抗5t4抗體及其用途的製作方法

2023-10-05 12:05:09 4

專利名稱：：抗5t4抗體及其用途的製作方法
技術領域：
：總的來說，本發明涉及用於診斷和/或治療贅生性或惡性病症的抗5T4抗體和抗體/藥物綴合物(即，免疫綴合物)。本發明還涉及用於製備抗5T4抗體和抗體/藥物綴合物的分離的可變區核酸和多肽。
背景技術：
：高親和力單克隆抗體的可得性已使得能夠開發靶向免疫治療。根據這種方法，治療劑與對於限定的靶細胞群具有結合特異性的抗體偶聯。已與單克隆抗體綴合的治療劑包括細胞毒素、生物應答調節劑、酶(例如，核糖核酸酶)，凋亡誘導蛋白質和肽、和放射性同位素。抗體/細胞毒素綴合物一般稱為免疫細胞毒素。與低分子量藥物例如氨甲蝶呤綴合的抗體一般稱為化學抗體/藥物綴合物。描述為免疫調諧劑(immunomodulator)的綴合物包含生物應答調節劑例如淋巴因子、生長因子和補體激活眼鏡蛇毒因子(CVF)。放射性標記的抗體包括可以用於放射治療以及成像的放射性同位素。對腫瘤細胞進行抗體介導的藥物遞送可以通過使藥物在正常組織中的攝入降到最低來增強藥物功效。參見例如，Reff等人(2002)CancerControl9:152-66;Sie雷s(2000)CancerChemother.Pharmacol.46S叩pl:S18-22;Goldenberg(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39:195-201。MYLOTARG(吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumabozogamicin))是商購可得的耙向免疫治療，其才艮據這種原理起作用並批准用於治療老年患者中的急性髓性白血病。參見Sievers等人(1999)Blood93:3678-84。在這種情況下，把向分子是與加利車黴素(calicheamincin)綴合的抗CD33單克隆抗體。然而，在人中的靶向免疫治療受到限制，部分原因是對於非人單克隆抗體的不良應答。使用嚙齒類動物抗體的早期臨床試驗揭示人抗小鼠抗體(HAMA)和人抗大鼠抗體(HARA)應答，這導致快速的抗體清除。其後已開發了免疫原性較小的抗體，包括嵌合抗體、人源化抗體、PRIMATIZED⑧抗體、和使用轉基因小鼠或噬菌體展示文庫製備的人抗體。參見Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-5;Queen等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-33;Newman等人(1992)Biotechnology(NY)10:1455-60;Green等人(1994)Nat.Genet.7:13-21;Marks等人(1991)丄Mol.Biol.222:581-97。HAMA應答的避免允許高劑量和重複劑量的施用以達到治療應答。用於藥物靶向的候選抗體包括識別癌胚抗原的抗體，即存在於胎兒細胞和贅生細胞上，並且基本上不存在於正常成人細胞中的抗原。參見例如，Magdelena"1992)J.Immunol.Methods150:133-43。5T4癌胚抗原是72kDa高度糖基化的跨膜糖蛋白，其包含42kDa非糖基化的核心(Hole等人(1988)Br.丄Cancer57:239-46，Hole等人(1990)Int.J.Cancer45:179-84;PCT國際公開號WO89/07947;美國專利號5,869,053)。5T4包括特徵在於2個富含亮氨酸的重複單位(LRRs)和居間親水區的細胞外結構域，其是用於靶向治療的可接近位點(Myers等人(1994)J.Biol.Chem.269:9319-24)。人5T4表達於眾多癌症類型中，包括膀胱、乳腺、子宮頸、子宮內膜、肺、食道、卵巢、胰腺、胃和睪丸的癌，並且基本上不存在於正常組織中，除了胎盤中的合胞體滋養層(參見，例如，Southall等人(1990)Br.J.Cancer61:89-95(5T4抗原在正常和惡性組織中的免疫組織學分布)；Mieke等人(1997)Clin.CancerRes,3:1923-1930(在結腸直腸癌患者中肺瘤細胞上的低細胞間粘附分子1表達和高5T4表達與減少的無病存活相關)；Starzynska等人(1994)Br.J.Cancer69:899-902(結腸直腸癌中5T4癌胚抗原表達的預後意義)；Starzynska等人(1992)Br.J.Cancer66:867-869(結腸直腸和胃癌中的5T4抗原的表達)；Jones等人(1990)Br.J.Cancer61:96-100(宮頸癌中的5T4抗原的表達)；Connor和Stern(199)Int.J.Cancer46:1029-1034(宮頸癌中的MHCI類表達的喪失);Ali等人(2001)OralOncology37:57-64(正常、發育異常和惡性口腔黏膜上的5T4癌胚抗原的表達模式)；PCT國際公開號WO89/07947;美國專利號5,869,053)。例如，據報導無5T4表達的組織包括肝臟、皮膚、脾、胸腺、中樞神經系統(CNS)、腎上腺和卵巢。據才艮道具有病灶性或低的5T4表達的組織包括肝臟、皮膚、脾、淋巴結、扁桃腺、甲狀腺、前列腺和精嚢。5T4的弱-中等彌散表達已在腎、肺、胰腺、咽和胃腸道中得到報導。據報導具有高5T4表達的唯一組織是合胞體滋養層；5T4也不存在於正常血清或孕婦血清中(即，水平〈10ng/ml)。5T4在腫瘤中的過量表達已與疾病ii^關聯，並且5T4表達的評估已提議為用於鑑定具有短期預後的患者的有用方法(Mulder等人(1997)Clin.CancerRes.3:1923-30，Naganuma等人(2002)AnticancerRes,22:1033-1038，Starzynska等人(1994)Br.丄Cancer69:899-902，Starzynska等人(1998)Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.10:479-484,Wrigley等人(1995)Int.J.Gynecol.Cancer5:269-274)。幾種抗5T4抗體已得到描述，包括mAb5T4(也稱為H8抗體，其識別5T4抗原的構象表位(Shaw等人(2002)Biochem.J.363:137-45，PCT國際公開號WO98/55607))，大鼠單克隆抗體(Woods等人(2002)Biochem.丄366:353-65),和稱為5T4的小鼠單克隆抗體(美國專利號5,869,053)。單鏈抗5T4抗體，以及包括與治療分子融合的抗5T4抗體序列的融合蛋白也已得到描述。例如，與人IgGl恆定結構域融合或與鼠類B7.1的細胞外結構域融合的抗5T4抗體序列誘導5T4表達腫瘤細胞系的細胞裂解(Myers等人(2002)CancerGeneTher.9:884-896，Shaw等人(2000)Biochim.Biophys.Acta.1524:238-246;U.S.專利申請公開號2003/0018004)。類似地，與超抗原融合的單鏈抗5T4抗體可以在體外刺激非小細胞肺癌細胞的T細胞依賴性細胞裂解(Forsberg等人(2001)Br.J.Cancer85:129-136)。使用PNU-214936的I期臨床試驗顯示有限的毒性和某些抗肺瘤應答，所述PNU-214936是與突變型超抗原葡萄球菌腸細胞毒素(enterocytotoxin)A(SEA)融合的單克隆抗體5T4的鼠類Fab片段(Cheng等人(2004)J.Clin.Oncol.22(4):602-9)。作為備選治療方法，重組5T4疫苗也^皮提議用於治療癌症(Mulryan等人(2002)Mol.CancerTher.1:1129-37;UK專利申請公開號2,370,571和2,378,704;EP專利申請公開號EP1,160,323和1,152,060)。本發明提供了新型抗5T4抗體、抗5T4/藥物繳合物、用於生產所公開的抗體和抗體/藥物綴合物的方法、以及關於其診斷和治療用途的方法。發明概述本發明提供了新型抗5T4抗體、其綴合物、和關於其^f吏用的方法。還提供了分離的抗5T4多肽和編碼其的分離的核酸。本發明的抗5T4抗體包括特異性結合人5T4抗原的抗體，其中所述抗體(a)包含鼠類Al、A2或A3抗體的抗原結合結構域；(b)與鼠類Al、A2或A3抗體竟爭5T4結合；(e)結合由Al、A2或A3抗體結合的5T4表位；或(d)包含(a)-(c)抗體的5T4結合片段。本發明的抗5T4抗體可以是嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、四聚體抗體、四價抗體、多特異性抗體、結構域特異性抗體、單結構域抗體、或融合蛋白、或鼠類單克隆抗體。例如，本發明的人源化抗5T4抗體包括這樣的抗體，其包含至少一個重鏈可變區或至少一個輕鏈可變區，其中該人源化抗體或抗體片段(a)包含鼠類A1、A2或A3抗體的抗原結合結構域；(b)與鼠類Al、A2或A3抗體竟爭5T4結合；(c)結合由A1、A2或A3抗體結合的5T4表位；或(d)(a)-(c)抗體的5T4結合片段。本發明的抗5T4抗體具有對於人5T4抗原至少約1x10-7M至約1xl(T12M的結合親和力。所公開的抗5T4抗體及其綴合物還可以顯示在體內靶向5T4表達細胞的特異性結合。本發明的代表性抗5T4抗體包括包含重鏈可變區的抗體，所述重鏈可變區包含(a)SEQIDNO:2的殘基20-138的^J^,列；(b)與SEQIDNO:2的殘基20-138至少85%等同的氨基斷列；(c)SEQIDNO:6的殘基19-135的氨基斷列；U)與SEQIDNO:6的殘基19-135至少86%等同的絲齡列；(e)SEQIDNO:10的殘基20-141的氨基斷列；(f)與SEQIDNO:10的殘基20-141至少91%等同的#^齡列；(g)SEQIDNOs:49、51、52、54、56、77、78、81或82中的任何一個的氨基斷列；(h)與SEQIDNO:51至少91%等同的胺基酸序列；(i)與SEQIDNO:54至少78%等同的胺基酸序列；(j)與SEQIDNO:77至少89%等同的氨基斷列；(k)與SEQIDNO:78至少790/。等同的氨基斷列；(I)與SEQIDNO:81至少80%等同的氨基齡列；或(m)與SEQIDNO:82至少78%等同的氨基齡列。本發明的代表性抗5T4抗體包括包舍輕鏈可變區的抗體，所述輕鏈可變區包含(a)SEQIDNO:4的殘基21-127的氨基齡列；(b)與SEQIDNO:4的殘基21-127至少94%等同的氨基,列；(c)SEQIDNO:8的殘基23-130的胺基酸序列；(d)與SEQIDNO:8的殘基23-130至少96%等同的#^,列；(e)SEQIDNO:12的殘基21-127的氨基,列；(f)與SEQIDNO:12的殘基21-127至少98%等同的#^斷列；(g)SEQIDNOs:58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、79、80、83或84中的任何一個的胺基酸序列；(h)與SEQIDNO:60至少83%等同的胺基酸序列；(i)與SEQIDNO:70至少93%等同的氨基,列；(j)與SEQIDNO:76至少85%等同的M齡列；U)與SEQIDNO:76至少85%等同的胺基酸序列；(l)與SEQIDNO:79至少88%等同的胺基酸序列；(m)與SEQIDNO:80至少84%等同的^J^酸序列；(n)與SEQIDNO:83至少卯％等同的^J^酸序列；或(o)與SEQIDNO:84至少91%等同的^i^^列。例如，抗5T4抗體可以包含(a)包含SEQIDNO:2的殘基20-138的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQIDNO:4的殘基21-127的胺基酸序列的輕鏈可變區；(b)包含衍生自SEQIDNO:6的殘基19一135的氨基,列的重鏈可變區，和包含衍生自SEQIDNO:8的殘基23-130的M,列的輕鏈可變區；或(c)包含衍生自SEQIDNO:10的殘基20-141的^J^酸序列的重鏈可變區，和包含衍生自SEQIDNO:12的殘基21-127的胺基酸序列的輕鏈可變區。本發明的嵌合和人源化抗5T4抗體可以包含衍生自人恆定區的恆定區，例如衍生自人k輕鏈恆定區的人輕鏈恆定區，和衍生自人IgGl或人IgG4重鏈恆定區的人重鏈恆定區。本發明的代表性人源化抗5T4抗體包括這樣的抗體，其包含(a)包含人抗體構架區的殘基的構架區；和(b)SEQIDNO:4、8或12的輕鏈可變區的一個或多個CDRs，或SEQIDNO:2、6或10的重鏈可變區的一個或多個CDRs。例如，人抗體構架區的殘基可以包含(a)DPK24亞群IV種系克隆，VkIII亞群(DPK23、DPK22、DP詣、DPK21)，或VkI亞群種系克隆(DPK9、DPKl、02、DPK7)的人抗體輕鏈構架區；(b)選自下述的人抗體重鏈構架區DP-21(VH7)、DP-54(VH3-07)、DP-47(VH3-23)、DP-53(VH-74)、DP-49(VH3-30)、DP-48(VH3-13)、DP-75、DP8(VHl-2)、DP-25、VI-2b和VI-3(VH103)、DP-15和VI-8(VH1-08)、DP-14和Vl-18(VH1-18)、DP-5和V1-24P(VH1-24)、DP-4(VH1-45)、DP-7(VH1-46)、DP-IO、DA-6和YAC-7(VH1-69)、DP-88(VHl-e)、DP畫3和DA-8(VHl-f);(c)(b)的重鏈構架區的共有序列；或(d)與(a)-(c)的構架區至少63%等同的構架區。本發明的代表性人源化抗5T4抗體還可以包括SEQIDNOs:SEQIDNOs:2、4、6、8、10或12的2個或更多CDRs,例如SEQIDNO:4、8或12的輕鏈可變區的2個或所有3個CDRs，或SEQIDNO:2、6或10的重鏈可變區的2個或所有3個CDRs，或SEQIDNO:4、8或12的輕鏈可變區的一個或多個CDRs和SEQIDNO:2、6或12的重鏈可變區的一個或多個CDRs,或SEQIDNOs:2、4、6、8、10或12的所有CDRs。代表性嵌合和人源化抗5T4抗體包括包含重鏈可變區序列的抗體，所述重鏈可變區序列包含(a)SEQIDNO:2的殘基20-138的胺基酸序列；(b)與SEQIDNO:2的殘基20-138至少85%等同的氨基齡列；(c)SEQIDNO:6的殘基19—135的氨基,列；(d)與SEQIDNO:6的殘基19-135至少86%等同的#^齡列；(e)SEQIDNO:10的殘基20-141的絲酸序列；(f)與SEQIDNO:10的殘基20-141至少91%等同的氨基,列；(g)SEQIDNO:49的殘基1—119的^J^崎列；(h)與SEQIDNO:49的殘基1-119至少90%等同的氨基,列；或(i)圖9A-9C中所示的人源化重鏈可變區的M,列。本發明的另外的嵌合和人源化抗5T4抗體包括包含由核酸編碼的重鏈可變區的抗體，所述核酸包含(a)SEQIDNO:1的核苷酸58-414的核苷酸序列；(b)SEQIDNO:5的核苷酸55-405的核苷酸序列；(c)SEQIDNO:9的核苷酸58-423的核苷酸序列；(d)SEQIDNO:48的核普酸1-358的核香酸序列；(e)編碼圖9A-9C中所示的人源化A1、A2或A3可變區的核苷酸序列；(f)與(a)-(e)中的任何一個的核苷酸序列至少90%等同的核苷酸序列；或(g)在嚴格雜交條件下與(a)-(e)中的任何一個的互補物特異性雜交的核酸。代表性嵌合和人源化抗5T4抗體包括包含輕鏈可變區序列的抗體，所述輕鏈可變區序列包含(a)SEQIDNO:4的殘基21-127的M酸序列；(b)與SEQIDNO:4的殘基21-127至少94%等同的M酸序列；(c)SEQIDNO:8的殘基23-130的絲斷列；(d)與SEQIDNO:8的殘基23-130至少96。/o等同的城辦列；(e)SEQIDNO:12的殘基21-127的胺基酸序列；(f)與SEQlDNO:12的殘基21-127至少98%等同的胺基酸序列；或(g)圖9A-9C中所示的人源化Al、A2或A3輕鏈可變區的氨基^列。還提供的是用於藥物遞送的抗體/藥物綴合物，其包含(a)本發明的嵌合或人源化抗5T4抗體或抗體片段；和(b)藥物，其與所述抗體直接或間接結合。代表性藥物包括治療劑，例如細胞毒素、放射性同位素、免疫調諧劑、抗血管生成劑、抗增殖劑、促凋亡劑、化學治療劑和治療性核酸。細胞毒素可以是例如抗生素、微管蛋白聚合的抑制劑、烷化劑、蛋白質合成抑制劑、蛋白激酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、拓樸異構酶抑制劑或酶。抗生素細胞毒素，例如加利車黴素、加利車黴素、N-乙醯-o加利車黴素或其衍生物，例如N-乙醯-口-加利車黴素二甲基醯肼，對於抗癌治療特別有用。所公開的抗5T4抗體/藥物綴合物可以包括用於使抗體與藥物結合的接頭。代表性接頭包括4-(4'乙醯苯氧基)丁酸(AcBut)、3-乙醯苯基乙酸(3誦acetylphenylacidicacid)(AcPac)、4-巰基-4-甲基-戊酸(Amide)。抗體/藥物綴合物還可以包括聚乙二醇或其他試劑以增強藥物摻入。關於藥物向5T4表達細胞的遞送，本發明提供了使細胞與抗體/藥物綴合物接觸的方法，所述抗體/藥物綴合物包含(i)嵌合或人源化抗5T4抗體，和(ii)與人源化抗5T4抗體直接或間接結合的藥物。根據所公開的方法，藥物被內化至靶細胞內。治療方法也在本文中得到公開，其包括給患有5T4陽性癌症的受試者施用治療有效量的抗5T4抗體/藥物綴合物，所述抗5T4抗體/藥物綴合物包含(i)嵌合或人源化抗5T4抗體或抗體片段，和(ii)與人源化抗5T4抗體或抗體片段直接或間接結合的治療劑。本發明的抗5T4治療可以與任何其他已知治療組合用於取得改善的效應。第二種治療劑可以與抗5T4抗體/藥物綴合物組合同時或以任何順序連續施用。還提供的是編碼人源化抗5T4可變區的分離的核酸，其對於生產所公開的人源化抗5T4抗體有用。編碼人源化抗5T4重鏈可變區的代表性核酸包括(a)SEQIDNO:1的核苷酸58-414的核苷睃亭列；(b)SEQIDNO:5的核苷酸55-405的核苷酸序列；(c)SEQIDNO:9的核苷酸58-423的核苷酸序列；(d)編碼SEQIDNOs:48、50、53或55中的vf壬何一個的核苷,列；(e)當查詢覆蓋度(querycoverage)為100%時，與SEQIDNO:50至少89%等同的核苷酸序列；(f)當查詢覆蓋度為100%時，與SEQIDNO:53至少82%等同的核苦酸序列；或(g)在嚴格雜交條件下與(a)-(d)中的任何一個的互補物特異性雜交的核酸。編碼人源化抗5T4輕鏈可變區的代表性核酸包括(a)SEQIDNO:3的核苷酸61-381的核普酸序列；(b)SEQIDNO:7的核苷酸67-390的核苷酸序列；(c)SEQIDNO:11的核苷酸61-381的核苷酸序列；(d)編碼SEQIDNOs:57、59、61、63、65、67、69、71、73或75中的4壬何一個的人源化A1、A2或A3輕鏈可變區的核苦酸序列；(e)當查詢覆蓋度為100%時，與SEQIDNO:59至少84%等同的核苷酸序列；(f)當查詢覆蓋度為100%時，與SEQIDNO:69至少86°/。等同的核苷酸序列；(g)當查詢覆蓋度為100%時，與SEQIDNO:75至少85%等同的核苷酸序列；或(h)在嚴格雜交條件下與(a)-(d)中的任何一個的互補物特異性雜交的核酸。附圖筒述圖1A-1C顯示鼠類抗5T4抗體A1、A2、和A3的重鏈和輕鏈可變區的核普酸及胺基酸序列。對胺基酸序列進行注釋，以通過下劃線標出互補決定區(CDRs)和通過雙下劃線標出前導序列。圖2是使用CT26/5T4細胞裂解物製備和用所指出的抗體探測的蛋白質印跡。圖3A-3B是顯示關於H8和Al抗體的2個獨立製劑的應答曲線和結合動力學的曲線圖。這些製劑基本上是等價的。圖4A-4C是顯示MDAMB435/5T4細胞對H8、Al、A2和A3抗體的調節的曲線圖。細胞表面上的抗體水平隨著時間過去而下降(圖4A、4C)(實心))，而上清液中的抗體水平保持恆定(圖4B、4C(空心))。MCF，平均細月包螢光；supt，上清液。圖5是人月包外域5T4Fc構建體、小鼠胞外域5T4Fc構建體、和人/小鼠5T4嵌合構建體的示意圖。這些構建體用於如實施例4中所述的表位作圖。圖6A-6B顯示人源化H8和所示之每一個抗體竟爭性結合人5T4胞外域Fc融合蛋白的圖示結果。HuH8，人源化H8抗體；ChiAl,嵌合A1抗體；ChiAl+C67F,具有C67F突變的嵌合Al抗體；ChiA2，嵌合A2抗體；muA2，鼠類A2抗體；ChiA3，嵌合A3抗體；ChiA3+C91Y,具有C91Y突變的嵌合A3抗體；muA3，鼠類A3抗體；NoAb，無抗體(對照)。圖7是顯示由H8、Al、A2、和A3結合的人5T4表位的線性圖。所指出的殘基是由Myers等人(1994)丄Biol.Chem.269(12):9319-9324描述的5T4抗原的殘基，其也可從Genbank登記號Z29083(SEQIDNO:87)獲得。LRR，富含亮氨酸的重複單位。圖8顯示了如實施例6中所述進行的球狀體(spheroid)試驗的結果。與對照細胞(MDAMB435/neo)比較，使用Al和A3抗體製備的抗5T4/加利車黴素綴合物顯著抑制5T4表達細胞(MDAMB435/5T4)的生長。CMA-676,抗CD33/加利車黴素綴合物；huH8-AcBu仁CalichDMH,使用4-(4'-乙醯苯氧基)丁酸(AcBut)與加利車黴素綴合的人源化H8抗體；CalichDMH，未綴合的加利車黴素；Al-AcBut-CalichDMH，使用4-(4'-乙醯苯氧基)丁酸(AdBut)與加利車黴素綴合的Al抗體；A3-AcBut-Calich畫H，使用4-(4'-乙醯苯氧基)丁酸(AcBut)與加利車黴素綴合的A3抗體。圖9A-9H顯示人源化Al重鏈可變區1版的核苷酸和M酸序列(SEQIDNOs:48—49);人源化A1重鏈可變區(huAlVH)1.2和2.0版的氨基^列；人源化A1輕鏈可變區(huAlVL)1.0、2.0和3.0版的胺基酸序列；人源化A2重鏈可變區1.0和2.0版(huA2VH)的M^列；人源化A2輕鏈可變區1.0和2.0版(huA2VL)的^ij^酸序列；人源化A3重鏈可變區1.0和2.0版(huA3VH)的#^酸序列；和人源化A3輕鏈可變區1.0和2.0版(huA3VL)的M^f列。CDRs是有下劃線的。圖10A-10B顯示可以用於製備人源化抗5T4抗體的代表性人重鏈可變區構架序列。圖IOA是亞群I的人重鏈可變區序列(SEQIDNOs:14-24)的比對和由此得出的共有構架序列(SEQIDNOs:25-27)。圖10B顯示了VH7和VH3亞群的人種系基因的序列(SEQIDNOs:88-93)。圖11是亞群VkIII的人輕鏈可變區序列(SEQIDNOs:29-34)的比對。有框的序列，CDRs。圖12是亞群VkI的人輕鏈可變區序列(SEQIDNOs:35-44)的比對。有框的序列，CDRs。圖13顯示VkI和VkIV亞群的另外的人種系序列，其具有可以用於製備人源化抗5T4抗體的構架區(SEQIDNOs:94-99)。圖14顯示可以用於製備嵌合和人源化抗5T4抗體的代表性人恆定區的氨基,列(SEQIDNOs:45—47)。圖15顯示全長食蟹猴(cynomologous)5T4抗原和部分黑尾絨猴5T4抗原的胺基酸序列。有下劃線的序列，引導序列。對於每個序列，5T4胞外域包括氛基酸30-356。發明詳述I.抗5T4抗體本發明提供了結合人5T4抗原並對於開發靶向免疫治療有用的新型鼠類抗體。該人5T4抗原是在滋養層細胞和眾多種癌細胞的表面上發現的72kDa非糖基化的磷蛋白。參見Hole等人(1988)Br.J.Cancer57:239-46,Hole等人(1990)lnt.J.Cancer45:179-184;PCT國際公開號WO89/07947;美國專利號5,869,053。本發明的鼠類抗5T4抗體命名為Al、A2和A3,並且如實施例1中所述進行製備。還提供的是衍生自Al、A2和A3並且與人5T4抗原特異性結合的抗5T4抗體。例如，本發明的抗5T4抗體包括包含來自Al、A2和A3抗體的抗原結合殘基的抗體；與A1、A2或A3抗體竟爭結合5T4抗原的抗體；和與A1、A2或A3抗體結合相同的5T4表位的抗體。特別地，所公開的Al、A2和A3均包含識別人5T4抗原上的獨特表位的抗原結合位點。此外，這些抗體之每一個還與H8結合不同的表位，並且A1、A2和A3均不與H8抗體竟爭結合人5T4。參見實施例4-5和圖6-7。因此，本發明提供了與人5T4的殘基30-163特異性結合的抗體(例如，A3)，與人5T4的殘基224-276特異性結合的抗體(例如，Al)，和與人5T4的殘基224-355特異性結合的抗體(例如，A2)。還提供的是包含由A1、A2或A3抗體結合的表位的人5T4抗原。例如，本發明提供了包含天然或全長5T4抗原的殘基30-163、224-276和224-355的5T4抗體片段。所公開的抗5T4抗體的特異性結合指在包含多種不同抗原的非均質樣品中抗體與人5T4抗原的優先結合。一般地，如果結合親和力為至少約10—7M或更高，例如至少約l(T8M或更高，包括至少約l(T9M或更高，至少約IO-"M或更高，或至少約10"M或更高，那麼特異性結合發生。例如，本發明的抗體與人5T4抗原的特異性結合包括在至少約1xl(T7M-約1x1(T12M的範圍中的結合，例如在約1x10_8M-約1x1012M的範圍內的結合，或在約1xl(T8M-約1xl(T"M的範圍內的結合，或在約1x10—8M-約1xIO"0M的範圍內的結合，或在約1xl(T9M-約1x10—10M的範圍內的結合。特異性結合還指在給受試者施用抗體後抗5T4抗體對5T4表達細胞的選擇性粑向。本發明的抗5T4抗體可以具有四聚體結構(例如，類似於天然存在的抗體)，或它們可以包含具有至少一個免疫球蛋白輕鏈可變區或至少一個免疫球蛋白重鏈區、或其5T4結合片段(例如，Fab、經修飾的Fab、F(ab')2或Fv片段)的任何其他結構。還包括的是單結構域抗體，其中一個或多個互補決定區(CDRs)(但小於所有6個CDR)構成抗原結合區域。本發明還包括嵌合抗體、人源化抗體、超人源化抗體、雙抗體(diabody)、單鏈抗體、四價抗體、和/或多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。這些抗體敘詞並非互相排斥的。天然存在的抗體是約150,000道爾頓的四聚(H2L2)糖蛋白，由2條相同的輕(L)鏈和2條相同的重(H)鏈組成。2條重鏈通過二硫鍵彼此連接，並且每條重鏈通過二硫鍵與輕鏈連接。輕鏈和重鏈各自進一步由氨基末端可變區和恆定區表徵。可變區包括在抗體中廣泛不同並且基本上決定特定抗體對於其特定抗原的結合親和力和特異性的序列。輕鏈和重鏈的可變區對齊以形成抗原結合結構域。嵌合抗體包含來自至少2個不同物種的序列。作為一個例子，重組克隆技術可以用於包括來自非人抗體(即，在用抗原免疫的非人物種中製備的抗體)的包含抗原結合位點的可變區和衍生自人免疫球蛋白的恆定區。本發明的嵌合抗5T4抗體包括包含Al、A2和A3抗體的重鏈和輕鏈可變區的抗體，所迷可變區即是(a)具有SEQIDNO:2的殘基20-138的M酸序列的重鏈可變區，和具有SEQIDNO:4的殘基21-127的胺基酸序列的輕鏈可變區；(b)SEQIDNO:6的殘基19-135的重鏈#^酸序列，和SEQIDNO:8的殘基23-130的輕鏈4J^酸序列；和(c)SEQIDNO:10的殘基20-141的重鏈胺基酸序列，和SEQIDNO:12的殘基21_127的輕鏈胺基酸序列。代表性人源化抗5T4抗體可以包括如SEQIDNO:49的胺基酸1-119所示的重鏈可變區，或圖9A-9C中所示的人源化重鏈可變區之任一，和同樣在圖9A-9C中顯示的人源化輕鏈可變區。本發明的代表性嵌合和人源化抗5T4抗體的製備在實施例7中得到描述。本發明的抗5T4抗體還可以包含重鏈和/或輕鏈可變區，所述可變區包含衍生自或基本上類似於Al、A2或A3可變區，或基本上類似於人源化Al、A2和A3可變區的胺基酸序列。就基本上相同的重鏈和輕鏈可變區而言，該基本上相同的序列至少約90%等同於SEQIDNOs:1-12中的任何一個的可變區序列或圖9A-9C中所示的人源化Al、A2和A3可變區，例如至少91%等同、或至少92%等同、或至少93%等同、或至少94%等同、或至少95。/。等同、或至少96%等同、或至少97%等同、或至少98%等同、或至少99%等同。本發明的代表性嵌合抗5T4抗體，即與5T4抗原特異性結合的抗體，還包括這樣的抗體，其具有(a)如SEQIDNO:2的殘基20-138、SEQIDNO:6的殘基19-135、SEQIDNO:10的殘基20-141所示的重鏈可變區^J^,列，或圖9A-9C中所示的人源化Al、A2或A3重鏈可變區中的任何一個；(b)與SEQIDNO:2的殘基20-138至少85°/。等同的重鏈可變區氨基斷列；(c)與SEQIDNO:6的殘基19-135至少86°/。等同的重鏈可變區氨基,列；(d)與SEQIDNO:10的殘基20-141至少91。/。等同的重鏈可變區^t^酸序列；(e)與SEQIDNO:49的殘基l-119至少卯。/。等同的重鏈可變區M酸序列；或(f)衍生自圖9A-9C中所示的人源化Al、A2或A3可變區中的任何一個的重鏈可變區絲斷列。與5T4抗原特異性結合的嵌合或人源化抗5T4抗體的重鏈可變區可以由下述核酸編碼(a)包含SEQIDNO:1的核苷酸58-414、SEQIDNO:5的核苷酸55-405、SEQIDNO:9的核苷酸58-423、SEQIDNO:48的核苷酸1-358的核苷酸序列的核酸；或編碼圖9A-9C中所示的人源化Al、A2或A3重鏈可變區的核酸；(b)包含與如下核酸至少卯％等同的核苷酸序列的核酸，所述核酸包含SEQIDNO:1的核苷酸58-414、SEQIDNO:5的核普酸55-405、或SEQIDNO:9的核苷酸58-423的核苷酸序列。例如，嵌合抗5T4抗體的重鏈可變區可以由這樣的核酸編碼，所述核酸與SEQIDNO:1的核苦酸58-414至少98%等同、包含與SEQIDNO:5的核苷酸55-405至少98%等同的核苷酸序列，或包含與SEQIDNO:48的核苦酸1-358至少89%等同的核苷酸序列。嵌合抗5T4抗體的重鏈可變區還可以由在嚴格雜交條件例如於65°C0.1XSSC的最終洗滌條件下，與如下核酸的互補物特異性雜交的核酸編碼，所述核酸包含SEQIDNO:1的核苷酸58-414、SEQIDNO:5的核苷酸55-405、或SEQIDNO:9的核苦酸58-423、或SEQIDNO:48的核苷酸1-358的核苷斷列。本發明的代表性嵌合抗5T4抗體進一步包括這些抗體，其具有(a)如SEQIDNO:4的殘基21—127、SEQIDNO:8的殘基23—130、SEQIDNO:12的殘基21-127所示的輕鏈可變區狄,列、或圖9A-9C中所示的人源化A1、A2或A3輕鏈可變區的殘基；或(b)與SEQIDNO:4的殘基21-127、SEQIDNO:8的殘基23—130、或SEQIDNO:12的殘基21-127至少卯％等同的輕鏈可變區#^酸序列。例如，輕鏈可變區^^酸序列可以包含(a)與SEQIDNO:4的殘基21-127至少94%等同的輕鏈可變區氨基,列；(b)與SEQIDNO:8的殘基23-130至少96%等同的輕鏈可變區胺基酸序列；(c)與SEQIDNO:12的殘基21-127至少98%等同的輕鏈可變區胺基酸序列；或(d)衍生自圖9A-9C中所示的人源化Al、A2或A3輕鏈可變區中的任何一個的輕鏈可變區狄齡列。酸編碼(a)包含SEQIDNO:3的核苷酸61-381、SEQIDNO:7的核苦酸67-3卯、SEQIDNO:11的核苷酸61-381的核苷酸序列、或編碼圖9A-9C中所示的人源化Al、A2或A3輕鏈可變區中的任何一個的核苷酸的核酸；或(b)包含與SEQ1DNO:3的核苷酸61-381、SEQIDNO:7的核苷酸67-390、或SEQII)NO:11的核苷酸61-381至少90%等同的核苷酸序列的核酸。例如，嵌合抗5T4抗體的輕鏈可變區可以由這樣的核酸編碼，其包含(a)與SEQ11)NO:3的核苷酸61-381至少97%等同的核苷酸序列；(b)與SEQIDNO:7的核苷酸67-390至少98%等同的核苷酸序列；或(c)與SEQIDNO:11的核苷酸61-381至少99%等同的核苷酸序列。與5T4抗原特異性結合的嵌合抗5T4抗體的輕鏈可變區還可以由在嚴格雜交條件例如於65°C0.1XSSC的最終洗滌條件下，與如下核酸的互補物特異性雜交的核酸編碼，所述核酸包含SEQIDNO:3的核苷酸61-381、SEQIDNO:7的核苷酸67-390、或SEQIDNO:11的核苦酸61-381的核苷酸序列。人源化抗體是一類嵌合抗體，其中負責抗原結合的可變區殘基(即，互補決定區的殘基、縮短的互補決定區(abbreviatedCDR)、或參與抗原結合的任何其他殘基)衍生自非人物種，而其餘可變區殘基(即，構架區的殘基)和恆定區至少部分衍生自人抗體序列。人源化抗體的構架區殘基和恆定區殘基的一個子集可以衍生自非人來源。人源化抗體的可變區也描述為人源化的(即，人源化的輕或重鏈可變區)。非人物種一般是用於由抗原免疫接種的物種，例如小鼠、大鼠、兔、非人靈長類、或其他非人哺乳動物物種。人源化抗體一般比傳統嵌合抗體的免疫原性小，並且在給人施用後顯示出改善的穩定性。參見例如，Benincosa等人(2000)丄Pharmacol.Exp.Ther.292:810-6;Kalofonos等人(1994)Eur，J.Cancer30A:1842-50;Subramanian等人(1998)Pediatr.Infect.Dis.丄17:110-5。互補決定區(CDRs)是參與抗原結合的抗體可變區的殘基。用於標識CDRs的幾種編號系統是常用的。Kabat定義基於序列變異性，Chothia定義基於結構環區域的定位。AbM定義是Kabat和Chothia方法之間的折中。根據Kabat、Chothia或AbM算法，輕鏈可變區的CDRs由第24和34位(CDR1-L)、第50和56位(CDR2-L)、以及第89和97位(CDR3-L)上的殘基界定。根據Kabat定義，重鏈可變區的CDRs由在第31和35B位(CDRl-H)、第50和65位(CDR2-H)、以及第95和102位上(CDR3-H)的殘基界定(根據Kabat編號)。根據Chothia定義，重鏈可變區的CDRs由第26和32位(CDR1-H)、第52和56位(CDR2-H)、以及第95和102位(CDR3-H)上的殘基界定(根據Chothia編號)。根據AbM定義，重鏈可變區的CDRs由26和35B位(C1)R1-H)、第50和58位(CDR2-H)、以及第95和102位(CDR3-H)上的殘基界定(根據Kabat編號)。參見Martin等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sd.USA86:9268-9272;Martin等人(1991)MethodsEnzymol.203:121-153;Ped匿n等人(1992)Imm,methods1:126;及Rees等人(1996)InSternbergM.J.E.(編輯)，ProteinStructurePrediction,OxfordUniversityPress,Oxford,第141-172頁。特異性決定區(SDRs)是與抗原直接相互作用的CDRs內的殘基。SDRs對應高變殘基。參見(Padlan等人(1995)FASEB丄9:133-139)。構架殘基是除高變或CDR殘基外的抗體可變區的那些殘基。構架殘基可以衍生自天然存在的人抗體，例如基本上類似於A1、A2或A3抗體的構架區的人構架。還可以使用代表個體序列之間的共有序列的人工構架序列。當選擇用於人源化的構架區時，在人類中廣泛呈現的序列可能優於較不常見的序列。可以製備人構架受體序列的另外突變，以恢復淨皮iL為涉及抗原接觸的鼠類殘基和/或涉及抗原結合位點的結構完整性的殘基，或改善抗體表達。肽結構預測可以用於分析人源化可變重和輕鏈序列，以鑑定和避免由人源化設計引入的翻譯後蛋白質修飾位點。如下所述，人源化抗體可以使用各種方法中的任何一種進行製備，包括互補決定區(CDRs)的鑲飾(veneering)、移植、縮短的CDRs的移植、特異性決定區(SDRs)的移植、和Frankenstein裝配，見下述。人源化抗體還包括楚人源化抗體，其中一個或多個變化已引入CDRs中。例如，人殘基可以置換CDRs中的非人殘基。這些一般方法可以與標準誘變和合成技術組合，以產生任何所需序列的抗5T4抗體。鑲飾基於通過用人胺基酸序列重建抗體的溶劑可及外部的表面來減少此，鑲飾抗體看起來對於人細胞比未修飾的非人抗體更不外源。參見Padlan(1991)Mol.Immunol.28:489-98。非人抗體通過鑑定非人抗體中暴露的外部構架區殘基(所述殘基不同於人抗體的構架區中相同位置上的那些)，並且用一般佔據人抗體中的那些相同位置的M酸替換所鑑定的殘基，以進行鑲飾。CDRs的移植通過用供體抗體(例如，非人抗體)的CDRs替換受體抗體(例如，包含所需構架殘基的人抗體或其他抗體)的一個或多個CDRs來進行。受體抗體可以基於在候選受體抗體和供體抗體之間的構架殘基的相似性進行選擇。例如，根據Frankenstein方法，鑑定與相關的非人抗體的各構架區具有實質上的序列同源性的人構架區，並且將非人抗體的CDRs移植到這些不同的人構架區的複合物上。同樣對於製備本發明的方法有用的一個相關方法在美國專利申請公開號2003/0040606中得到描述。縮短的CDRs的移植是相關方法。縮短的CDRs包括特異性決定殘基和相鄰胺基酸，包括在輕鏈中的第27d-34位、第50-55位和第89-96位上，以及在重鏈中的第31-35b位、第50-58位、和第95-101位上的那些殘基((Kabat等人(l987))的編號慣例))。參見(Padlan等人(1995)FASEB丄9:133-9)。特異性決定殘基(SDRs)的移植基於抗體結合位點的結合特異性和親和力由每個互補決定區(CDRs)內的最高變殘基決定的理解。可以通過分析抗體-抗原複合物的三維結構的分析，並分析可得到的氨基^列數據，基於CDR內每個位置上出現的M酸殘基的結構不同性，模擬序列變異性。SDRs被鑑定為是由接觸殘基組成的極低免疫原性的多肽序列。參見Padlan等人(1995)FASEBJ.9:133-139。一般而言，人受體構架基於其基本上類似於供體抗體的構架區，或最類似於可變區亞家族的共有序列進行選擇。移植後，可以在供體和/或受體序列中進行另外的改變，以優化抗原結合、功能性、密碼子使用、表達水平等，包括將非人殘基引入構架區內。參見例如，PCT國際公開號WO91/09967。對於將CDRs移植到重鏈可變構架區上，有用的構架序列可以衍生自DP-21(VH7)、DP-54(VH3-07)、DP-47(VH3-23)、DP-53(VH-74)、DP-49(VH3-30)、DP-48(VH3-13)、DP-75、DP-8(VH1-2)、DP-25、Vl-2b和VI-3(VH1-03)、DP-15和Vl-8(VH1-08)、DP-14和Vl國18(VH1-18)、DP-5和V1-24P(VH1-24)、DP-4(VH1-45)、DP-7(VH1-46)、DP隱10、DA-6和YAC-7(VH1-69)、DP-88(VHl-e)、DP-3和DA-8(VHl-f)。包含用於人源化的構架殘基的代表性重鏈可變區如SEQIDNOs:13-24和88-93所示。代表VH1構架殘基的共有序列的代表性構架如SEQIDNOs:25-27所示。還參見圖10A-10B。對於將CDRs移植到輕鏈可變構架區上，有用的構架序列可以衍生自DPK24亞群IV種系克隆，VkIH亞群(DPK23、1)PK22、DPK20、DPK21)，或VkI亞群種系克隆(DPK9、DPK1、02、DPK-7)。包含用於人源化的構架殘基的代表性輕鏈可變區如SEQIDNOs:28-34、35-44和94-99所示。參見圖11-14。本發明的代表性人源化抗5T4抗體包括具有非人抗5T4抗體的一個或多個CDRs的抗體，所述CDRs選自SEQIDNOs:2、6或10中的任何一個的重鏈可變區或SEQIDNOs:4、8或12中的任何一個的輕鏈可變區的CDR。例如，人源化抗5T4抗體可以包含選自SEQIDNOs:2、6或10中的任何一個的重鏈可變區，或SEQIDNOs:4、8或12中的任何一個的輕鏈可變區的CDRs中的2個或更多CDRs。人源化抗5T4抗體還可以包含含有具有SEQIDNOs:2、6或10中的任何一個的2個或3個CDRs的可變區的重鏈，和含有具有SEQIDNOs:4、8或12中的任何一個的2個或3個CDRs的可變區的輕鏈。可以構建本發明的人源化抗5T4抗體，其中第一鏈的可變區(即，輕鏈可變區或重鏈可變區)是人源化的，和其中第二鏈的可變區不是人源化的(即，在非人物種中產生的抗體的可變區)。這些抗體是稱為半人源化抗體的一類人源化抗體。可以用於製備半人源化抗體的非人抗5T4抗體包括如本文所乂>開的Al、A2和A3抗體，以及PCT國際公開號WO98/55607和Forsberg等人(1997)丄Biol.Chem.272(19):124430-12436中描迷的H8抗體，或Woods等人(2002)Biochem.丄366:353-65)中描述的大鼠單克隆抗體。例如，半人源化抗5T4抗體可以包含如SEQIDNO:49的胺基酸1-119所示的重鏈可變區，或圖9A-9C中所示的人源化A1、A2或A3重鏈可變區的胺基酸，和SEQIDNOs:4、8或12中的任何一個的輕鏈可變區。嵌合和人源化抗5T4抗體的恆定區可以衍生自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM中的任何一個、其任何同種型(例如，IgG的IgGl、IgG2、IgG3或IgG4同種型)，以及其突變形式的恆定區。人同種型的選擇和同種型中的特定胺基酸的f務飾可以增強或消除宿主防禦機制的激活並改變抗體生物分布。參見(Reff等人(2002)CancerControl9:152-66)。用於製備本發明的嵌合和人源化抗體的代表性恆定區如SEQII)NOs:45-47所示。還可以使用人k輕鏈恆定區，包括變體或突變形式。對於編碼免疫球蛋白恆定區的序列的克隆，可以刪除內含子序列。嵌合和人源化抗5T4抗體可以使用本領域已知的標準技術進行構建。例如，可變區可以通過使編碼可變區的重疊寡核苷酸退火在一起並將其連接到包含人抗體恆定區的表達載體中進行製備。參見例如，Harlow&Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,NewYork和美國專利號4,196,265;4,946,778;5,091,513;5,132,405;5,260,203;5,677,427;5,892,019;5,985,279;6,054,561。可以製備包含2個完整的四聚體抗體(包括同二聚體和異二聚體)的四價抗體(h4L4)，例如如PCT國際公開號WO02/096948中所述。抗體二聚體還可以通過將半胱氨酸殘基(這些殘基可以促進鏈間二硫鍵形成)引入抗體恆定區中、通過使用異雙官能交聯劑(Wolff等人(1993)CancerRes.53:2560-5)，或通過重組生產以包括雙重恆定區(dualconstantregion)(Stevenson等人(1989)AnticancerDrugDes.3:219-30)而製備。本發明的抗體的抗原結合片段可以例如通過表達截短的抗體序列，或通過全長抗體的翻譯後消化進行製備。本發明的抗5T4抗體，即A1、A2和A3抗體的變體，以及其嵌合和人源化形式可以容易地製備，以包括各種改變、置換、插入和缺失。例如，抗體序列可以就用於抗體表達的細胞類型中的密碼子使用進行優化。為了增加抗體的血清半衰期，可以將營救性受體結合表位(如杲尚未存在的話)摻入抗體重鏈序列內。參見美國專利號5,739,277。增強抗體穩定性的另外修飾包括IgG4的修飾，以用脯氨酸置換第241位上的殘基絲氨酸。參見Angal等人(1993)Mol.Immunol.30:105-108。其他有用的改變包括才艮據需要的置換以優化抗體與藥物綴合的效率。例如，抗體可以在其羧基末端上進行修飾，以包括用於藥物附著的胺基酸，例如可以添加一個或多個半胱氨酸殘基。恆定區可以進行修飾以引入用於結合碳水化合物或其他結構部分的位點。本發明的抗5T4抗體的變體可以使用標準重組技術進行生產，包括定點誘變，或重組克隆。抗5T4抗體的多樣庫可以經由基因排列和基因轉換方法在轉基因非人動物中製備(美國專利公開號2003/0017534),隨後使用功能試驗就相關活性對其進行測試。在本發明的具體實施方案中，抗5T4變體使用用於下述的親和力成熟方案來獲得突變CDRs(Yang等人(1995)J.Mol.Biol.254:392-403)、鏈改組(Marks等人(1992)Biotechnology(NY)10:779-783)、使用大腸桿菌增變菌抹(Low等人(1996)丄Mol,Biol.260:359-368)、DNA改組(Patten等人(1997)Curr,Opin.Biotechnol.8:724-733)、嗟菌體展示(Thompson等人(1996)J.Mol.Biol.256:77-88)、和有性PCR(sexualPCR)(Cramcri等人(1998)Nature391:288-291)。對於免疫治療應用，相關功能試驗包括與人5T4抗原的特異性結合，抗體內在化、和當施用給攜帶腫瘤的動物時對腫瘤位點的靶向，見本文在下文中的描述。本發明進一步提供了表達本發明的抗5T4抗體的細胞和細胞系。代表性宿主細胞包括哺乳動物和人細胞，例如CHO細胞、HEK-293細胞、HeLa細胞、CV-1細胞和COS細胞。在將異源構建體轉化到宿主細胞內後用於產生穩定細胞系的方法是本領域已知的。代表性非哺乳動物宿主細胞包括昆蟲細胞(Potter等人(1993)Int.Rev.Immunol.10(2-3):103-112)。抗體還可以在轉基因動物(Houdebine(2002)Curr.Opin.Biotechnol.13(6):625-629)和轉基因植物(Schillberg等人(2003)CellMol.LifeSci.60(3):433-45)中進行生產。II.抗5T4核酸和多肽本發明進一步提供了編碼抗5T4重鏈和輕鏈可變區的分離的核酸，和由所乂^開的核酸編碼的分離的多肽。本發明的核酸和多肽包括Al、A2和A3可變區，人源化Al、A2和A3可變區及其變體的核苷酸和M酸序列。分離的核酸和多肽可以用於製備嵌合和人源化抗5T4抗體。II.A.抗5T4核酸核酸是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈、雙鏈或三螺旋形式的聚合物。除非明確限制，否則核酸可以包含與參考天然核酸具有相似的性質的天然核苷酸的已知類似物。核酸包括基因、cDNAs、mRNAs和cRNAs。核酸可以進行合成，或可以源於任何生物來源，包括任何生物。用於克隆編碼抗5T4抗體的核酸的代表性方法在實施例1和7中得到描述。本發明的代表性核酸包含SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11和48中的任何一個的核苷酸序列。特別地，編碼A1、A2和A3重鏈可變區的核酸分別包含SEQIDNO:l的核苷酸58-41、SEQIDNO:5的核苦酸55-405、和SEQIDNO:9的核苷酸58-423，其分別編碼具有如SEQIDNO:2的殘基20-138、SEQIDNO:6的殘基19-135、和SEQIDNO:10的殘基20-141所示的胺基酸序列的重鏈可變區。編碼人源化A1重鏈可變區的核酸包含SEQIDNO:48的核苷酸1-358。編碼A1、A2和A3輕鏈可變區的核酸分別包含SEQIDNO:3的核脊酸61-381、SEQIDNO:7的核苦酸67-390、和SEQIDNO:11的殘基61-381，其分別編碼具有如SEQIDNO:4的殘基21-127、SEQIDNO:8的殘基23-130、和SEQIDNO:12的殘基21-127所示的氨基斷列的重鏈可變區。本發明的另外核酸包舍編碼圖9A-9C中所示的人源化A1、A2和A3可變區的核苷酸。本發明的核酸還可以包含與SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11和48中的任何一個基本上等同的核苷酸序列，包括與編碼SEQIDNOs:1、3、5、7、9和11中的任何一個的序列的可變區至少90%等同的核苷酸序列，例如至少約91%等同或至少92%等同、例如至少約93%等同、或至少94%等同、或至少95%等同、或至少96%等同、或至少97%等同、或至少98%等同、或至少99%等同。例如，本發明的核酸可以包含(a)與SEQIDNO:1的可變區編碼序列至少98%等同的核苷酸序列；(b)與SEQIDNO:3的可變區編碼序列至少97%等同的核苷酸序列；(c)與SEQIDNO:5的可變區編碼序列至少98%等同的核苷酸序列；(d)與SEQIDNO:7的可變區編碼序列至少98%等同的核苷酸序列；(e)與SEQIDNO:11的可變區編碼序列至少99%等同的核苷酸序列；或(f)與SEQIDNO:48的可變區編碼序列至少89%等同的核苷#列。使用序列比較算法，使用SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11和48中的任何一個的全長可變區編碼序列，或編碼圖9A-9H中所示的人源化Al、A2和A3可變區序列的核苷酸序列作為查詢序列，如下文所描述，或通過目測檢查進行序列比較，以獲得最大對應性。還參見實施例1和表1,以及實施例7和表11。基本上等同的序列可以是多態性序列，即群體中的可選序列或等位基因。等位基因差異可以小至1個鹼基對。基本上等同的序列還可以包含誘變的序列，包括包含沉默突變的序列。突變可以包含一個或多個殘基改變，一個或多個殘基的缺失，或一個或多個額外殘基的插入。基本上等同的核酸還可以定義為在嚴格條件下，與SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11或48中的任何一個的全長；SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11或48中的任何一個的可變區編碼序列的全長；或編碼圖9A-9H中所示的人源化Al、A2和A3可變區序列的核苦酸序列特異性雜交或基本上雜交的核酸。在核酸雜交的背景下，被比較的2個核酸序列可以命名為探針和靶。探針是參考核酸分子，靶是通常存在於一群異質核酸分子中的受試核酸分子。靶序列與受試序列同義。對於雜交研究，有用的探針與本發明的核酸分子的至少約14-40個核苷酸序列互補或極其相擬。優選地，探針包含SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11或48中的任何一個；SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11或48中的任何一個的可變區編碼序列；或編碼圖9A-9C中所示的人源化Al、A2和A3可變區序列的核苷酸序列之14-20個核苷酸,或當需要時甚至更長，例如30、40、50、60、100、200、300或500個核苷酸或多至全長序列。此類片段可以容易地製備，例如通過片段的化學合成，通過核酸擴增技術的應用，或通過將所選擇的序列引入重組載體內用於重組生產。特異性雜交指當特定核苷酸序列存在於複雜的核酸混合物(例如，總細胞DNA或RNA)中時，分子在嚴格條件下僅與該特定核苷酸序列結合、形成雙鏈或雜交。取決於雜交條件的嚴格性，特異性雜交可以容許探針和革巴序列之間的錯配。在核酸雜交實驗例如DNA和RNA印跡分析的情況下，嚴格雜交條件和嚴格雜交洗滌條件是序列和環境依賴的。越長的序列在越高的溫度下特異性雜交。關於核酸雜交的廣泛指導在Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分第2章，Elsevier,NewYork,NewYork中可以找到。一般地，在確定的離子強度和pH下，高度嚴格雜交和洗滌條件選擇為比特定序列的熱熔解點(Tm)低約5'C。一般地，在嚴格條件下，探針將與其靶的子序列而不是其他序列特異性雜交。Tm是50%的耙序列與完全匹配的探針雜交時的溫度(在限定的離子強度和pH下)。極度嚴格條件選擇為等於特定探針的Tm。對於具有超過約100個互補殘基的互補核酸的DNA或RNA印跡分衝斤，嚴格雜交^fr的例子是於42。C在含1mg肝素的50%甲醯胺中過夜雜交。高度嚴格洗滌條件的例子是於65。C在0.1XSSC中15分鐘。嚴格洗滌條件的例子是於65°C在0.2XSSC緩沖液中15分鐘。關於SSC緩沖液的描述，參見Sambrook等人，編輯(1989)MolecularCloning:ALaboratoryMa隨l，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork。通常,高度嚴格洗滌之前為低嚴格洗滌，以去除背景探針信號。對於超過約100個核苷酸的雙鏈體，中等嚴格洗滌條件的例子是於45X:在1XSSC中15分鐘。對於超過約100個核苷酸的雙鏈體，低嚴格洗滌的例子是於40匸在4X-6XSSC中15分鐘。對於短探針(例如，約10-50個核苷酸)，嚴格條件一般涉及在pH7.0-8.3,小於約1MNa+離子的鹽濃度，一般約0.01-1MNa+離子濃度(或其他鹽)，和溫度一般為至少約30°C。嚴格條件還可以由添加去穩定劑例如甲醯胺來達到。一般而言，在特定雜交試驗中比就無關探針所觀察到的大2倍(或更高)的信噪比指示檢測到特異性雜交。序列的雜交和洗滌條件的例子探針核苷酸序列優選於50。C在7%十二烷基琉酸鈉(SDS)、0.5MNal)O4、1mMEDTA中與乾核苷酸序列雜交，隨後於50。C在2XSSC、0.1%SDS中洗滌；更優選地，探針和耙序列於50。C在7。/。十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中雜交，隨後於50。C在1XSSC、0.1%SDS中洗滌；更優選地，探針和靼序列於50"在7%十二烷基琉酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中雜交，隨後於50。C在0.5XSSC、0.1%SDS中洗滌；更優選地，探針和乾序列於50°。在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中雜交，!51^於50。C在0.1XSSC、0.1。/。SDS中洗滌；更優選地，探針和耙序列於50。C在7。/。十二烷^i^克酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中雜交，隨後於65。C在0.1XSSC、0.1%SDS中洗滌。2個核酸序列基本上等同的另一表現是由核酸編碼的蛋白質是基本上等同的，具有相同的總體三維結構，或是生物學功能等價物。這些術語在本文的下文中進一步定義。如果相應的蛋白質M本上等同的，則在嚴格條件下4皮此不雜交的核酸分子仍^^本上等同的。這可以例如在2個核苷酸序列包含被遺傳密碼允許的保守置換變體時發生。保守置換變體是具有簡併密碼子置換的核酸序列，其中一個或多個所選擇的(或所有的)密碼子的第3位由混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基置換。參見Batzer等人(1991)NuclekAcidsRes.19:5081;Ohtsuka等人(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608;及Rossolini等人(1994)Mol.CellProbes8:91-98。本發明的核酸還包括與SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、48中的任何一個或編碼圖9A-9C中所示的人源化Al、A2和A3可變區序列的核苷酸序列互補的核酸，以及SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、48、或編碼圖9A-9C中所示的人源化A1、A2和A3可變區序列的核苷酸序列、及其互補序列的子序列和延長序列。互補序列是包含在鹼基對之間形成氫鍵時能夠彼此配對的反向平行核苷酸序列的2個核苷酸序列。如本文所使用的，術語互補序列意指基本上互補的核苷酸序列(如可以由下文所述的相同核普酸比較法評估的)，或定義為在相對嚴格條件例如本文描述的那些條件下能夠與所討論的核酸區段雜交。互補核酸區段的具體例子是反義寡核香酸。子序列是包含較長的核酸序列的一個部分的核酸序列。示例性子序列是上文中描述的探針或引物。如本文所使用的，術語引物指包含所選擇的核酸分子的約8個或更多脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，優選10-20個核苷酸，或更優選20-30個核苷酸的連續序列。本發明的引物涵蓋具有在本發明的核酸分子上引起聚合的足夠長度和適當序列的寡核苷酸。延長的序列包含摻入核酸內的另外的核苷酸(或其他類似分子)。例如，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在核酸分子的3'末端上添加序列。此外，核普酸序列可以與其他DNA序列組合，例如啟動子、啟動子區、增強子、多腺苷酸化信號、內含子序列、另外的限制酶位點、多克隆位點、和其他編碼區段。因此，本發明還提供了包含所公開的核酸的載體，包括用於重組表達的載體，其中本發明的核酸與功能啟動子可操作地連接。當與核酸可操作地連接時，啟動子與核酸功能組合，從而使得核酸的轉錄由啟動子區控制和調節。載體指能夠在宿主細胞中複製的核酸，例如質粒、粘津立和病毒載體。本發明的核酸可以進行克隆、合成、改變、突變或其組合。用於分離核酸的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域已知的。產生4^對改變、缺失或小插入的定點誘變也是本領域已知的。參見例如，Sambrook等人(編輯)(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork;Silhavy等人(1984)ExperimentswithGeneFusions.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork;Glover&Haines(1995)DNACloning:APracticalApproach,第2版，IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford/NewYork;A謹bel(編輯)(1995)ShortProtocolsinMolecularBiology,第3版，Wiley,NewYork。II.B.抗5T4多肽本發明還提供了分離的抗5T4多肽。多肽和蛋白質均指由肽鍵連接的胺基酸單鏈構成的化合物。代表性重鏈可變區多肽如SEQIDNO:2的殘基20-138、SEQIDN:6的殘基19-135、SEQIDNO:10的殘基20-141、和SEQIDNO:49的殘基1_119所示。代表性輕鏈可變區多肽如SEQII)NO:4的殘基21-127、SEQIDNO:8的殘基23-130、和SEQIDNO:12的殘基21-127所示。本發明的另外多肽包含圖9A-9C中所示的人源化A1、A2和A3可變區的胺基酸。本發明的另外多肽包括與所公開的抗5T4多肽基本上相似的重鏈和輕鏈可變區多肽，例如與SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12和49的可變區至少約90%等同、例如至少約91。/。等同、至少92%等同、至少93%等同、至少94%等同、至少95%等同、至少96%等同、至少97%等同、至少98%等同、或至少99%等同。可以使用序列比較算法，使用SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12和49中的任何一個的全長序列，或圖9A-9C中所示的人源化A1、A2或A3可變區中的任何一個的全長序列作為查詢序列，或使用其可變區序列，或通過目測檢查，就最大對應性進行序列比較。本發明進一步包含由本文所公開的核酸中的任何一個編碼的多肽。例如，本發明的代表性多肽包括(a)具有與SEQIDNO:2的殘基20-138至少85%相似的胺基酸序列的多肽；(b)具有與SEQIDNO:4的殘基21-127至少94%相似的胺基酸序列的多肽；(c)具有與SEQIDNO:6的殘基19-135至少86%相似的#^#列的多肽；(d)具有與SEQIDNO:8的殘基23-130至少96%相似的#^財列的多肽；(e)具有與SEQIDNO:10的殘基20-141至少91%相似的胺基酸序列的多肽；(f)具有與SEQIDNO:12的殘基21-127至少98%相似的氮基酸序列的多肽；和(g)具有與SEQIDNO:49的殘基1-119至少90%相似的胺基酸序列的多肽。參見實施例1和表2，以及實施例7和表11。本發明的多肽可以包含天然存在的胺基酸、合成的胺基酸、遺傳編碼的胺基酸、非遺傳編碼的胺基酸、及其組合。多肽可以包括L型和D型氨代表性非遺傳編碼的胺基酸包括但不限於2-氨基己二酸；3-氨基己二酸；P-氨基丙酸；2-氨基丁酸；4-氨基丁酸(哌啶酸)；6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基異丁酸；3-氨基異丁酸；2-M庚二酸；2,4-二氨基丁酸；鎖鏈素；2，2'-二氨基庚二酸；2，3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬醯胺；羥賴氨酸；別-羥賴氨酸；3-羥脯氨酸；4-羥脯氨酸；異鎖鏈素；另"-異亮氨酸；N-曱基甘氨酸(肌氨酸)；N-曱基異亮氨酸；N-甲基纈氨酸；正纈氨酸；正亮氨酸；和鳥氨酸。代表性衍生化的胺基酸包括例如，其中游離氨基已進行衍生以形成胺鹽酸鹽、對甲^璜醯基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙醯基或甲醯基的那些分子。游離氣基可以進行衍生以形成鹽、甲基和乙基酯或其他類型的酯或醯肼。游離羥基可以進行衍生以形成O-醯基或O-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可以進行衍生以形成N-im-卡基組氨酸。本發明還提供了本發明的抗5T4多肽的片段，例如構成5T4抗原結合位點的片段。還提供了比所公開的序列長的多肽序列。例如，一個或多個胺基酸可以加入抗體多肽的N末端或C末端。此類另外的胺基酸可以在各種應用中使用，包括但不限於純化應用。製備延長的蛋白質的方法是本領域已知的。本發明的抗5T4多肽包括包含這樣的胺基酸的蛋白質，所述氨基^！SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12或49中的任何一個的保守置換變體。保守置換變體指包含其中一個或多個殘基已由功能上相似的殘基保守置換的胺基酸的多肽。保守置換的例子包括一個非極性(疏水)殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置換另一個非極性殘基；一個極性(親水)殘基置換另一個極性殘基，例如精氨酸和賴氨酸之間、穀氨醯胺和天冬醯胺之間、甘氨酸和絲氨酸之間的置換；一個鹼性殘基例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸置換另一個鹼性殘基；或一個酸性殘基例如天冬氨酸或穀氨酸置換另一個酸性殘基。本發明的分離的多肽可以使用技術人員已知的各種標準技術進行純化和表徵。參見例如,Schroder&Lubke(1965)ThePeptides.AcademicPress,NewYork;Bodanszky(1993)PrinciplesofPeptideSynthesis,修訂版，第2版，Springer-Verlag,Berlin/NewYork;AusubeK編輯)(1995)ShortProtocolsinMolecularBiology,第3版，Wiley,NewYork.II.C.核苦酸和胺基酸序列比較對於2個或更多核苷酸或蛋白質序列，術語等同或同一性百分比指當就最大對應進行比較和比對時，兩個或更多個序列或子序列為相同的或具有指定百分比的相同胺基酸殘基或核苦酸，如使用本文公開的序列比較算法之一或通過目測檢查所得的。術語基本上相同就核苷酸或蛋白質序列而言意指一個特定序列由於一個或多個缺失、置換或添加(其淨效應是保留抗5T4核酸或多肽的生物學功能)而不同於天然存在的序列。對於2個或更多序列的比較，一般一個序列充當與一個或多個受試序列進行比較的參考序列。當使用序列比較算法時，將受試和參考序列輸入電腦程式內，必要時指定子序列坐標，並選擇序列算法程序參數。序列比較算法隨後基於所選擇的程序參數計算指定的受試序列相對於參考序列的序列同一性百分比。用於比較的序列的最佳比對可以通過下述來進行例如Smith&Waterman(1981)Adv,Appl.Math2:482-489的局部同源性算法，Needleman&W,ch(1970)丄Mol.Biol.48:443-453的同源性比對算法，Pearson&Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-2448的相似性搜索方法，這些算法的計算機化執行(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA),或目測檢查。一般參見Ausubel(編輯)(1995)ShortProtocolsinMolecularBiology,第3版，Wiley，NewYork。用於測定序列同一性百分比和序列相似性的優選算法是BLAST算法，其在AUschul等人(1990)丄Mol.Biol.215:403-41中得到描迷。用於執行BLAST分析的軟體通過美國國家生物技術信息中心(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公開獲得。BLAST算法參數決定比對的敏感性和速度。對於2個核苷酸序列的比較，BLASTn預設參數設為W=ll(字長)和E=10(期望值)，並且還包括低複雜度濾器的使用以掩蔽具有低組成複雜性的查詢序列的殘基。對於2個胺基酸序列的比較，BLASTp程序預設參數設為W=3(字長)，E=10(期望值)，BLOSUM62評分矩陣的使用，空位存在罰分=11和延長罰^=1，和低複雜度濾器的使用以掩蔽具有低組成複雜性的查詢序列的殘基。參見實施例l。III.抗5T4抗體/藥物綴合物本發明進一步提供了包含本發明的抗5T4抗體的抗體/藥物綴合物。還提供了用於製備抗體/藥物綴合物的方法，從而使得藥物與抗體直接或間接結合。本發明的抗體/藥物綴合物具有通式5T4Ab(-X-W)m，其中5T4Ab是如本文所描述的抗5T4抗體或抗體片段；接頭；口、一"丄^義、、-土'W是藥物；m是純化的綴合產物的平均負荷(例如，m使得藥物構成綴合物的3-10%重量)；和(-X-W)m是藥物衍生物。還提供的是用於製備本發明的抗體/藥物綴合物的方法。作為一個例子，式5T4Ab(-X-W)m的抗體/藥物綴合物可以通過下述進行製備(a)將藥物衍生物加入抗5T4抗體中，其中藥物是抗5T4抗體的3-10%重量；(b)在非親核的、蛋白質相容的、具有約7-9的pH範圍的緩衝溶液中使藥物衍生物和抗5T4抗體溫育，以產生抗體/藥物綴合物，其中溶液進一步包含(i)合適的有機共溶劑，和(ii)包含至少一種膽汁酸或其鹽的一種或多種添加劑，並且其中溫育在約30°C-約35。C進行約15分鐘-約24小時的時間段；和(c)對步驟(b)中產生的綴合物實施層析分離過程，以分離具有3-10%重量藥物負荷和具有低綴合級分(lowconjugatedfraction,LCF)的抗體/藥物綴合物與未綴合的抗5T4抗體、藥物衍生物和聚集的綴合物。III.A.藥物藥物是具有生物或可檢測的活性的任何物質，例如治療劑、可檢測的標記、結合劑等、和在體內代謝成活性劑的藥物前體。藥物還可以是藥物衍生物，其中藥物已進行官能化以使得能夠與本發明的抗體綴合。一般地，這些類型的綴合物稱為免疫綴合物。治療劑是可以用於治療或預防有此需要的受試者中的病狀的組合物。在本發明中有用的治療劑包括抗癌劑，即在5T4表達細胞例如癌細胞中具有抗癌活性的試劑，所述癌細胞來自鱗狀/腺瘤性肺癌(非小細胞肺癌)、浸潤性乳腺癌、結腸直腸癌、胃癌、鱗狀宮頸癌、浸潤性子宮內膜腺癌、浸潤性胰腺癌、卵巢癌、鱗狀膀胱癌和絨毛膜癌。代表性治療藥物包括細胞毒素、放射性同位素、化學治療劑、免疫調諧劑、抗血管生成劑、抗增殖劑、促凋亡劑、以及細胞生長抑制劑和細胞溶解酶(例如RNA酶)。藥物還可以包括治療性核酸，例如編碼免疫調諧劑、抗血管生成劑、抗增殖劑或促凋亡劑的基因。這些藥物敘詞並非互相排斥的，並且因此治療劑可以使用上文指出的術語中的一個或多個進行描述。例如，所選擇的放射性同位素也是細胞毒素。治療劑可以製備為藥學上可接受的鹽、酸或上述任何一種的衍生物。一般地，具有放射性同位素作為藥物的綴合物稱為》t射免疫綴合物，具有化學治療劑作為藥物的那些稱為化學免疫綴合物。用於在免疫綴合物中使用的合適的藥物的例子包括紫杉烷類(taxanes)、美登素類(maytansines)、CC曙1065和倍癌黴素類(duocarmycin)、加利車黴素和其他烯二炔類(enediynes)、和auristatins。其他例子包括抗葉酸劑、長春花生物鹼和蒽環類。植物毒素、其他生物活性蛋白質、酶(即，ADEPT)、方文射性同位素、光敏劑(即，用於光動力療法)也可以在免疫綴合物中4吏用。此外，綴合物可以4吏用二級載體(secondarycarrier)作為細胞毒素劑，例如脂質體或聚合物進行製備。術語細胞毒素一般指抑制或阻止細胞功能和/或導致細胞破壞的活性劑。代表性細胞毒素包括抗生素，微管蛋白聚合的抑制劑，結合併打斷DNA的烷化劑，和破壞蛋白質合成或必需細胞蛋白質的功能的活性劑，所述必需細胞蛋白質例如為蛋白激酶、磷酸酶、拓樸異構酶、酶和細胞周期蛋白。代表性細胞毒素包括但不限於多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、依達》匕星(idarubicin)、阿柔t匕星(adarubicin)、佐柔t匕星(zorubicin)、米託蒽酉昆(mitoxantrone)、表柔比星(epirubicin)、卡柔比星(carubicin)、諾力口黴素(nogalamycin)、美;若立爾(menogaril)、"比柔比星(pitarubicin)、戊柔比星(valmbicin)、阿糖月包苦(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、曲氟尿苦(trifluridine)、安西他濱(ancitabine)、依諾他濱(enocitabine)、阿扎胞普(azacitidine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、噴司他丁(pentostatin)、溴尿苦(broxuridine)、卡培他濱(capecitabine)、克拉屈濱(cladribine)、地西他濱(decitabine)、氟尿脊(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、谷氏菌素(gougerotin)、噪呤黴素(puromycin)、替力口氟(tegafur)、塞唑羧胺核苦(tiazofurin)、阿黴素(adriamycin)、順鉑(cisplatin)、卡柏(carboplatin)、環褲醯胺(cyclophosphamide)、達卡巴漆(dacarbazine)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、米託蒽醌、博來黴素(blomycin)、氮芥(mechlorethamine)、強的松(prednisone)、甲基千肼(procarbazine)、氨曱蝶呤(methotrexate)、氟尿嘧咬(flurouracils))、依託泊苦(etoposide)、泰素(taxol)、泰素類似物、鉑例如順鉑和卡鉑、絲裂黴素(mitomycin)、塞替派(thiotepa)、紫杉坑(taxanes)、長春新威(vincristine)、道"i若紅菌素(daunorubkin)、表柔比星(epirubicin)、放線菌素(actinomycin)、authramycin、氮絲氨酸(azaserines))、博來黴素(bleomycins)、它莫西芬(tamoxifen)、依達比星(idambicin)、多拉司他汀(dolastatins)/auristatins、哈米特林(hemiasterlins)、埃斯波黴素(esperamicins)和美登類化合物(maytansinoids)。在本發明的具體實施方案中，細胞毒素是抗生素，例如加利車黴素，也稱為IX-E33288複合物，例如Y-加利車黴素(Yi)或N-乙醯Y-加利車黴素。參見美國專利號4,970,198。適用於製備本發明的抗體/藥物綴合物的另外的加裡車黴素例子公開於美國專利號4,671,958;5,053,394;5,037,651;5,079,233;及5,108,912中，所述專利整體合併入本文。這些化合物包含曱基三硫化物，其可以與合適的硫醇反應，同時引入官能團如醯肼或對於使加利車黴素與抗5T4抗體綴合有用的其他官能團。還可以使用加利車黴素的二石克化物類似物，例如美國專利號5,606,040和5,770,710中描迷的類々乂物，所述專利整體合併入本文。對於放射治療應用，本發明的抗5T4抗體可以包含高能量的放射性同位素。同位素可以與抗體直接結合，例如在抗體中存在的半胱氨酸殘基上，或螯合劑可以用於介導抗體和放射性同位素的結合。適合於放射治療的放射性同位素包括但不限於a-發射體、p-發射體和俄歇電子。對於診斷應用，有用的放射性同位素包括正電子發射體和7-發射體。本發明的抗5T4抗體還可以硪化，例如在抗體的酪氨酸殘基上，以促進抗體的檢測或療效。可以與抗5T4抗體綴合的代表性放射性同位素包括"氟、64銅、65銅、67鎵、68鎵、77溴、,溴、95釕、97釕、103釕、105釕、"m*、107汞、203汞、123硤、124硪、125硤、126碘、131碘、133碘、川銦、113銦、991"錸、105錸、11錸、186錸、188錸、'2^碲(mtellurium)、"鎝、122|11碲、1251"碲、165銩、167銩、168銩、9釔、以及由它們衍生的氮化物或氧化物形式。其他合適的放射性同位素包括ot發射體，例如213鉍、213鉛和225錒。本發明的抗體/藥物綴合物可以包括免疫調諧劑，即引發免疫應答，包括體液免疫應答(例如抗原特異性抗體的產生)和細胞介導的免疫應答(例如淋巴細胞增殖)的試劑。代表性免疫調諧劑包括細胞因子，黃嘌呤，白介素，幹擾素，和生長因子(例如，TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF),和激素例如雌激素(已烯雌酚(diethylstilbestrol)、雌二醇)，雄激素(睪酮、HALOTESTIN⑧(氟甲睪酮(fluoxymesterone)))，孕激素(MEGACE(乙酸曱地孕酮(megestrolacetate))、PROVERA(乙酸曱羥孕酮(medroxyprogesteroneacetate))),和皮質類固醇(強的松、地塞米松(dexamethasone)、氬4b可的+^(hydrocortisone))。在本發明中有用的免疫調諧劑還包括阻斷激素對腫瘤的作用的抗激素藥，和抑制細胞因子生產、下調自身抗原表達、或掩蔽MHC抗原的免疫抑制劑。代表性抗激素藥包括抗雌激素藥，包括例如它莫西芬、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑類、4-羥基它莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、onapnstone和託瑞米芬(toremifene);和抗雄激素藥，例如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(kuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);和抗腎上腺素藥(anti-adrenalagents)。代表性免疫抑制劑包括2-#^-6-芳基-5-取代的嘧啶類、硫唑嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺、溴隱亭(bromocrypine)、達那唑(danazol)、氨^L(dapsone)、戊二醛、針對MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體、環孢菌素A(cyclosporinA)、類固醇例如糖皮質類固醇、細胞因子或細胞因子受體拮抗劑(例如，抗幹擾素抗體、抗1LIO抗體、抗TNFa抗體、抗IL2抗體)、鏈激酶、TGFJ3、雷帕黴素、T細胞受體、T細胞受體片段、和T細胞受體抗體。在本發明中有用的另外藥物包括抑制血管形成的抗血管生成劑，例如法尼基轉移酶抑制劑、COX-2抑制劑、VEGF抑制劑、bFGF抑制劑、類固醇硫酸酯酶抑制劑(例如，2-甲氧基雌二醇二氨基磺酸酯(2-MeOE2bisMATE))、白介素-24、凝血栓蛋白(thrombospondin)、metallospondin蛋白質、I類幹擾素、白介素12、魚精蛋白、血管他丁(angiostatin)、層粘連蛋白、內皮他丁(endostatin)和催乳激素片段。抗增殖劑和促凋亡劑包括PPAR-y激活物(例如，環戊烯酮前列腺素(cyPGs))、類視黃醇、三萜類化合物(triterpinoids)(例如，環菠蘿蜜烷(cycloartane)、羽扇豆烷(lupane)、烏蘇烷(ursane)、齊敦果烷(oleanane)、木檢烷(friedelane)、達瑪烷(dammarane)、葫蘆素(cucurbitacin)和檸檬苦素類似物(limonoid)三萜類化合物)、EGF受體抑制劑(例如，HER4)、雷帕黴素、CALCmUOL⑧(1，25-二羥基膽鈣化醇(維生素D))、芳香酶抑制劑(FEMARA(letrozone))、端粒末端轉移酶抑制劑、鐵螯合劑(例如，3-氨基吡啶-2-甲醛硫代縮氨基脲(Triapine))、凋亡蛋白(來自雞貧血病病毒的病毒蛋白質3——VP3)、Bcl-2和Bcl-X(L)的抑制劑、TNF-a、FAS配體、TNF相關的凋亡誘導配體(TRAIL/Apo2L)、TNF-a/FAS配體/TNF相關的凋亡誘導配體(TRAIL/Apo2L)信號傳導的激活物、和PI3K-Akt存活途徑信號抑制劑(例如，UCN-01和格爾德黴素)。代表性化學治療劑包括烷化劑例如噻替派和環磷醯胺；烷基磺酸酯類，例如白消安(busulfan),英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙咬類(aziidines)，例如benzodopa，卡巴醌(carboquone)，meturedopa和uredopa;乙烯亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)，三亞乙基磷醯胺，三亞乙基硫代磷醯胺和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥,例如笨丁酸氮芥(chlorambucil)，蔡氮芥(chlornaphazine)，cholophosphamide，雄氮齊(estramustine)，異環褲醯胺(ifosfamide)，氮芥(mechiorethamine)，氧氮芥鹽酸鹽,苯丙氨酸氮芥(melphalan),新氮芥(novembichin)，苯芥膽甾醇(phenesterine)，〉發尼氮芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfarnide)，尿口密咬氮芥(uracilmustard);石肖基脲類(nitrosureas)，例如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlrozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine);抗生素，例如阿克拉黴素(aclacinomysins)，放線菌素，authramycin，氮絲氨酸，博來黴素，i支線菌素c(cactinomycin),加利車黴素，卡柔比星，洋紅黴素(carminomycin),嗜癌素(carzinophmn)，色黴素，更生黴素，柔紅黴素，地託比星(detorubicin)，6_重氮基_5-氧代丄-正亮氨酸，多柔比星，表柔比星，依索比星(esorubicin)，依達比星，發波黴素，絲裂黴素，黴酚酸，諾加黴素，橄欖黴素，培洛黴素，紫菜黴素(potfiromycin)，嘌呤黴素，三4失阿黴素(quelamycin),羅多比星(rodorubicin),鏈黑菌素，鏈脲菌素，殺結核菌素，烏苯美司(ubenimex),淨司他丁(zinostatin)，佐柔比星；抗代謝物，例如氨甲蝶呤和5_氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，例如二曱葉酸(denopterin),氨甲蝶呤，蝶羅呤(pteropterin)，三曱曲沙(trimetrexate);噪呤類似物,例如氟達拉濱，6-巰噤呤，硫咪嘌呤(thiamiprine),硫鳥嘌呤；嘧。定類似物，例如安西他濱，阿扎胞苷，6-阿扎尿苷(azauridine)，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苦，二脫氧尿苷，去氧氟尿苷，依諾他濱，氟尿苷，5-EU;雄激素類，例如卡普睪酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolonepropionate),環石充雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睪內西旨(tcstolactone);抗腎上腺素藥，例如氨魯米特(arninoglutethimide)，米託坦(mitotane),曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑，例如亞葉酸(frolinicacid);醋葡醛內酯(aceglatone);醛磷酖胺糖苦(aldophospharnideglycoside);^SJ同戊酸；安p、f澱(amsacrine);bestrabucil;J匕生群(bisantrene);edatraxate;defofamine;矛火水寸山胺(demecolcine);地P丫酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋銨(emptiniumacetate);依託格魯(etoglucid);硝酸鎵；雍基脲；香菇多糖；氯尼達明(lonidamine);米託胍腙(mitoguazone);米託蒽醌；莫哌達醇(mopidamol);硝氨丙吖啶(nitracrine);噴司他丁；蛋氨氮芥(phenamet);p比柔t匕星(pirarubicin);鬼白酸(podophyllinicacid);2畫乙基醯肼；曱基苄肼；雷佐生(razoxane);西佐喃(sizofiran);鍺螺胺(spirogermanium);替奴佐酸(tenuaz:onicacid);三亞胺醌(traziquone);2，2'，2'—三氯三乙胺；烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine);達卡巴-秦；甘露氮齊(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇(mitolactol);派泊淡烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞普(Ara-C);環磷醯胺；噻替派；taxoids,例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-MyersSquibbOncologyofPrinceton,NewJersey)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE,Rhone-PoulencRorerofAntony,France);苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰嘌呤；氨曱蝶呤；鉑類似物，例如順鉑和卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16);異環磷醯胺；絲裂黴素C;米託蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；諾維本(navelbine);米託蒽醌(novantrone);替尼泊苦(teniposide);柔紅黴素；aininopterin;希羅達(xeloda);伊班膦酸鹽(ibandronate);CPT-11;拓樸異構酶抑制劑RFS2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);視黃酸；埃斯波黴素；和卡培他濱。可以與抗5T4抗體綴合併依照本發明的治療方法使用的另外的治療劑包括用於光動力療法的光敏劑(美國專利公開號2002/0197262和美國專利號5,952,329);用於熱療法的磁性顆粒(美國專利公開號2003/0032995);結合劑，例如肽、配體、細胞粘附配體等，和藥物前體例如含磷酸鹽的藥物前體、含硫代磷酸鹽的藥物前體、含石克酸鹽的藥物前體、含肽的藥物前體、含P-內醯胺的藥物前體、含取代的苯氧基乙醯胺的藥物前體或含取代的苯乙醯胺的藥物前體，可以轉變成更具活性的無細胞毒性藥物的5-氟胞嘧啶和其他5-氟胞嘧啶藥物前體。對於使用抗5T4抗體的診斷方法，藥物可以包含用於在體外或體內檢測5T4表達細胞的存在的可檢測標記。在體內可檢測的放射性同位素例如可使用閃爍掃描術、磁共振成像、或超聲檢測的那些標記可以在臨床診斷應用中使用。有用的閃爍掃描標記包括正電子發射體和Y-發射體。用於磁源成像的代表性造影劑是順磁或超順磁離子(例如，鐵、銅、錳、鉻、鉺、銪、鏑、鈥和釓)，氧化鐵顆粒，和水溶性造影劑。對於超聲檢測，氣體或液體可以截留在作為微氣泡造影劑釋放的多孔無機顆粒中。對於體外檢測，有用的可檢測標記包括螢光團、可檢測的表位或結合劑、和放射性標記。III.B.接頭分子藥物經由接頭分子與本發明的嵌合和人源化抗5T4抗體直接或間接綴合。接頭分子可以是穩定的或可水解的，由此它在進入細胞後釋放。引起藥物與抗體斷裂的主要機制包括在溶酶體的酸性pH中水解(腙類、縮醛類和順烏頭酸酯樣醯胺)，經由溶酶體酶的肽切割(組織蛋白酶和其他溶酶體酶)，和二硫化物的還原。由於用於斷裂的這些不同機制，使藥物與抗體連接的機制也是廣泛多樣的，並且可以使用任何合適的接頭。優選地，綴合方法產生具有最低限度的低綴合級分(LCF，大部分未綴合的抗體級分)，即小於約10%的樣品。合適的綴合搡作的一個例子依賴於醯肼和其他親核體與由抗體上天然存在的碳水化合物氧化產生的醛的綴合。含腙綴合物可以由引入的羰基進行製備，所述羰基提供所需的藥物釋放性質。綴合物還可以由在一個末端上具有二闢u化物、在中間具有烷基鏈、並且在另一個末端上具有肼衍生物的接頭進行製備。蒽環類是可以使用這種技術與抗體綴合的細胞毒素的一個例子。包含除腙外的官能團的接頭也可以具有在溶酶體的酸性環境中被切割的潛力。例如，綴合物可以由包含非腙位點的硫醇反應性接頭進行製備，所述位點是細胞內可斷裂的，例如酯、醯胺、和縮醛/縮酮。喜樹鹼是可以使用這些接頭進行綴合的一種細胞毒素劑。還可以使用由5-7元環酮製備的縮酮，其中縮酮的一個氧與細胞毒素劑連接而另一個氧與抗體附著的接頭連接。蒽環類化合物也是可以使用這些接頭的適宜細胞毒素的例子。pH敏感性接頭類別的另一個例子是順烏頭酸酯，其具有與醯胺鍵並置的羧酸。羧酸使酸性溶酶體中的醯胺水解加速。還可以使用具有幾種其他類型的結構以實現相似類型的水解速度加速的接頭。美登素類化合物是可以與在C-9上附著的接頭綴合的細胞毒素的例子。用於藥物綴合物的另一個潛在釋放方法是肽經由溶酶體酶的酶促水解。在一個例子中，肽經由醯胺鍵與對氨基苯甲醇連接，隨後氨基曱酸酯或碳酸酯在苯曱醇和細胞毒素劑之間形成。肽的切割導致氨基苯甲基M甲酸酯或碳酸酯的崩解或自我消滅。使用這種策略的例示性細胞毒素劑包括蒽環類、紫杉烷類、絲裂黴素C和auristatins。在一個例子中，苯酚還可以通過接頭而不是氨基甲酸酯的崩解得到釋放。在另一種變化中，二硫化物的還原被用於起始對巰基笨甲基氨基甲酸酯或碳酸酯的崩解。與抗體綴合的許多細胞毒素劑在水中的溶解性，如果有的話，也是極低的，並且由於綴合物的聚集，這可能限制在綴合物上的藥物負荷。克服這點的一種方法是給接頭添加增溶基團。可以使用由PEG和二肽組成的接頭製備的綴合物，包括具有與抗體連接的PEG二酸、硫羥酸、或馬來醯亞胺酸，二肽間隔物，和與蒽環或倍癌黴素類似物的胺的醯胺鍵的那些綴合物。另一個例子是由與細胞毒素劑鍵合的含PEG接頭的二闢u化物和與抗體鍵合的醯胺製備的綴合物。摻入PEG基團的方法對於克服聚集和藥物負荷限制可能是有利的。對於本發明的抗體/藥物綴合物製備優選的代表性接頭包括下式的接頭(CO-AIk1-Sp1-Ar畫Sp2-歳2-C(Z1)=Q-SP)其中All^和AlP獨立地是鍵或分支的或不分支的(C廣do)亞烷基鏈；Sp!是鍵、-S-、畫O-、-CONH-、曙NHCO-、-NR'-、-N(CH2CH2)2N-、或畫X-Ar，-Y-(CH2)n-Z，其中X、Y和Z獨立地是鍵、-NR'-、-S-或-O-,條件是當n-0時，Y和Z中的至少一個必須是鍵，且Ar'是由(d-C5)烷基、(C廣Cj烷氧基、(d-C4)硫代烷氧基、卣素、硝基、-COOR，、-CONHR'、-(CH2)nCOOR'、-S(CH2)nCOR'、-O(CH2)nCONHR，或-S(CH2)nCONHR'的1、2或3個基團任選取代的l，2-、1,3-或1，4-亞苯基，條件是當Alk'是鍵時，81是鍵；n是0-5的整數；R'是由-OH、(C,-C4)烷氧基、(d-C4)硫代烷氧基、滷素、辨基、(CrC3)二烷基氨基、或(Ci-C3)三烷基銨-A—的一個或2個基團任選取代的分支的或不分支的(CrCs)鏈，其中A—是完成鹽的藥學上可接受的陰離子；Ar是由(Cj-C6)烷基、(CrC5)烷氧基、(d-C4)硫代烷氧基、囟素、硝基、-COR'、-CONHR'、-O(CH2),'COOR'、-S(CH2)nCOOR，、-O(CH2)nCNHR'或-S(CH2)nCONHR，的1、2或3個基團任選取代的1，2-、1,3-或1，4-亞苯基，其中n和R'如上文定義，或Ar是l，2-、1，3-、1，4-、1，5-、1，6-、1，7-、1,8-、2,3-、2，6-或2，7-亞萘基，或其中亞萘基或吩瘞。秦各任選地由(C廣CJ烷基、(Q-C5)烷氧基、(d-C4)硫代烷氧基、囟素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2)nCOOR'、-S(CH2)nCOOR'或-S(CH2)。CONHR'的1、2、3或4個基團取代，其中n和R，如上文定義，條件是當Ar是吩瘞嗪時，SpJ是僅與氮連接的鍵；Sp2是鍵、-S-或-O-，條件是當Alk2是鍵時，Sp2是鍵；Z，是H、(C廣Cs)烷基、或由(C廣C5)烷基、(C,-Cs)烷氧基、(C,-C4)>5危代烷氧基、囟素、硝基、畫COOR'、-ONHR'、-O(CH2)nCOOR'、畫S(CH2)nCOOR'、-O(CH2)nCONHR'或-S(CH2)nCONHR，的1、2或3個基團任選取代的苯基，其中n和R'如上文定義；Sp是直鏈或支鏈二價或三價(Cj-C18)基團，二價或三價芳基或雜芳基基團，二價或三價(C3-C18)環烷基或雜環烷基基團，二價或三價芳基或雜芳基-芳基(CVQs)基團，二價或三價環烷基或雜環烷基-烷基(CrC18)基團，或二價或三價(C2-C18)不飽和的烷基基團，其中雜芳基優選是呋喃基、噻汾基、N-甲基吡咯基、吡澱基、N-曱基咪唑基、噁唑基、嘧咬基、壹啉基、異會啉基、N-甲基^唑基、氨基香豆素基、或吩嗪基，並且其中如果Sp是三價基團，那麼Sp還可以由低級(C廣Cs)二烷基氨基、低級(d-C5)烷氧基、羥基、或低級(d-C5)烷硫基任選取代；和Q是-NHNCO-、=NHNCS-、=NHNCONH-、二NHNCSNH-或-NHO-。優選地，Al^是分支或不分支的(d-C,o)亞烷基鏈，Sp'是鍵、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-或-NR'，其中R，如上文定義，條件是當Alk'是鍵時，Sp'是鍵；Ar是由(C廣C6)烷基、(C廣Cs)烷氧基、(C廣C4)硫代烷氧基、卣素、硝基、-COR'、-CONHR'、(CH2)nCOOR，、-S(CH2)nCOOR'、-O(CH2)。CONHR'或-S(CH2)。CONHR'的1、2或3個基團任選取代的1，2-、1，3-或1，4-亞苯基，其中n和R'如上文定義，或Ar是各自由(d-G)烷基、(d-Cs)烷氧基、(C,-C4)硫代烷氧基、滷素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-(CH2)nCOR，、-S(CH2)nCOOR，、-O(CH2)nCONHR，或-S(CH2)nCONHR'的1、2、3或4個基團任選取代的l，2-、l，3-、l，4-、1,5-、l，6-、l，7-、1,8-、2，3-、2,6-或2,7-亞萘基。Zi是(C廣Cs)烷基、或由(C廣Cs)烷基、(C廣Q)烷氧基、(d-C4)硫代烷氧基、卣素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2)nCOOR'、-S(CH2)nCOOR'、-O(CH2)nCONHR'或-S(CH2)nCONHR的1、2或3個基團任選取代的苯基；Alk2和Sp2—起是鍵；且Sp和Q如緊在上文中所定義的。整體合併入本文的美國專利號5,773,001公開了可以用於加利車黴素製備的親核藥物，特別是醯肼和相關親核體的接頭。這些接頭對於當藥物和接頭之間形成的鍵可水解時可以獲得更佳活性的那些情況特別有用。這些接頭包含2個官能團，包括(1)與抗體反應的基團(例如，羧酸)，和(2)用於與藥物反應的羰基(例如，醛或酮)。羰基可以與藥物上的醯肼基團反應以形成腙鍵。這個鍵是可水解的，從而允許治療劑在與把細胞結合後從綴合物中釋放。作為一個例子，抗5T4抗體可以通過下述與細胞毒性藥物綴合，(1)將細胞毒性藥物衍生物加入抗5T4抗體中，其中細胞毒性藥物是該蛋白質性質的載體的4.5%-11%重量；(2)在非親核的、蛋白質相容的、具有約7-9的pH範圍的緩沖溶液中使細胞毒性藥物衍生物和抗5T4抗體溫育，以產生單體的細胞毒性藥物/抗體綴合物，其中溶液還包含(a)合適的有機共溶劑，和(b)包含至少一種C6-ds羧酸或其鹽的添加劑，且其中溫育在約30°C-約35。C進行約15分鐘-24小時的時間段；和(3)對步驟(2)中產生的綴合物實施層析分離，以使具有3%重量-10%重量的細胞毒性藥物負荷和具有低於10%的低綴合級分(LCF)的單體綴合物與未綴合的抗體、細胞毒性藥物衍生物和聚集的綴合物分離。步驟(3)的層析分離可以包括方法例如尺寸排阻層析法(SEC)、超濾/滲濾(diafiltration)、HPLC、FPLC或SephacrylS-200層析法。層析分離還可以通過疏水作用層析法(H1C)使用PhenylSepharose6FastFlow層析介質、ButylSepharose4FastFlow層析介質、OctylSepharose4FastFlow層析介質、ToyopearlEther-650M層析介質、Macro-Prep甲基HIC介質或Macro-Prept-ButylHIC介質來完成。用於製備抗5T4抗體/藥物綴合物的代表性方法包括在共同待決的公開的美國專利申請公開號2004-082764A1和美國專利申請號10/699，874中針對CMC-544的製備描述的方法，所述專利申請整體合併入本文。綴合可以使用下述條件來進行10mg/ml抗體，8.5%(w/w)加利車黴素衍生物，37.5mM癸酸鈉，9%(v/v)乙醇，50mMHEPES(N-(2-羥乙基)哌，秦-N，-U-丁磺酸))，pH8.5，32°C,1小時。疏水相互作用層析法(HIC)可以使用丁基瓊脂糖FF樹脂，0.65M磷酸鉀加樣緩衝液，0.49M磷酸鉀洗滌緩衝液，和4mM磷酸鉀洗脫緩衝液來進行。緩衝液更換可以通過尺寸排阻層析法、超濾/滲濾、或其他合適的方法來完成。抗體/藥物綴合物可以配製在1.5%Dextran-40，0.9%蔗糖，0.01%TWEEN-80，20mMTris/50mMNaCl，pH8.0中。還可以使用包含5%蔗糖，0.01%TWEEN-80，20mMTris/10mMNaCl,pH8.0的備選配製溶液。凍幹循環基於製劑進行調整。配製物的濃度可以是0.5mg綴合物/ml。每個小瓶可以包舍1mg綴合物，即2ml充填。其他充填體積可以根據需要進行準備，例如，5ml充填。其他代表性方法包括針對CMD-193描述的方法，同樣在美國專利申請公開號20060002942中描述。綴合可以使用下述條件來進行10mg/ml抗體，7%(wAv)加利車黴素衍生物，lOmM脫氧膽酸鹽，50mMHEPES(N-(2-羥乙基)哌嗪-N，-(4-丁磺酸))，9%(v/v)乙醇，pH8,2，32°C，l小時。反應可以用0.66M磷酸鍾pH8.56稀釋10倍，並且HIC可以使用丁基瓊脂糖FF樹脂，0.60M磷酸鉀加樣緩衝液和洗滌緩衝液，和20mMTris/25mMNaCl洗脫緩衝液來進行。緩衝液更換可以使用超濾/滲濾用再生纖維素膜來完成。綴合物可以用20mMTris/10niMNaClpH8.0(10置換體積(diavolmnes))進行滲濾。抗體/藥物綴合物可以在5%蔗糖，0.01%TWEEN-80，20mMTris/10mMNaCl,pH8.0中進行配製。配製後的綴合物的濃度可以是lmg/ml，並且小瓶充填可以是5mg/小瓶，即5ml充填，或其他充填體積可以根據需要進行準備。在本發明的一個具體實施方案中，使用的接頭是4-(4'-乙醯苯氧基)丁酸(AcBut)。抗體/藥物綴合物通過使P-加利車黴素、y-加利車黴素或N-乙醯y-加利車黴素、或其衍生物與3-巰基-3-甲基丁醯肼、AeBut接頭和本發明的抗5T4抗體反應而製備。參見例如，美國專利號5,773,001。這個接頭產生在循環中基本上穩定的綴合物，每天釋放估計2%的NAc-yDMH，並且此綴合物在酸性溶酶體中立即地釋放NAc-yDMH。在本發明的其他實施方案中，抗體/藥物綴合物使用3-乙醯苯基乙酸(AcPac)或4_巰基-4-曱基-戊酸(Amide)作為接頭分子進行製備。對於》丈射性同位素綴合有用的代表性接頭包括二亞乙基三胺五乙酸鹽(DTPA)-異硫氰酸鹽、琥珀醯亞胺基6-肼煙酸酯鹽酸鹽(SHNH)、和六曱基丙烯胺將(HMPAO)(Bakker等人(19卯)J.Nucl.Med.31:1501-1509，Chattopadhyay等人(2001)Nucl.Med.Biol,28:741-744,Dewanjee等人(1994)J.Nucl.Med.35:1054-63，Kreiming等人(1989)Lancet1:242-244,Sagiuchi等人(2001)Ann.Nucl.Med.15:267-270);美國專利號6,024,938)。備選地，靶向分子可以進行衍生，從而使得放射性同位素可以與其直接結合(Yoo等人(1997)J.Nud.Med.38:294-300)。橫化法也是本領域已知的，並且代表性方案可以在例如Krenning等人(1989)Lancet1:242-4和Bakker等人(1990)JNucl.Med.31:1501-9中找到。為了進一步增加每抗體/藥物綴合物的藥物分子數目，藥物可以與聚乙二醇(PEG)綴合，包括直鏈或支鏈的聚乙二醇聚合物和單體。PEG單體具有下式-(CH2CH20)-。藥物和/或肽類似物可以與PEG直接或間接(即通過合適的間隔基團例如糖)結合。PEG/抗體/藥物組合物還可以包括另外的親脂和/或親水結構部分，以促進在體內的藥物穩定性和遞送至靶位點。用於製備含PEG的組合物的代表性方法可以在美國專利號6,461,603;6,309,633;及5,648,095以及其他地方找到。例如，為了增加抗體-加利車黴素綴合物中的加利車黴素的量，抗體在與加利車黴素綴合前與PEG進行綴合，例如，使用PEG-SPA、PEG-SBA或PEG-二-馬來醯亞胺。使用PEG製備的抗體/藥物綴合物可能顯示對於耙抗原減小的結合親和力，但由於增加的藥物負荷而仍是有效的。添加劑平的聚集物的抗體/加利車黴素綴合物。許多藥物包括加利車黴素的疏水性可能導致抗體/藥物綴合物的聚集。為了生產具有較高的藥物負荷/產量和減少的聚集的單體抗體/藥物綴合物，綴合反應可以在包含(i)丙二醇作為共溶劑，和(ii)含有至少一種C6-C18羧酸的添加劑的非親核的、蛋白質相容的緩衝溶液中進行。有用的酸包括C7-C,2酸，例如辛酸或辛酸(caprylicacid)或其鹽。還可以使用丙二醇之外的其他蛋白質相容性有機共溶劑，例如乙二醇、乙醇、DMF、DMSO等。有機共溶劑中的一些或全部用於將藥物轉移到綴合混合物中。對於使用N-羥基琥珀醯亞胺(OSu)酯或其他類似活化的酯製備抗體/藥物綴合物，有用的緩衝液包括磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和N-2-羥乙基艱，秦-N'-2-乙磺酸(HEPES緩衝液)。在綴合反應中使用的緩沖溶液應基本上缺乏游離胺和親核體。作為另一種方法，綴合反應可以在包^k丁醇但不含另外添加劑的非親核的、蛋白質相容的緩沖溶液中進行。參見例如，美國專利號5,712,374和5,714,586。用於綴合的另外方法和含加利車黴素的綴合物在美國專利號5，739，116和5,877,296中得到描述。用於形成單體綴合物的最佳反應條件可以通過反應變量例如溫度、pH、加利車黴素衍生物輸入量和添加劑濃度的變化憑經驗決定。丙二醇的代表性量為總溶液體積的10%-60%，例如，10%-40%，或約30%。包含至少一種CVC,8羧酸或其鹽的添加劑的代表性量為20mM-100mM，例如40mM_90mM，或約60mM-卯mM。CVd8羧酸或其鹽的濃度可以增至150-300mM,而共溶劑降至1%-10°/。。在本發明的代表性實施方案中，羧酸是辛酸、癸酸、或相應的鹽。例如，200mM辛酸可以與5%的丙二醇或乙醇一起使用。綴合反應可以在略微升高的溫度(30-35°C)和pH(8.2-8.7)進行。抗體的濃度可以為1-15mg/ml，並且加利車黴素衍生物例如N-乙醯Y-加利車黴素1)MHAcButOSu酯的濃度可以為抗體的約4.5重量o/q-11重量％。適合於其他藥物的綴合的條件可以由本領域技術人員無需過度實驗進行確定。111.C.抗體/藥物綴合物的純化綴合後，單體綴合物可以通過常規方法與未綴合的反應物和/或聚集形式的綴合物分開，所述常規方法例如尺寸排阻層析法(SEC)、疏水作用層析法(HIC)、離子交換層析法(mC)或層析聚焦(CF)。純化的綴合物是單體的，並且通常包含3重量％-10重量％的藥物。抗體/藥物綴合物還可以使用疏水作用層析法(HIC)進行純化，所述mc提供超過SEC的幾個優點，包括(1)有效地減少LCF含量以及聚集物的能力；(2)對大反應體積的適應；和(3)產物的最小稀釋。適合於生產規模使用的高容量HIC介質包括PhenylSepharose6FastFlow層析介質，ButylSepharose4FastFlow層析介質,OctylSepharose4FastFlow層析介質，ToyopeaiiEther國650M層析介質，Macro-PrepmethylHIC介質或Macro-Prept-ButylHIC介質。超濾/滲濾還可以用於緩沖液更換。在代表性純化方法中，執行多個步驟，包括離心細胞去除步驟、蛋白A親和捕獲步驟隨後為1個或2個正交層析精製(polishing)步驟、病毒過濾步驟、以及用於濃縮和配製的切線流過濾步驟。純化方法優選產生具有小於5%聚集物、小於20ppm蛋白質A、小於50ppm宿主細胞蛋白質、和大於50%的總回收率的產物。典型的抗5T4/加利車黴素製劑主要(~95%)包含如下綴合抗體，該抗體包含5-7摩爾加利車黴素/摩爾抗體。綴合物已在實驗室規模(IO-200mg)上進行重現性製備。表示為ng加利車黴素/mg單克隆抗體的藥物負荷由加利車黴素濃度(ng/mL)除以抗體濃度(mg/mL)來確定。這些值通過測量在280nm和310nm處的綴合物溶液的UV吸光度進行確定。重要的是注意，這是平均負荷，實際負荷是以此平均負荷值為中心的準高斯分布，即，某些抗體具有高於平均的負荷，而某些抗體具有低於平均的負荷。可以使用分析型H1C-HPLC(疏水作用高效液相層析法)測量的未綴合的抗體(低綴合級分)是幾乎未綴合或完全無綴合加利車黴素的抗體群體。這個值是對抗體上的加利車黴素分布的量度，並且一般不影響給藥的加利車黴素量。可以使用ELISA測量的未綴合的加利車黴素指未與抗體綴合的、以總加利車黴素的百分比表示的加利車黴素量。藥物負荷試驗不區分未綴合的和綴合的加利車黴素。當使用藥物負荷試驗時，未綴合的加利車黴素的量是無法檢測或可忽略不計的，並且因此這些試驗有效測量綴合的加利車黴素的量。分析型方法可以用於就人源化抗5T4加利車黴素綴合物的釋放和穩定性測試進行測定。綴合物可以就同一性(IEF)、強度(總蛋白質和總加利車黴素負荷)、純度(未綴合的加利車黴素、低綴合的抗體、聚集物含量和SDS-PAGE還原的)和免疫親和性(抗原結合ELISA)進行評估。可以使用本領域技術人員已知的其它試驗。使用這些試驗，可以維持商業製備中的批次之間一致性。III.D.抗體/藥物綴合物的藥代動力學5T4靶向的免疫綴合物的藥代動力學可以在各種動物中進行評估，並與未綴合的加利車黴素的藥代動力學進行比較。例如，這可以在雌性棵鼠、雄性斯普拉格-道利(Sprague-Dawley)大鼠、和雌性食蟹猴中在單次靜脈內推注施用後進行。一般抗5T4抗體的藥代動力學的特徵在於在各種物種中的低清除率、低分布體積、和長的表觀末端半衰期。未綴合的加利車黴素衍生物的血清濃度預期低於定量界限。關於這些綴合物在單劑量毒性範圍研究中的毒性譜預期類似於針對其他抗體/加利馬綴合物在相當劑量時獲得的毒性譜。IV.用於表徵抗5T4抗體和抗體/藥物綴合物的功能試驗本發明進一步公開了體外和體內試驗以表徵抗5T4抗體的活性，包括5T4結合活性、與細胞表面上呈現的5T4抗原結合後的細胞內在化、和在受試者中對5T4表達細胞的靶向。當與細胞毒素綴合時，本發明所公開的抗體可以引發抗癌活性，包括抑制5T4表達癌細胞的生長和/或誘導5T4表達細胞的細胞死亡。本發明的抗5T4抗體可以包含一種或多種前述活性。用於檢測抗5T4抗體與5T4抗原的結合的技術是本領域已知的，包括例如，如實施例2中所述的BIACORE⑧試驗。另外的代表性技術包括離心、親和層析法和其他免疫化學方法。參見例如Manson(1992)ImmunochemicalProtocols,HumanaPress,Totowa，NewJersey,UnitedStatesofAmerica;Ishikawa(1999)UltrasensitiveandRapidEnzymeImmunoassay,Elsevier,Amsterdam/NewYork。抗原結合試驗可以使用分離的5T4抗原或5T4表達細胞來進行。參見實施例2。抗5T4抗體的結合特異性可以通過結合表位的定義，即參與抗原結合的殘基(包括非鄰近殘基)的鑑定，和/或影響抗原結合的殘基的定義來進一步描述。參見實施例4-5。抗5T4抗體和抗體/藥物綴合物被5T4表達細胞的內在化可以通過觀察隨著時間的過去與5T4表達細胞的表面結合的抗體或綴合物的量的變化進行測定。用於評估抗體和抗體/藥物綴合物的膜定位的代表性技術在實施例3中得到描述。功能試驗還包括用於評估抗體/藥物綴合物的抗癌活性的方法，例如破壞現有的癌細胞，或延遲或阻止癌細胞生長的能力。由本發明的抗體/藥物綴合物耙向的癌症包括在受試者中的任何組織的原發性和轉移性腫瘤和癌，包括癌和惡性血液病例如白血病和淋巴瘤。少5T4表達細胞的增殖。用於在體外快速評估細胞生長抑制的代表性方法在Jones等人(2001)丄Immunol.Methods254:85-98中得到描述。抗5T4抗體還可以包含i秀導細胞死亡的能力，例如以核DNA的降解，核變性和濃縮，膜完整性的喪失，和吞噬作用為特徵的程序化細胞死亡。評估細胞的代表性試驗在Hoves等人(2003)Methods31:127-34;Peng等人(2002)Chin.Med.Sci.丄17:17-21;Yasuhara等人(2003)J.Histochem.Cytochem.51:873-885中得到描述。例如，為了評估抗5T4抗體/加利馬綴合物在體外的細胞毒性，MDAMB435/5T4細胞(過量表達人5T4抗原的人乳腺癌細胞)和MDAMB435/neo細胞(對照細胞)在抗體-加利車黴素綴合物或游離加利車黴素的存在下進行培養，基本上如由Boghaert等人(MO4)，Clin.CancerRes.，10:4538-4549所述的。每種試劑的細胞毒素報告為ED50(ng/ml)，這是引起細胞培養物相對於未經處理的對照發生50%減少的以綴合物或游離藥物給出的加利車黴素量。培養中的細胞數目在藥物暴露後使用活體染料(MTS)進行測定。還參見實施例6。抗體/加利車黴素綴合物的細胞毒性還可以使用以適合於球狀體生長的方式培養的MI)AMB435/5T4和MDAMB435/neo細胞進行評估。細胞在抗體/加利車黴素綴合物或游離加利車黴素的存在下進行培養，並且在藥物暴露後，測定每個球狀體的大小。每種試劑在抑制球狀體生長中的效率才艮告為ED50(ng/ml)，即引起^^狀體生長相對於未經處理的對照發生50%抑制的以綴合物或游離藥物給出的加利車黴素量。參見實施例6。為了評估抗5T4抗體/加利車黴素綴合物在體內的細胞毒性，在棵鼠中通過皮下注射MDAMB435/5T4細胞(過量表iiA5T4抗原的人乳腺癌細胞)、NCI-H157細胞(人非小細胞肺癌細胞)、PC14PE6細胞(人非小細胞肺癌細胞)或N87細胞(人胃癌細胞)，製備腫瘤。抗體/加利車黴素綴合物和對照化合物例如通過腹膜內注射，以4天為間隔，例如在第1、5和9天時給予總共3次劑量，施用於荷瘤小鼠。可測量的治療結果包括腫瘤細胞生長的抑制。為了進一步評估抗5T4抗體/加利車黴素綴合物的靶向能力，可以使用用於非小細胞和小細胞癌的同位模型，基本上如nn等人(2003)Clin.CancerRes.9(15):5532-5539所述。簡言之，將人肺腺癌(PC14PE6)細胞注入棵鼠的尾靜脈內，其隨後遷移以在肺中形成腫瘤。腫瘤可以在肺實質中以實性結節出現，並引起包含懸浮的腫瘤細胞的出血性胸腔積液。對照化合物和抗體/加利車黴素綴合物例如通過在腫瘤細胞注射後第6天開始行腹膜內注射施用於荷瘤小鼠，以4天為間隔給予總共3次劑量，例如在第6、10和14天時。可測量的治療結果包括減少的胸腔積液和增加的存活。V.抗5T4抗體和抗體/藥物綴合物的使用本發明的抗5T4抗體和抗體/藥物綴合物在體外和體內均可用於與5T4表達細胞相關的應用中。表達5T4的癌症包括鱗狀/腺瘤性肺癌(非小細胞肺癌)、浸潤性乳腺癌、結腸直腸癌、胃癌、鱗狀宮頸癌、浸潤性子宮內膜腺癌、浸潤性胰腺癌、卵巢癌、鱗狀膀胱癌和絨毛膜癌。5T4在支氣管、乳腺、結腸、直腸、胃、子宮頸、子宮內膜、胰腺、卵巢、絨毛膜(chorium)和精囊的癌中以高水平-皮檢測到。V.A.體外應用本發明提供了使用抗5T4抗體的體外方法。例如，所公開的抗體可以單獨或與細胞毒素劑或特異性結合5T4陽性癌細胞的其他藥物組合使用，以耗竭來自細胞樣品的此類細胞。還提供了經由使5T4表達細胞與抗體/藥物綴合物接觸用於誘導凋亡和/或抑制細胞增殖的方法，所述抗體/藥物綴合物包含與細胞毒素綴合的抗5T4抗體。代表性體外方法在上文中在"用於表徵抗5T4抗體和抗體/藥物綴合物的功能試驗"的標題下得到描述。基於其特異性結合5T4抗原的能力，本發明的抗5T4抗體還具有在體外檢測5T4陽性細胞的功用。用於檢測5T4表達細胞的方法可以包括(a)製備包含細胞的生物樣品；(b)使抗5T4抗體與生物樣品在體外接觸；和(c)檢測抗5T4抗體的結合。為了促進檢測，抗體可以與標記綴合。V.B.體內檢測和it斷本發明的抗5T4抗體還可以用於體內檢測法，例如用於診斷，以提供手術中輔助、或用於劑量確定。標記的抗5T4抗體施用於受試者後，在足以發生結合的一般時間後，可以顯現由抗體結合的5T4表達細胞的生物分布。所公開的診斷法可以與治療法組合使用。此外，本發明的抗5T4抗體可以施用用於檢測和治療的雙重目的。代表性非侵襲性檢測法包括閃爍掃描術(例如，SPECT(單光子發射計算機斷層攝影術)、PET(正電子發射斷層攝影術)、y照相成像、和直線掃描)，磁共振成像(例如，常規磁共振成像、磁化傳遞成像(MTI)、質子磁共振波譜(MRS)、彌散加權成像(DWI)和MR功能成像(fMRI))，和超聲。V.C.治療應用本發明進一步涉及用於在受試者中誘導5T4表達癌細胞的細胞溶解的方法和組合物。本發明的抗5T4抗體/藥物綴合物對於抑制癌細胞和非贅生增生性病症的細胞的生長有用，所述病症例如增生、化生、或最特別地，發育異常(關於此類異常生長病狀的綜述，參見DeVita，Jr.等人(2001)，Cancer:PrinciplesandPractice,第6版,LippincottWilliams&Wilkins。適合於使用抗5T4抗體/藥物綴合物靶向的癌症包括在乳腺，結腸，直腸，肺，口咽，下咽，食道，胃，胰腺，肝，膽嚢，膽管，小腸，泌尿道(包括腎)、膀胱和尿道上皮，女性生殖道，子宮頸，子宮，卵巢，男性生殖道，前列腺，精嚢，睪丸，內分泌腺，甲狀腺，腎上腺，垂體，皮膚，骨，軟組織，血管，腦，神經，a艮，腦膜中的5T4表達原發性和轉移性肺瘤。其他相關癌症是5T4表達白血病和淋巴瘤(例如，何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)，包括惰性、侵襲性、低度惡性、中度惡性或高度惡性的白血病或、淋巴瘤。特別地，5T4已知在鱗狀/腺瘤性肺癌(非小細胞肺癌)、浸潤性乳腺癌、結腸直腸癌、胃癌、鱗狀宮頸癌、浸潤性子宮內膜腺癌、浸潤性胰腺癌、卵巢癌、鱗狀膀胱癌和絨毛膜癌的細胞上表達。5T4在支氣管、乳腺、結腸、直腸、胃、子宮頸、子宮內膜、胰腺、卵巢、chorium和精嚢的癌上以高水平^皮檢測到。5T4抗原的細胞表面分布可以是均勻或不均勻的。在結腸直腸癌、胃癌和卵巢癌中，5T4的表達與疾病的i^艮直接相關。在乳腺癌中，觀察到在轉移性結節上增加的5T4染色強度，然而，5T4表達與疾病階段不相關。這些癌症還可以表達LewisY糖抗原，包括乳腺、結腸、胃、食道、胰腺、十二指腸、肺、膀胱和腎癌以及胃和胰島細胞神經內分泌腫瘤。參見美國專利號6,310,185。因此，待用本發明的抗5T4/藥物綴合物治療的患者可以基於生物標誌的表達進行選擇，所述標誌包括但不限於5T4抗原升高的表達，由此導致針對富集的靶表達而不是針對腫瘤起源或組織學而選擇的患者群體。耙表達可以作為細胞染色強度和染色的細胞數目的函數進行測量。例如，5T4的高表達的分類包括患者具有超過30%(即，40%、50%或60%)的細胞通過免疫組織化學5T4陽性染色在3+水平上(1-4)，而5T4的中等表達可以包括患者具有超過20%的細胞為1+至2+染色。除5T4抗原表達外的其它生物標誌也可以用於患者選擇，包括例如基於多藥抗性(MDR)的腫瘤表徵。近50%的人類癌症對化學療法是完全抵抗的，或僅短暫應答，這之後它們不再受常用的抗癌藥的影響。這種現象稱為MDR，並且某些腫瘤類型固有地表現MDR，而其他的在暴露於化學療法處理後獲得MDR。藥物外排泵P-糖蛋白介導與細胞毒性化學治療劑相關的大部分MDR。可以進行癌症患者腫瘤樣品中存在的MDR機制的表型和功能分析，以便將特定的腫瘤類型中的化學療法抗性與特定MDR機制關m^來。癌症生長或異常增殖是指提示細胞內發生向更晚期的癌症形式或疾病狀態的變化的許多指標中的任何一種。癌細胞或非贅生增殖性病症的細胞的生長抑制可以通過本領域已知的方法進行評估，例如延遲的腫瘤生長和轉移的抑制。用於測量癌症生長的抑制的其他指標包括癌細胞存活的減少，肺瘤體積的減少或形態(例如，如使用計算機斷層攝影術(CT)、超聲檢查或其他成像法測定的)，肺瘤脈管系統的破壞，遲髮型超敏性皮膚測試中文善的性能，細胞溶解性T淋巴細胞的活性增加，腫瘤特異性抗原水平的減少。儘管不希望受任何單一一種作用模式的束繂，抗原指導的靶向以及抗5T4抗體/藥物綴合物的被動靶向都可以促成抗瘤功效。抗原指導的靶向是指與對照組織(即，懷疑基本上缺乏5T4表達細胞以及施用的抗5T4/藥物綴合物的結合和/或積累的組織)比較，肽或肽類似物在靶組織(即，包含5T4表達細胞和積累抗5T4/藥物綴合物的預期位點的組織)中的優先移動和/或積累。抗體/藥物綴合物的優先定位一般使得靶組織中的抗體/藥物綴合物的量比對照組織中的抗體/藥物綴合物的量大大約2倍，例如大約5倍或更大，或大約10倍或更大的量。被動耙向一般指由於脈管系統中的局部變化，抗體或抗體/藥物綴合物浮皮隔絕在腫瘤位點處。例如，抗5T4/藥物綴合物可以在腫瘤位點處離開脈管系統(其由於增加的VEGF生產而有孔)，與5T4表達細胞結合，並觸發抗5T4/藥物綴合物的內在化。腫瘤的弱的靜脈和淋巴流還導致未結合的抗5T4/藥物綴合物的隔絕。使用酸不穩定性接頭與藥物綴合的抗體可以釋放藥物，所述藥物隨後擴散進入腫瘤細胞內。被動靶向的抗瘤效應雖不是永久的，或不如由抗原指導的靶向誘導的抗瘤效應一樣有效，但可促成總功效。V.D.製劑本發明的抗5T4抗體和抗5T4/藥物綴合物可以容易地製備和配製以用於安全和有效的臨床應用。用於施用於受試者的合適製劑包括水性的和非水性的無菌注射溶液，其可以包含抗氧化劑，緩衝劑，抑細菌劑，抗細菌劑和抗真菌劑(例如，對幾苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸和硫柳汞)，使製劑與預期接受者的體液等滲的溶質(例如，糖、鹽和多元醇)，懸浮劑和增稠劑。合適的溶劑包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)、及其混合物。製劑可以在單位劑量或多劑量容器例如密封的安瓿和小瓶中給出，並且可以貯藏於冷凍或冷凍乾燥(凍幹的)條件下，僅需要臨在施用給受試者前添加無菌液體載體，或用於隨後以適合於預期應用的同位素進行放射性標記。本發明的抗5T4抗體和抗體/藥物綴合物優選如下文所述配製為有效劑量。作為一個例子，代表性抗5T4抗體或抗5T4/藥物綴合物製劑包括組成為40mg/ml抗體或抗體/藥物綴合物、25mM乙酸鹽、150mM海藻糖、0.9%苯曱醇、0.02%聚山梨醇酯20、pH5.0的多劑量製劑，其具有在2-8'C下貯藏最低2年的保存限期。作為另一個例子，抗5T4抗體或抗5T4/藥物綴合物製劑可以包含在9.0mg/ml氯化鈉、7.35mg/ml二水合檸檬酸鈉、0.7mg/ml聚山梨醇酯80和無菌水、pH6.5中的10mg/ml抗體或抗體/藥物綴合物。用於施用於實驗小鼠模型的抗5T4/加利車黴素綴合物的代表性製劑包括2pg或4jig加利車黴素(參見實施例3、4和7)，這可以相應地按比例增加以用於對人的施用。抗5T4抗體或抗體/藥物綴合物的穩定凍幹製劑可以通過下述來製備(a)使抗體/藥物綴合物在溶液中溶解至0.5-2mg/ml的終濃度，所述溶液包含濃度1.5重量％-5重量％的冷凍保護劑、濃度0.5重量％-1.5重量o/。的聚合物填充劑、濃度O.OlM-0.1M的電解質、濃度0.005重量％-0.05重量％的溶解度促進劑、濃度5-50mM的緩衝劑(這使得溶液的最終pH為7.8-8.2)，和水；(b)將上述溶液在+5。C至+10。C溫度分裝到小瓶內；(c)在-35。C至-50。C的冷凍溫度下冷凍溶液；(d)在20-80微米的初級乾燥壓力下以-l(TC至-4(TC的擱板溫度對冷凍溶液實施24-78小時的初級冷凍乾燥步驟；和(e)在20-80微米的乾燥壓力下以-10。C至十35'C的擱板溫度對步驟(d)的冷凍乾燥產物實施15-30小時的次級乾燥步驟。對於冷凍保護劑的凍幹有用的代表性冷凍保護劑包括糖醇、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、聚乙二醇、醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸、醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、甘油醛、阿拉伯糖、來蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨糖醇、乳糖、甘露醇、甲基a-吡喃葡萄糖苷、麥芽糖、異抗壞血酸、抗壞血酸、內酯、山梨糖、葡糖二酸、赤蘚糖、蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖、神經氨酸、阿拉伯聚糖、果聚糖、巖藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、果聚糖、巖藻多糖、角叉菜膠、半乳卡洛糖、果膠、果膠酸、直鏈澱粉、支鏈澱粉、糖原、支鏈澱粉、纖維素、葡聚糖、石耳素、殼多糖、瓊脂糖、角蛋白、軟骨素、皮膚素、透明質酸、海藻酸、黃原膠、澱粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油和季戊四醇。例如，冷凍保護劑蔗糖可以以1.5重量％的濃度4吏用，聚合物填充劑Dextran40或羥乙基澱粉40可以以.9重量％的濃度使用，在凍幹溶液中使用的電解質是以0.05M的濃度存在的氯化鈉，和緩衝劑緩血酸胺可以以0.02M的濃度使用。溶解度促進劑(例如表面活性劑例如聚山梨醇酯80)也可以在凍幹過程期間使用。通常這種溶解度促進劑是表面活性劑。用於製備凍幹製劑的代表性步驟包括在-45。C溫度冷凍小瓶；對冷凍溶液在60微米的初級乾燥壓力下以-30。C的擱板溫度實施60小時的初始冷凍乾燥步驟；和對冷凍乾燥產物在60微米的乾燥壓力下在+25。C的擱板溫度實施24小時的次級乾燥步驟。抗5T4抗體和抗體/藥物綴合物在藥學上可接受的載體中進行配製，所述載體為例如，大的緩慢代謝的大分子例如蛋白質、多肽、脂質體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合物胺基酸、胺基酸共聚物和失活的病毒顆粒。還可以使用藥學上可接受的鹽，例如礦物酸鹽，例如鹽酸鹽、氬溴化物、磷酸鹽和硫酸鹽，或有機酸的鹽，例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和苯甲酸鹽。製劑可以另外包含液體例如水、鹽水、甘油和乙醇、和/或輔助物質，例如溼潤劑和/或乳化劑或pH緩衝物質，可以存在於此類組合物中。此類載體使得組合物能夠配製為用於由患者吞咽的片劑、丸劑、錠劑、膠嚢、液體、凝膠、糖漿劑、膏劑(slurry)和懸浮液。V.E.劑量和施用本發明的抗5T4抗體和抗5T4/藥物綴合物可以腸胃外施用，例如經由血管內、皮下、腹膜內、或肌內施用。關於組合物向肺途徑的遞送，組合物可以作為氣霧劑或粗噴霧劑施用，即，經鼻施用。鞘內、髓內或心室內施用可以用於治療中樞神經系統(CNS)癌症和CNS相關癌症。抗5T4抗體和抗5T4/藥物綴合物還可以透皮、經皮、局部、腸內、陰道內、舌下或經直腸施用。靜脈內施用可能是臨床中常規使用的。遞送方法基於下述考慮如待治療的病狀和位點、抗體製劑的類型、和組合物的治療效果進行選擇。本發明提供了有效量的抗5T4抗體和抗5T4/藥物綴合物施用於受試者，即足以引發所需的生物應答的抗ST4抗體或抗5T4/藥物綴合物量。例如，當施用於具有癌症的受試者時，有效量包含足以引發抗癌活性的量，所述抗癌活性包括癌細胞的細胞溶解、癌細胞增殖的抑制、癌細胞凋亡的誘導、癌細胞抗原的減少、延遲的腫瘤生長、和/或轉移的抑制。腫瘤萎縮被充分接受為功效的臨床代替標誌。關於功效的另一種已被充分接受的標誌是無ii^存活(progression-freesurvival)。抗5T4/加利車黴素綴合物一般顯示出對關鍵功效參數的至少25%的改善，例如中位生存、至腫瘤進展的時間、和總應答率的改善。一般地，有效劑量將是約0.01mg/m2-約50mg/m2,例如約0.1mg/m2-約20mg/m2，或約15mg/m2，所述劑量基於抗5T4抗體的量進行計算。抗5T4/藥物綴合物的有效劑量還可以基於綴合藥物的量進行計算。例如，用於施用於實驗小鼠模型的抗5T4/加利車黴素綴合物的代表性劑量包括2fig或4ng加利車黴素，這可以相應按比例增加用於對人的施用。例如，本發明的抗5T4/加利車黴素綴合物可以每3周l次施用於人患者，持續高達6個周期。對於放射性標記的抗5T4抗體，有效劑量一般是約1mCi-約300mCi，通常約5mCi-100mCi，這取決於放射性同位素和抗體的結合親和力。對於使用所公開的抗5T4抗體檢測5T4陽性細胞，將可檢測量的本發明的組合物施用於受試者，即抗5T4抗體的劑量使得可以在體外或體內確定抗體的存在。對於使用放射性同位素的閃爍掃描成像，放射性同位素的一般劑量可以包括約10(iCi-50mCi、或約100^Ci-25mCi、或約500fiCi-20mCi、或約1mCi-10mCi、或約10mCi的活性。本發明組合物中的活性成分的實際劑量水平可以改變，以便施用有效達到所需診斷或治療結果的組合物量。施用方案也可以進行改變。可以使用單次注射或多次注射。所選擇的劑量水平和方案將依賴各種因素，包括治療組合物的活性和穩定性(即，半衰期)、製劑、施用途徑、與其他藥物或治療的組合、待檢測和/或治療的疾病或病症、以及待治療的受試者的It康狀況和先前醫療史。對於本發明的抗5T4抗體和抗5T4/藥物綴合物，治療有效劑量可以最初在細胞培養試驗或動物模型例如嚙齒類動物、兔、犬、豬和/或靈長類動物中進行估計。動物模型也可以用於測定合適的施用濃度範圍和途徑。此類信息隨後可以用於確定在人中施用的有用劑量和途徑。一般地，施用最小劑量，並在不存在劑量限制性細胞毒性的情況下升高劑量。有效量或劑量的確定和調整以及何時和如何進行此類調整的評估是醫學領域的普通技術人員已知的。對於組合療法，抗5T4抗體、抗5T4/藥物綴合物、和/或另外的治療或診斷劑可以在適合於執行預期治療或診斷的任何時間範圍內進行施用。因此，這些單一藥劑可以基本上同時(即，作為單一製劑或在數分鐘或數小時內)或以任何順序連續施用。例如，這些單藥劑治療可以在彼此相隔約1年內，例如約10、8、6、4或2個月內，或4、3、2或1周內，或約5、4、3、2或1天內施用。關於製劑、劑量、施用方案和可測量的治療結果的另外指導，參見Berkow等人(2000)TheMerckManualofMedicalInformation(Merck醫學信息手冊)，Merck&Co.，Inc.,WhitehouseStation,NewJersey;Ebadi(1998)CRCDeskReferenceofClinicalPharmacology(臨床藥理學手冊).CRCPress,BocaRaton,Florida;Ge隨ro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(Remington:製藥科學和實踐)，LJppincott，Williams&Wilkins，Philadelphia,Pennsylvania;Katzung(2001)Basic&ClinicalPharmacology(基礎和臨床藥理學)，LangeMedicalBooks/McGraw-HillMedicalPub.Div.,NewYork;Hardman等人(2001)Goodman&Gilman'sthePharmacologicalBasisofTherapeutics(古德曼和吉爾曼的治療藥理學基礎)，TheMcGraw-HillCompanies,Columbus,Ohio;Speight&Holford(1997)Avery'sDrugTreatment:AGuidetotheProperties,Choices,TherapeuticUseandEconomicValueofDrugsinDiseaseManagement(艾弗裡藥物治療有關疾病處置中藥物的性質、選擇、治療應用和經濟價值的指南)，Lippincott，Williams,&Wilkins,Philadelphia,Pennsylvania。V.F.組合療法所公開的抗5T4抗體和抗5T4/藥物綴合物可以作為起始治療進行施用，或用於治療對常規療法無應答的病狀。此外，抗5T4抗體和抗5T4/藥物綴合物可以與其他療法(例如，手術切除、放射、另外的抗癌藥物等)組合使用，以由此引發加性的或增強的療效和/或減少某些抗癌劑的肝細胞毒性。本發明的抗5T4抗體和抗5T4/藥物綴合物可以與另外的藥劑共施用或共配製，或配製用於與另外的藥劑以任何順序連續施用。對於組合療法有用的代表性藥劑包括上文描述為對於抗5T4/藥物綴合物的製備有用的任^T藥物。本發明的抗5T4抗體和抗5T4/藥物綴合物也可以與其他治療抗體和抗體/藥物綴合物組合使用，包括除所公開的抗5T4抗體外的抗5T4抗體，以及靶向不同抗原的抗體和綴合物。可以單獨或作為抗體/藥物綴合物使用的代表性抗體包括抗-CD19抗體，抗-CD20抗體(例如，RITUXAN⑧、ZEVALI酵、BEXXAR),抗-CD22抗體，抗-CD33抗體(例如，MYLOTARG),抗-CD33抗體/藥物綴合物，抗-LewisY抗體(例如,Hu3S193、Mthu3S193、AGmthu3S193),抗-HER-2抗體(例如，HERCEPTIN(曲妥珠單抗)、MDX-210、OMNITARG(帕妥珠單抗、rhuMAb2C4)),抗-CD52抗體(例如，CAMPATH)，抗-EGFR抗體(例如，ERBITUX(西妥昔單抗)，ABX-EGF(帕尼單抗))，抗-VEGF抗體(例如，AVASTIN(貝伐珠單抗))，抗-DNA/組蛋白複合物抗體(例如，ch-TNT-1/b)，抗-CEA抗體(例如，CEA-Cide、YMB-1003)hLM609，抗-CD47抗體(例如，6H9)，抗-VEGFR2(或含激酶插入結構域的受體，KDR)抗體(例如，IMC-1C11)，抗-Ep-CAM抗體(例如，ING-1),抗-FAP抗體(例如，西羅珠單抗)，抗-DR4抗體(例如，TRAIL-R)，抗-孕酮受體抗體(例如，2C5),抗-CA19.9抗體(例如，G1VAREX)和抗纖維蛋白抗體(例如，MH-1)。抗5T4抗體/藥物綴合物還可以與作為治療方案一部分的一種或多種細胞毒素組合一起施用。對於這個目的有用的細胞毒性製劑包括CHOPP(環磷醯胺，多柔比星，長春新鹼，強的松和曱基苄肼)；CHOP(環磷醯胺，多柔比星，長春新鹼和強的松)；COP(環磷醯胺，長春新鹼和強的松)；CAP-BOP(環磷醯胺，多柔比星，甲基苄肼，博來黴素，長春新鹼和強的松)；m-BACOD(氨曱蝶呤，博來黴素，多柔比星，環磷醯胺，長春新鹼，地塞米松和甲醯四氬葉酸；ProMACE-MOPP(強的松，氨曱蝶呤，多柔比星，環磷醯胺，依託泊苷，亞葉酸，氮芥，長春新鹼，強的松和曱基千肼)；ProMACE-CytaBOM(強的松，氨曱蝶呤，多柔比星，環磷醯胺，依託泊苷，亞葉酸，阿糖胞苷，博來黴素和長春新鹼)；MACOP-B(氨曱蝶呤，多柔比星，環磷醯胺，長春新鹼，強的松，博來黴素和亞葉酸)；MOPP(氮芥，長春新鹼，強的松和甲基苄肼)；ABVD(阿黴素/多柔比星，博來黴素，長^威和達卡巴噪)；與ABV(阿黴素/多柔比星，博來黴素，長M)交替的MOPP(氮芥，長春新鹼，強的松和甲基千肼)；與ABVD(阿黴素/多柔比星，博來黴素，長春鹼和達卡巴溱)交替的MOPP(氮芥，長春新鹼，強的松和甲基苄肼)；ChlVPP(苯丁酸氮芥，長春鹼，甲基千肼，強的松)；IMVP-16(異環磷醯胺，氨曱蝶呤，依託泊苷)；MIME(丙脒腙(methyl-gag)，異環磷醯胺，氨曱蝶呤，依託泊苷)；DHAP(地塞米松，高劑量阿糖胞苷和順鉑)；ESHAP(依託泊苷，甲基強的+}龍，Hl)阿糖胞苷，和順鉑)；CEPP(B)(環磷醯胺，依託泊苷，曱基千肼，強的松和博來黴素)；CAMP(洛莫司汀，米託蒽醌，阿糖胞香和強的木>);和CVP-1(環磷醯胺，長春新鹼和強的木>);DHAP(順鉑，高劑量阿糖胞苷和地塞米松)；CAP(環磷醯胺，多柔比星，順鉑)；PV(順鉑，長春喊或長春地辛)；CE(卡鉑，依託泊苷)；EP(依託泊普，順輛)；MVP(絲裂黴素，長械或長春地辛，順柏)；PFL(順鉑，5-氟尿嘧啶，甲醯四氫葉酸)；1M(異環磷醯胺，絲裂黴素)；IE(異環磷醯胺，依託泊苷)；IP(異環磷醯胺，順鉑)；MIP(絲裂黴素，異環磷醯胺，順鉑)；ICE(異環磷醯胺，卡鉑，依託泊苷)；PIE(順鉑，異環磷醯胺，依託泊苷)；Viorelbine和順鉑；卡鉑和紫杉醇；CAV(環磷醯胺，多柔比星，長春新鹼)；CAE(環磷醯胺，多柔比星，依託泊苷)；CAVE(環磷醯胺，多柔比星，長春新鹼，依託泊苷)；EP(依託泊苷，順柏)；和CMCcV(環磷醯胺，氨甲蝶呤，洛莫司汀，長春新鹼)。抗5T4抗體和抗5T4/加利車黴素綴合物可以與全身性抗癌藥物或與靶向性細胞毒素例如CMD-193和SGN-15組合使用，所述全身性抗癌藥物例如epithilones(BMS-247550，Epo-卯6)、紫杉烷類的重配製劑(reformulation)(Abraxane,Xyotax)、樣i管蛋白抑制劑(MST-997，TTI-237)。另外有用的抗癌藥包括TAXOTERE、TARCEVA、GEMZAR(吉西他濱)、5-FU、AVASTIN⑧、ERBITLX⑧、TROVAX⑧、麻安莫單抗(anatumomabmafenatx)、來曲唑(leti'azole)、多西他賽和蒽環類。對於組合療法，抗5T4抗體、抗5T4/藥物綴合物、和/或一種或多種另外的治療或診斷劑可以在適合於執行預期療法或診斷的任何時間範圍內進行施用。因此，這些單一藥劑可以基本上同時(即，作為單一製劑或在數分鐘或數小時內)或以任何順序連續施用。例如，這些單一藥劑治療可以在彼此約l年內施用，例如在約10、8、6、4或2個月內，或4、3、2或1周內，或約5、4、3、2或1天內。抗5T4抗體或抗5T4/加利車黴素綴合物與第二種治療劑的組合施用優選引發比任何一種單獨施用時更大的效應。實施例已包括下述實施例用於舉例說明本發明的實施方式。下述實施例的某方法進行描述。這些實施例舉例說明了本申請共同發明人的標準實驗室實踐。根據;M^開內容和本領域技術人員的一般水平，本領域技術人員將明了下述實施例僅意欲是示例性的，並且可使用眾多變化、修飾和改變而不偏離本發明的範圍。實施例i鼠類抗5T4抗體抗5T4抗體在小鼠中使用人5T4抗原和用於免疫接種的標準方法進行製備。產生A1、A2和A3抗體的雜交瘤細胞系通過使單個B細胞與骨髓瘤細胞融合來生產。Al、A2和A3抗5T4抗體重鏈和輕鏈可變區使用SMARTcDNA合成系統(ClontechLaboratoriesInc.ofMountainView,California)進4亍克隆，隨後為PCR擴增。cDNA由從Al、A2或A3雜交瘤細胞中分離的1fig總RNA進行合成，其中使用oligo(dT)和SMARTHAoligo(ClontechLaboratoriesInc.)與POWERSCRIPTTM逆轉錄酶(ClontechLaboratoriesInc.)。cDNA隨後通過PCR進行擴增，其中使用可與SMARTIIAoligo序列退火的引物和小鼠恆定區特異性引物(對於輕鏈為小鼠k,對於Al重鏈為小鼠IgG2a，對於A2重鏈為1gG2b，和對於A3重鏈為小鼠1gGl)與VENT⑧聚合酶(NewEnglandBiolabsInc.ofIpswich,Massachusetts)。將重鏈和輕鏈可變區PCR產物亞克隆到pED6表達栽體內，並且測定核酸序列。這種方法是有利的，因為不需要預先知道DNA序列。此外，所得到的DNA序列不會由於使用簡併PCR引物而變化。Al、A2和A3重鏈可變區的核苷酸序列分別如SEQIDNO:1的核苷酸58-414、SEQIDNO:5的核苷酸55-405、和SEQIDNO:9的核苷酸58-423所示。Al、A2和A3重鏈可變區的胺基酸序列分別如SEQIDNO:2的殘基20—138、SEQIDNO:6的殘基19—135、和SEQII)NO:10的殘基20-141所示。Al、A2和A3輕鏈可變區的核苷酸序列分別如SEQIDNO:3的核普酸61-381、SEQII)NO:7的核苦酸67-390、和SEQIDNO:11的核香酸61-381所示。Al、A2和A3輕鏈可變區的胺基酸序列分別如SEQIDNO:4的殘基21-127、SEQIDNO:8的殘基23-130、和SEQIDNO:12的殘基21-127所示。還參見圖IA-IC。為了評估A1、A2和A3抗5T4可變區序列的新穎性，BLASTp搜索(對於蛋白質查詢序列)使用期望值二10、字長-3、低複雜度濾器、以及BLOSUM62矩陣的預設參數、以及允許空位存在罰分-U且延長罰分二l來進行。BLASTn搜索(對於核苷酸查詢序列)使用期望值=10、字長=11和低複雜度濾器的預設參數來進行。BLAST搜索結果才艮告為按E值順序排序的，與查詢序列相關的序列列表，E值是在資料庫中鑑定到的匹配事件的統計學顯著性的指示物。與用於BLAST分析的可變區序列最密切相關的序列標識在表l(BLASTn)和表2(BLASTp)中。表1BLASTn分析tableseeoriginaldocumentpage68tableseeoriginaldocumentpage69A3VH(SEQIDN:10)卯％gil2卯6050lgblAAC04511.1l抗-聚(dC)單克隆抗體重鏈[小家鼠lA3VL(SEQIDNO:12)97%gil2906108lgblAAC04540.1l單克隆抗體K輕鏈[小家鼠l實施例2鼠類抗5T4抗體的結合特異性和親和力為了評估Al、A2和A3抗體的結合特異性和親和力，使用固定在CM5晶片上的人5T4抗原進行BIACORE⑧分析。BIACORE⑧技術利用抗體與固定在表層上的5T4抗原結合後表層上的折射率改變。結合通過從表面折射的雷射的表面等離子體共振(SPR)進行檢測。信號動力學結合速率和解離速率的分析允許區分非特異性和特異性相互作用。H8抗5T4抗體用作對照。H8是在PCT國際公開號WO98/55607和Forsberg等人(1997)J.Biol.Chem.272(19):124430-12436中描述的雜交瘤產生的單克隆小鼠IgGl抗體。tableseeoriginaldocumentpage70BIACORE⑧結果顯示當與A2和A3抗體比較時，H8和Al抗體對於5T4具有更高的親和力。A2是相對低親和力的抗體。不尋常的半胱氨酸存在於Al重鏈可變區的殘基67位和A3重鏈可變區的殘基91位上。這些殘基由苯丙氨酸(Al)或酪氨酸(A3)替換不改變抗體結合性質或表達水平。H8、A1、A2和A3抗體的結合親和力也通過蛋白質印跡使用CT26/5T4細胞裂解物進行測定，其鑑定到經由H8、A1和A3的強結合。參見圖2。H8、A1、A2和A3抗體結合表達5T4抗原的細月包的能力4吏用PC14PE6細胞的螢光激活細胞分選術(FACS)進行測定。所有抗體顯示與表達5T4的PC14PE6細胞的特異性結合，然而，A2結合的水平顯著低於就H8、Al和A3所觀察到的結合水平。參見表4。tableseeoriginaldocumentpage71為了評估抗體生產中潛在的變異性，測試了Al和H8的2個獨立製劑。當與各自相應的製劑比較時，每種抗體的結合和動力學性質沒有顯著不同。參見圖3A-3B。實施例35T4表達細胞對鼠類抗5T4抗體的內在化為了評估在與5T4抗原結合後抗體的內在化，作為時間的函數，測定在細胞表面上相對於在上清液中檢測到的H8和Al抗體的量。使非酶促解離的(non畫enzymaticallydissociated)MDAMB435/5T4細胞(人乳腺癌細胞)在4。C下暴露於抗5T4抗體1小時。將細胞洗滌並在培養基中於37'C溫育4小時或24小時。使用FACS測定相對於未結合的抗體(即，存在於上清液中)，與細胞膜結合的抗體的量。5T4抗體自MDAMB435/5T4細胞表面的消失證實5T4抗原/抗體複合物在細胞表面上受到調節，這可能指示內在化和/或解離。參見圖4A-4C。實施例4使用5T4嵌合體的表位作圖為了鑑定A1、A2、A3和H8抗體各自結合的表位，使用(1)具有缺失或突變的序列的5T4胞外域Fc構建體，和(2)在COS-l細胞中瞬時表達的5T4嵌合構建體，進行ELISA試驗。所述胞外域包括氨基端區域，2個富舍亮氨酸的重複單位，和居間的親水區。包舍5T4胞外域和來自人IgGl的Fc恆定區的融合蛋白使用小鼠5T4(胺基酸1-361)、大鼠5T4(胺基酸1-361)、食蟹猴5T4(胺基酸1-355)、黑猩猩5T4(胺基酸1-355)、和黑尾絨猴(胺基酸1-355)進行製備。5T4嵌合構建體在圖5中得到描述。結合結果概括於表5中，其指出了H8、Al、A2和A3抗體各自的特異性結合、部分結合、或結合的缺乏。人源化H8以及嵌合Al、A2和A3抗體顯示出分別類似於鼠類H8、Al、A2和A3的結合性質。基於這些結果，人源化H8抗體被確定為與人5T4在殘基173和252之間結合。人源化H8與在殘基344上含有或不含有N連接的糖基化的5T4結合，這證實人源化H8與人5T4的結合不發生在膜近側。Al抗體具有在殘基173和252之間與人5T4的第一接觸和在殘基282和361之間與人5T4的第二接觸。A2抗體在殘基282-361之間與人5T4結合。A3抗體在殘基83直到163之間結合人5T4的第一個富含亮氨酸的重複單位區域。由每個抗體結合的表位在圖7中得到描述。表5使用5T4胞外域Fc融合物和人/小鼠5T4嵌合體的表位作圖結果tableseeoriginaldocumentpage72(+)結合；(-)無結合；(+/-)部分結合基於對於來自人和食蟹猴的5T4胞外域觀察到的不同結合，進行耙向突變以辯別參與抗體結合的殘基。測定人源化H8抗體與下表6中指出的各突變5T4胞外域(即在所示位置上包括來自食蟹猴的殘基的人5T4胞外域)的結合。這些結果顯示人5T4抗原的殘基213和214對於人源化H8所結合的表位是必需的。表6使用具有靶向突變的人5T4胞外域/Fc融合物的表位作圖結果tableseeoriginaldocumentpage73(+)結合；(-)無結合；(+/-)部分結合除了直接結合試驗外，使用生物素化的人源化H8抗體分別與Al、A2或A3抗體各自進行竟爭結合試驗。未觀察到與人5T4的結合受到抑制，從而支持A1、A2和A3均各自與H8抗體結合不同的5T4表位。參見圖6A-6。實施例5使用B1ACRE⑧的表位作圖H8、Al、A2和A3抗體的表位作圖還使用BIACORE⑧、使用具有結合的人5T4抗原的CM5晶片來進行。晶片用H8、Al、A2或A3抗體進行飽和，並且測量第一應答。晶片隨後用來自H8、Al、A2和A3抗體中的第二抗體進行飽和，並且測量第二應答。對於多次實驗，晶片通過使結合的抗體在10mM甘氨酸，pH1.5中解離，隨後利用緩沖液洗滌來再生。結果概括於下表7中。所顯示的百分比是第二抗體與CM5晶片直接結合後測量到的應答單位除以第二抗體與經第一抗體飽和的CM5晶片結合後測量到的應答單位。這些結果顯示H8、Al、A2和A3各自結合在人5T4上的不同表位。H8和A3抗體所結合的表位彼此在空間上接近，從而使得當在A3存在下分析H8的結合時與抗原的結合速率降低，並且反之亦然。使用嵌合和人源化H8、Al、A2和A3抗體獲得類似結果，這些抗體如下文實施例7中所述進行製備。參見表8。表7使用BIACORE的竟爭試驗的結果-用第一抗體飽和後第二抗體的應答百分比tableseeoriginaldocumentpage74tableseeoriginaldocumentpage75使用嵌合構建體(參見實施例4)和BIACORE⑧測定的表位作圖研究的組合結果呈現於圖7中。實施例6抗5T4/加利車黴素綴合物的功效活體染料(MTS)染色用於測定暴露於各種處理後的存活細胞的數目。MTS(非》文射性細胞增殖測定試劑盒)購自Promega(Madison、Wisconsin)並且根據製造商的說明書來使用。對於每種細胞系，建立校準曲線(2小時後細胞數目相對於光密度)以估計合適的起始種植密度。隨後將細胞以750-5,000細胞/孔的密度種在96多孔皿中。在種植後立即使細胞暴露於各種濃度(O、0.01、0.05、0.1、1、10、100和500ng加利車黴素當量/ml)的加利車黴素、CMA-676和抗5T4抗體的加利車黴素綴合物。測定藥物暴露96小時存活的細胞數目後，基於得自劑量應答曲線的logistic回歸參數計算EDso。EDso定義為暴露於藥物96小時後引起細胞數目50%減少的藥物(CalichDMH)濃度。加利車黴素當量(計算當量)是作為純物質或作為綴合物給予的加利車黴素濃度。依賴與抗體結合的加利車黴素的量(抗體藥物負荷)，不同的加利車黴素當量可以指示不同的蛋白質濃度。MTS試驗的結果顯示於表9中。使用Al和A3抗5T4試驗製備的抗體/加利車黴素綴合物實質性地減少了MDAMB435/5T4細胞的生存力。選擇性值通過將綴合物的特異性活性與非特異性活性比較進行計算。即，針對5T4表達細胞的CalichDMH倍數除以針對不表達5T4的細胞的CalichDMH倍數值。當使用非特異性抗體例如hp67.6(CMA-676)時，CalichDMH倍數值大約是相同的，從而使得選擇性是1。表9MTS試驗結果tableseeoriginaldocumentpage76選擇性H8=8;hP67.6=l;Al=93;CalichDMH，未綴合的加利車黴素huH8-AcBut-CalichDMH，使用4-(4'-乙醯苯氧基)丁酸(AcBut)與加利車黴素綴合的人源化H8抗體CMA-676,抗-CD33/加利車黴素綴合物Al-AcBut-CaliehDMH，使用4-(4'-乙醯苯氧基)丁酸(AcBut)與加利車黴素綴合的Al抗體A2-AcBut-CalichDMH，使用4-(4，-乙醯苯氧基)丁酸(AcBut)與加利車黴素綴合的A2抗體A3-AcBut-CalichDMH，使用4-(4'-乙醯苯氧基)丁酸(AcBut)與加利車黴素綴合的A3抗體抗5T4/加利車黴素綴合物的細胞毒性還使用更為近似體內細胞環境的三維球狀體細胞培養物進行測定。球狀體基本上根據Yuhas等人(1977)CancerRes.37:3639-3643進行製備。簡言之，將在5ml培養基中的105細胞種植在預先用5ml在培養基中的0.65%組織培養級瓊脂(SigmaofSt.Louis，Missouri)包^L的60mm聚苯乙烯細胞培秦恥上。平皿於37。C在具5%C02的空氣中溫育5-6天。選擇具有0.2mm直徑的球狀體並置於24孔多孔亞中。每個孔包含0.5ml瓊脂襯墊層、1個球狀體和1ml培養基覆蓋層。隨後使J求狀體暴露於各種濃度(O、0.091、0.365、1.46、5.86、23.44、93.75和375ng加利車黴素當量/ml)的加利車黴素、CMA-676以及^f吏用Al和A3抗5T4抗體和AcBut接頭製備的抗5T4/加利車黴素綴合物。兩種抗5T4/加利車黴素綴合物均顯著地抑制MDAMB435/5T4細胞的生長。參見圖8。實施例7嵌合和人源化抗5T4抗體的製備和結合性質構建具有鼠類H8重鏈和輕鏈可變區序列以AA1gG4重鏈恆定區和人K輕鏈恆定區的嵌合H8、Al、A2和A3抗體。在Al重鏈可變區的第67位上存在的半胱氨酸被任選地改變成苯丙氨酸，在A3重鏈可變區的第91位上存在的半胱氨酸被任選地改變成酪氨酸。這些變體在SEQIDNO:2(AlVH)和SEQIDNO:10(A3VH)中示出。內含子序列的存在或不存在和半胱氨酸殘基的替換不影響抗體表達。對於編碼IgG恆定區的序列的克隆，任選刪除內含子序列。人源化H8如PCT國際公開號WO2006/031653中所述進行製備。人源化Al抗體如下文進一步所述的通過CI)R移植進行製備。鼠類Al、A2和A3抗體的CDRs使用AbM定義進行鑑定，所述AbM定義基於序列變異性以及結構環區域的定位。一般而言，人受體構架基於下述進行選擇它們基本上相似於鼠類抗體的構架區，或最類似於該可變區亞家族的共有序列。還考慮構架基因座在人中的出現情況，廣泛出現的序列一般優於較不常見的序列。對人構架受體序列進行另外突變，以恢復據認為涉及抗原接觸的鼠類殘基和/或涉及抗原結合位點的結構完整性的殘基。胺基酸序列還可以就CHO細胞的密碼子偏好性進行優化並去除限制酶位點。肽結構預測程序可以用於分析人源化可變重和輕鏈序列，以鑑定並避免由人源化設計引入的翻譯後蛋白質修飾位點。構建人源化Al重鏈可變區(AlVH1.0版)以包括移植到人DP-"構架區(VH7亞群，登記號CAA43346，SEQIDNO:88)上的鼠A1的CDRs，所述構架區包含構架突變(S82A)和l個回復突變(E46K)。通過去除該回復突變製備變體(AlVH1.1和1.2版)。第二人源化Al重鏈可變區通過將A1CDRs移植到人Dl)-54種系構架區上進行製備(AlVH2.0版)。製備六(6)個回復突變以產生A1VH2.1版。如下文進一步所述，2種Al重鏈可變區都保留了5T4結合性質。DP-21和DP-54構架區顯示在其長度上63%的M酸序列同一性，說明可以進行眾多胺基酸改變而同時保留抗體的結合特異性，包括與特定表位結合的能力。人源化Al重鏈可變區的相似性顯示於表10中。編碼人源化Al重鏈可變區的代表性核香酸序列如SEQIl)NOs:48、50、53和55所示。人源化Al重鏈可變區的代表性"i^酸序列如SEQIDNs:49、51、52、54和56所示。還參見圖9A-9B。構建人源化Al輕鏈可變區以包括移植到人DPK24(VKIV亞群)、DPK9(VKJI亞群)和DPK23(VKIII亞群)種系構架區上的鼠類Al的CDRs。將S67Y回復突變摻入到人源化A1輕鏈可變區中後，用這些構架之每一個製備的構架都顯示出了5T4結合。參見下文，包括表13。DPK24構架區顯示在其長度上分別與DPK9和DPK23有74%和73%的氨基#列同一性。DPK9構架區顯示在其長度上與DPK23有74。/。的M酸序列同一性。人源化A1輕鏈可變區的相似性顯示於表IO中。人源化輕鏈可變構架區的多種版本證實可以進行眾多胺基酸改變而同時保留抗體的結合特異性，包括與特定表位結合的能力。編碼人源化Al輕鏈可變區的代表性核苷斷列如SEQlDNOs:57、59、61、63、65、67、69、71、73和75所示。人源化Al輕鏈可變區的代表性胺基酸序列如SEQIDNOs:58、60、62、64、66、68、70、72、74和76所示。還參見圖9C-9F。tableseeoriginaldocumentpage79人源化A2和A3抗體使用類似策略進行設計。人源化A2重鏈可變區和人源化A2輕鏈可變區的代表性胺基酸序列分別如SEQIDNOs:77_78和SEQIDNs:79-80所示。還參見圖9(;。人源化A3重鏈可變區和人源化A3輕鏈可變區的代表性胺基酸序列分別如SEQII)NOs:81-82和SEQIDNOs:83—84所示。還參見圖9H。為了評估人源化A1、A2和A3重鏈和輕鏈可變區的新穎性，如實施例1中所述進行BLASTn和BLASTp分析。結果呈現於表11中。tableseeoriginaldocumentpage80tableseeoriginaldocumentpage81*查詢覆蓋度度=100%時圖10A-10B顯示可以用作構架用於製備人源化Al、A2和A3抗5T4抗體的另外重鏈可變區序列。圖11-13顯示可以用作構架用於製備人源化Al、A2和A3抗5T4抗體的另外輕鏈可變區序列。圖14顯示可以用於製備嵌合和人源化Al、A2和A3抗5T4抗體的代表性恆定區。為了評估嵌合和人源化H8、Al、A2和A3抗體的結合特異性和親和力，使用固定在CM5晶片上的人5T4抗原進行BIACORE⑧分析。參見實施例2。關於嵌合A1、A2和A3抗體的結果顯示於下表12中。表12tableseeoriginaldocumentpage82一般而言，嵌合/人源化增加H8、Al、A2和A3對人5T4的親和力。比較表3。結合親和力的增加看起來主要起因於抗體和抗原較慢的解離而不是較快的結合。嵌合A2和A3抗體顯示在嵌合後改善最大的結合性質。所有人源化Al重鏈可變區保留5T4結合性質。此外，自人源化Al重鏈可變區去除K46回復突變不影響5T4結合性質。人源化Al輕鏈可變區顯示受損的5T4結合性質。使用1)PK9和DPK23構架構建的人源化Al輕鏈可變區比使用DPK24構架構建的人源化Al輕鏈可變區以更高的親和力結合5T4。已摻入回復突變以恢復和/或優化5T4結合。用酪氨酸殘基替換在第67位上的絲氨酸殘基，如鼠類A1構架區中所示，完全恢復5T4抗原結合性質。參見表13。表13經由ELISA對生物素化的嵌合Al抗體與人5T4的結合的抑制tableseeoriginaldocumentpage83實施例8抗5T4抗體的物種交叉反應性測定本文所公開的抗5T4抗體的交叉物種反應性，以確定用於體內功效研究和毒理學分析的相關物種。有關結合活性與不同5TM胞外域的關聯性之間的相互關係也被用於進一步描述每種抗體所結合的表位。結合試驗4吏用與人lgGlFc融合的來自各個物種的5T4胞外域來進行。每個胞外域區與人5T4的同一性百分比顯示於表14中。表14來自不同物種的5T4的關聯性tableseeoriginaldocumentpage83tableseeoriginaldocumentpage84包含在親水結構域內的6胺基酸同向重複來自人、小鼠、大鼠、犬和牛的5T4的全長或部分序列先前已^Hf為Genbank登記號Z29083(人，SEQIDNO:87)、AJ012160(小鼠)、BC087011(大鼠)、XM539020(犬)和XM593502(牛)。使用mRNA和基因組序列的比對來產生黑猩猩5T4的虛擬部分序列。從食蟹猴和黑尾絨猴中分離了編碼5T4蛋白質的核酸。這些另外5T4抗原的胺基酸序列顯示於圖15中並且也見如SEQIDNO:86(食蟹猴)和SEQIDNO:85(黑尾絨猴)所示。為了評估食蟹猴和黑尾絨猴序列的新穎性，如實施例2中所述進行BLAST分析。當使用全長黑尾絨猴5T4胺基酸序列作為查詢序列時，最接近的目標序列鑑定為人5T4(Genbank登記號NP—006661.1)，具有94%的同一性(302/320個胺基酸)。這兩個序列還在羧基末端上不同，其中SEQIDNO:85的胺基酸1-19未與該最接近的目標序列比對。當使用全長食蟹猴5T4胺基酸序列作為查詢序列時，最接近的非虛擬目標序列被鑑定為同樣來自食蟹猴的滋養層糖蛋白前體(Genbank登記號BAEO0432.1)，具有99%的同一性(364/366個胺基酸)-這些序列還在羧基末端上不同，其中SEQIDNO:86的胺基酸1-25未與該最接近的非虛擬目標序列比對。為了評估抗5T4抗體的結合，將5T4胞外域/Fc融合蛋白瞬時轉染到COS-1細胞內，並且進行ELISA試驗。無關的人IgG4和1gGl抗體用作對照。抗5T4抗體的交叉物種反應性概括於表15中。tableseeoriginaldocumentpage85huH8y4,具有IgG4恆定區的人源化H8抗體huH8yl，具有IgGl恆定區的人源化H8抗體ChiAly4,具有1gG4恆定區的嵌合A1抗體ChiA2y4，具有IgG4恆定區的嵌合A2抗體ChiA3了4，具有IgG4恆定區的嵌合A3抗體(+/-)，部分結合(-)，無結合權利要求1.特異性結合人5T4抗原的抗體，其中所述抗體(a)包含鼠類A1、A2或A3抗體的抗原結合結構域；(b)與鼠類A1、A2或A3抗體競爭5T4結合；(c)結合由A1、A2或A3抗體結合的5T4表位；或(d)包含(a)-(c)抗體的5T4結合片段。2.權利要求l的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、四聚體抗體、四價抗體、多特異性抗體、結構域特異性抗體、單結構域抗體或融合蛋白。3.權利要求l的抗體，其為鼠類單克隆抗體。4.權利要求l的抗體，其中所述抗體具有對於人5T4抗原至少約1xl(T7M-約1xl(T12M的結合親和力。5.權利要求1的抗體，其中抗體在體內特異地靶向5T4表達細胞。6.權利要求1的抗體，其中重鏈可變區包含SEQIDNO:2的殘基20—138，SEQIDNO:6的殘基19-135，SEQIDNO:10的殘基20-141或SEQIDNO:49的殘基1-119的^J^酸序列；或人源化Al、A2或A3重鏈可變區的殘基的胺基酸序列。7.權利要求1的抗體，其中輕鏈可變區包含SEQIDNO:4的殘基21-127，SEQIDNO:8的殘基23-130或SEQIDNO:12的殘基21-127的胺基酸序列；或人源化A1、A2或A3輕鏈可變區的殘基的M^列。8.權利要求1的抗體，其中重鏈可變區包含SEQIDNO:2的殘基20-138的胺基酸序列，且其中輕鏈可變區包含SEQIDNO:4的殘基21-127的#^*列。9.權利要求l的抗體，其中重鏈可變區包含衍生自SEQIDNO:6的殘基19-135的M齡列，且其中輕鏈可變區包含衍生自SEQIDNO:8的殘基23-130的胺基酸序列。10.權利要求l的抗體，其中重鏈可變區包含衍生自SEQIDNO:10的殘基20-141的絲酸序歹ij，且其中輕鏈可變區包含衍生自SEQIDNO:12的殘基21-127的M酸序列。11.權利要求2的抗體，其為嵌合或人源化抗5T4抗體。12.權利要求11的嵌合或人源化抗體，其包含衍生自人恆定區的恆定區。13.權利要求12的嵌合或人源化抗體，其中所述人輕鏈恆定區衍生自人k輕鏈恆定區。14.權利要求12的嵌合或人源化抗體或抗體片段，其中所述人重鏈恆定區衍生自人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區。15.權利要求14的嵌合或人源化抗體或抗體片段，其中所述人IgG4重鏈恆定區包含在第241位上的脯氨酸。16.權利要求ll的嵌合或人源化抗體，其中至少一條輕鏈或至少一條重鏈的可變區包含(a)含有人抗體構架區的殘基的構架區；和(b)SEQIDNO:4、8或12的輕鏈可變區的一個或多個CDRs，或SEQIDNO:2、6或10的重鏈可變區的一個或多個CDRs。17.權利要求16的嵌合或人源化抗體，其中所述人殘基是選自下述的人構架殘基(a)選自DP-21(VH7)、DP54(VH3-07)、DP-47(VH3-23)、DP-53(VH-74)、DP-49(VH3-30)、DP48(VH3-13)、DP-75、DP畫8(VH1-2)、DP畫25、Vl-2b和VI-3(VH1-03)、DP-15和Vl國8(VH1-08)、DP-14和Vl-18(VH1-18)、DP-5和V1-24P(VH1-24)、DP-4(VH1-45)、DP畫7(VH1-46)、DP陽IO、DA畫6和YAC畫7(VH1-69)、DP-88(VHl國e)、DP-3和DA-8(VHl-f)的人抗體重鏈構架區；(b)DPK24亞群IV種系克隆、VkIII亞群(DPK23、DPK22、DPK20、DPK21)、或VkI亞群種系克隆(DPK9、DPK1、02、DPK-7)的人抗體輕鏈構架區；(c)(a)的重鏈構架區的共有序列；或(d)與(a)_(c)的構架區至少63%等同的構架區。18.權利要求16的嵌合或人源化抗體，其包含SEQIDNOs:2、4、6、8、10或12中的任何一個的至少2個CDRs。19.權利要求18的人源化抗體，其中所述輕鏈包含可變區，該可變區包含SEQIDNOs:4、8或12中的任何一個的3個CI)Rs中的至少2個。20.權利要求19的人源化抗體，其中所述輕鏈包含可變區，該可變區包含SEQIDNOs:4、8或12中的任何一個的3個CDRs。21，權利要求16的人源化抗體，其中所述重鏈包含可變區，該可變區包含SEQIDNOs:2、6或10中的任何一個的3個CDRs中的至少2個。22.權利要求21的人源化抗體，其中所述重鏈包含可變區，該可變區包含SEQIDNOs:2、6或10中的任何一個的3個CDRs。23.4又利要求16的人源化抗體，其包含SEQIDNOs:2和4的CDRs、SEQII)NO:6和8的Cl)Rs、或SFQII)NO:10和12的Cl)Rs。24.權利要求ll的嵌合或人源化抗體，其中所述重鏈可變區序列包含(a)SEQIDMO:2的殘基20-138的胺基酸序列；(b)與SEQIDNO:2的殘基20-138至少85%等同的氨基,列；(c)SEQIDNO:6的殘基19-135的氨基,列；(d)與SEQIDNO:6的殘基19-135至少86%等同的氨基崎列；(e)SEQIDNO:10的殘基20-141的氨基,列；(f)與SEQIDNO:10的殘基20-141至少91%等同的氨基,歹寸；(g)SEQIDNOs:49、51、52、54、56、77、78、81或82中的任何一個的M酸序列；(h)與SEQIDNO:51至少91%等同的氨基,列；(i)與SEQIDNO:54至少78%等同的#^,列；(j)與SEQIDNO:77至少89%等同的氨基,列；(k)與SEQlDNO:78至少79%等同的胺基酸序列；(I)與SEQIDNO:81至少80%等同的胺基酸序列；或(m)與SEQIDNO:82至少78%等同的胺基酸序列。25.權利要求ll的嵌合或人源化抗體，其中所述輕鏈可變區序列包含(a)SEQIDNO:4的殘基21-127的氨基斷列；(b)與SEQIDNO:4的殘基21-127至少94%等同的氨基齡歹寸；(c)SEQ1DN:8的殘基23-130的氨基,列；(d)與SEQII)NO:8的殘基23-130至少96%等同的氨基齡列；(e)SEQlDNO:12的殘基21-127的氨基,列；(f)與SEQIDNO:12的殘基21-127至少98%等同的#^#列；(g)SEQIDNOs:58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、79、80、83或84中的4壬何一個的胺基酸序列；(h)與SEQIDNO:60至少83%等同的氨基晚字列；(i)與SEQIDNO:70至少93%等同的胺基酸序列；(j)與SEQIDNO:76至少85%等同的氨基斷列；(k)與SEQH)NO:76至少85%等同的氨基晚亭列；(1)與SEQII)NO:79至少88%等同的氨基晚字列；(m)與SEQIDINO:80至少84%等同的氨基睃字列；(n)與SEQIDNO:83至少90%等同的胺基酸序列；或(o)與SEQIDNO:84至少91%等同的氨基,列。26.用於藥物遞送的抗體/藥物綴合物，其包含(a)根據權利要求1的抗體；和(b)藥物，其與所述抗體直接或間接結合。27.權利要求26的抗體/藥物綴合物，其中所述藥物是選自細胞毒素、放射性同位素、免疫調諧劑、抗血管生成劑、抗增殖劑、促凋亡劑、化學治療劑和治療性核酸的治療劑。28.權利要求27的抗體/藥物綴合物，其中所述治療劑是細胞毒素。29.權利要求26的抗體/藥物綴合物，其中所述細胞毒素是抗生素、微管蛋白聚合的抑制劑、烷化劑、蛋白質合成抑制劑、蛋白激酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、拓樸異構酶抑制劑或酶。30.權利要求27的抗體/藥物綴合物，其中所述細胞毒素是抗生素。31.權利要求30的抗體/藥物綴合物，其中所述抗生素是加利車黴素。32.權利要求31的抗體/藥物綴合物，其中所述加利車黴素是加利車黴素的N-乙醯基衍生物或二硫化物類似物。33.權利要求32的抗體/藥物綴合物，其中所口利車黴素是]\-乙醯基-，加利車黴素。34.權利要求26的抗體/藥物綴合物，其中所述藥物經由接頭與抗體結合。35.權利要求34的抗體/藥物綴合物，其中所述接頭選自4-(4'-乙醯苯氧基)丁酸(AcBut)、3-乙醯苯基酸性酸(AcPac)、4-巰基-4-曱基-戊酸(Amide)及它們的f汙生物。36.用於將藥物遞送給5T4表達細胞的方法，其包括使所述細胞與抗體/藥物綴合物接觸，所述抗體/藥物綴合物包含(i)權利要求1的抗5T4抗體，和(ii)與抗5T4抗體直接或間接結合的藥物。37，權利要求36的方法，其中所述藥物內化入靶細胞中。38.用於治療具有5T4陽性癌症的受試者的方法，所述方法包括給所述受試者施用治療有效量的抗5T4抗體/藥物綴合物，所述抗5T4抗體/藥物綴合物包含(i)權利要求1的抗5T4抗體，和(ii)與抗5T4抗體直接或間接結合的治療劑。39.權利要求38的方法，其中所述抗5T4抗體/藥物綴合物是抗5T4抗體/加利車黴素綴合物，所述方法進一步包括施用第二治療劑，其中所述抗5T4/加利車黴素綴合物和所迷笫二治療劑同時或以任何順序相繼施用。40.與人5T4表位特異性結合的抗體，所a位包含SEQIDNO:87的殘基173-252和276-355，但不包含殘基213-214。41.與人5T4表位特異性結合的抗體，所述表位包含SEQIDNO:87的胺基酸276-355。42.與人5T4表位特異性結合的抗體，所述表位包含SEQIDNO:87的氮基酸83-163。43.抗體，其與具有SEQIDNO:86的JL&酸序列的食蟹猴5T4特異性結合。44.分離的5T4蛋白質，其包含(a)SEQIDNO:85或86的氨基*列；或(b)與SEQIDNO:85至少95%等同的氨基晚字列。45.抗體，其特異性結合權利要求44的分離的5T4蛋白質。46.編碼抗5T4重鏈可變區的分離的核酸，其包含(a)SEQIDNO:1的核普酸58-414的核苷酸序列；(b)SEQIDNO:5的核苷酸55-405的核苷酸序列；(c)SEQIDNO:9的核苷酸58-423的核香酸序列；(d)編碼SEQIDNOs:48、50、53或55中的任何一個的核苦,列；(e)當查詢覆蓋度為100%時，與SEQIDNO:50有89%等同的核苷酸序列；(f)當查詢覆蓋度為100%時，與SEQIDNO:53有82%等同的核苦酸序列；或(g)在嚴格雜交條件下與(a)-U)中的任何一個的互補物特異性雜交的核酸。47，編碼抗5T4輕鏈可變區的分離的核酸，其包含(a)SEQIDNO:3的核苷酸61-381的核苷酸序列；(b)SEQIDNO:7的核苦酸67-390的核苷酸序列；(c)SEQIDNO:11的核芬酸61-381的核苷酸序列；(d)編碼SEQIDNOs:57、59、61、63、65、67、69、71、73或75中的任何一個的人源化Al、A2或A3輕鏈可變區的核苷酸序列；(e)當查詢覆蓋度為100%時，與SEQIDNO:59有84%等同的核(f)當查詢覆蓋度為1(K)Q/。時，與SEQIDNO:69有86%等同的核苷酸序列；(g)當查詢覆蓋度為100%時，與SEQn)N:75有85%等同的核苷酸序列；或(h)在嚴格雜交條件下與(a)-(d)中的任何一個的互補物特異性雜交的核酸。全文摘要本發明涉及抗5T4抗體、抗5T4抗體/藥物綴合物以及其製備和使用的方法。文檔編號C07K16/00GK101437850SQ200780016577公開日2009年5月20日申請日期2007年3月9日優先權日2006年3月10日發明者A·昆斯,D·吉爾,E·R·博格哈特,K·A·馬爾奎特,K·斯萊庫馬爾,K·肯德克,L·齊斯提科娃,N·K·達姆爾,P·R·哈曼申請人:惠氏公司