冬蟲夏草中國被毛孢二氫乳清酸氧化酶、編碼基因及應用的製作方法
2023-10-05 12:07:04 1
專利名稱：冬蟲夏草中國被毛孢二氫乳清酸氧化酶、編碼基因及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一個來自「百令」生產菌冬蟲夏草中國被毛孢的參與二氫乳清酸出發合成代謝乳清酸的二氫乳清酸氧化酶(dihydroorotate oxidase),編碼這個酶的基因及其應用。
背景技術：
冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲屍體上的複合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統真菌藥材資源，具有代謝產物和生物活性多樣的特點，在生物醫藥領域展現出巨大的應用和發展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關注，在世界範圍內備受推崇。中醫認為，冬蟲夏草入肺腎二經，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病後虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節陰陽的中藥。現代藥理學已證實，冬蟲夏草具有免疫調節、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養、液體發酵等實際生產中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑑定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具 有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。天然蟲草具有嚴格的寄生性以及特殊的生態環境，故其產量很低，價格高昂。野生冬蟲夏草由於受生長環境等因素制約，資源匱乏。由於近幾年在人工栽培上進展不大，野生冬蟲夏草代用品研究多集中在液體發酵上。利用液體深層發酵培養冬蟲夏草菌絲體、提取物或發酵液，是解決冬蟲夏草藥源的一種有效途徑。蟲草發酵生產蟲草替代品，既可有效保護蟲草這一珍貴資源，又不受氣候、地理環境和蟲草寄生條件嚴格的限制，適合於工業化大規模生產。生產出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲草相似，因而國內外一直致力於蟲草菌絲體的發酵培養。人工發酵培養冬蟲夏草中國被毛孢得到的菌絲，經毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲草化學組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲草生產蟲草製品，以彌補自然資源的短缺，通過對發酵條件的優化，菌絲體生物量和代謝產物的量均有明顯提聞。近年來，隨著天然產物化學和現代色譜技術的飛速發展，在對蟲草產品研發中已逐步由蟲草原料或粗提物的直接利用轉向更深層次的功能性代謝產物研究。國內外已對蟲草代謝產物做了大量的研究，代謝產物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等幾大類化合物，其中嘧啶類核苷、蟲草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見成效。核苷類是蟲草最主要的活性物質之一，其中嘧啶類核苷包括胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷。尿喃唳核苷(uracil riboside)又稱尿苷(ulidine),別稱由雪核糖苷、二氫喃唳核苷、1-β-D-喃核糖基尿喃唳。胞喃唳核苷(cytosine riboside)又名胞苷(cytidine)、胞啶、l-β -D-呋喃核苷胞嘧啶。嘧啶核苷是多用途的核苷，可作為保健品和食品的添加劑。 它作為美容和抗紫外輻射化妝品也逐漸成為人們生活的必需品，作為藥物，已臨床應用於中樞神經、泌尿、代謝和心血管等多方面的疾病，在美國，核酸類藥品近年來在抗病毒、抗腫瘤方面顯示了不可替代的作用。
乳清酸，也稱維生素Β13，在60年代，用於治療黃膽和一般肝臟機能障礙。近年雖被新藥代替，但它具有改善肝功能，促進肝細胞的修復作用和其它新功能。如可治療痛風病，改進腦血管循環，增加吞噬細胞活性，提高組織再生能力，有助於治癒傷口。還可用於免疫輔藥。可以治療慢性X線中毒，作為化學品中毒的預防劑和治療劑。
二氫乳清酸的氧化是由二氫乳清酸還原酶(dihydroorotate dehyolrogenase)催化，二氫乳清酸氧化生成乳清酸(orotate)。此酶需FMN和非血紅素Fe2+，位於線粒體內膜的外側面，由醌類提供氧化能力，此酶存在於胞液中。
目前，作為重要合成代謝嘧啶類核苷的冬蟲夏草菌，還只停留在代謝產物成分分析和功效的研究上，對冬蟲夏草菌嘧啶類核苷合成代謝途徑中相關基因和蛋白的研究還很少見。
發明內容
本發明目的在於對「百令」生產菌冬蟲夏草中國被毛孢合成代謝乳清酸的酶及其編碼基因進行深入研究，提供了「百令」生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與二氫乳清酸出發合成代謝乳清酸的酶、編碼基因及其應用。
本發明採用的技術方案是
本發明提供一種來自「百令」生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與二氫乳清酸出發合成代謝乳清酸的二氫乳清酸氧化酶，所述酶具有SEQ ID No.1所示胺基酸序列90%以上同源性，優選其胺基酸序列為SEQ ID No.1所示(記為pynB蛋白)；該酶可催化二氫乳清酸製備乳清酸。由於胺基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID No.1所示胺基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述胺基酸序列同源性在90%以上，均屬於本發明保護範圍之列。具體的所述改變可包括胺基酸序列中胺基酸的缺失、插入或替換；其中，對於變體的保守性改變，所替換的胺基酸具有與原胺基酸相似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
本發明涉及所述冬蟲夏草中國被毛孢二氫乳清酸氧化酶在生物催化二氫乳清酸製備乳清酸中的應用。
進一步，所述的應用為以含冬蟲夏草中國被毛孢二氫乳清酸氧化酶菌體發酵培養獲得的溼菌體經細胞破碎後的破碎混合液為催化劑，以二氫乳清酸為底物，在NAD的作用下，於pH為6. 5 8. 5的緩衝溶液構成的轉化體系中，在30°C、150rpm條件下轉化反應 2 3h，反應結束後，將反 應液過濾，取濾液即為含乳清酸的粗品，所述粗品分離純化獲得乳清酸。
更進一步，所述底物的初始濃度為10g/L，所述催化劑的體積用量為100mL/g底物，所述催化劑的幹菌體濃度為6. 7mg/mL,所述NAD與底物的質量比為1:1。由二氫乳清酸合成代謝獲得乳清酸的路徑如下式所示
權利要求
1.一種冬蟲夏草中國被毛孢二氫乳清酸氧化酶，其特徵在於所述酶具有SEQ ID No.1所示胺基酸序列90%以上同源性。
2.如權利要求1所述冬蟲夏草中國被毛孢二氫乳清酸氧化酶，其特徵在於所述酶的胺基酸序列為SEQ ID No.1所示。
3.如權利要求1所述冬蟲夏草中國被毛孢二氫乳清酸氧化酶在生物催化二氫乳清酸製備乳清酸中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於所述的應用為以含冬蟲夏草中國被毛孢二氫乳清酸氧化酶菌體發酵培養獲得的溼菌體經細胞破碎後的破碎混合液為催化劑，以二氫乳清酸為底物，在NAD的作用下，於pH為6. 5^8. 5的緩衝溶液構成的轉化體系中，在30°C、150rpm條件下轉化反應2 3h，反應結束後，將反應液過濾，取濾液即為含氨甲醯磷酸的粗品，所述粗品分離純化獲得氨甲醯磷酸。
5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於所述底物的初始濃度為10g/L，所述催化劑的體積用量為100mL/g底物，所述催化劑的幹菌體濃度為6. 7mg/mL,所述NAD與底物的質量比為1:1。
6.一種編碼權利要求1所述酶的基因。
7.如權利要求6所述基因，其特徵在於所述基因具有SEQID No. 2所示核苷酸序列90%以上同源性。
8.如權利要求7所述基因，其特徵在於所述基因的核苷酸序列為SEQID No. 2所示。
9.如權利要求6 8之一所述基因在構建能夠生物催化二氫乳清酸製備乳清酸的基因工程菌中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特徵在於所述的應用為構建含有所述冬蟲夏草中國被毛孢二氫乳清酸氧化酶基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，培養液分離純化獲得含有冬蟲夏草中國被毛孢二氫乳清酸氧化酶的菌體細胞。
全文摘要
本發明涉及一個來自「百令」生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與二氫乳清酸出發合成代謝乳清酸的酶，編碼這個酶的基因及其應用；所述酶為二氫乳清酸氧化酶，胺基酸序列具有SEQ ID No.1所示序列90%以上同源性，其編碼基因的核苷酸序列具有SEQ ID No.2所示序列90%以上同源性；本發明從原理上對二氫乳清酸合成乳清酸的代謝途徑進行了詳細研究，包含本發明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉導、轉化、結合轉移的方法轉入工程菌中，通過調節乳清酸生物合成基因的表達，賦予宿主乳清酸的高表達性，為擴大乳清酸的產量提供了有效途徑，具有重大應用前景。
文檔編號C12N15/53GK103045550SQ20121053584
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月10日 優先權日2012年12月10日
發明者鄭裕國, 柳志強, 吳暉, 李邦良, 吳玲芳, 許靜, 許峰, 薛亞平, 袁水金, 王鴻豔 申請人:浙江工業大學, 杭州中美華東製藥有限公司