一株超高放氫藻株及其應用的製作方法

2023-10-04 20:53:54 1

一株超高放氫藻株及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株放氫藻株及其應用。本發明提供重組萊茵衣藻，為將質粒pChlamiRNA3導入萊茵衣藻中，得到重組萊茵衣藻。所述萊茵衣藻為萊茵衣藻CC400。本發明的實驗證明，本發明將pChlamiRNA3質粒轉入萊茵衣藻藻種CC400（mt+）中，得到重組萊茵衣藻，且在重組萊茵衣藻中篩選得到突變藻株91號，在用氣相色譜測定其產氫量時，突變藻株91號與野生型相比，持續產氫時間更長，達到600小時（野生型產氫時間可達到200小時）；總產氫量更高，達到13349毫升/升培養物（野生型可達到300毫升/升培養物）,是野生型的44.5倍。
【專利說明】一株超高放氫藻株及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一株超高放氫藻株及其應用。
【背景技術】
[0002]由於礦物資源的日益枯竭，尋找清潔的替代能源已成為一項迫切的課題。氫是宇宙間最簡單同時也是最為豐富的元素，被普遍認為是一種最有吸引力的替代能源。傳統的化學產氫方法採用電解水或熱解石油、天然氣，生產成本也普遍較高。藻類光合制氫是微藻利用太陽能裂解水釋放氫氣的生物過程，是實現氫能可持續生產的重要途徑之一。
[0003]萊茵衣藻是古老的單細胞真核綠藻，廣泛用於光合作用與產氫機理研究。其遺傳轉化簡單，基因組測序已於2007年完成，這為工程藻株的獲得奠定了堅實的基礎。高放氫藻株的篩選一直是國際前沿熱點，主要是圍繞著降低天線色素含量，提高光能利用率等方面開展相關研究工作。高放氫藻株的獲得，不僅對於科學研究有重要意義，而且在氫能源的開發應用方面也有廣闊的前景。

【發明內容】

[0004]本發明的一個目的是提供一種重組萊茵衣藻。
[0005]本發明提供的重 組萊茵衣藻，為將質粒pChlamiRNA3導入萊茵衣藻中，得到重組萊茵衣藻。
[0006]上述重組萊茵衣藻中，所述萊茵衣藻為萊茵衣藻CC400。
[0007]上述重組萊茵衣藻中，所述重組萊茵衣藻為萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)突變藻株91號，其保藏號為CGMCC N0.8706。
[0008]上述的重組萊茵衣藻在產氫中的應用也是本發明保護的範圍。
[0009]本發明的另一個目的是提供一種獲得氫的方法。
[0010]本發明提供的獲得氫的方法，為發酵上述的重組萊茵衣藻，得到氫。
[0011 ] 上述方法中，所述發酵採用的培養基為缺硫TAP培養液。
[0012]上述方法中，所述發酵條件為25°C、連續光照、持續攪拌，所述發酵時間為0-600小時，且不為O。
[0013]上述方法中，所述光照的強度為110 μ Es-lm-2,所述攪拌的轉速為200rpm。
[0014]本發明中萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)突變藻株91號，於2013年12月31日，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC N0.8706，分類命名為萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
[0015]本發明的實驗證明，本發明將pChlamiRNA3質粒轉入萊茵衣藻藻種CC400 (mt+)中，得到重組藻株，且在重組藻株中篩選得到突變藻株91號，在用氣相色譜測定其產氫量時，突變藻株91號與野生型相比，持續產氫時間更長，達到600小時(野生型產氫時間可達到200小時);總產氫量更高，達到13349毫升/升培養物(野生型可達到300毫升/升培養物)，是野生型的44.5倍。與已有報導相比，本發明中所述藻株產氫時間更持久，產氫量更高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為重組藻株的產氫量檢測(0_120h)
[0017]圖2為突變藻株的產氫量檢測(0_600h)
【具體實施方式】
[0018]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0019]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到，部分如下:
[0020]萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)藻種 CC400 (mt+)(以下也稱為野生型藻株)和質粒pChlamiRNA3均購自杜克大學萊茵衣藻中心(Chlamy center, http://www.chlamy.0rg/);質粒pChlamiRNA3中均含有巴龍黴素抗性基因。
[0021]下述實施例中所用的培養基:
[0022]I) TAP 培養液:NH4Cl0.4g/L ;MgS04.7Η200.lg/L ;CaCl2.2Η200.05g/L ;K2HPO40.108g/L ；KH2PO40.056g/L ；Trisbase2.423g/L ;亨特微量元素(Hunter，s traceelements) lml/L,冰乙酸 lml/L,其餘為水。
[0023]亨特微量兀素(Hunter，strace elements):H3BO4I1.4g/L、ZnSO4.7Η2022.0g/L、MnCl2.4H205.06g/L、CoCl2.6H201.61g/L、CuSO4.5H201.57g/L、(NH4)6Mo7O24.4H201.1Og/UFeSO4.7H204.99g/L，其餘為水。
[0024]2)缺硫 TAP 培養液(g/L) =NH4Cl0.4g/L ；MgCl2.6H200.08g/L ；CaCl2.2H200.05g/L ；K2HP040.108g/L ；KH2PO40.056g/L ；Trisbase2.423g/L ;亨特微量元素(Hunter，s traceelements) lml/L,冰乙酸 lml/L,其餘為水。
[0025]缺硫亨特微量兀素(Hunter，strace elements):H3BO4I1.4g/L> ZnCl2I0.42g/L>MnCl2.4H205.06g/L、CoCl2.6H201.61g/L、CuCl2.2H201.07g/L、(NH4)6Mo7O24.4H201.1Og/UFeCl2.4H203.57g/L，其餘為水。
[0026]3)固體TAP培養基:在TAP培養液中加1.5% (質量百分含量)的瓊脂粉。
[0027]4)含有巴龍黴素的培養基配方為:在固體TAP培養基中，加入100ug/ml巴龍黴素水溶液，使巴龍黴素在含有巴龍黴素的培養基中的終濃度為lOug/ml。
[0028]實施例1、產氫萊茵衣藻的獲得
[0029]1、培養
[0030]用TAP固體培養基培養萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) CC400藻株:配製TAP液體培養液，121°C高壓滅菌20分鐘，待培養液溫度降到室溫後，用接種針從固體培養基上挑取萊茵衣藻單克隆到TAP培養液中，置於恆溫光照培養箱中的搖床上連續光照培養(25°C，60rpm，110 μ Es^iT2)，懸浮培養細胞，得到 CC400 藻液。
[0031]固體培養時，將單克隆轉到TAP固體培養基上劃線培養。
[0032]2、重組萊茵衣藻的獲得
[0033]將質粒pChlamiRNA3線性化，並用玻璃珠法轉化藻種CC400，具體步驟如下:[0034]稱取0.1g玻璃珠(425-600um,Sigma)置於1.5ml離心管中，121°C滅菌20分鐘後，放於室溫待用。將IOOul CC400藻液和IOul pChlamiRNA3質粒(Kpn I線性化)加入上述盛有玻璃珠的離心管中，在vortex (Genie2)上，7檔震動15秒後，室溫25°C放置4分鐘。用移液器將藻液轉移到新鮮的TAP培養液中，置於恆溫光照培養箱中的搖床上連續光照培養24小時後(25°C，60rpm，110 μ Es—V2)，2500rpm離心，收集沉澱用TAP培養液懸起後，塗在含有巴龍黴素(10ug/ml)的培養基平板上，能夠生長的藻株，為重組萊茵衣藻。
[0035]3、產氫突變藻株的篩選
[0036]I)藻株培養
[0037]將上述2得到的重組萊茵衣藻分別接到盛150ml正常TAP培養液的三角瓶中；當0D750值達到1.5時，再將其轉到已加入磁轉子的500ml培養液中；待0D750值達到1.5左右時，收集培養物。
[0038]2)、產氫量的測定
[0039](I) 25°C，2500rpm，離心上述I)收集的培養物5分鐘；倒掉上清液，收集細胞；
[0040](2)用缺硫TAP培養液漂洗I)收集的細胞兩次；將漂洗過的細胞用20ml左右缺硫培養液重懸細胞；
[0041](3)取20 μ I懸浮細胞， 加入980 μ I缺硫培養液，再加入4ml丙酮，混勻，5000rpm，5分鐘；
[0042](4)取離心後的上清液,測定663nm和645nm處的吸光值,根據下面的公式計算總
葉綠素含量:
[0043]Chl (a+b ) =8.02 X 0D663+20.21 X 0D645
[0044](5)採用Schott培養瓶做放氫瓶，培養體系為100ml (加入缺硫TAP培養基)，計算最終葉綠素濃度達到20 μ g/ml所需的(I)步驟中的細胞原液體積，加入細胞，用缺硫TAP培養液補足到100ml ；
[0045](6)用石臘封住瓶口，以防止氣體外漏；
[0046](7)將培養瓶置於25°C，110 μ Es-lm-2培養箱中的磁力攪拌器(轉速200rpm)上連續光照培養(光照強度:110 μ Es-lm-2)，分別取不同的時間點測定放氫量。
[0047]採用SHIMADZU GC-2014氣相色譜測定氫氣含量，載氣為氮氣。測定時用Iml注射器吸取放氫瓶氣體部分500μ 1，注入進樣孔，甲烷外標法計算氣體體積。
[0048]Υ(甲烷體積，ul) =0.0002χ (X，峰面積)+0.708，R2 (相關係數)=0.9979)
[0049]結果如圖1所示，可以看出，對獲得的多個突變藻株進行放氫量測定，到缺硫密閉培養120小時時，突變藻株91號產氫量可達到816毫升/升培養物，是野生型的3.5倍(野生型可達到232毫升/升培養物)，其餘突變藻株產氫量均與野生型相當。這說明，與野生型相比，突變藻株91號具有更高的產氫能力。
[0050]將萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii )突變藻株91 號，於 2013 年 12 月 31 日，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC N0.8706，分類命名為萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)。
[0051]實施例2、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii )突變藻株 91 號的 CGMCCN0.8706 應用[0052]為了進一步確定突變藻株91號的持續產氫能力與產氫時間，對其產氫過程進行長時間監測，具體如下:
[0053]將萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)突變藻株 91 號 CGMCC N0.8706 按照實施例1中的3的方法進行培養和產氫檢測。以野生型藻株為對照。
[0054]結果如圖2所示，可以看出，到缺硫密閉培養200小時時，野生型藻株的產氫量達到最大值(300毫升/升培養物)，突變藻株91號的產氫量達到5744毫升/升培養物；且突變藻株91號產氫可一直持續到600小時，總產氫量達到13349毫升/升培養物，是野生型的44.5倍。 [0055]總之，突變藻株91號的持續產氫時間(600小時)和產氫量(13349毫升/升培養物)均高於野生型(200小時，300毫升/升培養物)，高於已報導藻株，具有一定的潛在應用價值。
【權利要求】
1.重組萊茵衣藻,為將質粒pChlamiRNA3導入萊茵衣藻中，得到重組萊茵衣藻。
2.根據權利要求1所述的重組萊茵衣藻，其特徵在於:所述萊茵衣藻為萊茵衣藻CC400。
3.根據權利要求1或2所述的重組萊茵衣藻，其特徵在於:所述重組萊茵衣藻為萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii )突變藻株 91 號，其保藏號為 CGMCC N0.8706。
4.權利要求1-3中任一所述的重組萊茵衣藻在產氫中的應用。
5.一種獲得氫的方法，為發酵權利要求1-3中任一所述的重組萊茵衣藻，得到氫。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於:所述發酵採用的培養基為缺硫TAP培養液。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特徵在於:所述發酵條件為25°C、連續光照、持續攪拌，所述發酵時間為0-600小時，且不為O。
8.根據權利要求 7所述的方法，其特徵在於:所述光照的強度為110yEs-lm-2，所述攪拌的轉速為200rpm。
【文檔編號】C12R1/89GK103710266SQ201410014492
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月13日 優先權日:2014年1月13日
【發明者】黃芳, 趙磊, 陳梅, 張錦 申請人:中國科學院植物研究所