從口腔上皮細胞分離核酸的製作方法

2023-10-05 08:25:29 4

專利名稱：從口腔上皮細胞分離核酸的製作方法
從口腔上皮細胞分離核酸
交叉引用
根據35 US.C119(e)的規定，本申請要求享有2003年11月12日申請的 美國臨時申請號60/519,103和2004年1月30日申請的美國臨時申請號 60/540,929 (其內^jfc飾弓閱作為參考)的利益。
鵬支持
根據國立衛生研究所裁定的合同號R21-HL71771,本發明在政府支持下 得以完成。自享有本發明的一些權利。 發明領域
本發明涉M口腔上皮細胞分離核酸的方法、用於獲得戶;f^核酸的裝置以
^^f獲得的核酸的應用。
背景技術：
主要的興趣集中在從多種部位和組織獲得RNA。基因鋭領懂日益豐細 作理解疾病發病機理和粒多種疾病和病症(例如癌)的診斷和預後以及其它 應用的工具。
確定從呼吸道獲得的上皮細胞的基因鋭的能力具有重要含義。例如，開 發早期自和診斷技術，以用於確定個體(其已被暴^例如刺激M1霧或香 煙煙霧的環境汙染物)是否已經發展劍市癌或處於發展成肺癌的危險中的能 力。齡呼吸道的上皮細胞(胸腔內和胸腔外氣道)繊暴露於包括香菸煙霧 的環境汙染物，並因此在BW個體中具有遺傳損傷的跡象。檢測這種損傷類型
的能力可指明個體是否患有肺癌或正處於發^市癌的危險中，以及戶;M巿癌
的類型。
肺癌、環銜汙染和特別是吸菸，依舊是重要的鶴問題。吸菸魏鵬過 90%的肺癌的原因，而僅僅15%的吸菸者實際上^^|總。 一旦己經賺， 肺癌幾乎是普，死的，5 ，活率僅僅10-15%。在美國肺癌導致死亡數(一 年約160，000)鵬其次最常見的四種癌類型的組合。另外，在美國2500 ^J見 在的吸菸者和2500萬曾經的吸菸者處於發展劍市癌的危險中。肺癌的一個最大問題是早期檢測。在治療B鶘中，^^f周知對於處於高危險中的個體的早期
檢湖樹於存活是極其重要的。在處娜癌中，非侵入性(non4nvasive)湖賦的開 發是很有幫助的。
因此，開糊TiTO個體肺癌危險(包括患有鵬和將來^^的危
險)的簡單的非侵入性i ttr具具有重要的意義，戶脫iTOf咖鵬鑑定在疾
病進展的多種狀態具有鋭變化的新己基因。然而，目前這翻究利用膽的 大支氣管(肺內氣道)刷取的上皮細胞。戶脫的方^~般包括支氣管鏡檢査法， 皿病人具有一定危險的侵入性方法。理^k是i^從口腔上皮細胞分離RNA
的方法，以)^開究延伸至鵬外氣道。如果人們i頓從口腔獲得的RNA，這可 充分M^對受微的危險，並且在門診病A^大的調査瞎況中可潛在地輕鬆 得至脾品。然而，如以下討論，口腔環境不容易獲得完整RNA。
不幸地是，不iM;侵入性活組織檢查手術沒有人可以從口腔上皮細胞(也
稱為口腔黏膜)獲得高質量的RNA。當將來自口腔中口腔黏膜的棉拭和刮屑 用於獲得上皮細胞的DNA以用 傳研究時12，可從切除的組織和口腔上皮 的活組織檢查樣品得到RNA。然後這可用於多種病狀態以測量基因,3，4。
從口腔上皮細胞非侵入性獲得RNA的一個主要障礙是唾液，其含有, RNA的^RNA銜5。從口腔刮取細胞可誘導產生唾液並釋^^f述的RNA酶 的事實，使得該障礙更加鋭。財卜，口腔組織的^^且織檢査包含平滑脂口其
它非上皮細胞。含有戶;M混合細胞群體的樣品不合乎所有研究的需要。例如，
平滑鵬啡上飾胞很可能不受環境汙鵬(例如香爝煙霧)的影響。
因此，理^4是具有可獲得完整口腔上皮細胞^l取RNA的方法和錢。
分離的口腔RNA樣品可用於廣泛的應用，包括研究以測量基因表達。 發明
我們己開發了新的刮^g以從受蹄口腔,細胞，特別是口腔黏膜上 皮細胞，這使得可分離包括RNA和DNA的核酸。《頓這種il^h皮細胞的 刮取^g,我們還開發出用於從口腔內部獲得細胞(優選口腔黏膜細胞)核酸 糊M受入性方法。我們職明口腔暴露於汙鵬(例如香菸煙霧)改變了口腔 襯裡的上皮細胞中某，因的,。本發明方法還提供了基於核酸的工具以評 價與暴露於氣道汙^W關的肺疾病危險。核酸工具包括分析基因,譜以及 分析DNA甲靴模式。因此，本發明,刮取錢，其具有近頂啲手柄端、遠側的lB^端和手柄
端和收集端之間的連接部分；其中連接部分使得手柄端和麟端可任選地彼此 分開；且其中收集端還包括外周緣和凹部，其中戶臓麟部分的至少一些外周 緣是鋸齒狀的，以允許刮取生物樣品，並且凹部允許l^^刮取的生物樣品。優 選地，在寬度，接部分與其兩側的手柄端和,繊常:1^的。
一個,的刮取^a具有勺狀的收集端。在另一 方案中，刮取裝置是
塑料的。在另一實施方案中，刮取CT是TO的。
在一個優選實旨案中，刮取裝置的連接部^a括穿孔。在另一實施方案
中，連接部分同與其接觸的手柄端和收集端不一樣厚。
還在一^H^^i方案中，刮取，以及其中所W^型從大約手柄，端 到收集te端的微約是3.5-6英寸。例如，4.0英寸、4.5英寸、5.0英寸.在 一個優選的刮取裝置中，收集端長度約是1-2英寸，例如L25英寸。
將收集端的長度和寬度設計成允許,^合儲存容器。在一個優選實施 方案中，儲存容器含有iM附著於儲存容器的蓋子。,地，將儲存容器和收
集端設計成收集端極好;ttyi合收集容器。 一般，也可將一^!型的溶液加入儲
存容器以穩定保存,的生t)^品。
本發明的一個實施方案,了生物樣品的非侵入性分離法，其中樣品包含 來自口腔黏膜的上皮細胞。
在一個優選實施方案中，本發明的刮取裝置用於分離含有核酸的生物樣
品。im是RNA或DNA。在一個實施方案中，核酸是RNA。在另一實施方 案中，核酸是DNA。雌地，從口腔黏膜的上皮細胞分離核酸，例如RNA。
本發明的一個雌實 案繊從^^口腔1 ^酸樣品的非侵入性方 法，包括用刮取裝置從受微口腔分離細胞、將刮取的細胞轉入含有核酸穩定 溶液(艮,制核酸酶活性的溶液)的儲存容器中、並隨後從保存在核酸穩定溶 液中的刮取的細胞樣品中提取核酸。
在一個 方案中，從樣品提取核^t前，將核酸穩定溶液中的刮取的細 胞樣品保存於-2(TC。在另一實施方案中，將樣品igit到中央實驗室以用於分析。
在一個雌實施方案中，核麟腿，且穩定溶液是滅活薩斷口穩定 RNA的7K溶液，例如"RNALater"溶液(購自Qiagen， Valencia, CA)。可<柳育縱樣品提取完整RNA的樹可方法。一^M^^^法是^ffi TRIzol 試劑(購自Invitrogen， Carisbad， CA)。
在一^K^實施方案中，分離約2(XW000 ng總RNA。在另一實施方案 中，分離約1000ng。
本發明另一優選實施方案提供了試劑盒，其含有收集生物樣品的刮取裝 置、儲存容器和核酸穩定溶液。
本發明另一雌的實 案麟rna ti^統，戶;M^統包括含有具有
近側的手柄端、包含鋸齒微卜周緣的遠側ij^^端和手柄端和收集端之間的連接 部分的刮取裝置，其中連接部分允i恃柄端和收集端可任M彼此分開；以及 包含RNA穩定溶液的儲存容器。 ^ife，儲存容器含有蓋子。甚至更,地, 蓋子附著於儲存容器。
本發明還，用於從口腔黏膜il^h皮細胞的試劑盒，包^y取^s和含 有RNA穩定溶液的儲存容器。在一，選的實施方案中，RNA穩定溶液是 RNALater。
本發明一4^選的實 案,收,品的方法，其包括如下步驟■ 具有近側的手柄端、包含鋸齒微卜周緣的遠側收集端和手柄端和麟端之間的 連接部分的刮取裝置；4!^包含RNA穩定溶液的儲存容器；用,端的鋸齒 微卜周緣從受微口腔的口腔黏膜刮取上皮細胞；將刮取的上皮細胞收驗刮 取裝置的收集端；將舌陬的上皮細胞轉入儲存容器；以及旋轉刮取體手柄以
使得^a的手柄端在連接部分與收集端分開，以至於儲存，包含RNA儲存
液、刮取的樣品以及刮取體的iB^端。
本發明^l^用於收皿酸樣品的刮取裝置，包^5側的手柄端；遠側的 ,端；和手柄端和,端之間的連接部分；其中，在寬度上連接部分與其兩 側的手柄端和收集端錢續的且刻痕(score)的，例如Mil穿孔；或雜接部 分比其兩側的手柄端和收集端薄；並且連接部分使得手柄端和收集端可任選地 彼此分開；且其中收集端還包含外周緣和凹部，其中戶脫的收集部分的至少一 些外周緣是鋸齒狀的，以允許刮取核酸樣品，且凹部允許lB^刮取的核酸樣品。
用於獲得分離自口腔上皮細胞的核酸的非侵入性方法，包括將從^# 口腔非侵入性分離的細胞轉入可使核酸酶失活的核酸穩定溶液中，並從分離的 細胞提取目的核酸，以獲得分離的核酸樣品。在一個雌的實施方案中，核酸是RNA。 i^M,用本發明的刮取縫M刮職口腔非侵入性分離細胞。
核酸，雌是RNA，可在最高室溫且包括室溫的鵬下以最低,穩定 保存最多三天，雌一至兩天。鵬趣氏，RNA保荊尋越長。在用於從口腔 上皮細胞獲得分離的核酸糊N1入性方法的一個雌實施方案中，在從樣品提 取RNA之前，將RNA穩定溶液中的刮取的細胞樣品保存於-15'C至-25'C 。優 選地，RNA穩定溶液是RNA穩定試劑RNALatero
我們己鄉5^現口腔粘MJ:皮細胞中基因^i可用作為肺細胞的狀態(或狀 況)的暢。這允許人們鑑定患有或處於^^^病危險中的個體。
在一個實施方案中，從口腔上皮細胞分離的RNA可用於基因^iii^析。 在另一實施方案中，從口腔上皮細胞分離的DNA可用於鑑定其中的變化，例 如3131 DNA甲,分析的甲m。
艦分析與不同病症(例如肺癌期)有關的基因鋭的口腔上飾胞的特 徵，本發明的一個實 案皿鑑定患有或處於，病症(例如肺癌)危險的 吸菸者。
因此，本發明一個實肺案麟用於檢測口腔粘ah皮細胞樣品中目的靶
基因皿的方法，其包括根據戶;M從口腔粘^h皮細胞分離核酸樣品；將步 戰a)分離的核酸樣品^至少一種可特異雜交目的,因的核酸探針；和在核 酸樣品中檢測戶腿目的鵬因的械。在一個實 案中，在實施步iKb)之前， 將目的,因附著在固相上。,核酸是RNA或DNA。
在一個,實 案中，目的基因在患有肺癌的^^與未患有肺癌的受 試者中^異M的。例如，目的基因在患有肺癌的受試者中泰逸，而在不患 有肺癌的^#中不縱。tmt&，人們檢査至少2個基因，更i^M少5個 目的基因。
我們以前發現約208個基因在患有肺癌的吸菸者與未患有l鵬的吸菸者的 氣道中^異,的，其包括肺癌診斷性氣道轉鬆且(lranscriptome)。類條也， 本發明的方、M2H^用於鑑定差異表達的基因(包括肺癌診斷性口,錄組) 的方法，所述基因的,模式可用於如文中所述的預後、診斷和治療應用。包 含診斷性口^^組的基因可在口腔上皮細胞中表達，並御市癌個體和M^個 體之間具有顯著不同的皿模式。肺癌診斷性口l^錄組也稱作吸菸者的差異 口腔轉錄組。所述的肺癌診斷性口,錄組的表達模式可用於肺病預後、肺病診斷和定期篩查相同個體以，是否個體已暴露T^險的氣道汙染物，例如可
改變^/^的^ii^的f^煙煙霧中。
本發明的一個鄉方案麟鑑另瞎因，該基因包括不同的口麟影且。一 個有用的口腔轉影且包含在支氣管中魏且也在口腔中鋭的基因，其中在支 氣管中的，受到汙染物(例如香菸煙霧)的差異影響。另一有用的轉錄組是 肺癌診斷性口，錄組。 一種鑑定包含肺癌診斷性口腔轉錄組的基因的方法是 首先鑑定口腔轉錄組(如上所述)，然後確定這些基因的哪一些在患有肺癌的
個體和在自個體的口腔中;W異^i的。
在一個實施方案中，我們現己鑑定了包含口麟影且的約166個基因，即
在支氣管中^iia也在口腔中鋭的基因，其中在支氣管中基因的魏^ij香
煙煙霧的影響，由下列基因組成ABCC1、 ABHD2、 AF333388.1、 AGTPBP1、 AIP1、 AKR1B10AKR1C1、 AKR1C2、 AL117536.1、 AL353759、 ALDH3A1、 ANXA3、 APLP2、 ARHE、 ARL1、 ARPC3、 ASM3A、 B4GALT5、 BECN1、 Clorf8、 C20orfl 11 、 C5orf5、 C6orf80、 CA12、 CABYR、 CANX、 CAP1 、 CCNG2、 CEACAM5、 CEACAM6、 CEM、 CHP、 CHST4、 CKB、 CLDN10、 CNK1、 COPB2、 COX5A、 CPNE3、 CRYM、 CSTA、 CTGF、 CYP1B1 、 CYP2A6、 CYP4F3、 DEFB1 、 DIAPH2、 DKFZP434J214、 DKFZP564K0822、 DKFZP566E144、 DSCR5、 DSG2、 EPAS1、 EPOR、 FKBP1A、 FLJ10134、 FU13052、 FLJ130521、 FLJ20359、 FM02、 FTH1 、 GALNT1 、 GALNB 、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GGA1 、 GHTTM、 GMDS、 GNE、 GPX2、 GRP58、 GSN、 GSTM3、 GSTM5、 GUK1、 HIG1、 HIST1H2BK、 HN1 、 HPGD、 HRIHFB2122、 HSPA2、 IDH1 、 IDS、 MPA2、 r認A、 JTB、 KATNB1、 KDELR3、 KIAA0397、 KIAA0905、 KLF4、 KRT14、 KRT15、 LAMP2、 LOC5腦、LOC57228、 LOC92482、 LOC92689、 LYPLA1、 MAFG、 函、MGC4342、 MGLL、固E、畫F、固G、 MT1H、固X、 MT2A、 NCOR2、 NKX3-1、 NQOl、 NUDT4、 ORLl、 P4HB、 PEX14、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 PSMB5、 PSMD14、 PTP4A1 、 PTS、 RAB11A、 RAB2、 RAB7、 RAP1GA1 、 RNP24、 RPN2、 S100A10、 S100A14、 S100P、 SCP2、 SDR1、 SHARP1、 SLC17A5、 SLC35A3、 SORD、 SPINT2、 SQSTM1、 SRPUL、 SSR4、 TACSTD2、 TALDOl、 TARS、 TCF7L1 、 TIAM1 、 TJP2、 TLE1 、 TM4SF1 、 TM4SF13、 TMP21 、 TNFSF13、 TNS、 TRA1、 TRIM16、 TXN、 TXNDC5、 TXNL、 TXNRD1、 UBE2J1、 UFD1L、UGT1A10、 YF13H12以及ZNF463。這些符號f^HUGO鑑定符號。

圖11列 出對應於這錢因的各自轉錄物的詳細資料，包跪雖因在吸菸者和非吸菸 者之間相比較的^i比率(正在吸菸者/從不吸菸者比率)以及p值，這顯示了
這,因在吸菸者和一頓煙者中^^異的顯著性(正在吸:)@#/從不吸菸者p
值)。圖11也顯示出現在包括HUGO、 GenBank和GO的i^庫中的這， 因的多種基因符號。也顯示了這些轉錄物的A^metrix cDNA晶片定位。在 一個實施方案中，對這，因在患有肺癌的個體和，個體之間的^S行比
較，以便鑑定形鵬癌診斷性口i^^a的基因。
在一個優選的實施方案中，另一口腔轉錄組由用它們的人類基因組組織 (HUGO)鑑定符號所鑑定的下列基因組成AGTPBP1、 AKR1C1、 AKR1C2、 ALDH3A1、 ANXA3、 CA12、 CEACAM6、 CLDNIO、 CYP1B1、 DPYSL3、 FLJ13052、 FTH1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GMDS、 GPX2、 腦、HSPA2、 MAFG、 ME1、 MGLL、 MMPIO、函F、廳G、畫X、 NQOl、 NUDT4、 PGD、 PRDX1 、 PRDX4、 RAB11A、 S100A10、 SDR1 、 SRPUL、 TALDOl 、 TARS、 TCF-3、 TRA1、 TRIM16、 TXN以及TXNRD1。圖12列出對應於這 ，因的所鑑定轉錄物各自的詳細資料，包皿些基因在吸菸者和非吸菸者之 間相比較的鋭比率(吸菸者/萄艦煙者魏比率)以及p值，M示了這離 因在吸菸者和一敞煙者中，差異的顯著性(吸菸者/非吸菸者p值)。在一個 雌實施方案中，比較這蝶因在患有肺癌的個體和賺個體之間的表達，以
鑑定產創市癌診斷性口腔轉影且的基因。然後w^診斷性口j^t^a可用於 篩選患有肺癌或處於，劍ffi危險的個體。
本發明的一個，方案$| 定個體是否處於^^|市病的增加危險的方
法，其包括從暴露T^道汙鄉或處於暴露於氣道汙鵬的危險中的個體的 口艦集生物樣品；並分析口麟影且基因中的至少一個基因、雌兩個基因、 雌5-10個基因、雌l(MOO個基因是否出J鵬傳變化，其中與對照個體組 中至少一個相同基因相比，在口腔轉錄組基因的一個或多個中的遺傳變化的存
在，可指示個皿有皿劍市病的增加危險。在一個實施方案中，遺傳變化是 基因的DNA甲基化模式的偏差或基因的表達模式的偏差。在一4^ 方 案中，空氣汙M/是來自香菸或雪茄的煙霧，JJ市病慰市癌。^ife，肺癌是 腺癌、皿細胞癌、小細胞癌、大細胞癌，劍市的良性贅生物。在一個雌實施方案中，個體是吸鵬，並^iA們檢查至d^佛自於肺 癌診斷性口腔轉錄組基因的基因的表達，其中與^t應的吸菸者對照組中相 比，在吸菸者中至少一個基因的更f綠達，是，市癌的危險增加的指示。在
另一,實施方案中，人們檢查口mt影且的至少三個基因的^。更^m, 人們檢查至少五個基因的鋭。
在一個,實施方案中，個體是吸菸者，並且人們檢査至少一，自於診 斷性肺癌口腔轉錄組基因的基因的表達，其中與在對應的吸菸者對照組中相 比，在吸菸者中至少一個基因的更高表達，是，市癌的危險增加的指示。在 另一優選實施方案中，人們檢査診斷性肺癌口腔轉錄組的至少三個基因的表 達。更^&，人們檢査至少五個基因的^。
在一個優選實施方案中，人們檢査編碼醛脫氫酶(ALDH3A1)、 NADPH (NQOl)和CEACAM5(CEACAM5)^ii的基因o
在另一優選實施方案中，個體是吸菸者，並且人們檢查至少一個選自於編 碼原癌基因的診斷'卿市癌口,錄組的基因的表達，其中與在對應的吸菸者對 照組中相比，在吸菸者中至少一個基因的更高或更低表達，是發廁市癌的危險 增加的指示。在一^^實施方案中，在自原癌基因的M口,錄組中至
少一個基因的更高^mt^ii是^Wf癌的危,加的矛標。
在另一雌實施方案中，個體是吸菸者，並且人們檢査至少一個選自於編 碼腫瘤抑制基因的診斷倒市癌口腔緣組的基因的鋭，其中與^t應的吸菸 者對照組中相比，在吸菸者中至少一個基因的更高或更低表達，是，市癌的
危險噌加的指示。在一個實施方案中，在編碼腫瘤抑制基因的^H會斷糊市癌 口腔轉影且中至少一個基因的更高lS^i^i是^^癌的危險增加的f際。 本發明也,診斷吸菸者或一艦煙者患肺病的素因的方法，其包括分析一
種或多種選自下列的基因的表達模式ABCC1、 ABHD2、 AF333388.1 、 AGTPBP1 、 AIP1、 AKR1B10AKR1C1、 AKR1C2、 AL117536.1、 AL353759、 ALDH3A1、 ANXA3、 APLP2、 ARHE、 ARL1、 ARPC3、 ASM3A、 B4GALT5、 BECN1、 Clorf8、 C20orfl11、 C5orf6、 C6orf80、 CA12、 CABYR、 CANX、 CAP1、 CCNG2、 CEACAM5、 CEACAM6、 CEI>6、 CHP、 CHST4、 CKB、 CLDN10、 CNK1、 COPB2、 COX5A、 CPNE3、 CRYM、 CSTA、 CTGF、 CYP1B1、 CYP2A6、 CYP4F3 、 DEFB1 、 DIAPH2 、 DKFZP434J214 、 DKFZP564K0822 、DKFZP566E144、 DSCR5、 DSG2、 EPAS1、 EPOR、 FKBP1A、 FLJ10134、 FLJ13052、 FU130521 、 FLJ20359、 FM02、 FIH1 、 GALNT1 、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GGA1、 GHTTM、 GMDS、 GNE、 GPX2、 GRP58、 GSN、 GSTM3、 GSTM5、 GUK1、 MG1、 HIST1H2BK、 ■、 HPGD、 HRIHFB2122、 HSPA2、 IDH1 、 IDS、 IMPA2、 ITM2A、 JTB、 KATNB1 、 KDELR3、 KIAA0397、 KIAA0905、 KLF4、 KRT14、 KRT15、 LAMP2、 LOC5脳、LOC57228、 LOC92482、 LOC92689、 LYPLA1、 MAFG、 ME1、 MGC4342、 MGLL、固E、 MT1F、 MT1G、 MT1H、 MT1X、 MT2A、 NCOR2、 NKX3-1、 NQOl、 NUDT4、 ORLl、 P4HB、 PEX14、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 PSMB5、 PSMD14、 PTP4A1、 PTS、 RAB11A、 RAB2、 RAB7、 RAP1GA1、 RNP24、 RPN2、 S100A10、 S100A14、 S證、SCP2、 SDR1、 SHARP1、 SLC17A5、 SLC35A3、 SORD、 SPINT2、 SQSTM1、 SRPUL、 SSR4、 TACSTD2、 TALDOl、 TARS、 TCF7L1、 TTAM1、 TJP2、 TLE1、 TM4SF1、 TM4SF13、 TMP21、 TNFSF13、 TNS、 TRA1、 TRM16、 TXN、 TXNDC5、 TXNL、 TXNRD1、 UBE2J1、 UFD1L、 UGT1A10、 YF13H12 以及ZNF463。在一個雌實施方案中，一種或多種選自下列的基因的鋭模 式AGTPBP1、 AKR1C1、 AKR1C2、 ALDH3A1、 ANXA3、 CA12、 CEACAM6、 CLDN10、 CYP1B1、 DPYSL3、 FLJ13052、 FTH1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GMDS、 GPX2、 HN1、 HSPA2、 MAFG、 ME1、 MGLL、 MMP10、 MT1F、固G、固X、 NQOl、 NUDT4、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 RAB11A、 S100A10、 SDR1、 SRPUL、 TALDOl、 TARS、 TCF-3、 TRA1、 TRIM16以 及TXN。 i^地，在從吸菸者或非吸菸者釆集的生物樣品中分析一種或多種 基因的,模式，其中與對照個體組中的這些基因的,模式相比， 一種或多
種這錢因的趨異魏模式是個體患肺病的素因的指示。在一^H^i實施方案
中，肺病劍市癌，包括腺癌、鱗狀細胞癌、小細胞癌、大細胞癌以刻巿的良性 贅生物。
在一個實施方案中，本發明,用於篩選^者患肺病素因的方法，其中
用於診斷的生物樣品是核酸樣品。在一個雌實施方案中，其中核酸是RNA 或DNA。皿地，樣品是RNAo在另一，實施方案中，使用核酸陣列進行 分析。在另一雌實施方案中，用定量實時PCR頓譜法進行分析。 附圖簡述圖1是本發明的一個鄉方案圖，包括具有可拆開的手柄端和鋸齒狀收集
端以及儲存容器的完整刮取^s。
圖2圖解了本發明的實施方案，其中顯示從刮取裝置的手柄分開的、含有 刮取的生物樣品的收集部分，和含有核酸穩定溶液的儲存織。
圖3圖解了本發明的實施方案，包括拆開的刮取裝置，其中手柄在連接部
分與收集端分開，並且麟端SA含有核酸穩定溶液的儲存容器中。
圖4圖解了本發明具有一，齒狀，的刮^S,端的選擇性實施方案。
圖5圖解了本發明的幾1^擇性實施方案，包括用於il^端的不同形伏。
圖6顯示在1%瓊月離RNA變imi:^U:皮細胞系(泳道1)和口腔黏膜 刮屑(泳道2)提取的RNA。顯示了28srRNA (上面的箭標)和18srRNA (下 面的箭標)條帶。這i，;iM尋的最好實例中的一個。多數刮屑產^C少的RNA 用於M^可顯示一些RNA降解的m。該部分,不會繊iM3i實時PCR 頗譜法測量RNA的能力。
圖7顯示使用本發明的方法，在得到的口腔黏膜細胞中細胞角蛋白 (pancytokeratin)的免,胞化學染色的結果。所有細胞具有上皮形態學，且 對多種，的抗體,為陽性(褐色)。
圖8A-B顯示在吸菸者和非吸菸者中選擇的口腔粘Rh皮細BIS因的, 水平。在圖8A中，Mil實時QRT-PCR測量口腔黏膜上皮基因,。顯示了3 個從未吸菸者和2個正在吸菸者對於#^基因的平均(+/-SD)^i倍數變化(只 對一個正在吸菸者樣品進行測量NQOl)。倍數變化指與一個非吸菸者樣品相 比，在樣品組中基因的平均皿水平比率。對於旨樣品一式兩，行所有實 時PCR試驗。在圖犯中，ita競靴PCR和MALDI TOF質i普法測量口腔 黏膜上皮基因,。將^ifcK平對總RNA濃度(10-7 P M/P g總RNA)進行 標準化。顯示了 7個絲吸菸者和10個正在吸菸者對針基因的平均(+/- SD) 袞達。在正在吸菸者中，在ALDH3A1和NQ01的基因泰逸中存，著地增加 (p〈.05)。
圖9顯示氣道和口腔中幾個基因,的相互關係。數據顯示在從未吸菸的 人("從未吸菸者")和正在吸菸者中三個基因(ALDH3A1 、 CEACAM5和NQOl) 的倍數變化。圖中比較了兩種基因,檢測技術質譜法和基因P車列。圖10闡明了肺癌呈現的三個主要問題。儘管85%的月鵬發現在現在或以 前吸菸者中， <職有15%的吸鵬^^鵬。第一個爭論問題是鑑定具有發 展 癌的易感性的那旨體，,早期診斷和fM起決定作用。當癌仍然是 高度局部化時，可診斷15%的肺癌；艦於這些病人，5特活率是50%。然 而，對於診斷具有遠側癌的B鵬病人中的50%, 5特活率低於5%。因此， 早期診,決定作用。
圖11顯示在支氣管中敬受香燭煙霧影響的基因列表。這蝶因也在口 腔上皮細胞中,。
圖12顯示圖11中所示基因的亞型，雜支氣管中的^iii要受香菸煙霧 的影響。這錢因也在口腔上皮細胞中鋭。
發明詳述
我們現已發5鵬於從口腔內部的細胞獲得核酸糊一侵入性方法。我們也發 明了用於收集生物樣品的刮取裝置，和用該刮取^S從口腔黏膜上皮細胞獲得 核酸糊瞎入性方法。本發明的方馳H^於核酸的工具，以i憤與暴露於 氣道汙 有關的肺病危險。核酸工具包括基因表達譜的分析以及DNA甲基 化模式的分析。
我們也顯示了使口腔暴露於例如香菸鵬的汙 )#改變在口腔襯裡的上 皮細胞中某難因的敏。例如，肺癌涉及從正常到惡化前再到癌的組織病理 學進展和肝鵬。肺腫瘤的基因魏陣列已鄉2ffi於表徵肺癌的鋭譜，和用 於顯示從非惡性的肺組織到肺癌的^ 變化的進展。然而，為了自和早期診 斷目的，/揚獲得樣品是不可行的。因此，本發明第一次鄉從口腔(氣道最 ,的部位)獲得細胞的方法，以在個體中鑑定上皮基因^ii模式。
確定哪旨#^他們的氣^1±皮細胞中存在^^變化和這^變化如何涉及 肺病(例如惡化前和惡性變化)的能力，是用於確定危險和診斷肺病(例如處 於治療非常有效的時期的癌)的顯著雌，因而斷氏了肺癌的死亡率和發病率。 本發明允許從口腔黏膜刮屑中獲得氣^±皮細胞的簡易性，顯示該方法具有廣 泛的臨,用性並在標準臨床篩選處於發展鄉市病危險的大量受試者中是有用 的工具。
在一個，方案中，從口腔上皮細胞分離的RNA可用於基因，i紛析。 在另一實施方案中，從口腔上皮細胞分離的DNA可用於DNA甲基化分析。M5i分析與肺癌不同時期有關的口腔粘Jii:皮細胞的基因表達譜，本發明 的一個^方案,鑑定患有或處於^M^械危險的吸菸者的方法。 刮取體
刮取^M允許人們從允i^離核酸(包括RNA和DNA)的受試者口腔 中非侵入性收集細胞。該工具具有允許從口腔黏膜麟大量高質量核酸(包括 RNA)的兩，徵可刮下幾層上皮細胞的精細的鋸齒狀，，禾口在收集端中 可收集刮取的細胞的凹表面(或凹部)。
現在參考類似參考數對1^類似元件的附圖，圖1圖解本發明的示範性實 施方案，其包括具有手柄和鋸齒狀^端以及儲存容器的^刮^置。刮取 ^S具有近側的手柄端10、遠側的收集端14和位於手柄端10和iB^端14之 間的連接部分12;其中連接部分12在寬度上與其兩側的手柄端10和ii^^端14 通常;13^續的。連接部分12允i恃柄端10和ij^^端14任自m分開。收 集端14還包括外周緣16和凹部8，其中至少一些外周緣16是鋸齒狀的，以允 許舌陬生物樣品，並且凹部8允許麟刮取的生鵬品。該實驗案中的儲存 容器18具有ilil^頭20附著至U儲存，18的蓋子22。
圖2圖解如圖1例證的本發明的實施方案，其中手柄端10已會縱lB^端 14拆開。艦可^g26和28拆開的穿子L^連接端刻痕，可發生拆幵。儲存 容器18含有核酸穩定溶液34。
圖3圖解如圖1和2例證的本發明的，方案，其中刮取^g被拆開，手 柄在連接部分從收集端分離，並且收集端置入含有核酸穩定溶液的儲存容器 中。從麟端14拆開手柄端10。將刮取體的麟端14 ^A含有核酸穩定溶 液34和含有生物樣品32的儲存容器18中。在該實驗案中，儲存鄉18也 有蓋子22和將蓋子22連接到儲存容器18的接頭20。
如圖1-3戶標，一^HM的實施方案鵬塑料的或一些其它聚合物工具， 其具有可刮下幾層上皮細胞的鋸齒狀纖和收穀陛細胞的彎曲表面。在該實
施方案中，標準塑料工具具有鋸齒^i^的凹面勺TO^ (例如5/16英寸寬和 1 6/16英寸長)和3英寸的手柄，其中當含有TO的細胞的刮取Xi^i入儲 存織(例如2ml微量離心管(microfbgetube))時該手,以被斷開。
收集端^l可部分的外周緣可為鋸齒狀。如圖1-3所述，在一個實施方案中， 使收集端的全部外周緣成鋸齒狀。然而，本發明包括其它實施方案，其中使不至廿鄉外周緣成鋸齒狀。例如，圖4圖解刮取體收集端14外周緣40的一面 (50%)為鋸齒狀的本發明選 實施方案。
刮取裝置的收集端可具有任意形狀。一^HM的刮取^S具有勺狀的, 端。圖5圖解了幾個實施方案，它們中頓具有M3i接部分52與收集端54 連接的手柄端50，其中1|^^端具有鋸齒彬卜周緣560
本發明的刮取裝置由可允許手柄端和收集iWii^接部^l行可拆開的連
接的任意材料製成。在一個,實施方案中，刮取^g是塑料的。
連接部分具有可允i^^鵬拆開手柄端和收集端的任意設計或結構。在一
個雌實施方案中，刮取體的連接部他括穿孔。在該實施方案中，當裝置
手柄端繞軸向後和向前旋轉時，收集端從手柄的穿孔部位被拆開。在另一實施
方案中，連接部分比鵬,手柄端和麟端薄。
刮取裝置可以是允許其用於收集樣品的任意大小。在一個優選實施方案
中，刮取體以及本文所有翅從大約手柄^5端到麟te端的長度約是3.5
至6英寸，例如4.5英寸。在一^HM的刮取縫中，麟端以及本文所有變
型的長度約是l-2英寸，例如約是L25英寸。
將^a,端的長度和寬度設計為可允許收集^s合儲存容器。在一個優
選實施方案中，儲存容器含有蓋子，雌其附軒儲存容器上。
在另一實施方案中，刮取裝置是已被切成一半的移液管尖頭，以產生用於 刮取口腔表面以ll^細胞的彎曲表面。
本發明的刮取^a可用於分離和收集任意目的樣品。在一^HM實施方案 中，樣品是生物樣品。在特別雌的實施方案中，樣品是來自口腔黏膜的大量 上皮細胞。
核酸樣品的收集和儲存
本發明麟從^#口腔收餓酸樣品的非侵入性方法，包括用刮取縫 從受i錄口腔分離細胞、將舌陬的細胞轉入含有核酸穩定溶液(即可抑制核酸 酶活性的溶液)的儲存容器中、以及在核酸穩定溶液中從刮取的細胞樣品提取 核酸。此後，儲存樣品1S用於分析。
使用刮取^g從^者口腔iB^樣品。用柔和壓力，將鋸齒狀ii^(J取面
頰內部的口腔黏膜，例如四至十次，並立即將麟的細胞臥核酸穩定溶液中，
例如Sil將，收集端置入儲存容器。在一個皿實施方案中，本發明的刮取裝置用.於分離含有核酸的生物樣
品。，是RNA或DNA。在一個實施方案中，核酸是RNA。在另一實施方 案中，核酸是DNA。然後^fi存的樣品送去分析。
在一個 方案中，可將核酸穩定溶液中刮取的細胞樣品保存於從最高為 且包含室溫(約22'C)至IJ-30'C的任奮離下。鵬越低，可越^fe穩定保存 樣品。在從樣品中提取核酸之前，繊雌是-5'C至-30'C,更雌是-15°(:至-2CTC，還更優選是-2(TC。在另一實施方案中，在從樣品提取核酸之前，樣品 可在4'C保存24^96小時。甚至更^t是24小時。
在特別雌的實施方案中，抓樣品提取核酸之前，核酸穩定溶液中的刮 取的細胞樣品可在室溫保存24至72小時。這樣將樣品從提取位點送往用於分 析的中央場所。
將本發明刮取的細胞樣品轉入適於儲存樣品中含有的核酸的任意儲存容 器。戶脫的容器是本領域公知的，並可從多種來源得到。在一^H^實施方案 中，儲存容器是小管，例如便於允許進一步處理樣品的微量離心管。例如，具 有約1.5-2毫升體積的塑料管。在一個雌實施方案中， 一旦收集端從其手柄 端拆下，儲存容器就具有容納刮取^S收集端的大小和形狀。甚至更^i也， 儲存容器具有蓋子，並且在刮取錢收集端體入容器中後，可關閉蓋子。優 選儲存容器蓋子附著於儲存鄉。
雌儲存容器含有適於樣品轉移和儲存的溶液，以允i條存目的核酸。優 選地，穩定溶液滅活可降解目的核酸的任何核酸酶。如果核酸是RNA,則穩 定溶液滅活RNA酶。如果核酸是DNA,則穩定溶液滅活DNA酶o
在一^H^實施方案中，核酸是RNA並且穩定溶液在5 ^H中內滅活至少 75%的RNA酶活性，,在一併中內滅活至少75%的RNA酶活性。還更優 ^i也，在^1A RNA的4 ，內穩定溶液滅活至少85%的RNA酶活性。甚至 更tmtlk,在^A RNA的一，內穩定溶液滅活至少85%的RNA酶活性。 更iMife，在^tA RNA的兩，內穩定溶液滅活至少90%的RNA酶活性， 還更，在、;tA RNA的一^H中內穩定溶液滅活至少90%的RNA酶活性。還 更^i也，在^A兩辦中內穩定溶液滅活至少95%的RNA酶活性。甚至更優 選在i!A—^l中內穩定溶液滅活至少95%的RNA酶活性。
允許回收完整總RNA的倒可RNA穩定餘艦用於儲存麟的樣品。在一個優選實施方案中，RNA穩定溶液是購自於Qiagen， Valencia, CA的 "RNALater"穩定試劑。
在一個，實施方案中，本發明方法可用於分離大量的分離出的口腔上皮 細胞RNA。 ^fe,單個分離a^，克-微克量的RNAo在一^i^實施 方案中，分離約200-200Qng總RNA。在一^H^實施方案中,分離了約1000 ng。
本發明中分離的口腔上皮細胞RNA可用於需要具有fM完整總RNA的 樹可方法離程。
Miffi術人員公知的樹可標準方法可分離從口腔上皮細胞樣品中得至啲核 酸0在S咖brook等人的Afo/ecw/lar歷o/oigy:爿/akrafcvy v4p戶ac/j, Cold Spring Harbor, N. Y 1989、 Ausubel，等人的Cwnnen^wtoco/j f》M /ecw^歷o/f^, Greene Publishing, Y, 1995中描述了 DNA和RNA分離的標準:^法，以及本文中經 常用到的重組核酸方法。
Mii導i^M少一種穩定溶液的組分中分離核酸的樹可適宜技術，可從穩
定溶液回收或提取目的核酸。^f柳已知方法，人們也可鑑定核麟自於哪些細 胞。艦用有機試劑提取法，氯臓取法，酚-氯^$1取法，M31乙醇、異丙醇
或任何其它低級,澱法，M:包括離子交,析法、大小排PIM析法、矽膠 層析法和反向層析法的層析法，^M;包括聚丙烯鵬凝膠電泳和劇鼸凝膠 電泳的電泳法，從穩定溶液可回收核酸，鄉本領域技術人員題而易見的。 雌用酚氯臓取法從穩定溶液回收核酸。
從樣品提取完整RNA的一，別，的方法Ji^ffi TRIzol試齊IJ(購自於 Invi1rogen Carlsbad, CA)0
回收核,，M3tt領域公知技術可任^M—，化核酸。在一4^& 實施方案中，進一，化導致RNA基本上沒有汙染的DNA或蛋白質。■ 用於核酸回收的任意前述技術可完皿一步純化。,^ffi低級醉(尤其是乙 醇或異丙醇)的沉澱法純化核酸。^t在存在皿沉澱的載體(例如糖原)時 進行沉澱。
M31多種機制擴增本發明的核酸樣品，其中一些可4頓PCR。參見例如屍Q 7k;W/ogy: 7V/na》/es a <^ i4/ / /z'cortcra， DA^4爿附;7/辨cart0w (Ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992)、 PO PwfocoZs:爿Gw油to腧k^ W ^/7/ //o ft'ora (Eds. Innis等,Academic Press, San Diego， CA， 1990)、 Mattila等人的A/krfe/c Ar幼19， 4967 (1991)、 Eckert等人的PCK A^/kx& J/ /7/Zcoft'ons 1， 17(1991)、屍C及(Eds. McPherson等，IRL Press, Oxfoni)以及美 國專利號4,683^02、 4,683,195、 4,800,159、 4,965,188和5,333,675，它們分別 在此為所有目的,弓間作為參考。可在陣列上擴增樣品。參見，例如美國專 利號6,300,070和美國專禾伸請09/513,300， ^jtfc弓間作為參考。
其它適宜的擴增方法包括連接酶鏈反應(LCR)(例如Wu和Wallace, Gfeww!'os4, 560(1989), Landegren等人的5fcfewe241， 1077(1988)和Barringer 等人的G微89:117 (1990))、轉錄擴增(Kwoh等，Phx .Ato/. 5b: LS4 86， 1173 (1989)和W088/10315)、自動維持序列擴增(GuateUi等，屍wc. Ato. C/S4， 87， 1874 (1990)和WO90/06995)、靶多核苷,列的選擇擴增(美國專 利號6，410 276)、 ^W序列引物聚合H^M應(CP-PCR)(美國專利號4，437，975)、 任意弓卿聚合酶鏈反應(AP-PCR)(美國專利號5,413,909、 5,861,245)以及基 於核酸的序列擴增(NABSA)。(參見美國專利號5,409,818、 5,554,517和 6,063,603,其分別在此引用作為參考)。美國專利號5^242,794 、 5,494,810、 4，988，617和USSN 09/854^17中描述了用到的其它擴增方法，其分別在此引用 作為參考。
通過本發明方法分離的RNA可包括信使RNA (mRNA)、轉運RNA (tRNA)、核糖體RNA (rRNA)以及病毒RNA。
M3tt發明方法分離的RNA適於多種目的和^生物學方法，包括但不 限於反轉錄成cDNA;為了在基因晶片、 苷酸微陣列等等上分析，生產 娜性、螢光鄉它^H己的cDNA;艦丙烯,^^月i^,電泳法進行電 泳；M:層析法(例如，離子交換、賺、反相駄小排P脂析法)進1彌化;
用核酸Wht行雜交以及M:機械、超聲波^它方法進行片段化。用於分析
RNA的常規方,括RNA印跡法、核糖核^BIW測定(RPAs)、反,酶 聚合,反應(RT-PCR)、定量實時PCR、製備cDNA用預行克隆、體夕溯 譯和微陣列分析。
M本發明方法分離的DNA適於多種目的和^生物學方法，包括但不 限於為了在基因晶片、寡核苷酸微陣列等等上分析，生產Mt性標己、螢光 標記或其它^i己的DNA;通過丙烯鵬或瓊月i^繊電泳法進行電泳；通過 層析法(例如，離子交換、賺、反相或大小排P脂析法)進行純化；用核酸探針進行雜交以及通過機械、超聲波或其它方法進行片段化。用於分析DNA 的常規:^^括DNA印跡法、聚合,反應(PCR)、定量實時PCR、克隆 法、體外轉錄和翻譯，以及微陣列分析。
本發明的一個皿實施方案,含有用於,生物樣品的刮取裝置、儲存 容器以及核酸穩定溶液的試劑盒。
本發明的另一雌實施方案還麟RNA收絲統，其包括具有近側手柄 端和遠側收集端(包含鋸齒狀外周緣)以及在手柄端和收集端之間的連接部分 的刮取裝置，其中連接部分允許手柄端和i^^^任M彼此分開；還包括含有 RNA穩定溶液的儲存容器。^地，儲存容器含有蓋子。甚至更優選地，蓋 子附著於儲存織。
本發明也,用於收集口腔黏膜的上皮細胞的試劑盒，其包蹄嫩^g和 含有RNA穩定溶液的儲存容器。在一個雌實施方案中，RNA穩定溶液是 RNALater。
本發明的一個,實施方案,用於收,品的方法，其包括步驟提供 具有近側手柄端和遠側收集端(包含鋸齒微卜周緣)以及在手柄端和收集端之 間的連接部分的刮取裝置；JH^含有RNA穩定溶液的儲存容器；用收集端的 鋸齒狀外周緣從^#口腔的口腔黏膜刮取上皮細胞；將刮取的上皮細胞收集 到刮取錢的麟端中；將刮取的上皮細胞轉入儲存容器；旋轉刮取體手柄， 使裝置手柄端與收集端在連接部分拆開，從而使得儲存容器包含RNA儲存溶 液、刮取的樣品以及刮取錢的lB^端。
如下討論的，從這些口腔上皮細胞分離的核酸劍市細胞狀況的指示。這允 i轉J劐市的非侵入性測試。
肺病的生辦蔬物
我們也發現在口腔黏膜上皮細胞中的基因表達可用作肺細胞狀態(或狀 況)的指示。這允許人們來鑑定患有或處於發展為肺病(例如肺癌)危險的個 體。
我們已糹^M示氣道(包括口腔)暴露於例如香菸煙霧的汙染物，導致所謂 的"場缺損(field defect)",這指從口腔黏膜上皮襯裡皿支氣管上皮細胞襯 裡到肺的所有氣道襯裡上皮細胞中基因魏的變化。(Spira等，Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2004 Jul 6; 101(27): 10143-8)。也可參見國際申請PCT/US04/18460。由於場 ,現在可能檢測變化，例如，導,病的靴前和惡性變化，其中
^ffi從上皮細胞(其不但;W活組織檢査獲得而皿其它更易得到的包括口腔 上皮細胞樣品的氣道部分中得到)分離的細JW品。
本發明一個方面基於在吸菸者和非吸菸者之間有不同的基因m模式的發 現(Spim等，2004)。本發明另一方面基於另外的基於核酸的變化(DNA甲 基化)與肺癌有關的發現。因此，在本發明的一個實施方案中，從口腔上皮細 胞分離的RNA可用於基因敬i紛析。在另一實施方案中，從口腔上皮細胞 分離的DNA可用於DNA甲基化分析。
本發明一個方面,用於檢湖明tt自^im個體發展劍市癌風險的生物
標記物，也稱為耙基因。本發明麟用於檢測口腔黏膜上皮細胞樣品中目的耙 基因魏的方法，其包括M^M的口腔粘MJ:皮細胞分離核酸樣品；將步iKa) 中分離的核酸樣品接觸至少一種特異雜交目的耙基因的核酸探針；和在核酸樣 品中檢測戶;M目的耙基因的存在。在一個實施方案中，在實施步H(b)之前將目 的鵬因附著於固相。核^t^是RNA或DNA。
本發明方法可用於鑑定在患有或處於發展為肺病風險的個體的口腔上皮細 胞中發生改變的IE^因或生tltti己物。
有用的生t/^己,括在患有或處於發展為肺病風險的個體的口腔上皮細 胞中更高水平a低水平^ii的基因。
如圖4所示，^^吸菸的人中,並在正在吸菸者的口腔上皮細胞中更 髙7K平表達的基因的具體實例包括ALDH3A1 、 CEACAM5和NQOl 0
其它有用的生辦射己物是在患有或處於，為肺病風險的個體的口腔上皮 細胞中具有不同DNA模式例如甲基化模式的那些(Tsoij等，Oncogene 21: 5450-5461(2002); Fukami等，IntJ. Cancer 107:53-59(2003))。
本發明也提供"氣道轉錄組"的鑑別和表徵，或提供氣道的標籤基因 (signature gene)魏譜，以及麟在與上皮暴露於汙鄉(例如直接或間接暴露 於香菸煙霧、石棉和煙霧)有關的轉錄組中變化的鑑別。特別皿的氣道轉錄 組是口，錄組，其包括在^Ji吸菸者和IUi非吸菸者的口腔上皮細胞之間的 表達顯著不同的基因。這^道轉影且基因^譜,停止吸菸後肺組織功能 的信息、非吸菸者和吸菸者中的肺癌素因以及織其它肺病的素因。從非吸菸 者可獲得口l^^組,模式，其中在正常,模式中的偏差劍市病增長風險 的指示。也可從暴露於空氣汙染物的非吸菸受試者中獲得口腔轉錄組表達模式，其中與對空氣汙膽正常應答有關的^ii模式偏差是發展湖市病的增長風 險的指示。
本發明也,口腔轉錄組，其包括下列的編石騷因ABCC1、 ABHD2、 AF333388.1、 AGTPBP1、 AIP1、 AKR1B10AKR1C1 、 AKR1C2、 AL117536.1、 AL353759、 ALDH3A1、 ANXA3、 APLP2、 ARHE、 ARL1、 ARPC3、 ASM3A、 B4GALT5、 BECN1、 Clorf8、 C20o艦、C5o漁、C6orf80、 CA12、 CABYR、 CANX、 CAP1、 CCNG2、 CEACAM5、 CEACAM6、 CEI>6、 CHP、 CHST4、 CKB、 CLDNIO、 CNK1、 COPB2、 COX5A、 CPNE3、 CRYM、 CSTA、 CTGF、 CYP1B1 、 CYP2A6 、 CYP4F3 、 DEFB1 、 DIAPH2 、 DKFZP434J214 、 DKFZP564K0822、 DKFZP566E144、 DSCR5、 DSG2、 EPAS1、 EPOR、 FKBP1A、 FLJ10134、 FLJ13052、 FLJ130521、 FLJ20359、 FM02、 FTH1、 GALNT1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC:、 GCLM、 GGA1、 GHTIM、 GMDS、 GNE、 GPX2、 GRP58、 GSN、 GSTM3、 GSTM5、 GUK1、 HIG1、 HST1H2BK、 HN1、 HPGD、 HRMFB2122、 HSPA2、 IDH1、 IDS、 IMPA2、 ITM2A、 JTB、 KATNB1、 KDELR3、 KIAA0397、 KIAA0905、 KLF4、 KRT14、 KKT15、 LAMP2、 LOC5脳、 LOC57228、 LOC92482、 LOC92689、 LYPLA1、 MAFG、畫、MGC4342、 MGLL、固E、固F、 MT1G、固H、固X、 MT2A、 NCOR2、 NKX3-1、 NQOl、 NUDT4、 0RL1、 P4HB、 PEX14、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 PSMB5、 PSMD14、 PTP4A1、 PTS、 RAB11A、 RAB2、 RAB7、 RAP1GA1、 RNP24、 RPN2、 S100A10、 S100A14、 S證、SCP2、 SDR1、 SHARP1、 SLC17A5、 SLC35A3、 SORD、 SPINT2、 SQS漏、SRPUL、 SSR4、 TACSTD2、 TALDO、丁ARS、 TCF7L1、 TIAM1、 TJP2、 TLE1、 TM4SF1、 TM4SF13、 TMP21、 TNFSF13、 TNS、 TRA1、 TRIM16、 TXN、 TXNDC5、 TXNL、 TXNRD1、 UBE2J1、 UFD1L、 UGT1A10、 YF13H12以及ZNF463。以下表1列出該基因列表中所示的HUGO 鑑定符號(ID)相對應的GenBank ED和GenBank說明。
表l
GENBANK—ID HUpOJtD GENBANIL說明
NM一07781.1 FU20359 假定的蛋白FU20359
NMJ)8004.
FU034 假定的蛋白FLJ10134
AF07S844,
MT1F 鯛硫蛋白1F(功育&I4)NM 00595 UMTIH鍋硫蛋白1H
BC0O5894.1FM02^m單力喊酶2
AP182275.1CYP2A6"細胞色素P450,家族2，鵬
BF246115MT1F鍋硫蛋白1F(功能性)
NM 005952.1M丁X鍋硫蛋白IX
雨一00595(UMT1G鍋硫蛋白1G
麵一OO能.lCKB"肌酸鵬，腦"
NM一000860'1HPGD縫前列素ratHl5"(NAD)
AL021786ITM2A齡膜蛋白2A
L2卯08.1SORD山梨麟鵬酶
NM 002275.1KRT15角蛋白15
AF333388.1加由S68948支持的假定的基因
U56725.1HSPA2皿70kDa蛋白2
M麵3MT1F魏硫蛋白1F(功能性)
BF217861MT1E頓硫蛋白1E(功離)
AF052094.1EPAS1內皮PAS結構^g白l
X97671EPOR促,K^素受體
NM一002450.1MT1X^ii硫蛋白IX
AF114012.TNFSF13"腫瘤 因灘彬
NM一005953,1MT2A^M硫蛋白2A
AL046979TNS張力蛋白
NM一000851,1GSTM5谷臓太S-轉移酶M5
AB017546PEX〗4過氧化t^生物發生因子14
NM 006312.1NC0R2核受糊鵬物2
NM 006314.1 CNK
KSR樣的M增強^ (ras的剩勒ABO 14605.1AIP1atrophiii"l相互作用蛋白1
NM二031283.1TCF7U"轉錄因子7樣l(J細旨異性的，HMG4 '
AB007857KIAA0397KIAA0397基因，
NM一001888.1CRYM"晶體蛋白，nrn"
NM一005769.1CHST4微化^(N-乙g^胺W)贈S^酶4
BC0O6230.1MGIX甘油單酯脂肪酶
NM一Ol 8555.2ZNF463鋅指蛋白463
NM一015001.1SHARPSMART/HDAC1相關的,鵬白
NM 01柳5.1C5or傷她體5可雜6
"高爾基體相關的，含Y銜接蛋白耳(adapto
AWO01443ear)的，ARF結雜白1"
AA046650HRIHFB2122Tara樣蛋白
Z97056KDELR3KDEL(Lys-AsjvGlu-Leu)內質網蛋白,受體3
BCOO 1049.1UFD1L泛素齢,1樣
NM一Ol 5523.1DKFZP566E44小片段核,
NM一006694.JTB瑕歐易位斷點
NM 030796.1假定的蛋白DKFZp564K0822AF217514.1C20orfl11雜體20可雜111
AF027205.1SPINT2"絲氨麟白SIW^怖J, Kunite型，2"
BC0O3379.1LOC57228來自克隆643的假定的蛋白
BC0O6249.1GUK1鳥苷酸鵬1
NM O04872.1Corf8鵬體1可維8
M94859.1CANX
NM一00080.1FKBP1A"FK506結合蛋白1A, 12kDa"
AV7O6096L0C簡2假定的蛋白LOC92482
MM O06367.2CAP1"CAP,腺苷酸環,目關蛋白1 (,)"AL556438 BC003560.1 雨014297.1 麗OQ3艮l
丁LE1 RPN2
SQSTM1
",的轉導素節DNA !性的
鵷體結^IS白n
甲狀腺中泰逸的蛋白 sequestosome 1
BC004146.1 PSMB5 NM 004786.1 TXNL
AI951720
TLE
"蛋白,前體，macropain)亞基，p型，5" "硫縱蛋白樣，32kDa" "Spit 1的轉導素樣增強子(E(spl)同源物，果 蠅)"
雨一006280,1 SSR4 NM 030810.1 TXNDC5
"信號序列受體，A(易位子相關蛋白-厶)" 含硫縱蛋白結構域的5
雨004766.1 C0PB2
AF139131.1 NM一006827.
mi 003299.1
BECN1 丁MP2
TRA1
"夕敞體蛋白復^1,亞勒-2(p，)"
"beclin 1 (巻曲! , m蛋白樣BCL2相互
作用蛋白)"
跨鵬輸蛋白
腫瘤排斥繊(gp96) 1
NM 020474.2 GALNT1
UDP-N-乙醯Kx-D^半乳糖胺多肽N-乙醯, 半,S^酶1 (GalNAc-Tl)
NM一005886.1 KATOB1
雨一024329,1 MGC4342
NM一004817,1 TJP2
AK000095.1 CHP
劍蛋白p80(包含WD重餅歹i》亞基B 1 假定的蛋白MGC4342
緊密雜蛋白2(緊密連合2) 鈣結合蛋白P22BC000758.1 C6orfS0 AB035745.1 DSCR5
NM一005805.1 PSMD14
她體6可雜80 唐氏^徵，區基因5 "蛋白,前體，macropain)26S 3ES，非ATP 酶，14"
K)4152
TACS丁D2 腫瘤相關辦縮號轉導物2
NM O廳l.l UBE2JI
(泛織娜E2， J1(UBC6同源物，,)
BC00437U APLP2 NM 004255.1 C0X5A
崎粉狀蛋白(A4)前,蛋白2 細胞色素c氧娜亞基Va
AJ215102
RAB1A
"RAB11A，癌基因家方滅員RAS"
K)4183.1
LAMP2
^WB關的膜蛋白2
NM一005896.1
M97655.1
AK024976.1
IDH1
PTS
RNP24
"異機^^Hl(NADP+),可溶的" 有被小mmg白
AF13820.1 GHITM
生長^l導型的跨膜蛋白
NM 000202.2 IDS NM 00H77.2 ARU
艾杜糖,2-硫鵬,unter総御 ADP賺靴因子樣1
A歸0826.1 雨一006406.1 D83485.1 NM 014056.
RAB7 PRDX4 GRP58 HJG1
"RAB7,癌基因^^員RAS" peroxircdoxin4
" 節的蛋白，58kDa" 小鼠缺氧誘導的基因1的可能的直向同源物麗000177.1 GSN
" :膠蛋白(澱粉樣鄉，Finnish型)，
BG054844 ARHE BC001709.1 FLJ3052
"ras同源糖因家族，成員E，， NAD,
，902,1 T畫l BC000893.1 HIS丁1H2BK
AL353759
NM 012434.1 SLCI7A5
AF00456U
蘭一014933.1
NM一003909.1
AW134535
BH)3829
ARPC3
KIAA0905
CPNE3
CCNG2
DSG2
T細胞淋巴麟和鄉l "組蛋白l, H2bk,"
"智人(Homo sapiens)組蛋白1, H2ac, mRNA(cDNA克隆MAGE: 6526471),部分 cds"
"可溶的載體家族17(陰離子/^t蛋白)，成 員5"
"肌動蛋白相關蛋白2/3複合物，亞基3, 21kDa"
酵母Sec31p W物 copine m 細m期蛋白G2 橋粒糊蛋白2
U48296.I
PTP4AJ
"蛋白酪^m,ivA型，成員r
BC001709.1 窗0J5239.1
B4GALT5
FU13052
AGTPBP1
"UDP-Gal: pGicNAc p 1,4 半孚111驗移酶, 多肽5" NAD, ATP/GTP結合蛋白1
J02783.1
P4HB
"前膠原-臓酸，2-酮^:酸4"加雙彌脯麵一020672.1 S100A14
AL527430 GSTM3
NM一004753.1 SDR1
爾一00701U ABHD2
AI539710 ABCC1
NM一002865.1 RAB2
BG28畫 LYPLA1
NM一002032.1 FTH1
賜002885.1 RAPGA1
NM一006729.1 DIAPH2
AF200715.1 CED-6
BC005911.1 SCP2
B蘭271 GALNT3
NMJ)143效,1 TM4SF13
NMJH9094.1 NUDT4
AI762U3 GMDS
NM一0"214.1 IMM2
AV728268 SORL
NM一0039.1 丁ARS
氨酸冬羥化斷，P"多肽(蛋白二硫鍵異構酶； 甲>1^1 結合蛋白55)"
S100鈣結合蛋白A14 谷臓太S-鄉酶M3(頓 短OT^II/還原酶1 含ab水解酶結構域2
"ATP-結始，3E^IC(CFTR/MRP),成員1"
"RAB2,癌基因家鵬員RAS " 溶血磷鵬I
"鐵蛋白，重多肽l"
"RAP1, GTP酶活化蛋白1" 透明同源物2(剩筆) FTB結1W繊蛋白CED^ 固醇載體蛋白2
UDP-N-乙醯^a-D"半孕U^胺多肽N-乙醯, 判LH驗移酶3(GalNAoT3) 跨膜4鵬麟員13
UDP-N-乙醯,胺-2-差向異構6l/N-乙醯甘露 糖胺鵬
nudix (二磷m^g^的部分X)-型基序4 "GDP-甘MH4, 6")!fe7K酶" 鵬肌H喊4》單^mSl2
"sortilin相效體，含L(DLR類)A重餅列" 蘇氨醯-tRNA合鵬觀一0訓3.1 Xq22.2
NM一012243.1 AA873600 W87466 NM 06315,1
"可溶的載體家族35(UDP-N-乙醯葡糖胺 SLC35A3(UDP佳NAc)2^蛋白)，成員A3" ASM3A 鵬綱,磷酸二酉鵬 Loc92689假定的蛋白bc001096 CED、6 PTB結構域銜接蛋白CED"6
AF247704.1 NKX3-1
"NK3 ^因子相關的，基因座l(剩尾)"
NM 001072.1 UGT1A10
"UDP糖SI^酶1家族，多肽A10"
NM一002359.1 MAFG NM 005980.1 SI00P
v-maf Ml^刊隹肉瘤癌基因同源物G (鳥) S100媽結合蛋白P
NM—000896.1 CYP4F3
"細胞色素P450,家族4, M^族F,多肽3' peroxiredoxin 1
"sioo鈣結合蛋白aio(W^白n配體，依
兩002966.1 S脆IO鵰合飾'輕多肽(PU))"
NM 021027.
UGT1A10
"UDP糖S^酶1 ,，多肽A10"
NM 017423.1 GALNT7
UDP-N-乙醯《-D"半孕Utt胺多肽N-乙醯g 半儘S^酶7(GalNAc-T7)
BF67, NM一OO函.l NM 016185.1
GCLC GMDS HN1
"穀氨酸-半胱氨^im催 基"
"GDP-甘,4務船娥' 血液學和神經學鋭的lAA083483
FTH1
"鐵蛋白，重多肽1"
AL117536.1
M92934.1
M63310.1
加
CTGF ANXA3
由AK057191、 AL117536支持的假定WS因
結^SiP在長因子
膜麟白A3
NM 000463.1 UGT1A10
MM
NM一001218，2 CA12
雨012189.1 CABYR
"UDP糖 / 酶1家族，多肽A10"
碳酸酐酶xn
鈣-結合酪氨酸^Yy磷酸化調節的(fibrousheathin 2)
3BC005008.1 NM一003330.1 NM一00263U NM一00206U NM 006755.1
Ml 8728.1
NM一005213,1
U73945.1
AF31391U
BF5M079
雨一00647(U
麗014467.1
CEACAM6
丁XNKD1
PGD
GCLM
TALD01
CEACAM6
CSTA
DEFB1
TXN
KXF4
TRIM16
SRPUL
癌胚抗原相關的細51*佔附肝的辦異性效
硫,蛋白還原酶i
"穀氨酸-半胱氨mi^酶，働亞基"
轉,
癌胚抗原-相關的細胞粘附分子6(非特異性交 半胱氨麟白^p^劑A (stefin A)
"防禦素，p-r
硫鞭蛋白 Kn^el樣因子4(腸) 含三麟序的16 sushi重複蛋白
AL049699
ME1
"蘋果,l' NADP(+)^M的，鵬的"觀一002395'2 ME1
BC002690.I KRTI4 AI346S35 TM4SF1
"蘋果,l, NADP(+)^5M的，M的" "角蛋白1《單純性大皰性表皮鬆解，
Dow!ing-Meara, Koebn改)"
跨膜4驗麟員1
NM一OOl 353.2 BC00O卯6.1 蘭OO薩.l
AKRCI CLDN0
"醛酮還原酶家族1,成員Cl(二氫二醇脫氫 酶1; 2(kx(3"a)^^固醇月
"NAD(P)H MSI,醌l " claudin10
S6S290.1
AKRC
",還原酶家族i，成員ci(m醇脫氫
酶1; 20"O(3《)^^l固醇I^ID "
M33376.1 NM一002083.1 NM 000卯3.1
AKRC2
GPX2
NQ01
"醛,原酶家族i,成員C2(m醇脫氫
ffl型)"
穀胱甘^Mft化tlSl2(胃腳 "NAD(P)H^tSI，醌l"
艦ALDH3A1
"醛^tH3繊，鵬A1"
NM 004363.1 CBACAM5
癌Mdi相關的細皿附^ 5,
兩000]04.2 CYP1B1
"細胞色素P450，家族1，嫁族B,多肽1J
雨020299.1 AKRB0在一個雌實施方案中，本發明H^包織碼下列的基因的口麟魏 AGTPBPl 、 AKR1C1、 AKR1C2、 ALDH3A1、 ANXA3、 CA12、 CEACAM6、 CLDNIO、 CYP1B1、 DPYSL3、 FU13052、 FTH1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GMDS、 GPX2、 ■、 HSPA2、 MAFG、應、MGLL、 MMPIO、 固F、顧G、固X、 NQOl、 NUDT4、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 RAB11A、 SIOOAIO、 SDR1、 SRPUL、 TALDOl 、 TARS、 TCF-3、 TRA1、 TRM16以及 TXN。以下表2列出該基因列表中所示的HUGO鑑定符號(ID湘對應的GenBank ED和GenBank說明。
表2
AFFXGENBANKHUGOGOGENBANK說明
IBIDIDID
基質金屬蛋白酶IO(,質
205680—atNM一002425MMPIO30574素2)
210524一x一atNM一007372MT1F5737隱解旋,關蛋白
20S5Sl一x一atNMJ)05952MT1X9634頓硫蛋白IX
211538一s一atNM 021979HSPA27286皿70kD蛋白2
204745一x一atNM一005950M丁〗G46872，流蛋白1G
217165一x一atM讓3MT1F5737
221016一s—atNMJJ31283TCF-36355HMG框綠因子TCF-3
2函6一s一atNM_007283MGLL6954甘油單酯脂肪酶
200599一s一atNM—003299TRA15524腫瘤排斥繊(gp96)1
RAB11A,癌基因家族成員
200863一s一at顧一0(M663RAB1〗A6S86RAS
201923一at廳一006406PRDX47252peroxiredoxin 4
20S918 s atNM一023018FU13052NAD鵬20S9l9丄at NM一02308 HJ13052
NAD袋
2024Sl一atNM一004753 SDR1
S152 短^^還原酶1
2(M500一s一at麗一015239 AGTPBP1
ATP/GTP結合蛋白1
206302一s一at NM一Ol, NUDT4
nudix(二磷酸核苷連接的部 簡分，基序4
200748一s一at NM一002032 FTH1
6826鐵蛋白，重多肽1
203397丄at僱一0044S2 GALNT3 5975
214106一s一at NM一00500 GMDS
201263一at NM_00391 TARS
204970一s一at NM一002359 MAFG
UDP-N-乙醯"tt-D-半乳糖 胺多肽N-乙醯氨基半乳 糖SH^酶3(GalNAoT3)
5975 GDP-甘賺4，6"船KSI
6435 蘇氨醯-tRNA合鵬
v-maf ^働瘤癌基 6355 因同源物G(鳥)
200S72一at NM—002966 S]OOAIO 7165
S100鈣結合蛋白A10(膜聯
蛋白n配體，依鈣結合蛋 白i,輕多肽(pn》2086S0一at NM一002574 PRDX
歸 peroxiredoxini
283〗3一s丄at畫一07423 GALNT7 5975 201431 s at麗001387 DPYSL3 7165
UDP-N-乙醯"tt-D"半乳糖
胺多肽N-乙醯氨基半乳 糖 ^酶7(Ga脆c-T7) 二都
217755—at NM一016185 ■ 203963一at NM一001218 CA12
202923一s一at NM一001498 GCLC
血液學糊申經學魏的1 6730碳酸酐酶xn
穀氨酸-半胱氨酸連接酶，
6534催艦基
204875一s一at NM一001500 GMDS 201266一at NM一003330 丁XNRD1
5975 GDP-甘,4務船鵬 6118 ^^蛋白還原酶1
20:il〗8一at 209369—at
203925一at 21657一at 208S64一s一at 201463一s一at
NM一002631 PGD NM 005139 ANXA3
NM一002061 M18728.1 NM一003329 NM 006755
203757_s_at NM_002483 205柳一at NM一04467 20434at 雨006470
GCLM CEACAM6 丁XN TALD01
CEACAM6
SRPUL
TRIM16
9051 5737
6534 7165 7〗65 5975
7〗65 6118 5737
膜麟白A3
穀氨酸-半胱氨酸連接酶， ,亞基
硫縱蛋白 ^11
癌胚抗原相關的細胞粘附 肝6 (機異性交叉反應 繊)
sushi重複蛋白 含H^S序的162CM05S一atAL049699 ME1
6099
221841一s一at NM一004235 —
Kn jpel樣因子4(腸)
204059一s一at NM一002395 ME1
蘋果,1, NADP (+>依 6099鵬的，M的
204151 x at 2固9一s一at 216594 x at
NM一001353 BC000906.1
AKJUCI NQ01
20283 l一at NM一002083 GPX2 205328一at NM—006984 CLDN10
醛酮還原酶家族1,成員
6S05 oc(3"a",固醇MH) 6118
穀胱甘肽過氧化物酶2(胃 6979腸)
20'1468一s一at NM一000903 NQ01
額NAD(P)H^i[^,醌l
201467一s一at NM一0009(B
6118蘭(P)HMLSI,醌l
20， x at NM 001354 AKR1C2
217626 at BF508244 AKR1C1
ra^原SI^1，成員C2
(二氛二醇脫氨酶2;膽汁 酸結合蛋白；3KX羥基類固
15722醇M(^m勤
ESTs ,高度類似於 DBDD—HUMAN反式-1>2-6805 二辦-u-二醇J3JSg[gt智人]205623_at NM—000691 ALDH3A1 6081醛fl^tH3家族，成員Al
202435一s一at NM一000104 CYP1B1 6118
202436—s一at NM一000104 CYP1B1 6118
202437—s一at NM一000]04 CYP1B1
6118
細胞色素P450,麟夷I(二 氧芑誘導型的)，多肽1 (原 發性嬰兒青艦3)
細胞色素P450,亞家族I(二 氧芑誘導型的)，多肽1 (原 發性嬰兒青艦3)
細胞色素P450,鄉矣I(二 氧芑誘導型的)，多肽1 (原 發性嬰兒青光眼3)
本發明預計i^該方^^在吸菸者和非吸菸者的肺和肺癌的m前相關的 口腔上皮細胞中鑑定口腔轉錄組、表達的基因的獨特組或基因表達模式。所有
的這些，模式構成指示細胞功能的可操作性和途徑的^ii^^，其可用於指
導涉及 販、診斷和可能療法的決定。因此，從相對易魏的位點(例如口腔) 得到的上皮細胞基因，譜可,重要的預後、診斷和治療信息，這可應用於 診斷和治療肺病。
因此，在一個實施方案中，本發明麟"口腔轉錄組"，其鋭模式可用 於文中戶脫的鵬、鵬、診斷和治療'鵬途。
本發明的技術包括用核苷酸探ft^行檢測。伏選地，核苷 針可以皿 擇性雜交目的鵬因的任意核苷酸。例如，它與鵬因轉錄物雜交更強於與其 它天然存在的轉錄因子序列雜交。^!十種類包括cDNA、 RNA ^f十(riboprabe)、合成的寡核苷酸和基因組Mh通常特殊瞎形決定所用到的探針種類，例如用
於原，交的RNA探針，和例如用於RNA印跡法的cDNA。耙編$ 因的檢 測本身可用於 與增強的^有關的條件。更容易與^i-轉錄物和其它^ii 產物水平相關的其它檢測耙的測定方式通常也是有用的。探針可以根據需求而 儘量短以差異識別目的mRNA轉錄物，且例如可魅15鵬，更iMM少是 17麟。探針更雌超少20離
本領域，人員從耙基因的MS,列也可反向工程構，針。然而限制 了所述探針的用途，因為由 傳密碼的簡併性，可以理解任意一種給定的反 向工程構建的序列並不必定與來自相同肽的倒可給定的反向工程構建的互補序 列良好雜交或根本不與其雜交。這是本領域技術人員通常考慮到的因素，而且 任何給定序列的簡併性通常範圍太寬，以至於對樹可一個序列產生大量數目的 微。
探針的標己形式可以是任何適合的形式，例如使用艦性同位素，如32P 和35S。無論微是化學合成還是生物合成的，通過使用合適的標記鹼基，可 實UW性同位素t斜己。其它新己形式可以包括,抗^^i己，例如具有ELISA 的特點，或任意報告分子。本文所用的"報告分子"，是皿可允許雜交探針 檢測的可分析鑑定的信號的分子。檢湖何以是定性或定量的。通常用到的報告 舒包括螢光團、酶、生物素、化學發光舒、生物發光舒、洋地黃毒苷、 抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白g^lt性同位素。其中通常用到的,括辣 根過氧化物酶、減性磷酸酶、葡麟化酶和&半乳蹄酶。酶可綴合抗生物素 蛋白或鏈黴抗生物素蛋白以與生物素化探針一起使用。類1自，' 可綴合抗 生物素蛋白或,抗生物素蛋白以與生物素化酶一起使用。通常選擇在被相應 酶水解後產生可檢測至啲鵬變化的與這些酶一起j頓的底物。例如，磷艦 硝基苯酉驢於與喊性磷酸斷艮告M—起使用；對於辣根過氧化物酶，通常使 用l二苯二胺、5-氨基水楊酸或聯甲苯胺。M31技術人員已知的任何方法可將 報告分子M入DNA探針，例如Mil切口平移、引物延伸、隨,核苷酸引 發、通過3'或5'端，giB或iia其它方、樹參見，例如Sambrook等. 5z'o/ogy.'爿/akvato^v ^p/ raac/j, Cold Spring Harbor, N. Y 1989)。
基因,的檢測
在本發明的一個實施方案中，iOT本領域中用於測量基因鋭的倒可已知方法(包括mRNA轉錄物分析以及DNA甲,分析)，將分離的上皮核, ^W^基因或多基因的^iio
對於本領,術人員而言，評價mRNA 7K平的方法是^^f周知的。在一 個，實施方案中，SM檢測RNA轉錄物來確定基因^ii,例如M RNA 印跡法，例如，其中將RNA製劑在變性瓊月^^繊上電泳、並將辦Ait宜 的支持物(如活化的纖維素膜、硝酸纖維素膜或玻璃膜或尼龍膜)。然後使用 本領域公知方法(例如娜自顯影術)，將標己的(例如艦性新己的)cDNA 或RNA與製劑雜交、並進t亍冼滌和分析。
使用已知的擴增方法，可進一步完成RNA轉錄物的檢測。例如，將mRNA 反轉錄成cDNA，隨後進行聚合,反應(RT-PCR);或i^ffl美國專利號5,322,770 中描述的兩步驟中的一種酶，或如R L. Marshall等人的PCR Methods and Applications 4: 80~84 (1994)中描述的將mRNA反轉錄成cDNA,隨後進行)(tf爾 缺口連接,反應(RT-AGLCR),均在本發明範圍內。
本文用到的其它己知擴增方飾括，但不限於PNAS USA 87: 1874^1878 (1990)中描述的並也在Nature 350 (No.6313):91-92(1991)描述的所謂的 "NASBA"或"35R"力法;公幵的歐洲專利申i^(EPA)號4544610中描述的 擴增法；艘縱增法(如G.T Walker等人的Clin. Chem. 42: 9-13 (1996)和歐 洲專利申請號684315中所述以及如PCT公幵文件W09322461所述的耙介 導擴增法。
也可利用原^V魏示，其中將娜性新己的反義RNA微與雜且織檢 査樣品的薄切片雜交、洗滌、用RNA酶切割，並暴露於艦自顯影術的敏感 乳劑中。用蘇7Mf染色樣品以證實樣品的組織學組成，且皿，的濾光器， 暗場成像顯示顯影的享服。也可^^非目性標記，例如洋地黃毒苷。
棘，$ DNA陣列、晶片或微陣列上檢測醒毅，包括mRNA鋭。 將與目的基因對應的寡核苷酸固定在晶片上，然後使其與從患者中得到的測試 樣品的新己核自交。含有目的基因轉錄物的樣品可得到陽性雜交信號。DNA 陣列的製備方法及其用途都是本領域公知的(參見例如，美國專利號 6,618,6796、 6,379,897、 6,664,377、 6,451,536、 548^57、 U S. 20030157485,以 及Schena等人的1995 Science 20: 467470; Geihold等人的1999 Trends in Biochem. Sci. 24， 168-173;和Lennon等人的2000 Drug discovery Today 5: 59-65,它們在此全部引用作為參考)。也可進行基因敬連續分析(SAGE)(參 見美國專利申請20030215858)。
本發明方法可使用固體基片，包括一些優選實施方案中的陣列。在 US,S,N09/536，841、 WOOO/58516、美國專利號5，143，854、 5 242，974、 5 252，743、 5，324，633 、 5,384^61、 5,405,783 、 5,424,186、 5,451,683、 5,482,867、 5,491,074、 5,527,681、 5,550^15、 5,571,639、 5,578,832 、 5,593,839、 5,599,695 、 5,624,711、 5,631,734、 5,795,716、 5,831,070、 5,837,832、 5,856,101、 5,858,659、 5,936,324、 5,968,740、 5,974,164、 5,981,185、 5,981,956、 6,025,601、 6,033,860、 6,040,193、 6,090,555、 6，136 269、 6,269,846和6,428,752， PCT申請號PCT/US99/00730(國 際公幵號WO99/36760)以及PCT/US01/04285中描述了適於聚，陣列合成的
方法和M,出於所有目的，它們iP&tk全部引用作為參考。
在特別實施方案中描述了合成方法的專利包括美國專利號5,412,087、 6，147 205、 6^62-16、 6,310,189、 5,889,165以及5,959,098。
用於本發明的核酸陣列包括，但不限於根據商標GeneChip7從Afifymetrix (Santa Clam， CA)購買的那些陣列。在aflfymetrix.com網站上顯示了陣列實例。
本發明也預計將聚合物附著在固體基片的許多用途。這些用途包括基因表 皿控、特徵分析、文庫篩選、基因型分析和診斷法。美國專利號5,800,992、 6,013,449、 6,020,135、 6,033,860、 6,040,138、 6，177 248和6^09,822中顯示了 基因^ 控禾崎徵分析方法的實例。在USSN60/319，253、 10/013,598和美國 專利號5,856,092 、 6,300,063、 5,858,659、 6，284，460、 6,361,947、 6,368,799和 6,333,179中公開了基因型分析及其用途的實例。在美國專利號5,871,928、 5,902,723、 6,045,996、 5,541,061和6,197,506中具體鋭了用途的其它實例。
例如，為監控mRNA 7k平，從待檢的生物樣品提取mRNA、反轉錄、並 製備螢光標記的cDNA探針。然後將能與目的基因雜交的微陣列用所樹己的 eDNA ^fHt行探測、掃描載玻片並測量螢光3M。 ^m應於雜交 賊和表 駄平。
在一個，實施方案中，用定量實時PCR測量基因,。定量實時PCR 指在擴增過程中，禾IJ用螢光隨時間推移監控的聚合麟反應，以須懂與特殊序 列擴增禾g^對應的參數。在擴增f盾環期間，釋放的螢光量與PCR各個循環中 擴增的產物量成比例。本發明也預計將聚合物附著在固體基片的許多用途。這翻途包括基因表
達監控、特徵分析、文庫篩選、基因型分析和診斷法。美國專利號5,800,992、 6,013,449、 6,020,135、 6,033,860、 6,040,138、 6,177 248和6,309,822中顯示了 基因^i^控和特徵分析方法的實例。在USSN60/319253、 10/013,598和美國 專利號5,856,092、 6,300,063 、 5,858,659、 6,284,460、 6,361,947 、 6,368,799和 6，333，179中公開了基因型分析及其用途的實例。在美國專利號5，871，928、 5，902，723 、 6,045,996、 5,541,061和6,197,506中具體鋭了用途的其它實例。
在某^^實船案中，本發明也預計樣品製備方法。在鋭分析之前或 同時，通過多種機理可擴增核酸樣品，其中一些用到PCR。參見如，/>CK 7fec/iwo/ogy: /V/w^7/es owe/ JpWcaft'ora》r Z)iV^ Jwp/拆cato" (Ed. H. A. Erlich， Freeman Press, NY， NY, 1992)、屍C7 屍ratoco/y." CM^ ft M"/kw(f aw/脈/歸ora (Eds. Innis等，Academic Press, San Diego， CA, 1990)、Mattila等人的A^cfe/cMc油
19， 4967(1991); Eckert等人的PO Afe^ocfe owcMp; //caft'om 1, 17(1991)、 屍O (Eds. McPherson等，IRL Press, Oxford)以及美國專利號4,683^02、 4，683，195、 4,800,159、 4,965,188和5,333,675，出於所有目的，它們各自ttetb 鄉引用作為參考。可在陣列上擴增樣品。參見，例如，美國專利號6,300，070 和美國專利申請09/513,300， ^&fc弓間作為參考。
其它合適的擴增方法包括連接酶鏈反應(LCR)(如，Wu和Wallace的 Gfewwto4， 560(1989)、 Landegren等，5bfewe241, 1077(1988)以及Bairinger 等人的C 微狄117(1990))、 ^i:擴增(Kwoh等人的/yw. Ato/.爿ok/. <SW. OS4 86, 1173(1989)和W088/10315)、自動維持序列擴增(Guatelli等人的Pwc. Ato 爿a^ LS4， 87， 1874(1990)和WO90/06995)、靶多核苷,列的選擇性 擴增(美國專利號6，410"6)、，序列引物聚合,反應(CP-PCRX美國專利 號4,437,975)、任意引物聚合酶鏈反應(AP-PCR)(美國專利號5,413,909、 5,861^45)以及基於核酸的序列擴增(NABSA)(參見美國專利號5，409，818、 5，554，517和6，063，603，它們分別艦弓間作為參考)。在美國專利號5,242,794、 5，494，810、 4,988,617和USSN 09/854,317中描述了其它可用的擴增方法，它們 分別在此弓間作為參考。
例如，在Dong等人的Gewowe /toeorc/j 11, 1418 (2001)、美國專利號 6,361,947、 6，391，592和美國專利申請號09/916,135、 09/920,491、 09/910^292和10/013,598中，描述了用於斷賺,品M^度的樣品製備的其他方法和駄。 本領域中己經充分開發了實施多核苷麟交測定的方法。雜交測定力法和 割牛依賴於應用而變化，並根據已知的常規結合方法進at擇，包括下列中提 到的Maniatis等人的Afofecw/a^ C7o"/"g.v4 L360mto7MawMa/ (2nd Ed. Cold Spring Harbor, N. Y， 1989)、 Beiger和Kimmel的Afef/jo^/" ￡>z^wo/ogy, Vol.152, Gi^afe to M /ecw/ar C7o"f"g Tkr/zra^wes (Academic Press, Inc. ■ ， San Diego, CA ， 1987)、Young和Davism的P.N.A.S,肌'1194 (1983)。例如，在美國專利5,871,928、 5,874^19、 6,045,996和6,386,749、 6,391,623中已描述了用^t行重複的和控 制的雜交反應的方法和儀器，所述辨盼別在此弓間作為參考。
在某^^實施方案中，本發明也預計在配體之間雜交的信號檢測。參見, 例如，美國專利號5,143,854、 5,578,832、 5,631,734、 5,834,758、 5,936,324、 5,981,956、 6,025,601、 6,141,096、 6,185,030、 6 201，639、 6 218，803以及6,225,625、 美國臨時專利申請60/364,731和PCT申請PCT/US99/06097(公開號 W099/47964)'出於所有目的，它們也都分別^ltb^P弓間作為參考。
例如，在美國辨U號5，143，854、 5,547,839、 5，578，832、 5，631，734、 5，800，992、 5,834,758、 5,856,092、 5,902,723 、 5,936,324、 5,981,956、 6,025,601、 6,090,555、 6，141，096、 6,185,030、 6^01,639、 6^18,803和6^25,625、美國專利申請60/364,731 和PCT申請PCT/US99/06097(公開號W099/47964)中公開了用於強度數據的信 號檢測和處理的方法和儀器的實例，出於所有目的，它們也都分別在此鄉引 用作為參考。
本發明在實踐中也可〗頓常規生物方法、軟體和系統。本發明的計，軟 件產品通常包括具有用於實施本發明方法的邏輯步驟的計,可執行指令的計 算機可讀的介質。合適的計算機可讀的介質包括軟盤、CD~ ROM/DVD/DVDROM、硬碟驅動器、瞬時儲存器、ROM/RAM、磁帶等等。 計#^幾可執行指令可用雜的計,語言§)1^種語言的組合編寫。如，在Setubal 禾口 Meidanis等人的/"frtx/wcdort to Cow/ wtoft'o a/ 5Jo/ogy Afef/jocfe (FWS Publishing Company, Boston, 1997)、 Salzberg， Searles， Kasif， (Ed.)， Cow/ M加'ona/
Afofecw/<ar歷o/ogy(Elsevier ， Amsterdam ， 1998) 、 Rashidi禾口 Buehler'的 5wz'^& naft'Gs 5as7'cs: y4/y &'caft'ow 5fc>/og^ca/ 5Wewce Afecft'c/ne (CRC Press, London, 2000)，以及Ouelette禾口 Bzevanis的歷o爭/7wwft'cy.. J屍rac /a / C w^fey4na/聲&o/Genea K/^r te^s (Wiley & Sons, Inc., 2nd ed.， 2001)中描述了基本的 計對幾生物學旅。
本發明也可使用用於多種目的的多種計Mie^產品和軟體，例如弓i物設
計、娜管理、分析和儀纖作。參見，例如，美國專利號5，593，839、 5,795,716、 5,733,729、 5,974,164、 6,066,454、 6，090，555、 6,185,561、 6,188,783 、 6，223，127、 6,229,911以及6,308,170。
另夕卜，例如在美國專利申請10/063,559、 60/349,546、 60/376,003、 60/394,574、 60/403,381中所顯示的，本發明具有iM的實施方案，其包,過網絡(例如 網際網路),遺傳信息的方法。
貫穿本說明書，以範圍形式,本發明的多個方面。應當SH的是，說明 書的範圍形式僅僅為了方便和簡潔起見，且不應該^^釋為對本發明範圍的硬 性限制。因此，說明書範圍應當可理解為具體公開了該範圍內所有可能的子範 圍以及個別數值。例如，如從1至6的說明書範圍可被鵬為具體公開了子範 風如從1至3、從至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等等， 以及公開了該範圍內的個別數字，例如1、 2、 3、 4、 5和6。 1M用與範圍寬 度無關。另外，^^艦的例證體中也包括分數範圍。因此，例如1至3的範 圍包括例如l.l、 1.2、 1.3、 1.4、 1.5、 1.6等的分數。
差異DNA甲皿
本發明,分析DNA甲基化模式的方法，與患有或處於，鄉市病危險 的個體相比較，戶脫的DNA甲S^模式與麟個體口腔上鵬胞的基因特異 性相關。鵬只在差異DNA識別位點，，灘擇性切割的酶，可檢測戶腿的 差異甲謝七。例如，用只在被甲基化的DNA識別位點上進^t刀害啲酶，綱 只在未被甲靴的DNA識別位點上切割的酶，來消化DNA。本發明可f頓任 何育繼擇性切割麟個體的DNA區域但不切割患有或處於鄉劍市病危險的 個體的對應DNA區域的酶。
如文中所述，"甲基敏感型"酶是活性，於其DNA識別位點的甲基化 狀態的DNA限帝勝內切核酸酶。例如，存在只有在未被甲基化時切割其DNA 識別序列的甲纖感型酶。因此，未被甲靴的DNA樣品比甲靴DNA樣 品可被切割成更小尺寸。類似地，超甲基化DNA樣品不會被切割，且比普通 未被甲靴的DNA樣品產生更大的片段。與此相反，存在只有在被甲靴時切割其DNAi鄉j序列的甲纖感型酶。如文中戶脫，可鄉i頓術語"切割"、 "切"和"消化"。
適於本發明方激頓的、消化非甲靴DNA的甲纖感型鵬括，但不 限於，HpaH、 Hhal、 Madl、 BstUI和Acfl。用到的,酶是HpaH,其只切割 非甲割娘列CCGG。也可j飾只消化非甲靴DNA的甲^i型酶的組合。 只消化甲基化DNA的適宜自括，但不限於Dpnl和McrBC (New England BioLabs)。
M^:領域技術人員已知的標準方法，可分離從口腔上皮細胞樣品得至, DNAo在Sambrook等人的M fecw/ar歷o/ogy..」to rato/yy^pwflcA， Cold Spring Harbor, N. Y 1989和Ausubel等人的Cwt^ pratoco/sMo/ecw/or說o/ogy, Greene Publishing, Y, 1995中描述了 DNA分離的標準施。
選擇在特定位點切割DNA的限制酶的切割》法和禾將，對於技術人員而 言是已知的。例如，限制酶的許多供應商JH^定限制酶切割的DNA序列的 條件和種類的信息，包括New England BioLabs、 ProMega Biochems、 Boehringer-Mannheim等等。Sambrook等人(參見Sambrook等,M)fecw/or胸/ogK. 爿torato;7柳羅/|， Cold Spring Haibor, N. Y1989)鵬了限制,其它酶 的^ffi力法的常規描述。在本發明的方法中，伏選在能以95°/"00%效率來切 割DNA的^f牛下j^g酶。
檢測差異甲基化DNA的甲基多態性微的鑑定
本發明禾,在自和非MJi DNA中的差異作為鑑定甲基多態性機十的方 法。在一個實施方案中，本發明使用差異甲基化。在哺乳動物細胞中，甲基化 在基因鋭中起重要作用。例如，基因(啟動子和第一外顯子區)在鋭它們 的細胞中經常不被甲基化，且在不,它們的細胞種類中被甲基化。已經知道 甲基化改^^常出現御市癌中(Tsou等，2002)。榭"^異甲靴區域的DNA 片段進行測序，並篩選可用作本發明的生物銜己的多姚^E的雜。可在公 共 庫(例如NCBI)中尋找^13±測序發現多態性標記。通過iWT鑑定的 甲基多態性^iB在自個體中與患有或處於發展働市病(例如肺癌)危險的個 體中相比的關係，然後可將其用作^fe體異常的診斷。
通過本領域公知的任何方法，以及從而製備的對應於這些區域的探針和/ 或引物，可鑑定差異甲基化區域。在美國專利號5,871,917、 5,436,142和美國申請號US 20020155451A1和US 20030022215A1、 20030099997中描述了用於
鑑定差異甲靴區域的多種方法，其內^jtb弓間作為參考。
以下是如何鑑定在麟個體中與患有或處於鄉劍市病(例如肺癌)的個 體中相比差異甲基化的區域的實例。
在美國專利號5，871，917中描述了一種^r法。該方法MM用不^i刀割甲基 化DNA的CNG特異性P艮制酶切害綱試DNA對照DNA來檢測在CpNpG序 列的差異甲基化。該方制吏用偶聯了扣除雜交的一輪或多輪DNA擴增，來鑑 定差異甲基化的或突變的DNA片段。因此，戶脫^法可以有選銜也鑑定甲基 化不是基因組或超甲皿的基因組的區域。
實施DNA印跡絲確定分離的片段可檢測差異甲靴區域。用甲纖感 型酶切害頓 縱口對照基因組DNA，並Mim察用限制酶切割的DNA片段的大 小或3賊在樣品之間是否相同，來檢測特定位點的甲基化不足繊甲基化。通 過電泳分析並鵬針雜交測縱卩對照DNA樣品、以忍見麵個雜交復，的 大小或3破是否相同或是不同，來鄉該過程。在Sambnx)k等人的Afofecw/or .'爿/fl6omto^y脈/t ac/1, Cold Spring Hartior， N. Y 1989中可找到用於 7 電1^卩核,交^的具體方法。
然後篩選片旨列中可用作為本文所述的甲基多態性探針的多態性標己。 iiaJd^技術分離的,具有至少14個核苷,約200個核苷酸o
用於Jd^方法的^t限制酶的實例包括，但不限於BsiSI、 Hin21、 Msel、 Sau3A、 Rsal、 TspEI、 Mael、 Niaffl、 Dpnl等等。雌的甲纖感型酶是HpaII， 其可識另,切害排甲基化的CCGG序列，但不識別和切割外部的胞嘧啶被甲 靴的CCGG序列。
也可艦美國專利申請號2003009997中描述的方法，W^差異甲靴， 該^法公開了{頓可隨非甲^^甲靴DNA的酶，用於在兩種DNA源 之間鑑定差異甲皿的存在的方法。例如，用只切割非甲,DNA的甲 感型酶混合物(例如啤an、 Hhal、 Mael、 BstUI禾卩AciI)處旨自| 個體的 DNA，從而降解非甲皿DNA。然後用降解甲皿DNA的酶(例如McrBC， New England Biolabs)處S^自肺癌患者的DNA。然後扣除雜交可允許選#|4 提取在 個體和患有肺癌的個體之間是差異甲,的序列。
檢測差異甲基化的可選擇的方、M括二硫化物處理，隨後l)測序，或2) #異切割，隨後進行質i紛析，如von Wintzingenxie等人的2002, PNAS, 99.'70394戶腐，在此弓間作為參考。
為了作為探針，通過本領域任何已知方法可標記所鑑定的甲基多態性標 記，例如鵬摻入與以上限定的"報告肝"連接的核苷酸。
或者，所鑑定的甲基多態性1tia不必進行t斜己，並可用DingC.和CantorC R的2003， Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A. 100， 3059-64中描述的質譜擾術(在
此全部弓間作為參考)，將戶臓的^ia用於定s^^基因頻率。 應用
本發明的方法、核酸以及刮取^g可用於多種應用。 本發明預計鑑^t香菸煙霧,性應答，並因此顯示易例如受其致癌效應 的影響的吸菸者亞群，這使m)t們可^處於，劍市病危險的個體。如圖io
所示，月轆呈1LH個主要問題。儘管85%的月轆發5贓現在或以前的吸菸者中， 但只有15%的吸菸者^ ^市癌。第一個爭論問題是鑑定具有^^市癌的易
感性的那齡體，鄉早期診斷和予鵬起決定作用。當癌臓是高度局部化時,
可診斷15%的肺癌；JM"於這，人，5 ，活率是50%。然而，對於診斷具 有遠側癌的肺癌病人中的50%, 5特活率低於5%。因此，早期診斷起決定 作用。
此處和貫穿說明書所用的術語"對照"或短語"對照個體組"或"對照 個體"指至少一個個體，^S少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10個"t體，更 tt^M少10-100個個體或甚至10O1000個個體，認為他們的氣道已被暴露於 與測試個體或其診斷/預後/治療正被討論的個體相似的汙染物。作為對照，他 們是被衫^出的與測試個糊似的個體。例如，如果個體是吸菸者，則對照組 由相似年齡、人種和吸菸方式自齡的吸菸者組成。然而，如果個體是非吸菸 者，對照則來自非吸菸者組。
艦文中戶腿的方法診斷或治療的肺病，包括但不限於哮喘、慢性支氣管 炎、肺氣腫、支氣管擴張、原發糊市動脈高壓和急性呼吸窘迫症候群。文中所 述的方^^可用於診斷或治療涉及免疫系統的肺病，包括過敏粗市炎、嗜酸性 細鵬市炎和持續性真菌感染、肺纖維化、系統性硬化病、特發啦市含鐵血黃素 沉積症、肺泡蛋白沉積、肺癌(例如腺癌、鱗狀細胞癌、小細胞和大細胞癌和 肺的良性贅生物，包括支氣管腺瘤和錯構瘤)。Mil分析口腔上皮細胞中與J3鵬不同期相關的基因^i譜，本發明的一個 實施方案麟鑑定暴露於環發汙膽的個體(如患有或處於發臓市癌危險的 吸菸者)的方法。
在本發明的一個實施方案中，分離的口腔上皮細胞核酸可用於開發以非侵 入性方式實施的對多種狀況的診斷性測試，作為il31從口腔刮取細胞而不是通 過支氣管鏡檢査法得至御胞的常規鵬方法。一^NI合戶脫診斷的特別雌的 狀況JiM (包括，成為肺癌的危險)。
本發明的一個實施方案麟鑑定包含不同口麟鬆且的基因。 一個有用的 口腔轉影且包括在支氣管中表達的且，支氣管中的,受香菸煙霧影響的、 並也在口腔中,的基因。另一有用的轉錄組，癌診斷性口腔轉錄組。一種 用於鑑定包括肺癌診斷性口l^^組的基因的方法是:首先鑑定口,;t^且(如 上所述的)，然後確定這些基因中哪一些在患有肺癌的個體和1 個體的口腔 中^M異,的。
在一個實施方案中，我們現己鑑別出約166 4^括口麟影且的基因，即 在支氣管中皿的且，支氣管中的,受f^煙煙霧影響的、並也在口腔中表 達的基因，由下列基因鄉滅ABCC1、 ABHD2、 AF333388.1、 AGTPBP1、 AIP1、 AKR1B10AKR1C1、 AKR1C2、 AL117536.1、 AL353759、 ALDH3A1、 ANXA3、 APLP2、 ARHE、 ARL1、 ARPC3、 ASM3A、 B4GALT5、 BECN1、 Clorf8、 C20orfUl、 C5orf6、 C6orf80、 CA12、 CABYR、 CANX、 CAP1、 CCNG2、 CEACAM5、 CEACAM6、 CEI>6、 CHP、 CHST4、 CKB、 CLDNIO、 CNK1、 COPB2、 COX5A、 CPNE3、 CRYM、 CSTA、 CTGF、 CYP1B1、 CYP2A6、 CYP4F3、 DEFB1 、 DIAPH2、 DKFZP434J214、 DKFZP564K0822、 DKFZP566E144、 DSCR5、 DSG2、 EPAS1、 EPOR、 FKBP1A、 FLJ10134、 FLJ13052、 FLJ130521、 FLJ20359、 FM02、 FTH1 、 GALNT1 、 GALNT3 、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GGA1 、 GHTIM、 GMDS、 GNE、 GPX2、 GRP58、 GSN、 GS簡、GSTM5、 GUK1、 HIG1、 HIST1H2BK、 HN1 、 HPGD、 HRIHFB2122、 HSPA2、 IDH1 、 IDS、 IMPA2、 ITM2A、 JTB、 KATNB1、 KDELR3、 KIAA0397、 KIAA0905、 KLF4、 KRT14、 KRT15、 LAMP2、 LOC5腦、LOC57228、 LOC簡2、 LOC92689、 LYPLA1、 MAFG、 ME1、 MGC4342、 MGLL、畫E、 MT1F、固G、 MT1H、 MT1X、 MT2A、 NCOR2、 NKX3-1、 NQOl、 NUDT4、 ORLl、 P4HB、 PEX14、 PGD、 PRDX1、PRDX4、 PSMB5、 PSMD14、 PTP4A1 、 PTS、 RAB11A、 RAB2、 RAB7、 RAP1GA1 、 RNP24、 RPN2、 S100A10、 S100A14、 S證、SCP2、 SDR1、 SHARP1、 SLC簡、 SLC35A3、 SORD、 SPINT2、 SQSTM1、 SRPUL、 SSR4、 TACSTD2、 TALDOl、 TARS、 TCF7L1、 TTAM1、 TJP2、 TLE1、 IM4SF1、 TM4SF13、 TMP21、 TNFSF13、 ■、 TRA1、 TRIM16、 TXN、 TXNDC5、 TXNL、 TXNRD1、 UBE2J1、 UFD1L、 UGT1A10、 YF13H12以及ZNF463。這些符號f^HUGO鑑定符號。圖11列 出對應於這難因的各自轉錄物的詳細資料，包縱難因在吸菸者和非吸菸 者之間相比較的敏比率(正在吸菸者/從不吸鵬比率)以及p值，鄉示了 這，因在吸菸者和一鵬煙者中^ii差異的顯著性(正在吸菸者/從不吸菸者p 值)。圖11也顯示出現在包括HUGO、 GenBank和GO的l!^庫中的這些基因 的多種基因符號。也顯示了這些轉錄物的Affymetrix cDNA晶片定位。在一個 實施方案中，對這蝶因在患有肺癌的個體和麟個體之間的^t行比較， 以便鑑定生鄉繊診斷性口J^^且的基因。
在一個優選的實施方案中，另一口腔轉錄組由用它們的人類基因組組織 (HUGO)鑑定符號所鑑定的下列基因組成AGTPBP1、 AKR1C1、 AKR1C2、 ALDH3A1、 ANXA3、 CA12、 CEACAM6、 CLDNIO、 CYP1B1、 DPYSL3、 FU13052、 FTH1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GMDS、 GPX2、 畫、HSPA2、 MAFG、 ME1、 MGLL、 MMP10、 MT1F、固G、固X、 NQOl、 NUDT4、 PGD、 PRDX1 、 PRDX4、 RAB11A、 S100A10、 SDR1 、 SRPUL、 TALDOl 、 TARS、 TCF-3、 TRA1、 TRM16、 TXN以及TXNRD1。圖12列出對應於這 雖因的所鑑定轉錄物各自的詳細資料，包跪蝶因在吸菸者和非吸菸者之 間相比較的魏比率(吸菸者/非吸菸者鋭比率)以及p值，腿示了這錢 因在吸鵬和非吸菸者中^i^異的顯著性(吸菸者/非吸菸者p值)。在一個 ，實施方案中，比較這，因在患有肺癌的個體和 個體之間的 , 以 鑑定產創,診斷性口 ,錄組的基因。
本發明的一個優選實施方案提供鑑定"異常(outlier)"基因的方法，該基 因可作為對f^煙煙霧和其它空氣汙，的致癌，易感性的生物^H己。所述的 異常基因被定義為在處於汙染物(如對發展劍市癌的吸菸者的菸草煙霧)危險 的個體小亞群中趨異鋭的那難因；並朋脫的異常基因代鋭些吸菸者不 能提髙對煙# 4的適宜應答，以及可顯示，劍鵬增加風險的M。例如，艦前述的氣道轉錄組，我們鑑定了三銷在吸菸者的亞群，這些吸菸者不會
將許多主要的氧，殿異生素基因的^i上調至與其他吸菸者相同的程度。在 分析的6個月內，這艦'鵬中的一個賺劍鵬。財卜，我們發現了一個在 從不吸菸者中是異常的並以正在吸菸者的水平^i基因亞群的從不吸菸者。在 吸菸者小亞群中基因表達的這，異模式代^些吸菸者不能提高對煙霧接觸 的適宜應答，以及可顯示，^^癌增加風險的，Q
因此，在一個鄉方案中，本發明麟在吸鵬中確劍市病(例如肺癌)
增加的危險的方法，其包括從個體釆集氣道樣品；分析至少一種、,至少兩
種、還更^M少4種、還更tt^S少5種、還更^ms少6種、還更iMM
少7種、還更^fM少8沐還更tt^M少8種、腿更t^M少9種異常基
因的表達，其中與對照組相比，所避少一種、tms少兩種、還更it^S少
4禾中、還更^iS少5種、還更1^M少6種、還更i^iS少7種、還更,
至少8種、還更1MM少8種、且還更^M少9種的^ii偏差可指示正處於
發展鄉市病(例如肺癌)增加的危險的吸菸者o
在本發明的一個實施方案中，可從口腔上皮細胞獲得足夠的核酸，棘徵
在不同疾病狀態中超過6,000個基因的,^:。皿地，御巿癌的進展期。
在該實施方案中，M皮細胞分離的核酸可用於定義不同群體的基因表達(以 下稱為口腔轉影且)的正常模式，以鑑定可能影響轉錄組的因素，例如年齡、 性別、人種。類f鵬，已經證實吸菸者具有顯著改變的氣1±皮基因皿模式, 並且在個體停止吸菸後，在正在吸菸者中發生變化的基因中的許多保持異常。 包含特殊目的氣道轉錄組的基因中的一個亞群在口腔中，，並在本文中指口
腔轉影且。
本發明分離的核酸也可用於鑑定在患有肺癌的吸菸者的口腔上皮細胞中是 驗卜改變的基因，並可用於幵發"類別 翻IJ"算絲鑑定患有肺癌的吸菸者。 在吸菸者小亞群中基因，的趨異^f^些吸菸者不肖鵬高對煙霧接
觸的適宜應答，以及可顯示賺劍鵬增加風險的絲(Spim等，2004)。結果，
所述的耙基因可作為對香菸煙霧和其它空氣汙自的致癌效應易感性的生物標記。
因此，在一個實施方案中，本發明鵬在吸菸者中確定肺病(例如肺癌) 增加的危險的方法，其包括從個體採集口腔上皮細胞樣品；分析至少一種、優魅少兩種、還更iMM少4種、還更^ll少5種、還更^M少6種、還 更^S少7種、還更i^M少8種、還更i^M少8種、腿更^M處 部耙基因的泰逸，其中與對照組相比，戶，至少一種、1MM少兩種、還更優 選至少4種、還更皿至少5種、還更iMM少6種、還更^^M少7種、還 更^M少8種、還更tt^S少8種、腿更tt^M少鄉9種的遺傳變化可 指示正處於發,市病(例如， )增加的危險的吸菸者。
在一個優選的實施方案中，遺傳變化是基因鋭的增加的水平。在另一優 選實施方案中，遺傳變化是基因泰逸的降低的水平。在一個,實施方案中， 與 個體相比，遺傳變化是DNA甲基化中的偏差。
在一個特別優選的實施方案中，使用基於核酸晶片的測定，分離的RNA 可用於基因^i譜分析來一次分Hfi午多基因,徵。例如， <頓AfifymetrixU133 人基因毅陣列。
在另Ht別雌的實施方案中，本發明分離的RNA的用途可用於開刻市
皿顯示在從非吸菸者口腔中採集的生物樣品中ia因的增加^^降低 表達，本文公開的方^tii可用於顯示非吸菸者對環境汙染物的接觸。如果觀察 到所述的變化，貝何分析所暴露的個體的工作離住環境的齡個體組，且如 果在口麟魏敏中他們中樹可一個都不顯頑示的增加和斷氐，且他們可 能處於賺劍市病的和易受TO影響的更大危險中。例如，可4頓這些,絲 進行工作場所 分析，其中結果可用於評價個懶皮暴露於香菸煙霧、礦區煙 塵、鑽井煙塵、石棉和/或其它化學和/或物理氣道汙染物中的工作環境。篩選 可用於衫,自危險環境的高危險工人以轉移至低危險環境。
因此，在一個實施方案中，本發明麟鵬和診斷方絲,處於魏成 肺病(例如肺癌)危險的個體，其包括鵬口麟錄組的基因魏模式中的變 化。方、魏括從個體口腔獲得核酸樣品並測量根據本文,的口麟錄組的基 因轉錄物的^ii7jC平。雌測量口麟影且中至少兩種、還更^M少3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10種^^物，皿更i^M少l(M5、 15-20、 20-50種或建多 種轉錄物，且還更^^有基因的水平，其中與正常口腔,組相比，口腔轉 錄組中存在的至少一種、皿至少兩種、還更,至少三種、且還更iM至少 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1(M5、 15-20、 20-30、 3(M0、 40~50、 50-60、 60-70、70-80、 8(^85種基因的^iM異，可J際肺病增加的危險。對照JiM少一個、 優選多於一個暴露於相同汙染物的個體的組，並對暴露具有正常或健康的應 答。
在一個實施方案中，與這些 照中鋭的基因水平相比，在至少一種靶 基因中的差異，可J際處於鄉劍言病的增加的危險的個體。
在一個實施方案中，本發明il^預後肺病的方法，其包括在口腔轉錄組的
至少一個紀基因中檢汲瞎因鋭變化，其中與對照組相比，魏的增加可指示
發展卿市病的增加的危險。
在一個雌實施方案中，本發明,用於在長時間間隔期間(例如數周、 數月或甚至數年)鵬口腔轉影且中變化的方法。因此，在時間間隔(雌兩 個或更多個時間間隔，例如與年度Wt有關)中進行口腔轉彩且^ii分析，從 而使得可1^宗個體基礎中口,影且,模式的變化。本發明的m方法可用 於il^氣m^者在延長的時間段中所暴露的多種汙染物產生的應答。所述 汙鄉包括直接或間接暴露於香菸煙霧麟它空氣汙娜
本發明的方法和刮取體可用於研究位H道不同部分的上皮細胞損傷與 肺病(包括肺癌)的易感性、早期診斷和預後之間的聯繫。例如，本發明的生 物標己可用於來自口腔的核,品，以確定個體^l^fr病的易感性。類船也， 支氣管分析法可用於早期診斷，而肺自身組織分析法可涉及預後。在國際申請 PCT/US2004/18460中也描述了所述的方法，^&tb，引用作為參考。
本發明的方法和刮取驢可用於流行病學研究，包掛憤不同因素對肺病 發生劍市病發生危險的影響。用於所述的流行病學研究的具體目的因素包括， 但不限於人種因素、家方魏傳以及暴露於二手菸。
類似也，本發明的方法和刮取縫可用於臨床研究，包括從事新香菸的研 制，來iWT不同化學預防方法的效力，和評價^^t肺病發生鄉市病發生危險 的效果。
本發明具有許多,實施方案，並,於本領m術人員詳細知道的許多
專利、申請和其它參考文獻。因此，當貫穿說明書全文弓間或重複專利、申請 或其它參考文獻時，應當理解的是出於所有目的和出於弓l用的主張而將它們全 部引用作為參考。實施例
為了從口腔粘^±皮,完整RNA以用於研究吸菸對氣^±皮的生物學 效應，劍門已開發出相對非侵入性方法以用於從口腔獲得小量RNA。使用定 量實時PCR,我們已領懂了在個體^#中所衫^的基因的鋭，並已4頓新 近描述的、僅需要納克量的總RNA進行分析，並適於高通量分析個數百基因 的質譜法。
我們用微驗液管尖頭縱向切割，以相對非侵入性的模式從口腔黏膜收集 上皮細胞。隨後我們設計具有鋸齒>1^^凹面的標準塑料工具。它是5/16英寸 寬、1 6/16英寸長，具有3英寸手柄，當具有收集的細胞的刮取工具被插入含 有l ml RNA later溶液(Qiagen, Valencia, CA)的2 ml微量離心管時，該手柄可 折斷。該工具具有兩個允許從口腔黏膜收集大量高質量的RNA的部件；可刮 取幾層上皮細胞的精細鋸齒^i^:，和收集細胞的凹表面。用輕柔壓力，將鋸 齒狀ii^t著面頰內部的口腔黏膜刮擦(十次)，並立即將收集的細胞浸入1 cc RNAlater溶液(Qiagen， Valencia, CA)。在4'C穩定4tft多24小時後，用TRIzol 試劑(Invhrogem Carlsbad, CA)根據製造商規程從細胞沉澱分離來自口腔上皮 細胞的總RNAo在RNA變銜 ±證^^瞇的情況中RNA的完整性(參見 圖6)。 M^細胞沉艦糊胞離'lXThermoShandonCytospin， Pittsbuigh, PA) 並用細胞角蛋白抗辦Signet, DedhamMA)皿，來定量上皮細胞^4 (圖7)。 4頓i^順呈，我們已育縱齡受微獲得3004500 ng RNA (平均值+A標縫 =983+A667ng)。
對於該研究中所有麟的受微而言，該方法具有良好的耐受性，並且在 刮取過程中^t後沒有受^fi聖受、數或鄉。我們試過許多其它體，包括 內窺鏡細胞刷(cytobrush) (CELEBRITY Endoscopy Cytology Brush, Boston Scientific, Boston, MA)、 Cell Lifter(ComingInc., Corning, NY)、巴氏塗片(pap smear)試齊檢以腿舌板，且4頓戰夫順呈並不能獲得大量完整RNA。財卜， 我們已發現與將細Jtl:接^A TRIzd1相比，上皮細胞在RNAJater的儲存顯 著提高RNA完整性的保存。我們己發現在分離RNA之前，細胞也能在 RNAlater中室溫保存最多24小時。
為了iWT從口腔黏膜細胞收集的RNA的生物識性，我們測難定數目 的解毒相，因(預計其通ffi觸f^煙煙霧可能發生變化7)和參與細胞粘附的基因的^ii。禾iJ用，的娜呈，從12個從不吸菸者和14正在吸菸者中麟 了口腔黏膜脆。
i^ffi定量實時RT-PCR8來測M^自3個從不吸菸者和2個正在吸;W的 樣品的NAD(P)H脫氣酶、醌l(NQOl)、醛脫MH家族3成員A1(ALDH3A1)以 及癌胚抗原相關的細J^佔附肝5(CEACAM5)的魏(參見圖8A和表1A)。 在^H草煙霧的患者中，NQOl、 ALDH3A1和CEACAM5的平均^ii分別 增長了7、 2和3倍。用競爭PCR和基質輔助激，TO子化(MALDI)飛行時 間(TOF)質譜(MS)6,我們測量了 7個從不吸菸者和10個正在吸菸者中 ALDH3A1、 NQOl和CEACAM5的表達(圖犯和表1B)。與從不吸菸者相 比，在吸菸者中所有3個基因的毅都上調，對於ALDH3A1和NQ01具有統 計學上顯著的變化。
這對開究4樣第一種以非侵入性方錄口腔黏膜細胞獲得RNA以用於測 量基因表達的成功方法。該方法可用於了解口腔中涉及的多種疾病的分子機 理，用BTO對吸入的汙染物(例如香菸煙霧)的應答和其弓胞的損傷、以及 iWT吸入的傳^J的診斷和生物影響，和用於開發氣道和肺癌的簡單、早期診 斷性生物標記(可應用於篩選有危險的群體)。質譜系統允許短時間段內高通 量分析大量基因(100-200)，並適於大量樣品的大量 。表1:用於由QRT-PCR和MALDI TOF MS測量的3個基因的正向和反
向引物
A.用於QRT-PCR的引物
ALDH3A1正向 CEACAM5正向 NQOl正向 ALDH3A1反向 CEACAM5反向 NQOl反向
5,-ATG GGA TCC TAC CAT GGC AAG-3' [SEQ IDNO:l〗
5，-GTC TTG TTT CCC AG A TTT CA<3 GAA-3, [SEQ ID NO:2]
5、TGG GAG ACA GCC TCT TAC TTG C-3，SEQIDNO:3]
5，-GCG GCG GTG AGA GAA AGT CT-3'SEQIDNO:4]
5,-AGA GTG GAT AGC TTA AAA GAA AAA AAG TTT C-3，SEQIDNO:5]
5，-CAG CTC GGT CCA ATC CCT TC.3, [SEQIDNO:6]
B.用於競爭PCR和MALDI-TOFMS的引物
PCR
引物
ALDH3A1
正向
CEACAM5
正向
NQOl正向
ALDH3A1
反向
5、ACGTTGGATGCACTGAAAGAGTTCTACGGG-3' [SEQIDNO:7]
5，-ACGTTGGATGATGTGAAACCCAGAACCCAG-3， [SEQIDNO:8]
5 '-ACGTTGGATGCCAC AGAAATGCAGAATGCC-3' [SEQIDNO:9]
5 ，-ACGTTGGATGCGGGCACTAATGATTCTTCC-3' [SEQ ID NO: 10CEACAM5
反向
NQOl反向
延伸
引物 ALDH3A1-B CEACAM5-E NQ01-E
5，-ACGTTGC5ATGTCCGGGCCATAGAGGACATT-3， [SEQIDNO:ll]
5,-ACGTT(3<3ATGTGTACTCTCTGCAAGGGATC-3, [SEQIDNO:12]
5,-GGGAAGATGCTAAGAAATC-3， [SEQIDNO:13〗
5，-CAGGCGCAGTGATTCA(3T-3' 〖SEQIDNO:14]
5'-GAATGCCACTCTGAATT-3, [SEQIDNO:15]1. King, I. B., J. Satia-Abouta, M. D. Tho，ist, J. Bigler, R- E. Patterson, A. R. Kristal， A. L. Shattuck, J. D. Potter, E. White, and J， S. Abouta. 2002. Buccal cell DNA yield, quality, and collection costs: comparison of methods for laTge scae studies. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev餘11:1130-1133,
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此^B^^f有文獻都弓l用作為參考。
權利要求
1. 一種試劑盒，其含有i)用於收集生物樣品的刮取裝置，其包括；a)近側的手柄端；b)遠側的收集端；和c)手柄端和收集端之間的連接部分；其中連接部分在寬度上與其兩側的手柄端和收集端通常是連續的；並且連接部分允許手柄端和收集端可任選地彼此分開；和其中收集端還包含外周緣和凹部，其中所述的收集部分的至少一些外周緣是鋸齒狀的，以允許刮取生物樣品，並且凹部允許收集刮取的生物樣品；ii)儲存容器；和iii)穩定溶液。
2. 權利要求l戶脫的試劑盒，其中戶脫的收集端是勺狀的。
3. 權利要求i戶脫的試劑盒，其中戶;f^t包含塑料。
4. 權利要求1戶脫的試劑盒'其中0f^i接部雜含穿孔。
5. 權利要求1戶脫的試劑盒，其中從大約手柄^5端到麟鵬端的裝 置長度約是3-6英寸。
6. 權利要求1戶脫的試劑盒，其中^端長度約是1-2英寸。
7. 權利要求1臓的試劑盒，其中,端的長度和寬度允許蝶鵬合 儲存容器。
8. 權利要求1戶腿的試劑盒，其中戶腿樣品包含來自^#的口腔黏膜 的上皮細胞。
9. 權利要求l戶臓的試劑盒，其中戶瓶生,品含有核酸。
10. 權利要求1戶脫的試劑盒，其中戶脫核,自RNA和DNA。
11. 權利要求l戶脫的試劑盒，其中戶; ^儲存^i含有蓋子。
12. 權利要求ll戶艦的試劑盒，其中戶;MM子附著於儲存容器。
13. —種RNAiB^系統，其包括(a)具有近側的手柄端、包含鋸齒微卜周緣的遠側收集端和手柄端和收 集端之間的連接部分的刮取裝置，其中連接部分允許手柄端和收集端可任選地彼此分開；和(b)包含RNA穩定溶液的儲存容器。
14. 權利要求13臓的試劑盒，其中^M儲存容器含有蓋子。
15. 權利要求14戶，的試劑盒，其中戶;f3M子附^f儲存，。
16. —種用於從口腔黏膜1{^±皮細胞的試劑盒，其包括(a) 具有近側的手柄端、包含鋸齒狀外周緣的遠側收集端和手柄端和收 集端之間的連接部分的刮取裝置，其中連接部分允許手柄端和收集端可任選地 彼此分開；和(b) 包含腿穩定溶液的儲存容器。
17. —種用於獲得分離自口腔上皮細胞的核酸的非侵入性方法，其包括(a) 將從受蹄口腔非侵入性分離的細胞轉入可滅活核酸酶的核酸穩定 溶液中，和(b) 從分離的細胞提取目的核酸，以獲得分離的核酸樣品。
18. —種用於^核,品的刮取CT,其包括-a) 近側的手柄端；b) 遠側的收集端；和c) 手柄端和麟端之間的連接部分；其中連接部分在寬度上與其兩側的手柄端和lfe^M常Ji^的；並且連 接部分允許手柄端和收集端可任艦彼此分開；且其中收集端還包含外周緣和 凹部，其中戶腿的收集部分的至少一些外周緣是鋸齒狀的，以允許刮取核酸樣 品，且凹部允許,刮取的核酸樣品。
19. 一種1|^#品的方法，其包^^驟(a) 鄉具有近側手柄端、包含鋸齒微卜周緣的遠側收集端和手柄端和 收集端之間的連接部分的刮取裝置；(b) 鄉含有職穩定溶液的儲存容器；(c) 用收集端的鋸齒微卜周緣從^#口腔的口腔黏膜刮取上皮細胞；(d) 將刮取的上皮細胞收穀括IJ^S的收集端中；(e) 將刮取的上皮細胞轉入儲存容器；和(f) 旋轉刮取裝置手柄，以使裝置手柄端在連接部分與收集端分開，從 而使得儲存容器包含RNA儲存液、刮取的樣品以及刮取裝置的t^^端。
20. 權利要求17戶脫的方法，其中戶腐核酸是RNA。
21. 權利要求17戶脫的方法，其中Mffl刮取裝置進^^取，從口腔非 侵入性地分離細胞。
22. 權利要求21戶腿的方法，其中戶腿刮取錢是能以相對非侵入性的 方式從口腔黏膜收集大量上皮細胞的塑料工具，其中該塑料工具包含可刮下幾 層上皮細胞的鋸齒^lti^fBil^^些細胞的凹表面。
23. 權利要求20戶脫的方法，其中在從樣品提取RNA之前，將RNA穩 定溶液中刮取的細胞樣品保存於-15至-25'C。
24. 權利要求23戶服的方法，其中戶腿RNA穩定溶液是RNALaterRNA穩 定試劑。
25. —種用於檢測口腔黏膜上皮細胞樣品中目的ia因衰達的方祛，其包括(a) 用權利要求17戶脫的方法，從口腔粘Rh皮細胞分離核酸樣品；(b) 將步驟a)中分離的核酸樣品^至少一種特異雜交目的耙基因的核 酸探針；和(c) 在核酸樣品中檢測戶，目的IES因的存在。 . 權利要求24戶做的施，其中臓目的基因在患有肺癌的受微中 ，而不在未患肺癌的^t中，。
26. 權利要求25所述的方法，其中在實施步W))之前，將所述的目的耙 基因附著於固相。
27. 權利要求25所述的方法，其中所述核酸是RNA。
28. 權利要求25戶脫的方法，其中戶;f^核酸是DNA。
29. 包^1l碼下列的基因的口,影且.'ABCC1、 ABHD2、 AF333388.1、 AGTPBP1、 AIP1、 AKR1B10AKR1C1、 AKR1C2、 AL117536.1、 AL353759、 ALDH3A1、 ANXA3、 APLP2、 ARHE、 ARL1、 ARPC3、 ASM3A、 B4GALT5、 BECN1、 Clorf8、 C20o戲、C5orf6、 C6orf80、 CA12、 CABYR、 CANX、 CAP1、 CCNG2、 CEACAM5、 CEACAM6、 CED"6、 CHP、 CHST4、 CKB、 CLDN10、 CNK1、 COPB2、 COX5A、 CPNE3、 CRYM、 CSTA、 CTGF、 CYP1B1、 CYP2A6、 CYP4F3、 DEFB1、 DIAPH2、 DKFZP434J214、 DKFZP564K0822、 DKFZP566E144、 DSCR5、 DSG2、 EPAS1、EPOR、 FKBP1A、 FLJ10134、 FU13052、 FUB0521、 FLJ20359、 FM02、 FTH1、 GALNT1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GGA1、 GHTTM、 GMDS、 GNE、 GPX2、 GRP58、 GSN、 GSTM3、 GSTM5、 GUK1、 HIG1、 MST1H2BK、 HN1、 HPGD、 HRIHFB2122、 HSPA2、 IDH1、 IDS、 IMPA2、 ITM2A、 JTB、 KATNB1、 KDELR3、 KIAA0397、 KIAA0905、 KLF4、 KRT14、 KRT15、 LAMP2、 LOC51186、 LOC57228、 LOC92482、 LOC92689、 LYPLA1、 MAFG、 ME1、 MGC4342、 MGLL、 MT1E、 MT1F、 MT1G、 MHH、 MT1X、 MT2A、 NCOR2、 NKX3-1、 NQOl、 NUDT4、 ORLl、 P4HB、 PEX14、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 PSMB5、 PSMD14、 PTP4A1、 PTS、 RAB11A、 RAB2、 RAB7、 RAP1GA1、 RNP24、 RPN2、 S100A10、 S100A14、 S證、SCP2、 SDR1、 SHARP 1、 SLC17A5、 SLC35A3、 SORD、 SPINT2、 SQSTM1、 SRPUL、 SSR4、 TACSTD2、 TALDOl、 TARS、 TCF7L1、 HAM1、 TJP2、TLE1、 TM4SF1、 TM4SF13、 1MP21、 ，SF13、 TNS、 TRA1、 TRIM16、 TXN、 TXNDC5、 TXNL、 TXNRD1、 UBE2J1、 UFD1L、 UGT1A10、 YF13H12以及ZNF463。
30. 包,碼下列的基因的口,影且AGTPBP1、 AKR1C1、 AKR1C2、 ALDH3A1、 ANXA3、 CA12、 CEACAM6、 CLDN10、 CYP1B1、 DPYSL3、 FU13052、 FIH1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GMDS、 GPX2、 ■、 HSPA2、 MAFG、 ME1、 MGLL、 MMP10、 固F、顧G、顧X、 NQOl、 NUDT4、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 RAB11A、 S100A10、 SDR1、 SRPUL、 TALDOl、 TARS、 TCF-3、 TRA1、 TRIM16以及 TXNo
31. —種確定個體是否處於,劍市病的增加的危險中的方法，其包括a) 從暴露於氣道汙染物或處於暴露於氣道汙^l:險中個體的口腔採集生物樣品；和b) 分析權利要求29的口腔轉錄組基因中的至少一個基因是否出現遺 傳變化，其中與對照個體組中至少一個相同基因相比，在口腔轉^^且基因的一 個或多個中的遺傳變化的存在，可^^個M有^M^市病的增加危險。
32. 權利要求31所述的方法，其中所^t傳變皿自基因的DNA甲基化模式偏差和基因的^ii模式偏差。
33. 權利要求32戶腿的方法，其中戶;f^t傳變化是基因的敏模式偏差。
34. 權利要求33戶脫的方法，其中戶腐空氣汙鄉絲自香菸或雪茄的 煙霧，朋湖輪慰轆。
35. 權利要求34戶腿的方法，其中戶細鵬選自腺癌、鱗狀細胞癌、小 細胞癌、大細胞癌以刻市良性贅生物。
36. 權利要求34或35戶脫的方法，其中戶;M個體是吸鵬，並JA們檢 查至少一y^自口腔轉錄組基因的基因的表達，其中與自應的吸菸者對照組中相比，在吸菸者中至少一個基因的更低泰逸，是發展劇市癌的危險增加的指
37. 權利要求36戶腿的方法，其中口腔轉錄組的至少三個基因的更低表 達，是發展湖市癌的危,加的J際。
38. 權利要求34或35戶脫的方法，其中戶脫個體是吸菸者，並且人們檢 查至少一4^自口腔轉錄組基因的基因的泰逸，其中與M應的吸菸者對照組 中相比，在吸菸者中至少一個基因的更高表達，是發展鄉市癌的危險增加的指 示。
39. 權利要求38自的方法，其中選自口腔轉錄組基因的至少三個基因 的更高鋭，是發展劍轆的危,力啲J際。
40. 權利要求34或35戶服的方法，其中戶; ^個體是吸鵬，並且人們檢 査至少一個選自編碼原癌基因的口,錄組的基因的，，其中與M應的吸 煙者對照組中相比，在吸菸者中至少一個基因的更高，，是發展劍市癌的危 險增加的矛標。
41. 權利要求40所述的方法，其中編碼原癌基因的每個口腔轉錄組中至 少一個基因的更高表達，是，湖鵬的危險增加的指示。
42. 權利要求34或35戶脫的方法，其中0M個體是吸菸者，並且人們檢 查至少一個選自編碼腫瘤抑制基因的口腔轉影且的基因的泰達，其中與M應 的吸菸者對照組中相比，在吸菸者中至少一個基因的更低,，是發展劍巿癌 的危卩魏加的J際。
43. 權利要求42戶，的方法，其中編碼腫瘤抑制基因的^口腔轉錄組 中至少一個基因的更^^達，是^^i市癌的危險增加的^^。
44. —種診斷吸菸者患肺病的素因的方法，其包括在從吸菸者口腔採集的 生物樣品中分析一種或多種選自下歹啲基因的表達模式ABCC1、 ABHD2、AF333388.k AGTPBP1、 AIP1、 AKRIBIOAKRICI、 AKR1C2、 AL117536.1、 AL353759、 ALDH3A1、 ANXA3、 APLP2、 ARHE、 ARL1、 ARPC3、 ASM3A、 B4GALT5、 BECN1、 Clorf8、 C20orfUl、 C5orK、 C6orf80、 CA12、 CABYR、 CANX、 CAP1、 CCNG2、 CEACAM5、 CEACAM6、 CEI>6、 CHP、 CHST4、 CKB、 CLD扁、CNK1、 COPB2、 COX5A、 CPNE3、 CRYM、 CSTA、 CTGF、 CYP1B1 、 CYP2A6 、 CYP4F3 、 DEFB1 、 DIAPH2 、 DKFZP434J214 、 DKFZP564K0822、 DKFZP566E144、 DSCR5、 DSG2、 EPAS1、 EPOR、 FKBP1A、 FLJ10134、 FLJ13052、 FU130521 、 FLJ20359、 FM02、 FTH1 、 GALNT1 、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GGA1、 GHITM、 GMDS、 GNE、 GPX2、 GRP58、 GSN、 GSTM3、 GSTM5、 GUK1、 HIG1、 HS丁1H2BK、訓、HPGD、 HRIHFB2122、 HSPA2、 IDH1、 IDS、 MPA2、 ITM2A、 JTB、 KATNB1、 KDELR3、 KIAA0397、 KIAA0905、 KLF4、 KRT14、 KRT15、 LAMP2、 LOC5脳、 LOC57228、 LOC92482、 LOC92689、 LYPLA1、 MAFG、廳、MGC4342、 MGLL、 MT1E、 MT1F、 MT1G、 MT1H、 MT1X、 MT2A、 NCOR2、 NKX3-1、 NQOl、 NUDT4、 ORLl、 P4HB、 PEX14、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 PSMB5、 PSMD14、 PTP4A1、 PTS、 RAB11A、 RAB2、 RAB7、 RAP1GA1、 RNP24、 RPN2、 S100A10、 S100A14、 S100P、 SCP2、 SDR1、 SHARP1、 SLC17A5、 SLC35A3、 SORD、 SPINT2、 SQSTM1、 SRPUL、 SSR4、 TACSTD2、 TALDOl、 TARS、 TCF7L1、 TIAM1、 TJP2、 TLE1、 TM4SF1、 TM4SF13、 TMP21、 TNFSF13、 TNS、 TRA1、 TRIM16、 TON、 TXNDC5、 TXNL、 TOSIRD1、 UBE2J1、 UFD1L、 UGT1A10、 YF13H12以及ZNF463;其中與這些基因^t照個體組的^ii模式 相比， 一種或多種這，因的趨異^i模式是個體患肺病的素因的^t^。
45. —種診斷吸菸者患肺病的素因的方法，其包括在從吸菸者口腔採集的 生物樣品中分析一種或多種選自下列的基因的^ii模式AGTPBP1、 AKR1C1、 AKR1C2、 ALDH3A1、 ANXA3、 CA12、 CEACAM6、 CLDNIO、 CYP1B1、 DPYSL3、 FLJ13052、 FTH1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GMDS、 GPX2、蘭、HSPA2、 MAFG、 ME1、 MGLL、 MMP10、固F、固G、 MT1X、 NQOl、 NUDT4、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 RAB11A、 S100A10、 SDR1、 SRPUL、 TALDOl 、 TARS、 TCF-3、 TRA1、 TRM16以及TXN;其中與這些基因^1" 照個體組的，模式相比， 一種或多種這些基因的趨異^ii模式是個體患肺病的素因的，^。
46. —種診斷不吸菸者患肺病的素因的方法，其包括抓不吸菸者口腔採 集的生物樣品中分ITO自異常基因的一種或多種基因的表達模式，其中與不發 展^W癌的那些吸菸者相比，異常基因定義為那些在發展劍市癌的吸菸者亞群 中趨異，的基因，其中與這,因，照個體組的表達M相比， 一種或多種的這，因的趨異^i模^h體患肺病的素因的指示。
47. 權利要求45或46所述的方袪，其中所淑市病慰市癌。
48. 權利要求47戶脫的方法，其中戶;f^M癌選自腺癌、鱗狀細胞癌、小 細胞癌、大細自以 良性贅生物。
49. 權利要求3M8任一項戶脫的方法，其中戶腿生,品是核酸樣品。
50. 權利要求49戶脫的方法，其中戶;M核酸是RNA或DNA。
51. 權利要求50所述的方法，其中用核酸陣列實施分析。
52. 權利要求50所述的方法，其中用定量實時PCR自譜法實施分析o
全文摘要
本發明涉及用於收集生物樣品的刮取裝置，和涉及用該刮取裝置獲得來自口腔黏膜上皮細胞的核酸的非侵入性方法。所述的核酸可用於例如基因表達譜分析，包括評價與氣道汙染物相關的肺病危險。
文檔編號A61B10/02GK101420907SQ200480040286
公開日2009年4月29日 申請日期2004年11月12日 優先權日2003年11月12日
發明者A·斯皮拉, J·S·布羅迪 申請人:波士頓大學信託人