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Sars冠狀病毒的細胞毒性t細胞表位肽及其用途的製作方法

2023-10-05 00:23:59 2

專利名稱:Sars冠狀病毒的細胞毒性t細胞表位肽及其用途的製作方法
技術領域:
本發明涉及SARS冠狀病毒的細胞毒性T細胞表位肽及其用途。
背景技術:
重症急性呼吸系統症候群(SevereAcute Respiratory Syndrome, SARS)是一種由新型SARS冠狀病毒(SARS-CoV)引起的致死率高的新發感染性疾病。自2003年在中國爆發以來,已有8000人以上感染,約800人死亡。然而,尚未有有效的預防、治療方法。SARS 發生以後,已鑑定出作為SARS的致病病毒的SARS病毒(非專利文獻1),並確定了其鹼基序列(非專利文獻2)。SARS冠狀病毒是屬於單鏈(+) RNA病毒的冠狀病毒科的新種類的冠狀病毒。SARS 冠狀病毒基因組非常大,有29. 7kb (非專利文獻2、,根據推測編碼23個蛋白質。作為主要的結構蛋白,有刺突(Spike、1256aa)、核殼體(Nucleocapsid、423aa)、膜(Membrane、222aa) 和較小的包膜(Envelope,77aa)0作為非結構蛋白,有2個多聚蛋白ppla(4382aa、序列號 31 ;GenBank收錄號AAP13439)和pplM2696aa),利用蛋白酶可以位點特異性地從這些多聚蛋白中切出各個蛋白質。現有技術文獻非專利文獻非專利文獻1 =Ksiazek, T. G. et al.,N. Engl. J. Med. 348 1953-1966 (2003)非專利文獻2 =Marra, Μ. A. et al.,Science 300 :1399-1404(2003)非專利文獻3 :Yang, Ζ. Y. et al.,Nature 428 :561-564(2004)非專利文獻4 :ffang. Y. D. et al.,J. Virol. 78 :5612-5618 (2004)非專利文獻5 :Chen, H. et al.,J. Immunol. 175 :591-598 (2005)非專利文獻6 :Zhou, Μ. et al.,J. Immunol. 177 :2138-2145(2006)

發明內容
發明所要解決的課題迄今為止,已有利用編碼刺突蛋白的DNA疫苗來誘導病毒中和抗體的報導(非專利文獻3)。有效的防禦反應需要體液免疫和細胞免疫,在涉及SARS冠狀病毒的領域中,與體液免疫相比,細胞免疫的研究尚未取得進展。細胞免疫中對於病毒防禦發揮重要作用的是細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymph0Cyte、CTL),SARS冠狀病毒特異性CTL活性的調控可能成為針對SARS冠狀病毒的新的治療方法。從該觀點出發,希望鑑定SARS冠狀病毒蛋白中抗原性強的CTL表位肽。作為SARS冠狀病毒特異性的CTL表位肽,到目前為止已經鑑定了幾種來自作為結構蛋白的刺突蛋白的部分肽(非專利文獻4 6)。但是,關於來自非結構蛋白的CTL表位肽,目前還沒有任何報導。本發明的目的在於提供SARS冠狀病毒的新的CTL表位肽。更具體而言,本發明的目的在於提供包含來自SARS冠狀病毒ppla蛋白的新的CTL表位的肽、肽結合核糖體和抗原呈遞細胞。另外,本發明的目的還在於提供以該肽、肽結合核糖體或抗原呈遞細胞為有效成分的SARS冠狀病毒特異性的HLA-A2限制性CTL的誘導劑、用於治療或預防SARS冠狀病毒感染的疫苗等。解決課題所採用的手段為了鑑定迄今尚未報導過的來自SARS冠狀病毒的CTL表位,本發明人進行了以下的研究。首先,著眼於SARS冠狀病毒的非結構蛋白ppla蛋白,從預測的表位候選肽中選擇 30種肽。然後,確認了肽對作為MHC I類分子的HLA-A2分子具有結合親和力,並發現了表位候選肽中特別有9種肽具有顯著的CTL誘導活性。進而,通過用包含肽的肽結合核糖體進行免疫,可知可誘導CTL以及在體內活化CTL應答。基於上述見解,本發明人使提供包含來自SARS冠狀病毒ppla蛋白的新的CTL表位的肽成為可能,從而完成了本發明。即,本發明提供一種肽,其包含選自由序列號10、11、12、13、15、17、18、23和對組成的組中的胺基酸序列。另外,本發明的肽優選包含選自由序列號10、12、15、17和對組成的組中的胺基酸序列,更優選包含序列號M的胺基酸序列。本發明的肽的特徵在於,其為包含SARS冠狀病毒特異性的細胞毒性T細胞表位的肽,是包含HLA-A2限制性細胞毒性T 細胞表位的肽。本發明提供一種肽結合核糖體,其是在核糖體的表面結合有肽的肽結合核糖體, 其中,核糖體含有磷脂和穩定劑,所述磷脂包含具有ι個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基;肽為選自上述肽中的至少1種。上述磷脂優選為包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基的磷脂,更優選為具有油醯基的磷脂。另外,上述磷脂優選為選自二醯基磷脂醯絲氨酸、二醯基磷脂醯甘油、二醯基磷脂酸、二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、琥珀醯亞胺基-二醯基磷脂醯乙醇胺和馬來醯亞胺-二醯基磷脂醯乙醇胺中的至少1種。通過使核糖體中所含的磷脂具備這樣的構成,能夠有效地增強用於殺傷病原體感染細胞的CTL,從而能夠預防、治療感染症。上述穩定劑優選為膽固醇。通過該構成,能夠使上述核糖體更穩定。上述肽優選結合在上述核糖體所含的磷脂上。由此,能夠將肽呈遞到核糖體表面, 從而能夠更有效地誘導SARS冠狀病毒特異性的CTL。另外,本發明的肽結合核糖體中,優選核糖體具有以下的組成。(A)包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的磷脂1 99. 8摩爾% ;(B)穩定劑:0· 2 75摩爾%。另外,本發明的肽結合核糖體優選以下的組成。(I)包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的酸性磷脂1 85摩爾% ;(II)包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的中性磷脂0. 01 80摩爾% ;(III)結合有選自上述肽中的至少1種的、包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為 14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的磷脂0. 2 80摩爾% ;
(IV)穩定劑0. 2 75摩爾%。本發明提供一種抗原呈遞細胞,其是通過使表達細胞表面抗原HLA-A2的細胞在體外與選自上述肽中的至少1種接觸而製備的。上述細胞優選為自體來源的細胞,優選為同種來源的細胞。另外,本發明還提供一種SARS冠狀病毒特異性的HLA-A2限制性CTL的誘導劑,其含有選自上述肽中的至少1種、上述肽結合核糖體或上述抗原呈遞細胞作為有效成分。本發明提供一種用於預防SARS冠狀病毒感染的疫苗,其含有選自上述肽中的至少1種、上述肽結合核糖體或上述抗原呈遞細胞作為有效成分。此外,本發明提供對需要提供針對SARS冠狀病毒的免疫性的對象提供免疫性的方法,其中,包括對上述對象給予選自上述肽中的至少1種、上述肽結合核糖體或上述抗原呈遞細胞。本發明提供對需要提供針對SARS冠狀病毒的免疫性的對象提供免疫性的方法, 其中,包括從上述對象採集細胞,使細胞在體外與選自上述肽中的至少1種接觸而製備抗原呈遞細胞,將抗原呈遞細胞回輸給上述對象。上述細胞優選為淋巴系單核細胞,更優選為樹突細胞。發明的效果本發明提供包含來自SARS冠狀病毒ppla蛋白的新的CTL表位的肽、肽結合核糖體和抗原呈遞細胞。另外,通過該肽、肽結合核糖體或抗原呈遞細胞,可誘導CTL以及在體內活化CTL應答,因此,本發明的肽、肽結合核糖體和抗原呈遞細胞均可以作為用於排除 SARS冠狀病毒的CTL誘導劑和/或疫苗來使用。另外,由於非結構蛋白在病毒感染的過程中比結構蛋白更早合成,因此,通過利用來自非結構蛋白PPla蛋白的CTL表位來活化免疫反應,能夠期待在病毒感染初期排除病毒的效果。


圖1是利用流式細胞儀獲得的用肽結合核糖體免疫的小鼠的CD8和IFN- γ的染色圖。圖2是利用流式細胞儀獲得的用刺突-1203肽結合核糖體免疫的小鼠的CD8和 IFN-Y的染色圖。圖3是利用流式細胞儀獲得的用CFSE標記的抗原呈遞細胞加強免疫的小鼠的 CFSE的染色圖。
具體實施例方式以下,對用來實施本發明的最佳實施方式進行詳細說明。本發明中的肽是包含來自SARS冠狀病毒ppla蛋白的CTL表位的肽,具體可以舉出包含選自由序列號10、11、12、13、15、17、18、23和24組成的組中的胺基酸序列的肽、以及由選自由序列號10、11、12、13、15、17、18、23和對組成的組中的胺基酸序列構成的肽。另外,優選選自由序列號10、12、15、17和M組成的組中的胺基酸序列,更優選序列號M的胺基酸序列。這些肽包含HLA-A2限制性CTL表位,更具體而言,包含HLA-A*0201限制性CTL 表位。另外,本發明的肽在不損害原來的CTL表位活性的條件下,可以以各種形式(例如未變性、融合體、糖基化、非糖基化等)使用,可以包含C末端修飾(醯胺化、酯化、醛化等)、N 末端修飾(乙醯化、生物素化、螢光標記等)和官能團的化學修飾(磷酸化、硫酸化、生物素
寸乂 O這裡,關於肽的合成,可以根據通常的肽化學中使用的方法來進行。作為公知的肽合成方法,可以舉出文獻(Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ;The Proteins, Vol 2,Academic Press Inc.,New York, 1976 ;^ 7° 千卜『合成,丸善株式會社, 1975;^ 千K合成Q基礎i實驗,丸善株式會社,1985 ;醫藥品的開發続第14卷·《子卜「合成,廣川書店,1991)等中記載的方法。以上所述的本發明的肽通過使用一種或將兩種以上組合,能夠作為SARS冠狀病毒特異性的HLA-A2限制性CTL的誘導劑和/或用於治療或預防SARS冠狀病毒感染的疫苗使用。即,本發明的肽能夠與HLA-A2分子結合,通過呈遞給表達HLA-A2分子的細胞而強烈地誘導CTL,因此,本發明的肽能夠作為用於排除SARS冠狀病毒的CTL誘導劑和/或疫苗使用。本發明的肽結合核糖體中所用的核糖體是指具有封閉空間的磷脂雙層膜。本發明的肽結合核糖體中所用的核糖體含有磷脂和穩定劑,所述磷脂包含具有1 個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基。作為磷脂,優選使用包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基的磷脂。包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基的磷脂中,醯基的碳原子數優選為16 22,更優選為18 22,最優選為18。作為醯基,具體可以舉出棕櫚油醯基、油醯基、瓢兒菜基(Erucoyl)等,最優選為油醯基。包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 24的烴基的磷脂中,烴基的碳原子數優選為16 22,更優選為18 22,最優選為18。作為烴基,具體可以舉出十四碳烯基、十六碳烯基、十八碳烯基、C20單烯基、C22單烯基、C24 單烯基等。磷脂所具有的甘油殘基的1-位和2-位上結合的不飽和醯基或不飽和烴基可以相同也可以不同。從工業上的生產率的觀點出發,優選1-位和2-位的基團相同。從使CTL活性增強至實用上足夠的水平的觀點出發,優選磷脂包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基。當醯基的碳原子數少於13時,有時核糖體的穩定性變差、或者CTL活性增強效果不充分。另外,當醯基的碳原子數超過M時,有時核糖體的穩定性變差。作為包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的磷脂,可以舉出酸性磷脂、中性磷脂、具有能夠結合肽的的官能團的反應性磷脂等種類。這些磷脂可以根據各種要求適當選擇其種類和比例。作為酸性磷脂,可以使用磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯肌醇等。從使 CTL活性增強至實用上足夠的水平的觀點和工業上的供給性、作為醫藥品使用的品質等觀點出發,優選使用包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基的二醯基磷脂醯絲氨酸、二醯基磷脂醯甘油、二醯基磷脂酸和二醯基磷脂醯肌醇。酸性磷脂給核糖體的表面提供陰離子性電離基團,因而會賦予核糖體表面負性的ζ電位。因此,核糖體能夠獲得電荷排斥力,從而在水性溶劑中作為穩定的製劑而存在。這樣,酸性磷脂在確保水性溶劑中的核糖體的穩定性的方面是非常重要的。作為中性磷脂,例如可以使用磷脂醯膽鹼等。本發明中能夠使用的中性磷脂,可以在實現CTL活性增強效果的範圍內適當選擇其種類和量來使用。與酸性磷脂和結合有肽的磷脂相比,中性磷脂使核糖體穩定化的功能強,能夠提高膜的穩定性。從該觀點出發,本發明的肽結合核糖體中使用的核糖體優選含有中性磷脂。可以在確保用於實現CTL活性增強效果的酸性磷脂、用於肽結合的反應性磷脂和穩定劑的含量的基礎上,確定中性磷脂的使用裡。本發明的肽通過與核糖體中所含的、包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M 的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的磷脂結合而結合到核糖體的表面上。作為用於結合該肽的磷脂,可以使用具有肽能夠結合的官能團的反應性磷脂。包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 24的烴基的反應性磷脂,可以根據各種要求適當選擇其種類和比例。與前述磷脂同樣,反應性磷脂中也不優選磷脂中所含的不飽和醯基或不飽和烴基的碳原子數超過M或者少於14 的情況。作為反應性磷脂,可以舉出磷脂醯乙醇胺或其末端改性物。另外,磷脂醯甘油、磷脂醯絲氨酸、磷脂酸、磷脂醯肌醇和它們的末端改性物也可以作為反應性磷脂使用。從工業上的獲得性、與肽的結合工序的簡便性、收率等的角度出發,優選使用磷脂醯乙醇胺或其末端改性物。磷脂醯乙醇胺在其末端具有能夠結合抗體的氨基。另外,從使CTL活性增強至實用上足夠的水平的角度以及在核糖體中的穩定性和工業上的供給性、作為醫藥品使用的品質等的角度出發,最優選使用包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基的二醯基磷脂醯乙醇胺或其末端改性物。二醯基磷脂醯乙醇胺例如可以通過以二醯基磷脂醯膽鹼為原料,使用磷脂酶D使膽鹼與乙醇胺發生鹼交換反應而得到。具體而言,將溶解有二醯基磷脂醯膽鹼的氯仿溶液與溶解有磷脂酶D和乙醇胺的水以適當比率混合,可以得到粗反應物。利用氯仿/甲醇/ 水性溶劑,將粗反應物用矽膠柱純化,可以得到目標二醯基磷脂醯乙醇胺。本領域技術人員可以適當選擇溶劑組成比等柱純化條件來實施。作為末端改性物,可以舉出在二醯基磷脂醯乙醇胺的氨基上結合有二元反應性化合物的一個末端的二醯基磷脂醯乙醇胺末端改性物。作為二元反應性化合物,可以使用在至少一個末端上具有能夠與二醯基磷脂醯乙醇胺的氨基反應的醛基或琥珀醯亞胺基的化合物。作為具有醛基的二元反應性化合物,可以舉出乙二醛、戊二醛、丁二醛、對苯二甲醛等。優選為戊二醛。作為具有琥珀醯亞胺基的二元反應性化合物,可以舉出二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)、乙二醇-雙(琥珀醯亞胺基丁二酸酯)、雙琥珀醯亞胺基丁二酸酯、雙琥珀醯亞胺基辛二酸酯或雙琥珀醯亞胺基戊二酸酯等。另外,作為一個末端具有琥珀酞亞胺基、另一個末端具有馬來醯亞胺基的二元反應性化合物,可以舉出N-琥珀醯亞胺基4-(對馬來醯亞胺苯基)丁酸酯、磺基琥珀酞亞胺基-4-(對馬來醯亞胺苯基)丁酸酯、N-琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺苯基)乙酸酯、 N-琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺苯基)丙酸酯、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺乙基)_環己烷-1-羧酸酯、磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺乙基)-環己烷-1-羧酸酯、 Ν-(Υ-馬來醯亞胺丁醯氧基)琥珀醯亞胺、Ν-(ε-馬來醯亞胺己醯氧基)琥珀醯亞胺等。 當使用這樣的二元反應性化合物時,能夠得到具有馬來醯亞胺基作為官能團的二醯基磷脂醯乙醇胺末端改性物。通過將以上所述的二元反應性化合物的一個末端的官能團結合在二醯基磷脂醯乙醇胺的氨基上,能夠得到二醯基磷脂醯乙醇胺末端改性物。作為在核糖體的表面結合肽的方法,例如可以舉出製備含有上述反應性磷脂的核糖體,然後添加肽使肽與核糖體中的反應性磷脂結合的方法。另外,通過預先使肽與反應性磷脂結合,然後,將所得的肽結合反應性磷脂與除反應性磷脂以外的磷脂和穩定劑混合,也可以得到表面結合有肽的核糖體。在反應性磷脂上結合肽的方法是本技術領域公知的。本發明的肽結合核糖體中使用的核糖體含有至少1種、例如含有2種以上、優選含有3種以上包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的磷脂。例如,本發明的肽結合核糖體中使用的核糖體含有選自二醯基磷脂醯絲氨酸、二醯基磷脂醯甘油、二醯基磷脂酸、二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、琥珀醯亞胺基-二醯基磷脂醯乙醇胺和馬來醯亞胺-二醯基磷脂醯乙醇胺中的至少1種、例如2種以上、優選3種以上的、包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M 的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的磷脂。另外,本發明的肽結合核糖體中使用的核糖體優選分別含有至少1種下述磷脂包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的酸性磷脂、包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的中性磷脂,和包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的反應性磷脂。本發明中,作為核糖體的穩定劑,可以使用固醇類或生育酚類。作為固醇類,只要是一般作為固醇類已知的物質即可,例如可以舉出膽固醇、谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇等,從容易獲得等觀點出發,特別優選使用膽固醇。作為生育酚類,只要是一般作為生育酚已知的物質即可,例如,從容易獲得等觀點出發,優選舉出市售的α-生育酚。此外,只要不損害本發明的效果,本發明的肽結合核糖體中使用的核糖體也可以含有能夠構成核糖體的、公知的核糖體構成成分。作為本發明的肽結合核糖體中使用的核糖體的組成,例如可以舉出以下組成(A)包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的磷脂1 99. 8摩爾% ;(B)穩定劑:0· 2 75摩爾%。需要說明的是,各成分的含量以相對於肽結合核糖體的全部構成成分的摩爾百分 t匕來表不。從核糖體的穩定性的觀點出發,上述成分㈧的含量優選為10 90摩爾%、更優選為30 80摩爾%、進一步優選為50 70摩爾%。從核糖體的穩定性的觀點出發,上述成分(B)的含量優選為5 70摩爾%、更優選為10 60摩爾%、進一步優選為20 50摩爾%。當穩定劑的含量超過75摩爾%時, 核糖體的穩定性受損,因而不優選。上述成分(A)中包含以下物質(a)未結合有肽的、包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1 個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的磷脂,和
(b)結合有肽的、包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的磷脂。上述成分(a)的含量通常為0. 01 85摩爾%、優選為0. 1 80摩爾%、更優選為0. 1 60摩爾%、進一步優選為0. 1 50摩爾%。上述成分(b)的含量通常為0. 2 80摩爾%、優選為0. 3 60摩爾%、更優選為 0. 4 50摩爾%、進一步優選為0. 5 25摩爾%。當含量低於0. 2摩爾%時,肽量減少,因而難以使CTL活化至實用上足夠的水平,當超過80摩爾%時,核糖體的穩定性下降。上述成分(a)的磷脂中通常含有上述的酸性磷脂和中性磷脂。另外,上述成分(b) 的磷脂中含有上述的反應性磷脂。酸性磷脂的含量通常為1 85摩爾%、優選為2 80摩爾%、更優選為4 60 摩爾%、進一步優選為5 40摩爾%。當含量低於1摩爾%時,ζ電位減小,核糖體的穩定性降低,另外,難以使CTL活化至實用上足夠的水平。另一方面,當含量超過85摩爾%時, 作為其結果,核糖體中的肽結合磷脂的含量下降,難以使CTL活化至實用上足夠的水平。中性磷脂的含量通常為0.01 80摩爾%、優選為0. 1 70摩爾%、更優選為 0. 1 60摩爾%、進一步優選為0. 1 50摩爾%。當含量超過80.0摩爾%時,核糖體中所含的酸性磷脂、肽結合磷脂和核糖體的穩定劑的含量下降,難以使CTL活化至實用上足夠的水平。結合有肽的磷脂是肽結合在所述的反應性磷脂上而得到的,關於反應性磷脂與肽結合的比例,可以在不妨礙本發明效果的範圍內,通過適當應用結合所用的官能團的種類、 結合處理條件等來進行選擇。例如,在使用在二醯基磷脂醯乙醇胺的末端氨基上結合二元反應性化合物雙琥珀醯亞胺基丁二酸酯的一個末端而得到的二醯基磷脂醯乙醇胺的末端改性物作為反應性磷脂的情況下,通過選擇結合處理各條件,能夠使10 99%的反應性磷脂與肽結合。此時,未與肽結合的反應性磷脂成為酸性磷脂而含有在核糖體中。作為本發明的肽結合核糖體的優選方式,可以舉出以下的組成(I)包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的酸性磷脂1 85摩爾% ;(II)包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的中性磷脂0. 01 80摩爾% ;(III)結合有選自上述肽中的至少1種的、包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為 14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的磷脂0. 2 80摩爾% ;(IV)穩定劑0. 2 75摩爾%。(總計100摩爾%)作為本發明的肽結合核糖體中使用的核糖體的更優選的方式,可以舉出以下的組成上述成分(I) 2 80摩爾%上述成分(II) 0. 1 70摩爾%上述成分(III) :0·3 6O摩爾%上述成分(IV) 10 70摩爾%
(總計100摩爾%)作為本發明的肽結合核糖體中使用的核糖體的進一步優選的方式,可以舉出以下的組成上述成分(I) 4 60摩爾%上述成分(II) 0. 1 60摩爾%上述成分(III) :0.4 5O摩爾%上述成分(IV) 20 60摩爾%(總計100摩爾%)作為本發明的肽結合核糖體中使用的核糖體的特別優選的方式,可以舉出以下的組成上述成分(I) 5 40摩爾%上述成分(II) 0. 1 50摩爾%上述成分(III) :0· 5 25摩爾%上述成分(IV) 25 55摩爾%(總計100摩爾%)雖然肽結合核糖體中使用的核糖體中的磷脂中所含的不飽和醯基或不飽和烴基的特徵碳原子數為14 對是本發明的特徵,但是在不妨礙本發明效果的範圍內,也可以含有包含碳原子數少於14或超過M的不飽和醯基或不飽和烴基的磷脂。相對於本發明的肽結合核糖體中使用的核糖體中的磷脂所含的全部不飽和醯基或不飽和烴基的總數,碳原子數為14 M的不飽和醯基或不飽和烴基數的比例例如為50%以上、優選為60%以上、更優選為75%以上、進一步優選為90%以上、最優選為97%以上(例如實質上為100% )。本發明的肽結合核糖體中使用的核糖體在不妨礙本發明的效果的情況下,可以含有包含碳原子數為14 M的範圍的酞基或烴基的除磷脂以外的脂質。該脂質的含量通常為40摩爾%以下、優選為20摩爾%以下、更優選為10摩爾%以下、進一步優選為5摩爾% 以下(例如實質上為0摩爾%)。本發明中使用的核糖體可以通過使用作為構成成分的磷脂、反應性磷脂、穩定劑、 肽等,適當進行配合或加工,並將其添加到適當的溶劑中等方法而得到。例如可以舉出擠壓法、渦流攪拌法、超聲波法、表面活性劑去除法、反相蒸發法、乙醇注入法、預囊泡法(1 VO夕 >法)、弗氏壓碎器法、W/0/W型乳液法、退火法、凍融法等製造方法。核糖體的粒徑沒有特別限定,從保存穩定性等的角度出發,粒徑可以舉出20 600nm、優選為30 500nm、更優選為40 400nm、進一步優選為50 300nm、最優選為70 230nm。需要說明的是,本發明中,為了提高核糖體的理化穩定性,在核糖體的製備過程中或製備後,可以在核糖體的內水相和/或外水相中添加糖類或多元醇類。特別是需要長期保存或製劑化過程中需要保存的情況下,優選添加並溶解糖或多元醇作為核糖體的保護劑,並通過冷凍乾燥除去水分製成磷脂組合物的冷凍乾燥物。作為糖類,例如可以舉出葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖等單糖類;蔗糖、乳糖、纖維二糖、海藻糖、麥芽糖等雙糖類;棉籽糖、松三糖等三糖類;環糊精等寡糖;糊精等多糖類;木糖醇、山梨糖醇、廿露醇、麥芽糖醇等糖醇等。這些糖類中,優選單糖類或雙糖類,其中,從容易獲得等的角度出發,更優選舉出葡萄糖或蔗糖。
作為多元醇類,例如可以舉出甘油、二甘油、三甘油、四甘油、五廿油、六甘油、七甘油、八甘油、九甘油、十甘油、聚甘油等甘油類化合物;山梨糖醇、甘露醇等糖醇類化合物; 乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、五乙二醇、六乙二醇、七乙二醇、八乙二醇、九乙二醇等。其中,從容易獲得的角度出發,優選列舉甘油、二甘油、三甘油、山梨糖醇、甘露醇、分子量為400 10000的聚乙二醇。核糖體的內水相和/或外水相中所含的糖類或多元醇類的濃度以相對於核糖體溶液的重量濃度計,例如可以舉出1 20重量%,優選舉出2 10 重量%。製造本發明的肽結合核糖體時,通過在製作肽結合前的核糖體之後使其與肽結合,能夠簡便地得到肽結合核糖體。例如,製備含有磷脂、穩定劑和用於在膜表面結合肽的反應性磷脂的核糖體、例如核糖體溶液,在其外水相中添加2 10重量%左右的前述糖類之一的蔗糖並溶解。將該糖添加後的製劑轉移到IOml的玻璃制小瓶中,置於層式冷凍乾燥機內,冷卻至_40°C等使試樣凍結後,利用常規方法得到冷凍乾燥物。這裡得到的核糖體的冷凍乾燥物已經除去了水分,因此能夠長期保存,然後根據需要添加特定的肽而實施後續步驟,由此能夠快速簡便地得到本發明的肽結合核糖體。在肽與核糖體的相互作用強因而不穩定性強的情況下等,像這樣以核糖體的冷凍乾燥物的階段進行保存,並在需要時結合肽來使用是非常簡便的。本發明的肽結合核糖體中使用的核糖體可以含有結合有肽的磷脂。作為得到含有結合有肽的磷脂的核糖體的方法,可以舉出以下的㈧和⑶的方法。(A)製備含有磷脂、反應性磷脂、穩定劑的核糖體,向其中添加肽和二元反應性化合物,使核糖體中含有的反應性磷脂的官能團與肽的官能團通過二元反應性化合物連接。 這裡可使用的二元反應性化合物可以同樣地使用在反應性磷脂的末端改性物製備中所用的二元反應性化合物。具體而言,作為具有醛基的二元反應性化合物,可以舉出乙二醛、戊二醛、丁二醛、對苯二甲醛等。優選舉出戊二醛。另外,作為具有琥珀醯亞胺基的二元反應性化合物,可以舉出二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)、乙二醇-雙(琥珀醯亞胺基丁二酸酯)、雙琥珀醯亞胺基丁二酸酯、雙琥珀醯亞胺基辛二酸酯或雙琥珀醯亞胺基戊二酸酯等。 另外,作為一個末端具有琥珀醯亞胺基、另一個末端具有馬來醯亞胺基的二元反應性化合物,可以使用N-琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺苯基)丁酸酯、磺基琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺苯基)丁酸酯、N-琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺苯基)乙酸酯、N-琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺苯基)丙酸酯、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺乙基)_環己烷-1-羧酸酯、磺基琥珀醯亞胺基-4- (N-馬來醯亞胺乙基)-環己烷-1-羧酸酯、N- ( γ -馬來醯亞胺丁醯氧基)琥珀醯亞胺、Ν-( ε -馬來醯亞胺己醯氧基)琥珀醯亞胺等。使用所述二元反應性化合物時,能夠得到具有馬來醯亞胺基作為官能團的反應性磷脂(例如磷脂醯乙醇胺)的末端改性物。(B)製備含有磷脂、反應性磷脂、穩定劑的核糖體,向其中添加肽而使核糖體中所含的反應性磷脂的官能團與肽的官能團連接而結合的方法。作為所述㈧和⑶中的鍵的種類,例如可以舉出離子鍵、疏水鍵、共價鍵等,優選為共價鍵。進而,作為共價鍵的具體例子,可以舉出席夫鹼鍵、醯胺鍵、硫醚鍵、酯鍵等。以上的2種方法均能夠在核糖體中所含的反應性磷脂上結合肽,從而形成核糖體中結合有肽的磷脂。
上述(A)的方法中,作為使原料核糖體與肽通過二元反應性化合物相結合的方法的具體例子,例如可以舉出利用席夫鹼鍵的方法。作為通過席夫鹼鍵將核糖體與肽結合的方法,可以舉出製備表面具有氨基的核糖體,在核糖體的懸浮液中添加肽,然後,加入作為二元反應性化合物的二醛,使核糖體表面的氨基與肽中的氨基通過席夫鹼而結合的方法。作為該結合順序的具體例子,例如可以舉出以下的方法。(A-I)為得到表面具有氨基的核糖體,在核糖體原料脂質(磷脂、核糖體的穩定劑等)中混合包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的反應性磷脂(例如,磷脂醯乙醇胺),製成核糖體表面存在規定量的氨基的核糖體。(A-2)向上述核糖體懸浮液中添加肽。(A-3)然後,加入戊二醛作為二元反應性化合物,進行規定時間的反應從而在核糖體與肽之間形成席夫鹼鍵。(A-4)然後,為使剩餘的戊二醛的反應性失活,在核糖體懸浮液中加入廿氨酸作為含氨基的水溶性化合物並使其反應。(A-5)通過凝膠過濾、透析、超濾、離心分離等方法,除去未結合到核糖體上的肽、 戊二醛與甘氨酸的反應產物和剩餘的甘氨酸,得到肽結合核糖體懸浮液。作為上述(B)的方法的具體例子,可以舉出在磷脂膜中引入具有能夠形成醯胺鍵、硫醚鍵、席夫鹼鍵、酯鍵等的官能團的反應性磷脂的方法。作為這樣的官能團的具體例子,可以舉出琥珀醯亞胺基、馬來醯亞胺基、氨基、亞氨基、羧基、羥基、巰基等。作為引入到核糖體中的反應性磷脂的例子,可以使用前述的包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 24的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的反應性磷脂(例如磷脂醯乙醇胺)的氨基末端的末端改性物。作為該結合順序的具體例子,以使用二醯基磷脂醯乙醇胺的情況為例如下進行說明。(B-I)通過公知的方法,使包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基的二醯基磷脂醯乙醇胺與雙琥珀醯亞胺基丁二酸酯僅在一個末端發生反應,得到末端具有琥珀醯亞胺基作為官能團的、結合有雙琥珀醯亞胺基丁二酸酯的二醯基磷脂醯乙醇胺。(B-2)通過公知的方法,將上述結合有雙琥珀醯亞胺基丁二酸酯的二醯基磷脂醯乙醇胺與其它核糖體構成成分(磷脂、穩定劑等)混合,製成表面具有琥珀醯亞胺基作為官能團的核糖體組合物。(B-3)在上述核糖體組合物懸浮液中加入肽,使肽中的氨基與磷脂膜表面的琥珀醯亞胺基反應。(B-4)通過凝膠過濾、透析、超濾、離心分離等方法除去未反應的肽、反應副產物等,得到含有肽結合磷脂的核糖體懸浮液。使核糖體與肽結合時,以多數情況下作為官能團含有的氨基或巰基為對象在實用上是優選的。以氨基為對象時,通過與琥珀醯亞胺基反應,能夠形成席夫鹼鍵。以巰基為對象時,通過與馬來醯亞胺基反應,能夠形成硫醚鍵。本發明中的抗原呈遞細胞是通過使表達細胞表面抗原HLA-A2的細胞在體外與1 種或2種以上的肽接觸而製備的細胞。細胞優選為自體來源和/或同種來源的細胞。另夕卜,作為細胞,可以舉出表達細胞表面抗原HLA-A2(例如HLA-A*0201)的細胞。優選為淋巴系單核細胞(T細胞、巨噬細胞、B細胞、樹突細胞等),更優選為樹突細胞。本發明的抗原呈遞細胞通過給予(注入)對象,能夠作為SARS冠狀病毒特異性的 HLA-A2限制性CTL的誘導劑和/或用於治療或預防SARS冠狀病毒的感染的疫苗使用。即, 本發明的抗原呈遞細胞將本發明的肽呈遞到細胞表面,能夠強烈地誘導CTL,因此能夠作為用於排除SARS冠狀病毒的CTL誘導劑和/或疫苗使用。抗原呈遞細胞優選每IO7的細胞使用優選1 100 μ Μ、更優選5 50 μ Μ、例如10 μ M的肽而製備的抗原呈遞細胞。本發明的肽、肽結合核糖體和抗原呈遞細胞能夠作為SARS冠狀病毒特異性的 HLA-A2限制性CTL的誘導劑和/或用於治療或預防SARS冠狀病毒感染的疫苗使用。對象可以是包括人在內的任何動物。在特定的實施方式中,對象為人。本發明的誘導劑和/或疫苗根據作為有效成分的物質的性狀製成一般的醫藥組合物的形態,組合物的直接遞送一般通過非經口的注射(例如皮下注射、腹腔內注射、靜脈內注射、肌肉內注射、組織間隙的空間內的注射等)來實現。作為其它給予方法,可以舉出黏膜給予(例如,經口、滴鼻或經肺)、經眼的給予、經皮的給予和栓劑。S卩,非經口給予的情況下,可以以注射劑、經鼻劑、局部給予劑(經皮劑等)、直腸給予劑等給予形態給予。經口給予的情況下,可以以本領域中通常使用的給予形態給予。作為注射劑,例如可以舉出無菌的溶液或懸浮液、乳劑等,具體可以舉出水、水-丙二醇溶液、 緩衝液、0. 4%的生理鹽水等。另外,製成液態製劑的情況下,可以冷卻保行或者通過冷凍乾燥等除去水分後進行保存。冷凍乾燥製劑在使用時加入注射用蒸餾水等,再溶解後使用。作為局部給予劑,例如可以舉出霜劑、軟膏、洗劑、經皮劑等。作為經口劑或直腸給予劑,例如可以舉出膠囊、片劑、丸劑、散劑、滴劑、栓劑、液體劑等。以上的劑型通過本領域中通常實施的方法與藥學上可容許的賦形劑、添加劑一起製成製劑。作為藥學上可容許的賦形劑、添加劑,可以舉出載體、結合劑、香料、緩衝劑、增粘劑、著色劑、穩定劑、乳化劑、分散劑、助懸劑、防腐劑、PH調節劑、滲漲度調節劑、浸潤劑等。 另外,作為藥學上可容許的載體,例如可以舉出碳酸鎂、乳糖、果膠、澱粉、甲基纖維素等。含有本發明的肽、肽結合核糖體或抗原呈遞細胞作為有效成分的誘導劑、以及含有本發明的肽、肽結合核糖體或抗原呈遞細胞作為有效成分的疫苗,為了增強其效果,還可以含有佐劑。作為佐劑,可以舉出氫氧化鋁凝膠、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、百日咳菌佐劑、聚(I C)、CpG-DNA等。其中,優選CpG-DNA。CpG-DNA是含有非甲基化CpG基序的DNA, 通過活化樹突細胞,能夠增強本發明的肽、肽結合核糖體或抗原呈遞細胞的CTL誘導效應。製劑中的本發明的肽的給予量、製劑的給予次數因症狀、年齡、體重、給予形態等的不同而不同,通常為0. Olyg lmg、優選為0. 1 μ g 500 μ g、更優選為l.Oyg 100μ g,優選以該劑量幾天至幾個月給予1次。例如,在初始免疫(即,治療性或預防性給予)時對於成人患者給予1. O μ g 500 μ g的肽,根據患者血液中的特異性CTL活性測定所反映的患者的應答和狀態,在幾周至幾個月後按照加強療法在其後進行1. 0 μ g 100 μ g 的肽的加強給予。另外,本發明的抗原呈遞細胞的給予細胞數優選為IO9 IO6個、更優選為IO8 IO7個,可以根據症狀、年齡、體重、給予形態等進行適當調整。實施例以下,基於實施例更具體地說明本發明,但本發明不限於以下的實施例。
(實施例1:CTL表位的預測)使用兩種表位預測計算機軟體BIMAS(URL :http//www-bimas. cit. nih. gov/ molbio/hla_bind/)和 SYFPEITHI (URL :http://www. syfpeithi. de/)對 ppla 的候選表位進行檢索。從以HLA分子HLA-A*0201和肽長度9 10胺基酸殘基為對象的檢索中選出 30種在兩種分析方法中均顯示高預測分值的表位候選肽。這30種表位候選肽的胺基酸序列如表1所示。對於30種表位候選肽,分別製作合成肽,並對實際能夠作為表位起作用的肽進行檢索,為進一步分析鑑定出的9種表位肽的功能進行以下的實施例1 6。[表1]
權利要求
1.一種肽,其包含選自由序列號10、11、12、13、15、17、18、23和24組成的組中的胺基酸序列。
2.一種肽結合核糖體,其是在核糖體的表面結合有肽的肽結合核糖體,其中,核糖體含有磷脂和穩定劑,所述磷脂包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基;肽為選自權利要求1所述的肽中的至少1種。
3.如權利要求2所述的肽結合核糖體,其中,所述磷脂為包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基的磷脂。
4.如權利要求2所述的肽結合核糖體,其中,所述磷脂為具有油醯基的磷脂。
5.如權利要求2所述的肽結合核糖體,其中,所述磷脂為選自二醯基磷脂醯絲氨酸、 二醯基磷脂醯甘油、二醯基磷脂酸、二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、琥珀醯亞胺基-二醯基磷脂醯乙醇胺和馬來醯亞胺-二醯基磷脂醯乙醇胺中的至少1種。
6.如權利要求2所述的肽結合核糖體,其中,所述穩定劑為膽固醇。
7.如權利要求2所述的肽結合核糖體,其中,在核糖體中所含的、包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的磷脂上結合有選自權利要求1所述的肽中的至少1種。
8.如權利要求2所述的肽結合核糖體,其中,核糖體具有以下的組成(A)包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的磷脂1 99. 8摩爾% ;(B)穩定劑0.2 75摩爾%。
9.一種肽結合核糖體,其具有以下的組成(I)包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的酸性磷脂1 85摩爾% ;(II)包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的中性磷脂0. 01 80摩爾% ;(III)結合有選自權利要求1所述的肽中的至少1種、且包含具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的醯基或具有1個不飽和鍵的碳原子數為14 M的烴基的磷脂0. 2 80摩爾% ;(IV)穩定劑;0.2 75摩爾%。
10.一種抗原呈遞細胞,其是通過使表達細胞表面抗原HLA-A2的細胞在體外與選自權利要求1所述的肽中的至少1種接觸而製備的。
11.如權利要求10所述的抗原呈遞細胞,其中,所述細胞為自體來源的細胞。
12.如權利要求10所述的抗原呈遞細胞,其中,所述細胞為同種來源的細胞。
13.—種SARS冠狀病毒特異性的HLA-A2限制性CTL的誘導劑,其中,含有選自權利要求1所述的肽中的至少1種作為有效成分。
14.一種用於預防SARS冠狀病毒感染的疫苗,其中,含有選自權利要求1所述的肽中的至少1種作為有效成分。
15.一種SARS冠狀病毒特異性的HLA-A2限制性CTL的誘導劑,其中,含有權利要求2 9中任一項所述的肽結合核糖體作為有效成分。
16.一種用於預防SARS冠狀病毒感染的疫苗,其中,含有權利要求2 9中任一項所述的肽結合核糖體作為有效成分。
17.—種SARS冠狀病毒特異性的HLA-A2限制性CTL的誘導劑,其中,含有權利要求 10 12中任一項所述的抗原呈遞細胞作為有效成分。
18.一種用於預防SARS冠狀病毒感染的疫苗,其中,含有權利要求10 12中任一項所述的抗原呈遞細胞作為有效成分。
19.如權利要求13或15所述的SARS冠狀病毒特異性的HLA-A2限制性CTL的誘導劑, 其中,還含有CpG-DNA。
20.如權利要求14或16所述的用於預防SARS冠狀病毒感染的疫苗,其中,還含有 CpG-DNA。
全文摘要
本發明的目的在於提供SARS冠狀病毒的新的CTL表位肽。本發明提供包含選自由序列號10、11、12、13、15、17、18、23和24組成的組中的胺基酸序列的肽。
文檔編號C07K7/06GK102227442SQ20098014759
公開日2011年10月26日 申請日期2009年11月27日 優先權日2008年11月28日
發明者內田哲也, 小田洋, 松井政則 申請人:國立感染症研究所所長代表的日本國, 學校法人琦玉醫科大學, 日油株式會社

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專利名稱:用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置的製作方法背景技術:1-本發明所屬領域本發明涉及一種用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置,其中的管狀容器被放在循環於配送鏈上的文檔匣或託架裝置中。本發明特別適用於,然而並非僅僅專用於,對引入自動分析系統的血液樣本試管之類的自動識別。本發明還涉及專為實現讀