應用底泥微生物數量預報複雜水環境綜合質量的方法

2023-10-18 03:32:24 3

專利名稱：應用底泥微生物數量預報複雜水環境綜合質量的方法
技術領域：
本發明涉及水處理領域，具體地說是應用底泥微生物數量預報複雜水環境綜合質量的方法。
背景技術：
理化方法是水環境監測與評價的主要方法，傳統的化學或物理指標能夠定量分析主要成分的含量，但是難於直接地、全面地反映這些成分的綜合影響。從20世紀80年代至今，生物學指標在水環境質量評價中應用日益廣泛，並以生命周期長、敏感程度高、綜合性能強的特點而成為不可或缺、甚至標準化的水質評價與監測指標。迄今，魚、水生附著生物和應用最為廣泛的大型無脊椎動物構成了主要的水質評價與監測生物類群，雖然對這些生物進行監測可以更真實、全面地反映水環境的變化，但存在著時間滯後、難於量化、幹擾生物的因素多等缺陷。因而，很有必要採用分布廣泛、更為敏感的水環境微生物來對複雜水環境的綜合質量進行監測與評判。在水域生態系統中，微生物既是營養/汙染物質的分解者和轉化者，又是物質/能量的貯存者，同時還是食物鏈的重要生產者。水環境微生物對水環境質量最為敏感，極易受其影響，水環境微生物的種類及組成會隨著水環境的汙染程度而發生變化一般水環境質量退化或受損將對微生物的種類、數量產生負面影響，但某些耐性微生物種類在被汙染環境後數量反而可能增加。一般來說，懸浮於水體的微生物只能表徵水環境的瞬時質量；而穩定的底泥是各種汙染物質的最終貯存庫，可以為微生物提供一個長期的、完全不同的生態位，因此底泥微生物可以反應較長時期的水環境質量，應用底泥微生物可以對水環境的綜合質量/汙染狀況起到更好的指示作用。傳統的微生物(形態)分類學需要將不同種類的微生物分開進行實驗室純培養， 結果可能只有< 的好氧型種類能夠存活下來，而大多數的厭氧種類因為不能獲得嚴格的厭氧生境而死亡，因此僅僅依靠傳統的形態學分類有時候可能會導致錯誤的結論。20世紀80年代以來，利用分子生物學手段可以史無前例地檢測到複雜微生物類群中基因型/表型多樣性的詳細信息，但是很多、甚至大多數鑑定出來的微生物不能進行實驗室純培養，因而無法研究其生態功能或代謝機理，有時候微生物種類之間邊緣基因的交換還可能迷惑分子生物學手段的鑑定、分類結果。因此，儘管分子生物學手段可以鑑定出各種好氧或厭氧的微生物種類，但由於缺乏關於其生理生態方面的基本知識，也難於用來對所在生境的水環境質量進行評判。

發明內容
針對上述領域中的缺陷，本發明提供一種應用底泥微生物數量預報複雜水環境綜合質量的方法，通過指標及微生物數據來預告水環境的綜合質量，更全面，且更有現實意義。應用底泥微生物數量預報複雜水環境綜合質量的方法，包括如下步驟
(1)測定水域底泥的表層與亞表層的優勢微生物數量，( 通過下式計算出評判水環境綜合質量的出現概率，P(bad)/P(medium) = Exp[-2. 987+8. 049X In(surf/sub)]P(good)/P(medium) = Exp[_0· 944-0. 269X In (surf/sub)]P (medium) = e0 = 1其中，P(bad)= 「水環境綜合質量為差」事件的出現概率，P(good)= 「水環境綜合質量為良」事件的出現概率，P (medium)= 「水環境綜合質量為中」事件的出現概率，Surf =表層底泥中優勢細菌種數，Sub =亞表層底泥中優勢細菌種數。所述表層為深5cm的泥層，所述亞表層為深20cm的泥層。所述步驟(1)通過PCR-DGGE鑑定底泥表層與亞表層中的優勢微生物的種類來實現。所述PCR-DGGE的方法步驟如下A、提取底泥中的微生物DNA，B、用採用通用引物對GC-F338和R518，PCR擴增目的片段，所述引物GC-F338 5' -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GTAC GGG AGG CAG CAG-3『，R518 5' -ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'；C、DGGE電泳分離PCR產物，D、DGGE條帶的切膠回收後重新PCR，所述引物為F338和R518，所述引物F338 :5，-TAC GGGAGG CAG CAG-3 『，R518 5' -ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'；E、回收二次PCR產物，與表達載體連接，轉化，培養，提取質粒，PCT檢測，所述PCR 檢測中所述引物為M13-47和RV-M，所述引物M13-47 5' -CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3『，RV-M 5' -GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC ACA AGG-3『。F、陽性質粒測序，確定所含微生物的種類。所述表達載體為Rndl8-T載體。所述轉化所用生物體為DH5 α感受態細胞。所述步驟還包括以水中化學指標評定的水環境綜合質量為參照。所述水中化學指標評定的水環境綜合質量的方法測定水中化學指標，與以 《GB3838-2002》V類為基準，計算各樣點對應的各項水質指標與V類標準值的商，而後將各商加權求均值，令GX = X/VX其中，GX為各水質指標與《GB3838-2002》V類標準之商，即TP/VTP、TN/Vtn、NH4-N/ Vra4_N、Cr/Vtt.....Pb/V Pb、Cd/Vcd ；VX為各水質指標對應的《GB3838-2002》V類標準；又令Gaverage = (GTP+GTNXO. 5+GNH4_NX 0. 5+GCr+. . . +GZn+GCu+GPb+GCd)/i其中，i為水質指標數量；進而進行評判分級，具體如下GIII/V = (mTP/VTP+mTN/VTNX0.5+IIINH4_N/VNH4_NX0.5+IIICr/VCr+...+IIIZn/Vzn+III Cu /Vcu+III Pb /Vpb+III Cd /Vcd)/i ；GV/V = (VTP/VTP+VTN/VTNX0. 5+VNH4_N/VNH4_NX 0. 5+VCr/VCr+. · · +VZn/VZn+VCu/VCu+VPb/ VPb+Vcd/Vcd)/i = 1 ；GB/V = (Btp/Vtp+Btn/VtnX0. 5+Bnh4_n/Vnh4_nX0. 5+BCr/VCr+. · · +BZn/VZn+BCu/VCu+BPb/ VPA/Vcd)/L其中，B為《GB18918-2002》一級(B)標準，若(Average < GIII/V，水環境綜合質量判為優；若 GIII/V < Gaverage < GV/V，判為良；若 GV/V < Gaverage GB/V，判為差。本發明的方法具體如下一、應用化學指標對水環境綜合質量進行評判，作為對照。參考「地表水環境質量標準(GB3838_20(^)，，和「城鎮汙水處理廠汙染物排放標準 (GB18918-2002) 」的分級標準與對應功能，首次建立了適宜各種水質、各類水體的複雜水環境質量綜合評價模式，具體如下。以《GB3838-2002》V類為基準，計算各樣點對應的各項水質指標與V類標準值的商，而後將各商加權求均值。令GX = X/VX其中，GX為各水質指標與《GB3838-2002》V類標準之商，即TP/VTP、TN/Vtn、NH4-N/ Vra4_N、Cr/Vtt.....Pb/V Pb、Cd/Vcd ；VX為各水質指標對應的《GB3838-2002》V類標準。又令Gaverage = (GTP+GTNXO. 5+GNH4_NX 0. 5+GCr+. . . +GZn+GCu+GPb+GCd)/i其中，i為水質指標數量。進而進行評判分級，具體如下。GIII/V = (mTP/VTP+mTN/VTNX0.5+IIINH4_N/VNH4_NX0.5+IIICr/VCr+...+IIIZn/
Vzn+III Cu /Vcu+ΠΙ Pb /Vpb+III Cd /VJ/i ；GV/V = (VTP/VTP+VTN/VTNX0. 5+VNH4_N/VNH4_NX 0. 5+VCr/VCr+. · · +VZn/VZn+VCu/VCu+VPb/ VPb+Vcd/Vcd)/i = 1 ； GB/V = (Btp/Vtp+Btn/VtnX 0. 5+BNH4_N/VNH4_NX 0. 5+BCr/VCr+. · · +BZn/VZn+BCu/VCu+BPb/ VPb+Bcd/Vcd)/i其中，B為((GB18918-2002)) 一級(B)標準。因此，若(Average < GIII/V，水環境綜合質量判為優；若GIII/V < Gaverage < GV/V,判為良；若 GV/V < Gaverage GB/V,判為差(劣於城鎮汙水處理廠出水)。二、應用PCR-DGGE手段對底泥微生物進行鑑定採集底泥樣品放入_20°C冰箱保存待用。1.提取底泥中的微生物基因組DNA具體操作參照Fast DNA SPIN Kit for Soil 試劑盒步驟(www.mpbio.com)。2. PCR擴增目的片段採用GC-F338引物(其中通用引物F338R518由博邁得生物公司設計合成，並根據 DGGE電泳的分離特點在F338端加入一段GC夾子)、通過PCR將所需16SRNA片段擴增出來， 所得PCR產物為長度在ISObp左右的片段。
引物 GC-F338 5' -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GTAC GGG AGG CAG CAG-3『，R518 :5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG—3，。3. PCR產物的純化具體操作步驟參照PCR產物純化試劑盒說明書(北京博邁得公司產品)。4. DGGE電泳分離PCR產物DGGE電流分離的原理在於，根據基因基序列的不同而將DNA序列分開。在雙鏈的 DNA分子中，A-T鹼基之間有2個氫鍵，而G-C鹼基之間有3個氫鍵連接，因此A-T鹼基對對變性劑的耐受性要低於G-C鹼基對。由於這4種鹼基的組成和排列差異，使不同序列雙鏈DNA分子具有不同的解鏈溫度。當雙鏈DNA片段在含有梯度變性劑(尿素、甲酞胺)的聚丙烯醯胺凝膠中電泳時，解鏈的速度、程度與其序列密切相關，當某一雙鏈DNA序列遷移到變性凝膠的一定位置、並達到解鏈溫度時，即開始部分解鏈，部分解鏈的DNA片段的遷移速度隨解鏈程度的增大而減小，從而使不同序列的DNA片段滯留於凝膠的不同位置，經過染色後凝膠形成為指紋帶譜。理論上，只要選擇的電泳條件(變性劑梯度、電泳時間、電壓等)足夠精細，僅有單一鹼基差異的DNA片段也可能夠被分開。5. DGGE條帶的切膠回收將DGGE凝膠的清晰條帶，用消毒鑷子切下，條帶儘量切得細膩均勻，將切膠條帶置於一個乾淨的EP管中，並加入40 μ L無菌水，4°C、放置12 Mh。6. DGGE條帶的切膠回收後的重新PCR以第5步的無菌水為模板，擴增引物使用F338和R518。引物 F338 5' -TAC GGG AGG CAG CAG-3『，R518 :5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3，。7.重新PCR產物的回收(使用博邁得試劑盒純化)具體操作步驟參照北京博邁得生物公司凝膠回收純化試劑盒說明書。8.第7步回收產物與Rndl8-T載體(Takara)的連接。9.轉化DH5a感受態細胞。10.挑取白色的單菌落，搖菌，提取質粒，PCR檢測。11.陽性樣品送公司測序(測序工作由北京博邁得生物公司完成)。由於對常規的PCR-DGGE常規方法進行了優化，因為其檢測的優勢細菌種數目與實際存在的更接近。三、應用底泥微生物數量對複雜水環境綜合質量進行預報水環境底泥表層(5cm)與亞表層QOcm)底泥中優勢細菌種數比是表徵水環境質量的關鍵因子，並存在如下量化關係。P(bad)/P(medium) = Exp[-2. 987+8. 049X In(surf/sub)]
P(good)/P(medium) = Exp[_0· 944-0. 269X In (surf/sub)]P (medium) = e0 = 1其中，P (bad)= 「水環境綜合質量為差」事件的出現概率，P (good)= 「水環境綜合質量為良」事件的出現概率，POiiedium)= 「水環境綜合質量為中」事件的出現概率。Surf =表層底泥(深5cm)中優勢細菌種數，Sub =亞表層底泥(深20cm)中優勢細菌種數。本發明具有如下優點
1.本申請以最新國家標準一《地表水環境質量標準(GB3838_20(^)》為基礎，既有中國特色，也符合我國國情；並且引入了《城鎮汙水處理廠汙染物排放標準 (GB18918-2002)》相關標準，適用範圍寬，從清潔水體到重度汙染的水環境均可作為參照適用。2.本申請選用的水質理化指標數量及選項並不固定，可根據評判目的、有選擇性地從國家相關標準中選取；計算結果既有定量化的水環境綜合質量指數，也可以根據國家標準計算結果進行定性評判，而且該評判標準還可以隨著國家標準的更新而更新，具有很強的適應性和生命力。3.水環境中雖然微生物種類繁多，但是佔總類群大多數的厭氧種類無法在常規實驗條件下按照傳統模式進行純培養；分子生物手段雖然可以鑑定出微生物種類，但是往往只能對優勢微生物定性鑑定、難於知曉其生態功能；即使是可以純培養的菌種，往往也只能查找到該菌種所在屬、科的生理特徵、生態功能，由於同科/屬菌種之間可能存在的巨大差異，也就難於依據生理特徵或生態功能來評判其所在生境的水環境質量。本申請繞開了菌種純培養、菌種生理特徵或生態功能這些數據溝壑或技術壁壘，直接採用優勢細菌種數作為考查指標，首次成功找到了河流底泥優勢細菌種類與水環境質量之間的量化響應關係， 突破了微觀分子生物學研究與宏觀水環境質量評價之間的傳統鴻溝。


(填寫下面的圖名稱，及把詳細的信息放置有圖名下面。圖 1 基因組提取從左至右 94# 97# 20# 76# 83# 86# 78# 62# 175a 64a 79a 67# 77# I #表示樣點包括表層和亞表層，a表示表層b表示亞表層圖2 基因組PCR 從左至右20# 62# 76#圖 3 液體純化從左至右 39# 123# 20# 35# 62# 64# 76# 79# 83# 86# 94# 97# 175a圖4 DGGE電泳圖譜圖 5 DGGE 後 PCR 從左至右 6 (bl b2 b3 b4 abl ab2 ab3 ab4 ab5 ab6 ab7 ab8 ab9 ablO)64#(la_8a)括號內與DGGE切膠條帶對應，a代表表層b代表亞表層ab表示表層和亞表層共有。圖 6 固體純化從左至右 35# (abl ab2 bl b2 ab3 b3 ab4)62#(bl b2 b3 b4 abl ab2 ab3 ab4 ab5ab6 ab7 ab8 ab9 ablO)括號內與DGGE切膠條帶對應，a代表表層b代表亞表層ab表示表層和亞表層共有。圖7克隆後菌落圖 8 菌落 PCR 從左至右 175#(la_6a)62#(bl b2 b3 b4 abl ab2 ab3 ab4 ab5 ab6 ab7 ab8 ab9abl0)括號內與DGGE切膠條帶對應，a代表表層b代表亞表層ab表示表層和亞表層共有圖9測序圖譜(北京博邁得生物公司)
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明。實施例1
一、根據水質化學指標對某樣點(潮白河62#)水環境綜合質量進行評判
在潮白河北京段，採集水樣並分析TP、TN、NH3-N, Cr、Zn、Cu、Pb、Cd指標如表1所示。
表1湖白河北京段某樣點水質
權利要求
1.應用底泥微生物數量預報複雜水環境綜合質量的方法，包括如下步驟(1)測定水域底泥的表層與亞表層的優勢微生物數量，( 通過下式計算出評判水環境綜合質量的出現概率，P(bad)/P (medium) = Exp[-2. 987+8. 049X In(surf/sub)]， P(good)/P(medium) = Exp[-0. 944-0. 269X In(surf/sub)]， P (medium) = e0 = 1，其中，P(bad)= 「水環境綜合質量為差」事件的出現概率，P(good)= 「水環境綜合質量為良」事件的出現概率，P(medium)= 「水環境綜合質量為中」事件的出現概率，Surf = 表層底泥中優勢細菌種數，Sub =亞表層底泥中優勢細菌種數。
2.根據權利要求1所述的方法，所述表層為深5cm的泥層，所述亞表層為深20cm的泥層。
3.根據權利要求1所述的方法，所述步驟(1)通過PCR-DGGE鑑定底泥表層與亞表層中的優勢微生物的種類來實現。
4.根據權利要求3所述的方法，所述PCR-DGGE的方法步驟如下A、提取底泥中的微生物DNA，B、用採用通用引物對GC-F338和R518，PCR擴增目的片段，所述引物 GC-F338 5' -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GTAC GGG AGG CAG CAG-3『，R518 5' -ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'；C、DGGE電泳分離PCR產物，D、DGGE條帶的切膠回收後重新PCR，所述引物為F338和R518， 所述引物 F338 :5，-TAC GGG AGG CAG CAG-3『，R518 5' -ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'；E、回收二次PCR產物，與表達載體連接，轉化，培養，提取質粒，PCT檢測，所述引物為 Ml3-47 和 RV-M，所述引物 M13-47 5' -CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3『， RV-M 5' -GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC ACA AGG-3『。F、陽性質粒測序，確定所含微生物的種類。
5.根據權利要求4所述的方法，所述表達載體為RiidlS-T載體。
6.根據權利要求4所述的方法，所述轉化所用生物體為DH5α感受態細胞。
7.根據權利要求1所述的方法，所述步驟還包括以水中化學指標評定的水環境綜合質量為參照。
8.根據權利要求7所述的方法，所述水中化學指標評定的水環境綜合質量的方法a、 測定水中化學指標，b、與以《GB3838-2002》V類為基準，計算各樣點對應的各項水質指標與 V類標準值的商，而後將各商加權求均值，令 GX = X/VX其中，GX為各水質指標與《GB3838-2002》V類標準之商，即TP/Vtp、TN/Vtn、NH4_N/Vnh4_n、 Cr/Vcr, · · ·、Pb/V Pb、Cd/Vcd ；VX 為各水質指標對應的((GB3838-2002)) V 類標準； 又令 Gaverage = (GTP+GTNXO. 5+GNH4_NX0. 5+GCr+. . . +GZn+GCu+GPb+GCd)/i其中，i為水質指標數量； C、進而進行評判分級，具體如下GIII/V = (IIITp/VTp+IIITN/VTNX0. 5+III冊4_N/V冊4_ΝΧ0· 5+IIICr/VCr+. · · +IIIzn/Vzn+III Cu /Vcu+ΠΙ Pb /Vpb+III Cd /VJ/i ；GV/V = (VTP/VTP+VTN/VTNX0. 5+V刪/V刪 X0. 5+VCr/VCr+. · · +Vzn/Vzn+Vcu/Vcu+Vpb/Vpb+Vcd/Vcd)/i = 1 ；GB/V = (Btp/Vtp+Btn/VtnX0. 5+B麗4_n/V麗4_nX0. 5+BCr/VCr+. · · +Bzn/Vzn+Bcu/Vcu+Bpb/Vpb+Bcd/Vcd)/i ；其中，B為《GB18918-2002》一級(B)標準，若(Average < GIII/V，水環境綜合質量判為優；若 GIII/V < Gaverage < GV/V，判為良；若 GV/V < Gaverage GB/V，判為差。
全文摘要
本發明的應用底泥微生物數量預報複雜水環境綜合質量的方法屬於水處理領域。本發明通過PCR-DGGE手段鑑定了底泥優勢細菌種類；最終找到了表層、亞表層底泥優勢細菌種類的數量比對水環境綜合質量的量化響應關係，突破了微觀分子生物學研究與宏觀水環境質量評價之間的傳統鴻溝，能適用各類水體、各種汙染程度的複雜水環境綜合質量預報與評判。同進依據我國水環境質量相關國家標準，建立了複雜水環境綜合質量定量/性化評判模式以用於參照，該參照也能獨立預測水環境綜合質量的情況。
文檔編號G01N33/18GK102507885SQ20111029415
公開日2012年6月20日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者單保慶, 靖德兵 申請人:首都師範大學