重組人血清白蛋白-幹擾素α1b融合蛋白及其製備方法

2023-10-05 03:57:49 2

專利名稱：重組人血清白蛋白-幹擾素α1b融合蛋白及其製備方法
技術領域：
本發明一般的涉及重組人血清白蛋白融合蛋白及其製備方法，特別地涉及重組人 血清白蛋白-幹擾素及其製備方法。
背景技術：
幹擾素(interferon，IFN)是一類重要的家族性細胞因子，具有抵抗病毒感染，抑 制腫瘤生長和調節機體免疫功能的作用。IFN蛋白家族基於它們的基因序列、染色體定位和 受體特異性分為3型1型包括IFN-α，-β, -ω, -ε , -κ等亞型；II型幹擾素由單基因 家族IFN-γ構成，又稱為免疫幹擾素；III型是一種新發現的細胞因子，稱為IFN-λ。其中 IFN-α的抗病毒活性最強，IFN-α分子的不同亞亞型由165-172個胺基酸組成，分子量約 19kD左右。隨著基因工程技術的發展，IFN-α成為第一個用於臨床的基因重組細胞因子， 已經被美國FDA批准應用於病毒性肝炎、癌症及多發性硬化症等多種疾病的治療。但是幹 擾素分子量較小，易被腎小球濾過，體內不穩定，易被血清蛋白酶降解，血漿半衰期短而治 療周期長，需要頻繁注射給藥，患者依從性降低。為了克服上述缺點，長效幹擾素藥物開發已成為一個重要方向。延長重組幹擾素 半衰期有以下幾種有效方式1)緩控釋製劑，幹擾素包封於聚合層中，通過皮下或肌肉給 藥，聚合層隨時間減少，使藥物從微囊中緩慢持續釋放，這有利於穩定藥物，減少胃腸道酶 的破壞，延長藥物體內半衰期；2)利用定點突變技術，如寡核苷酸引物、PCR介導的定點突 變及盒式突變等方法使幹擾素中蛋白酶位點改變成對蛋白酶不敏感的其他胺基酸，從而減 少血液中的酶對其降解，延長體內半衰期；幻化學修飾技術，將糖基或PEG等共價連結到幹 擾素表面，使蛋白相對分子量增大，減少了腎小球的濾過，保護蛋白不被蛋白酶降解，同時 擋住蛋白表面的抗原決定簇，降低免疫原性；4)蛋白融合技術，通過基因重組手段將幹擾 素基因與特定的載體蛋白基因融合，由同一調控序列控制基因表達產物，用基因工程手段 人工創造的新分子。目前為使蛋白獲得長效的目的採用最多的載體是HSA和抗體Fc片段。由於緩釋給藥系統存在包封率低，突釋和釋放不完全以及在製備過程強烈的物 理、化學變化導致的IFN變性失活等問題，要製備理想的幹擾素緩釋製劑還需要大量研究； 目前FDA已批准兩種PEG化幹擾素用於臨床，分別是先靈葆雅的PEG-htron (branchedPEG 40kD-IFN- α 2b)和羅氏的 Pegasys (linear PEG12kD_IFN_ α 2b)。然而，這兩種 PEG 化幹擾 素均為非均一產物。PEGHntron是由14種單修飾和少量未修飾的IFNa -2b組成的混合 物，而Pegasys為至少由6種單修飾的組成的混合物，這種眾多異構體混合物造成不同的生 理反應，同時也導致了產品質量控制、工業化生產純化等難題。定點突變技術對蛋白質工程 技術要求相當高，類似於組合化學庫篩選技術且其延長半衰期的效果並不理想。因此基於 基因工程手段研製的長效蛋白藥物越來越受到人們關注，這其中以人血清白蛋白融合技術 最為突出，該方法以人血清白蛋白為載體。人血清白蛋白(HSA)是人體血液中天然的物質 輸送載體，血清中含量最高，其相對分子量約為65kDa，是由585個胺基酸組成的單鏈球型 蛋白質，無酶學及免疫學活性，體內半衰期長達19天，是理想的改善藥物半衰期的藥物融 合蛋白ο

發明內容
本發明的首要目的是提供一種人血清白蛋白-幹擾素α lb，其具有SEQ ID No. 1 所示的序列。本發明的第二個目的是提供SEQ ID No. 1所示人血清白蛋白-幹擾素α Ib的制 備方法，該方法至少包括如下步驟(a)重組人血清白蛋白-幹擾素α Ib融合蛋白表達基因的密碼子優化及化學合 成；(b)含(a)所述表達基因的酵母表達質粒的構建；(c)含(b)所述表達質粒的畢赤酵母轉化體的構建及篩選；(d)轉化體工程菌的發酵培養；(e)工程菌表達融合蛋白的純化。上述方法中步驟(a)中的密碼子優化優選酵母偏愛的密碼子。步驟(c)中的畢赤酵母優選畢赤酵母GS115。步驟(e)中融合蛋白優選分泌型表達，優選通過人血清白蛋白的天然信號肽實 現。步驟(e)優選包括(1)對(d)所得工程菌進行離心處理後將所得離心上清液進行超濾濃縮；(2)超濾濃縮液的Blue Sepharose FF染料親和層析純化；(3)前步所得洗脫液的CM Sepharose FF陽離子交換層析進一步純化。其中步驟(1)中超濾時超濾膜孔徑優選30kDa ；步驟O)中20mM PB緩衝液優選， 洗脫使用的2M NaCl, pH7. 0優選；步驟(3)中25mmol/L醋酸鈉緩衝液優選，洗脫使用的 0. 3mol/LNaCl, pH4. 4-5. 0 優選。本發明的最後一個目的是提供前述人血清白蛋白-幹擾素α Ib在製備預防或治 療B肝及B肝病毒感染相關的疾病的藥物中的用途。


圖1表示GS115轉化子的PCR分析電泳圖，圖中各泳道樣品自左至右依次為DNA Marker,陽性轉化子，陽性轉化子，陽性轉化子，陽性轉化子，陰性轉化子，陽性轉化子，陰性 對照。圖2表示融合蛋白純化產物的Western blot檢測結果，圖中自左至右蛋白 Marker,融合蛋白純化產物。圖3表示融合蛋白純化產物的非還原性SDS-PAGE檢測結果，圖中各泳道樣品自 左至右依次為蛋白Marker，超濾濃縮樣品，Blue Sepharose FF染料親和層析純化樣品，CM Sepharose FF陽離子交換層析純化樣品。圖4表示融合蛋白純化產物的MALDI-T0F質譜分子量檢測結果。
具體實施例方式實施例1 表達載體的構建將上海生工有限公司合成的pBluescript II KS (+)-HAS-NIFN 以 BamHI、EcoRI 雙 酶切，酶切產物以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，用Agarose Gel DNA Purification Kit回收目 的基因，與經過相同酶切的畢赤酵母表達載體PPIC3. 5連接，構建出pPIC3. 5-HSA-IFNa Ib重組質粒。實施例2 畢赤酵母GSl 15的電擊轉化及篩選將2-4 ug SalI線性化處理的重組質粒pPIC3. 5-HSA-IFN α Ib電擊轉化感受態畢 赤酵母GS115。電擊結束後立即加入ImL lmol/L山梨醇，混勻後取200uL塗布於MD平板 (1. 34% YNB，4X 10_5%生物素，2%葡萄糖，1. 5%瓊脂)，30°C培養至菌落出現。篩選陽性克 隆。實施例3 重組畢赤酵母的PCR鑑定用TIANamp Yeast DNA Kit 提取重組子 GS115/pPIC3. 5-HSA-IFN α Ib 基因組DNA。 在50uL的PCR反應體系中加入上遊引物(5，TCAAAGATTCCCAAAGGC 3，20 μ M) 1 μ L，下遊 引物(5』 CAGCGAAGTCGTCCATAA3』 20 μ Μ) 1 μ L，提取的重組子基因組 2. 5ng,4XdNTP 混合液 (各 2. 5mM) 4 μ L，Pyrobest DNA 聚合酶(0. 5U/ μ L) 2. 5 μ L，10 X Pyrobest 緩衝液 5 μ L，雙 蒸水 H2O M 50 μ L0 PCR 條件為94°C預變性 5min, 94°C變性 Imin，53°C退火 Imin，72°C延伸 90s，30個循環，72°C延伸5min。凝膠電泳檢測PCR產物。實施例4 重組子GS115/pPIC3. 5-HSA-IFN α Ib的誘導表達及純化將篩選得到的表達量較高的重組子接種於裝有50ml BMGY培養基(1 %酵母提取 物，2%蛋白腖，1. 34% ￥他，4父10-5%生物素，1%甘油)的500ml三角瓶中，30°C，300r/min 培養至A6tltl值為2. 0-6. 0，離心收集菌體，BMMY (用0. 5%甲醇代替BMGY中的甘油)重懸細 胞至慫(1(1值為1.0，301，30017/1^11下進行誘導表達，每隔對11補加一次甲醇，誘導表達9611。8000rpm離心5min，收集上清。利用超濾杯，超濾膜孔徑為30kDa，用A液(20mM PBpH7. 0)平衡超濾膜，然後將IL上清液濃縮10倍。濃縮液加入2倍緩衝液繼續超濾，最 終收集樣品溶液50ml。將濃縮液上樣到用A液充分平衡的Blue Sepharose FF層析柱，用 兩個柱體積的A液衝洗，然後用B液QOmM PB+2M NaCl pH7. 0)進行洗脫，收集洗脫峰組 分；將Bluekpharose FF親和層析的洗脫峰組分上樣到用C液05mmol/L醋酸鈉緩衝液 PH4. 5)充分平衡好的CM Sepharose FF陽離子交換層析柱，用D液05mmol/L醋酸鈉緩衝 液+0. 3mol/L NaCl ρΗ4· 5)衝洗，收集洗脫峰組分。實施例5 融合蛋白純化產物的Wfestern blot鑑定融合蛋白純化產物經SDS-PAGE後，電轉移蛋白至硝酸纖維素膜上，將膜轉入 TBST配製的5% BSA中，4°C封閉過夜，用TBST清洗後加入小鼠抗人HSA的單克隆抗體 (1 2000)室溫孵育lh，用TBS清洗後加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG的二抗 (1 2000)室溫孵育Ih，用TBS清洗後用HRP-DAB Kit顯色。實施例6 :rHSA-IFN α Ib分子量檢測採用基質輔助雷射解吸離子化飛行時間質譜法，基質為芥子酸；N2雷射源；波長為 337nm ；飛行管長1. 5M ；加速電壓20KV。實施例7 融合蛋白rHSA-IFN α Ib體外抗病毒活性測定依據《中華人民共和國藥典》2010年版第三部，採用細胞病變抑制法(CPE)，利用 WISH-VSV系統測定HSA-NIFN的活性。用Lowry法測定其蛋白含量，計算比活性。
權利要求
1.一種重組人血清白蛋白-幹擾素α Ib融合蛋白，其特徵在於具有序列表SEQ ID No. 1所示序列。
2.如權利要求1所述的重組人血清白蛋白-幹擾素αIb融合蛋白的製備方法，其特徵 是該方法至少包括以下步驟(a)重組人血清白蛋白-幹擾素αIb融合蛋白表達基因的密碼子優化及化學合成；(b)含(a)所述表達基因的酵母表達質粒的構建；(c)含(b)所述表達質粒的畢赤酵母轉化體的構建及篩選；(d)轉化體工程菌的發酵培養；(e)工程菌表達融合蛋白的純化。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(a)所述的密碼子優化選擇酵母偏愛 的密碼子。
4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(c)中選擇的畢赤酵母是畢赤酵母 GS115。
5.如權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(e)中所述的融合蛋白為分泌型表達。
6.如權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(e)進一步包括(1)對(d)所得工程菌進行離心處理後將所得離心上清液進行超濾濃縮；(2)超濾濃縮液的BlueSepharose FF染料親和層析純化；(3)前步所得洗脫液的CMSepharose FF陽離子交換層析進一步純化。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於步驟(1)中超濾膜孔徑為30kDa。
8.如權利要求6所述的方法，其特徵在於步驟O)中選擇緩衝液上樣，洗脫選擇 20mMPB+2M NaCl，ρΗ7· O。
9.如權利要求6所述的方法，其特徵在於步驟(3)中選擇緩衝液上樣，洗脫選擇 25mmol/L 醋酸鈉緩衝液+0. 3mol/L NaCl pH4. 4-5. O。
10.權利要求1所述的重組人血清白蛋白-幹擾素αIb融合蛋白在製備預防和/或治 療B肝及B肝病毒感染相關的疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種重組人血清白蛋白-幹擾素α1b融合蛋白，編碼融合蛋白的DNA序列，以及在畢赤酵母發酵液中純化rHSA-IFNα1b的生產工藝。本發明的融合蛋白在保持了幹擾素α1b的生理特性的基礎上延長其在體內的半衰期，純化操作簡單、方便有利於擴大化工業生產。
文檔編號C12N15/62GK102093480SQ20101018935
公開日2011年6月15日 申請日期2010年6月2日 優先權日2010年6月2日
發明者劉金毅, 周敏毅, 徐晨, 田碩, 程永慶 申請人:北京三元基因工程有限公司, 北京畢艾歐科技發展有限責任公司