽轉移至罐時，將任何多餘的愈傷組織切掉。通過大約每6周將其轉移至包含0.2mg/1丐l味丁酸的新鮮罐中，可以將幼芽無限期地維持在罐中。一旦形成了良好的根系，就將T。代幼芽從罐中取出，將瓊脂從根上除去，並且將小植物轉移至盆栽土壤中。每個獨立的T。小植物代表了轉基因插入至卡諾拉油菜基因組中的獨立發生，並被稱為事件。將透明杯置於小植物上數日，以允許植物適應新環境。一旦植物已變硬，就移去杯。然後，使T。轉基因事件在溫室中生長至成熟，並且收集L種子。T。事件的表徵通過Southern分析來測定每個事件中轉基因插入位點基因座的數目。通過Northern分析或終點RT-PCR來驗證在T。事件中的W五「轉基因表達。在19天的授粉後天數(DAP),對於胚胎發育中的單個時間點，獲得REV表達數據。從這些數據中得出結論，在這個發育時間點時，LFAH12和2S2白蛋白啟動子驅動比AAP1啟動子更高水平的REVRNA產生。2SVREV構建體在許多事件中產生中等至高水平的表達。所述表達數據證實，所有5種啟動子在轉基因卡諾拉油菜植物中驅動轉基因表達方面具有功能。對於所有7種REV轉基因構建體成功地產生了T。植物。所測試的構建體包括(a)AAPl/REV基因;(b)AAPl/REVcDNA;(c)LFAH12/REV基因；(d)LFAH12/REVcDNA;(e)2S2/REV基因；(f)FAE1/REV基因；和(g)LEC2/REV基因。實施例2:在重複田間試驗中評估在胚胎發育期間^T轉基因的表達對於卡諾拉油菜產量的影響。在這個實施例中，將包含有在各種胚胎特異性啟動子控制下的擬南芥屬物種轉基因的轉基因卡諾拉油菜植物在田間試驗中進行測試。轉基因iiT事件進展至田間試驗基於轉基因表達和轉基因插入基因座數目的組合來選擇T。事件以用於進展至田間試驗。將具有經驗證的轉基因表達和單個轉基因插入基因座的事件指定為最高優先級以推進至田間測試。在某些情況下，如果多個基因的存在由於基因劑量而產生高的總體轉基因表達水平，那麼選擇具有多個插入基因座的事件。使來自所選事件的L種子在田間地塊中作為分離性L群體(segregatingT\populations)進行生長。將每個事件種植為2行、24個植物的地塊。對於具有單個轉基因插入基因座的事件，在所述24個L植物中的轉基因分離將產生大約6個缺乏轉基因的無效植物、12個雜合子植物和6個純合子植物的分布。在開花前將每個L植物獨個地裝入袋中，以防止異型雜交。分開地收穫來自所述24個1\植物中每一個的L種子。將L種子原種用於鑑定所述24個親本L植物中的哪些是無效的、雜合子的或純合子的。使來自每個L植物的大約30粒L種子在培養皿中的濾紙上進行發芽，所述培養皿具有包含抗生素G418(卡那黴素的類似物)的溶液。因為使用/7/^//抗性基因作為選擇標記來共轉化植物，所以只有攜帶轉基因的那些種子將發芽並繼續生長。如果平板上的所有種子被證實對於G418敏感，那麼該L親本被鑑定為無效品系。如果平板上的所有種子對於G418具有抗性，那麼該L親本被鑑定為純合子品系。如果平板上大約四分之一的種子是敏感的和其餘的種子具有抗性，那麼該T,親本被鑑定為雜合子品系。將從來自相同轉化事件的純合子L親本獲得的T2種子混合在一起，以產生用于田間試驗測試的純合子種子原種。將從來自相同轉化事件的無效L親本獲得的T2種子混合在一起，以產生用于田間試驗測試的無效同胞種子原種。田間試驗設計通過在大規模重複試驗中在田間使每種轉基因品系直接與其無效同胞進行比較，在轉基因卡諾拉油菜品系中測試胚胎特異性啟動子用於評估WiT轉基因作為產量增加基因的潛力的用途。因為無效同胞由於L代中轉基因的分離而產生，所以無效和純合子同胞在遺傳上幾乎是相同的。唯一的顯著差異是^r轉基因的存在或不存在。這種緊密的遺傳同一性使得無效同胞成為用於評估^^K轉基因的效應的最佳對照。因為試驗的主要目的是比較來自事件的轉基因品系與其無效分離子，所以選擇裂區(splitplot)設計。這種設計使得能夠高水平地評估轉基因和非轉基因分項之間的相互作用以及事件間的轉基因副區之間的差異(副區(subplot)和主區(mainplot)的相互作用)，並且較低水平地評估總體事件或主區之間的差異。田間試驗在跨越草原環境的多個位置處進行，以在卡諾拉油菜所通常在其中進行生長的環境條件範圍下評估產量表型。在所有位置處，每個轉基因事件與在鄰近區塊中的其無效同胞進行物理配對。純合子和無效同胞的每個區塊對在每個試驗位置處重複4次。將在每次實驗中的4個重複區塊對的位置在每個試驗位置處進行隨機分布。區塊為1.6mx6m，並且以約142粒種子/平方米的密度進行種植。使用對於卡諾拉油菜的商業生產而言典型的標準農學實踐來使植物生長至成熟。實施例3:從胚胎特異性啟動子表達i^T轉基因以增加轉基因卡諾拉油菜中的種子產量。在每個產量田間試驗位置處的所有區塊用聯合收割機獨個地進行收割。作為來自每個區塊的就水份含量進行了調整的種子總重量，收集種子總產量數據。對於每次試驗中的每個轉基因事件，將來自每個純合子品系的4個重複區塊的總產量平均值與來自相關的無效同胞品系的4個重複區塊的總產量平均值進行比較。這種比較用於評估AiT轉基因對於種子總產量的影響。將來自多個試驗位置中每一個位置的結果相組合，以產生iiT轉基因對種子總產量的影響的交叉試驗分析。在每個試驗位置處的統計學方差分析允許對純合子轉基因品系與其無效同胞之間的種子總產量中的差異指定顯著性閾值(P=0.05)。在種子總產量方面顯示出統計學顯著增加的轉基因Afr卡諾拉油菜品系概括在表l中。對於所有7種啟動子/i^r轉基因構建體鑑定出在總產量方面顯示出統計學顯著增加的轉基因品系。這些結果證實，使用胚胎特異性啟動子過量表達REV導致增加的種子產量。用LEC2啟動子獲得了對產量的最大影響，這暗示REV的過量表達在胚胎發育的最早階段中可能是最有效的，因為LEC2啟動子在發育中非常早地具有最大活性，並逐漸降低轉錄活性直至胚胎發育的更遲階段。AAP1、LFAH12和2S2啟動子在胚胎發育中的漸進地更遲的階段時開始具有轉錄活性，但在增加產量方面也是有效的。就所回收的獨立事件的數目而言LFAH12啟動子是突出的，所述獨立事件顯示出顯著增加的產量，這表明使用這種啟動子獲得了性狀的高度外顯率。對於FAE1啟動子只回收了1個在產量方面具有中等增加的事件，這可能暗示在胚胎發育的較早階段中開始具有轉錄活性的啟動子提供了用於產量增加的最佳手段，並證實基因的早期胚胎過量表達可以用於評估參與植物生長和/或發育的基因是否具有在轉基因植物中增加農作物產量的潛力。表1.相對於其無效同胞而言純合子^^r植物中種子總產量的變化。所有值都是統計學上顯著的(P=0.05)。tableseeoriginaldocumentpage47tableseeoriginaldocumentpage48實施例4:在使用胚胎特異性啟動子在胚胎發育期間表達Rev的轉基因卡諾拉油菜中增加的種子大小。將從在田間試驗中的獨個區塊中收穫的所有種子在烤箱中以低熱乾燥至均勻的水份含量。對于田間試驗中每個區塊的每個種子樣品，使用Agriculex(Guelph，Ontario,Canada)種子計數器計數出1000粒種子。然後測量每1000粒種子樣品的重量。將來自每個純合子品系的4個重複區塊的種子千粒重(thousandseedweight,TSW)平均值與來自相關的無效同胞品系的4個重複區塊的TSW平均值進行比較。將在純合子轉基因ii5T品系與其無效同胞品系之間的TSW值中的差異用作可以歸因於REV轉基因的種子大小的差異的量度。在每個試驗位置處的統計學方差分析允許對純合子轉基因品系與其無效同胞之間的TSW中的差異指定顯著性閾值(P-0.05)。如由TSW所表明的在種子大小方面顯示出統計學顯著增加的轉基因T^r卡諾拉油菜品系概括在表2中。對於所述7種啟動子/i^r轉基因構建體中的6種鑑定出在TSW方面顯示出統計學顯著增加的轉基因品系。驅動REV表達的LEC2和LFAH12啟動子對於種子大小的影響與使用這些啟動子而觀察到的對於總產量的影響相一致。LEC2/REV構建體產生在種子大小方面的強的正增加，這表明REV在非常早期胚胎發育中的過量表達是有效的。LFAH12啟動子再次顯示出性狀的強外顯率，其中6個獨立事件在種子大小方面顯示出統計學上顯著的增加。驅動REV過量表達的AAP1和2S2啟動子也在種子大小方面產生統計學上顯著的增加。攜帶FAE1/REV轉基因構建體的事件無一顯示出TSW的顯著增加。因為FAE1啟動子的活性在所測試的5種啟動子之中最遲在胚胎發育中開始出現，所以效應的這種缺乏暗示，當與影響植物生長和發育的基因例如REV相結合時，在胚胎發育的較早階段中開始具有轉錄活性的啟動子提供了增加產量的手段。此外，這些啟動子可以用於就其在轉基因植物中增加產量(例如種子大小和/或數目)的潛力來評估與生長和/或發育相關的其他植物基因。表2.由種子千粒重所表明的種子大小的變化。所有值都是統計學上顯著的(P=0.05)。由*標出的值在1個試驗位置處是顯著的。tableseeoriginaldocumentpage49實施例5:在使用胚胎特異性啟動子在胚胎發育期間表達Rev的轉基因卡諾拉油菜中增加的種子大小和產量。對於增加的種子大小表型的一種可想到的結果可以是由植物所產生的補償性應答，其導致減少的種子數目以維持將資源恆定地淨分配至種子產生。表3概括了6個獨立的轉基因^^r事件，所述轉基因K事件在田間試驗中顯示出統計學上顯著增加的種子大小和總產量的增加。在攜帶AAP1/REV、LFAH12/REV、2S2/REV和LEC2/REV轉基因構建體的事件中觀察到種子大小和總產量的同時增加，這表明所有4種啟動子在增加種子大小方面是有效的，而不引起作為由植物所產生的補償性應答的種子數目的減少。表3中TSW值與總產量值的比較揭示出，增加的種子大小不是所觀察到的產量的總增加的原因。增加的種子大小是促成總產量的一種組分。增加的產量的其餘部分是由於增加的種子數目。在大多數情況下，增加的種子數目是增加的總產量的主要組分。增加的種子數目可以起因於種子數目/莢的增加、總狀花序數目的增加、莢數目/總狀花序的增加、種子敗育率的減少、或者這些效應的組合。在顯示出增加的種子大小和總產量的事件列表中不存在攜帶FAE1/REV轉基因構建體的事件表明，在胚胎發育的較早階段中開始具有轉錄活性的啟動子提供了用於就其在轉基因植物中增加種子大小和產量的潛力來評估參與植物發育和生長的植物基因的最佳手段。還顯示出，可以用在胚胎發育的較早階段中開始具有轉錄活性的啟動子來獲得對於產量增加的最大功效。表3.顯示出增加的種子大小和總產量的獨立轉基因A^T事件。值是統計學上顯著的(P=0.05)，除了**之外，其不是統計學上顯著的但在所有4個試驗位置處是正的。用*標記的值在1個試驗位置處是顯著的。tableseeoriginaldocumentpage50實施例6:轉基因大豆植物，其表達被設計為賦予REVOLUTA的胚胎特異性表達的轉基因構建體。基於LFAH12胚胎特異性啟動子用於在轉基因卡諾拉油菜植物中驅動REV0LUTA轉基因表達從而獲得產量和種子大小增加的成功應用(表l、2和3)，構建LFAH12-AtREV基因構建體用於大豆的轉化。大豆與卡諾拉油菜一樣是雙子葉植物，並且A^TW^^基因在植物物種間的高度保守使得擬南芥屬物種i^ra/^T^基因在被引入轉基因大豆植物中時可能會起作用。REV轉基因構建體LFAH12-AtREV基因-rev3，UTR用AcoiI-LFAH12(GAATTCTCAGGAAGATTAAGTCTTTGCTTG;SEQIDNO:14)和&cI-LFAH12(GAGCTCGCTGAAAATATCAAAAGAAGGAACA;SEQIDNO:15)引物從Ze^"ere"a屍e/cT7er/基因組DNA中擴增出LFAH12啟動子的2170bp區域。這些引物分別從離公開的LFAH12序列((GenBank⑧標號AF016103.1或GI:3452128)(Broun等人，戶"/^/.13:201-210(1998))的5'和3'末端24個核苷酸和15個核普酸處開始。將幾個獨立的PCR反應產物克隆到pCR-Blunt(Invitrogen)中並進行測序。所有序列彼此相同，並且與公開的LFAH12序列具有97%同一性。差異可能是由於用於取回啟動子的屍ei^7er/的特定的添加物。用^roAI將LFAH12移至pBluescriptII質粒，並且將啟動子在pBluescript中的定向確定為J;wzl在啟動子的5'側和5^el在啟動子的3'側(pTG143)。作為來自pTG95(在pCGN1547中的35S-At^T基因-rev3，UTR，專利W001/33944A1)的5^el-"/I片段獲取At^T基因-rev3，UTR盒，並連同LFAH12啟動子(來自pTG143的iT/wjI-^el片段)一起以三路連接方式連接到已用^wjI進行切割的pCGN1547二元載體(McBride等人，戶/a/^WoA14:269-276，1990)中，以形成與植物NPTII表達盒處於頭對尾定向的LFAH12啟動子-AtT^r基因-rev3，UTR(pTG171)。用從pTG171中切出LFAH12pr-AtREV基因-rev3，UTR盒，用T4聚合酶變成平端，並克隆到已用^則I進行切割的pBluescriptII內，以產生pTG^4(TG-GM6)。大豆的轉化使用生物射彈方法，用^T轉基因表達構建體轉化大豆品種X5，以將在金顆粒上的DNA引入在懸浮培養中生長的大豆細胞內。將包含^^r轉基因表達構建體的線性DNA與在分開的線性DNA片段上的潮黴素選擇標記基因一起進行共轉化。為了製備用於插入到大豆細胞內的DNA，向金顆粒中加入2.5pl^5TDNA和2.5pipHYGRDNA。添加50plCaCl2並渦旋振蕩5秒。隨後添加20pl亞精胺並渦旋振蕩5秒。允許沉澱物沉降至管底部。去除上清液，並用200pl100%乙醇將粒狀沉澱洗滌2次。去除上清液，並將粒狀沉澱重懸浮於120pl100%乙醇中。每皿等分8jil以用於插入。在生物射彈插入後，使細胞在燒瓶中的懸浮培養中生長12天。然後，將培養物轉移至包含30ml2.4%糖+Finer，sLight(F.L.)+170pl10pg/ftl潮黴素(hyg)的新燒瓶中。對於接下來的4周，通過轉移至具有2.40/。糖+F.L.+hyg的新燒瓶而每周更換一次培養基。在第5至笫10周期間在燒瓶中形成經轉化的綠色愈傷組織。將具有綠色愈傷組織的燒瓶的內容物傾倒入無菌100x15mm皿或蓋中。使用無菌鑷子，將綠色愈傷組織與褐色細胞撥開，並轉移至裝滿1-2m12.4%糖+F.L.+1^8/孔的26孔平板。1個綠色愈傷組織(克隆)/孔。目標是獲得20-3G個克隆/燒瓶。每2周更換平板中的培養基，使用無菌10-mL移液管和自動移液器(pipetor)以從所有孔中吸取所有培養基。培養基用新鮮的2.4%糖+1^8替換。就合適的胚胎發生前(proembryogenic)培養物來監控平板。這些是具有幾個胚胎發生前突出物的綠色物體並顯示快速分裂和生長。一旦通過顯微鏡觀察鑑定了合適的細胞團，就將它轉移到無菌亞或蓋上，在那裡去除儘可能多的死細胞物質。將組織的剩餘部分轉移至2.4%糖+Hyg的常規30ml燒瓶中。允許克隆在培養基更換之間生長約3-5周。當克隆充分生長時，將它們分開。每個克隆僅保留5個最佳部分。這些是具有幾個胚胎發生前突出物的綠色物體。平滑的、綠色集落不是所希望的。克隆每3-5周進行亞培養，直至它們足夠大。在這個點上，作為再生的第一個步驟，將克隆轉移至具有活性炭的大豆再生培養基上，以去除2，4-D(0MSM6AC，Simmonds和Donaldson,戶/a/7"e"ie/7or〃19:485-490，2000，其通過提及而整體合併入本文)。克隆在包含活性炭(AC)的0MSM6AC上生長不超過6天，以從組織中去除2，4-D。然後，將克隆轉移至大豆胚胎髮芽培養基(0MSM6G，Simtnonds和Donaldson,同上)上3周。這種培養基允許胚胎的發育。3周後，選擇最好的20個胚胎並轉移至大豆成熟培養基(0MSM6PH，Simmonds和Donaldson,同上)。最好的胚胎是具有1或2個子葉和可見的分生組織的單個(與融合相反)胚胎。轉移胚胎，從而使得分生組織與瓊脂表面平行。使克隆在0MSM6PH上維持4周，在這期間胚胎變成黃色。一旦變黃，它們就隨時可進行乾燥並再生為植物。將胚胎在已滅菌30分鐘、在底部具有3層1120-飽和的Whatman濾紙的Magenta盒中進行乾燥。使胚胎乾燥10天，並隨後轉移至在平板中的大豆生根培養基(B5/2培養基，Si咖onds和Donaldson,同上)上約10-12天。當幼芽長至蓋或當葉打開時，小植物就隨時可轉到SunshineMix(平地)上。轉基因小植物在平地中生長，直至出現第一片具有三小葉的葉，並隨後轉移至6英寸罐中以生長至結實。實施例7:從胚胎特異性啟動子表達^T轉基因，以測定在轉基因大豆中增加的種子大小。基於轉基因表達和轉基因插入基因座數目的組合來選擇具有LFAH12-AtREV基因-rev3，UTR(TGGM6)轉基因構建體的T。事件以用於進展至表型評估。將具有經驗證的轉基因表達和單個轉基因插入基因座的事件指定為最高優先級以推進至種子擴展和田間測試。在某些情況下，如果多個基因的存在由於基因劑量而產生高的總體轉基因表達水平，那麼選擇具有多個插入基因座的事件。將來自所選T。事件的L種子在溫室中作為分離性L群體進行生長。獨個地從所有L植物收穫種子。使關於每個事件的L代植物進行生長，並通過PCR進行分型，以確定對於^T轉基因而言哪些L品系是純合子、雜合子或無效分離子。收穫來自每個T2品系的種子、計數並稱重。基於關於每個丁2品系的種子總重量和種子數目，對於每個品系計算種子千粒重(TSW)值。然後，對於每個事件，對於純合子、雜合子和無效分離子類別的種子計算平均TSW。具有由LFAH12胚胎特異性啟動子驅動的REV表達的2個獨立轉化事件對於純合子和雜合子品系在種子大小方面顯示出相對於無效分離子品系而言統計學上顯著的增加。在表4中概括的結果證實了A^「轉基因在早期胚胎發育期間的過量表達。表4.如由相對於其無效分離子同胞品系而言在純合子和雜合子轉基因植物中的種子千粒重所表明的，胚胎特異性啟動子用於評估W^r轉基因在大豆中增加種子大小的能力的用途。tableseeoriginaldocumentpage54實施例8:從胚胎特異性啟動子表達^^轉基因，以測定轉基因大豆中增加的種子總產量。為了測試由胚胎特異性啟動子驅動的y^r轉基因表達對於種子總產量的影響，合併來自純合子和無效分離子同胞品系的T3種子，並在夏季生長季節期間種植在田間。在測量種子重量前，將從田間的獨個地塊中收穫的所有種子在烤箱中以低熱乾燥至均勻的水份含量。相對於其無效同胞，具有由LFAH12胚胎特異性啟動子驅動的REV表達的1個轉基因事件顯示出22.7%的增加的種子總產量和8.0%的增加的種子大小(表5)。表5.通過將純合子轉基因植物與無效分離子同胞植物進行比較，胚胎特異性啟動子用於評估A^T轉基因在大豆中增加種子大小和產量的能力的用途。tableseeoriginaldocumentpage55提供了前面的實施例以舉例說明而不是限制本發明的範圍。本發明的其他變化形式對於本領域普通技術人員而言將是顯而易見的，並且由所附權利要求書包括。所有出版物、專利、專利申請和本文引用的其他參考文獻也通過提及而整體合併入本文。權利要求1.用於增加植物中的種子大小的方法，其包括在早期胚胎發育期間在種子中過量表達植物生長和發育相關基因。2.根據權利要求1的方法，其中在所述種子中的所述生長和/或發育相關基因的表達處於早期特異性胚胎啟動子的控制下。3.根據權利要求2的方法，其中所述早期特異性胚胎啟動子對於所述植物來說是異源的。4.根據權利要求2的方法，其中所述早期特異性胚胎啟動子對於所述植物來說是同源的。5.根據權利要求2的方法，其中所述早期特異性啟動子是與胺基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長酶基因(FAE1)或葉狀子葉基因(LEC2)相關的啟動子。6.根據權利要求5的方法，其中所述AAP1啟動子是來自擬南芥的AAP1啟動子，所述油酸12-羥化酶去飽和酶啟動子是來自Ze^were7/fl屍加cT/er/的油酸12-羥化酶去飽和酶基因啟動子(LFAH12)，所述2S2基因啟動子來自擬南芥，所述脂肪酸延長酶基因啟動子來自擬南芥，或所述葉狀子葉基因啟動子來自擬南芥。7.根據權利要求1-6中任一項的方法，其中所述植物生長和/或發育相關基因是MK基因、^戶(環化酶相關蛋白)基因、稻組蛋白脫乙醯酶1基因、WFc基因、》i7基因、5及i7基因、^Z(Argos-Like)基因、6W/(油菜素類固醇激素感受)基因、W7^基因、Pepino基因、^^(G蛋白信號傳導調節劑)基因、T7W基因、55(BigBrother)基因、j^^基因、/;^7^基因、VW基因、W)^基因、粉K基因或^^基因。8.根據權利要求7的方法，其中所述生長和/或發育相關基因是鮮。9.根據權利要求8的方法，其中所述)ir基因來源於擬南芥。10.根據權利要求1-9中任一項的方法，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。11.根據權利要求10的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。12.根據權利要求ll的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜、玉米、亞麻薺、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。13.根據權利要求12的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜或大豆，所述植物生長和/或發育相關基因是i^r，和所述早期特異性啟動子是與胺基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長酶基因(FAE1)或葉狀子葉基因(LEC2)相關的啟動子。14.根據權利要求13的方法，其中所述AAP1啟動子是來自擬南芥的AAP1啟動子，所述油酸12-羥化酶去飽和酶啟動子是來自Zes^/ere/h屍e/cT/eW的油酸12-羥化酶去飽和酶基因啟動子(LFAH12)，所述2S2基因啟動子來自擬南芥，所述脂肪酸延長酶基因啟動子來自擬南芥，或所述葉狀子葉基因啟動子來自擬南芥。15.用於增加可從植物獲得的種子數目的方法，其包括在早期胚胎發育期間在種子中過量表達植物生長和發育相關基因。16.根據權利要求15的方法，其中在所述種子中的所述生長和/或發育相關基因的表達處於早期特異性胚胎啟動子的控制下。17.根據權利要求16的方法，其中所述早期特異性胚胎啟動子對於所述植物來說是異源的。18.根據權利要求16的方法，其中所述早期特異性胚胎啟動子對於所迷植物來說是同源的。19.根據權利要求16-18中任一項的方法，其中所述早期特異性啟動子是與胺基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長酶基因(FAE1)或葉狀子葉基因(LEC2)相關的啟動子。20.根據權利要求19的方法，其中所述AAP1啟動子是來自擬南芥的AAP1啟動子，所述油酸12-羥化酶去飽和酶啟動子是來自Ze^were7/a/e/2cr/eW的油酸12-羥化酶去飽和酶基因啟動子(LFAH12),所述2S2基因啟動子來自擬南芥，所述脂肪酸延長酶基因啟動子來自擬南芥，或所述葉狀子葉基因啟動子來自擬南芥。21.根據權利要求15-20中任一項的方法，其中所述植物生長和/或發育相關基因是i^^基因、"？(環化酶相關蛋白)基因、稻組蛋白脫乙醯酶l基因、W屍c基因、AA7基因、》Ai7基因、Argos-Like)基因、6W7(油菜素類固醇激素感受)基因、W7^基因、Pepino基因、A"(G蛋白信號傳導調節劑)基因、T7W基因、S》(BigBrother)基因、基因、/^T2基因、#W基因、基因、E4A^基因或J戶2基因。22.根據權利要求21的方法，其中所述生長和/或發育相關基因是鍵。23.根據權利要求22的方法，其中所述)^r基因來源於擬南芥。24.根據權利要求15-23中任一項的方法，其中所述植物是單子葉才直物或雙子葉植物。25.根據權利要求24的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。26.根據權利要求25的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜、玉米、亞麻薺、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。27.根據權利要求26的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜或大豆，所述植物生長和/或發育相關基因是w^;和所述早期特異性啟動子是與胺基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長酶基因(FAE1)或葉狀子葉基因(LEC2)相關的啟動子。28.根據權利要求27的方法，其中所述AAP1啟動子是來自擬南芥的AAP1啟動子，所述油酸12-羥化酶去飽和酶啟動子是來自Zesgi/ere7/a屍e/3d7eW的油酸12-羥化酶去飽和酶基因啟動子(LFAH12),所述2S2基因啟動子來自擬南芥，所述脂肪酸延長酶基因啟動子來自擬南芥，或所述葉狀子葉基因啟動子來自擬南芥。29.遺傳構建體，其包含編碼與一種或多種控制序列有效地連接的植物生長和/或發育相關基因的核酸序列，其中所述一種或多種控制序列能夠在胚胎發育期間促進所述植物生長和/或發育相關基因的表達。30.根據權利要求29的遺傳構建體，其中所述控制序列是早期特異性胚胎啟動子。31.根據權利要求30的遺傳構建體，其中所述早期特異性胚胎啟動子是與胺基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長酶基因(FAE1)或葉狀子葉基因(LEC2)相關的啟動子。32.根據權利要求31的遺傳構建體，其中所述AAP1啟動子是來自擬南芥的AAP1啟動子，所述油酸12-羥化酶去飽和酶啟動子是來自Zesguere//a屍e/7tf/er/的油酸12-羥化酶去飽和酶基因啟動子(LFAH12),所述2S2基因啟動子來自擬南芥，所述脂肪酸延長酶基因啟動子來自擬南芥，或所述葉狀子葉基因啟動子來自擬南芥。33.根據權利要求29-32中任一項的遺傳構建體，其中所述植物生長和/或發育相關基因是i^r基因、"戶(環化酶相關蛋白)基因、稻組蛋白脫乙醯酶1基因、f》屍c基因、5A7基因、"Ai7基因、(Argos-Like)基因、6W/(油菜素類固醇激素感受)基因、基因、Pepino基因、y"(G蛋白信號傳導調節劑)基因、T7W基因、朋(BigBrother)基因、^MZ^基因、/^T2基因、#^/基因、WU基因、WA^基因或J屍2基因。34.根據權利要求33的遺傳構建體，其中所述植物生長和/或發育相關基因是/^r基因。35.根據權利要求34的遺傳構建體，其中所述MK基因是擬南芥36.根據權利要求29-35中任一項的遺傳構建體，其中所述構建體進一步包含polyA序列。37.用於產生具有增加的種子大小的轉基因植物的方法，所述方法包括(a)將根據權利要求29-36中任一項的遺傳構建體引入植物或植物細胞內；和(b)在促進再生和成熟植物生長的條件下培養包含所述遺傳構建體的所述植物或植物細胞。38.根據權利要求37的方法，其中所述植物或植物細胞來源於為單子葉植物或雙子葉植物的植物。39.根據權利要求38的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。40.根據權利要求39的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜、玉米、亞麻齊、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。41.根據權利要求40的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜或大豆。42.用於產生具有增加的種子數目的轉基因植物的方法，所述方法包括(a)將根據權利要求29-36中任一項的遺傳構建體引入植物或植物細胞內；和(b)在促進再生和成熟植物生長的條件下培養包含所述遺傳構建體的所述植物或植物細胞。43.根據權利要求42的方法，其中所述植物或植物細胞來源於為單子葉植物或雙子葉植物的植物。44.根據權利要求43的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。45.根據權利要求44的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜、玉米、亞麻薺、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。46.根據權利要求45的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜或大豆。47.用於產生具有增加的種子大小和增加的種子數目的轉基因植物的方法，所述方法包括(a)將根據權利要求29-36中任一項的遺傳構建體引入植物或植物細胞內；和(b)在促進再生和成熟植物生長的條件下培養包含所述遺傳構建體的所述植物或植物細胞。48.根據權利要求47的方法，其中所述植物或植物細胞來源於為單子葉植物或雙子葉植物的植物。49.根據權利要求48的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。50.根據權利要求49的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜、玉米、亞麻齊、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。51.根據權利要求50的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜或大豆。52.轉基因植物，其包含根據權利要求29-36中任一項的遺傳構建體，並且當與相應的野生型植物相比較時具有增加的種子大小，當與相應的野生型植物相比較時具有增加的種子數目，或當與相應的野生型植物相比較時具有增加的種子大小和種子數目。53.根據權利要求52的轉基因植物，其中所述植物或植物細胞來源於為單子葉植物或雙子葉植物的植物。54.根據權利要求53的轉基因植物，其中所述植物是十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。55.根據權利要求54的轉基因植物，其中所述植物是卡諾拉油菜、玉米、亞麻齊、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。56.根據權利要求55的轉基因植物，其中所述植物是卡諾拉油菜或大豆。57.根據權利要求53的轉基因植物，其中所述單子葉植物是稻、燕麥、玉米或小麥。58.根據權利要求57的轉基因植物，其中所述植物是十字花科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。59.根據權利要求53的轉基因植物，其中所述雙子葉植物是大豆、棉花、亞麻薺、苜蓿或卡諾拉油菜。60.根據權利要求52-59中任一項的轉基因植物，其中所述植物是全植物、植物器官、種子、植物細胞或其後代。61.根據權利要求60的轉基因植物，其中所述植物器官是葉、莖、花或根。62.根據權利要求60的轉基因植物，其中所述植物細胞是組織培養細胞。63.用於選擇當與早期特異性胚胎啟動子功能性地相結合時增加植物產量的基因的方法，其包括構建表達載體，所述表達栽體包含與早期特異性胚胎啟動子功能性地相結合的與植物生長和/或發育相關的基因；用所述表達載體轉染植物細胞以形成轉基因植物；培養所述轉基因植物；和在當與野生型植物相比較時具有增加的產量的轉基因植物中選擇生長和/或發育相關基因。64.根據權利要求63的方法，其中所述生長和/或發育相關基因是"(環化酶相關蛋白)基因、稻組蛋白脫乙醯酶l基因、f2屍c基因、AT/基因、Ai7基因、^Z(Argos-Like)基因、6"7(油菜素類固醇激素感受)基因、Wr5基因、Pepino基因、W"(G蛋白信號傳導調節劑)基因、77/V基因、A及(BigBrother)基因、i)7Z^基因、/A^T2基因、iWl7基因、WA7基因、/^^基因或J/^基因。65.根據權利要求63的方法，其中所述早期特異性胚胎啟動子是與胺基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長酶基因(FAE1)或葉狀子葉基因(LEC2)相關的啟動子。66.根據權利要求63的方法，其中所述AAP1啟動子是來自擬南芥的AAP1啟動子，所述油酸12-羥化酶去飽和酶啟動子是來自Zew"ere/7a屍e/^/e/7的油酸12-羥化酶去飽和酶基因啟動子(LFAH12)，所述2S2基因啟動子來自擬南芥，所迷脂肪酸延長酶基因啟動子來自擬南芥，或所述葉狀子葉基因啟動子來自擬南芥。全文摘要本發明提供了用於增加植物中的種子大小和/或種子數目的方法和組合物。特別地，提供了用於在胚胎發育期間過量表達植物生長和/或發育相關或關聯基因的方法和組合物。用遺傳構建體轉化的轉基因植物提供了在田間產生更大和/或更多種子的成熟植物，所述遺傳構建體具有在早期特異性胚胎啟動子控制下的植物生長和/或發育相關基因。還提供了用於選擇生長和發育相關基因的方法，所述生長和發育相關基因提供具有更高產量表型的轉基因植物。文檔編號A01H1/00GK101374408SQ200680052853公開日2009年2月25日申請日期2006年12月15日優先權日2005年12月15日發明者J·德羅徹,T·恩谷彥申請人:目標栽培公司