重組過敏原肌動蛋白結合蛋白及其製備方法
2023-10-25 09:56:02 1
專利名稱：重組過敏原肌動蛋白結合蛋白及其製備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體的說涉及重組蛋白及其製備方法。
背景技術：
變態反應性疾病是人類常見的自身免疫性疾病，其危害極大且極難根治，同時，其與過敏人群所生存的外界環境密切相關。據相關報導，變態反應性疾病的發病率在30％以上，並且有隨著城市化及工業化進程的推進而不斷增多的趨勢。自然界的過敏原種類繁多，分布廣泛。作為空氣過敏原的植物花粉，不僅其本身的危害人類無法規避，而且不同植物花粉之間以及植物花粉與其它類型的過敏原之間都存在著交叉反應，這樣就使得過敏人群始終處於過敏原包圍之中。
花粉過敏原有其普遍性。花粉過敏原的種類繁多，花粉以氣溶膠的形式存在，並隨著空氣流動，可以使相當範圍的過敏人群受害。研究表明幾乎所有發生量較大的花粉都有其過敏人群。花粉過敏原普遍性的另一方面來自交叉反應(cross-reactivity)的發生。具體表現在不僅不同種屬的植物花粉過敏原之間可以發生交叉反應，而且不同科目的植物花粉過敏原間也能發生交叉反應，甚至花粉過敏原與食物過敏原之間也可以發生交叉反應。這樣就組成了一個強大的過敏原網絡，使得過敏性體質人群總是處於過敏原包圍狀態之中，極其容易引發過敏症。
一般地，在花粉大量開散季節，根據病人的典型病史、症狀與體徵來對花粉過敏症作出非特異性診斷。對於特異性診斷，早期較多依賴於花粉浸提液穿刺皮膚試驗所得的結果，但是，由於陽性結果僅能說明患者存在對該類花粉過敏的可能，因此確診率並不高。相比較而言，根據病人血清中特異性IgE(sIgE)的含量進行診斷，其準確率卻相對較高。
免疫治療法是過敏性疾病的最佳治療方案，該方法首見報導於1911年，其後廣泛採用而流傳至今。但是，傳統的免疫療法依賴於花粉浸提液，由於其成分複雜而且無法進行標準化定量，存在諸多缺點，如見效慢，需要病人長期堅持，有誘發過敏的危險等等，從而使其應用受到了一定的限制。
相比較而言，重組過敏原的產量高，生產條件穩定，方便進行過敏原的標準化，利於臨床診斷和治療，因此對重組過敏原基因的研究正呈現急劇增長的態勢，並成為變態反應學的研究熱點。
具有廣泛的交叉反應性的過敏原蛋白質通常被稱之為泛過敏原。大量過敏原基因的獲得為揭示過敏原交叉反應的分子機理提供了基礎平臺。研究表明雖然同種植物花粉過敏原之間存在高度的異質性，但是，同種過敏原基因之間卻存在高度的相似性，而同科不同屬種植物花粉過敏原之間也享有一些共同的結構特徵。正是由於花粉過敏原之間保有共同的結構特徵，特別是IgE結合表位的相似性，才構成了交叉反應發生的分子生物學基礎。
發明內容
本發明的目的在於針對上述問題及天然花粉過敏原浸提液行脫敏治療的不足，從過敏原基因的全長cDNA出發，通過基因工程的手段，合成重組過敏原肌動蛋白結合蛋白，用於研製一種具有廣譜性治療作用的重組花粉泛過敏原疫苗，以歸避天然提取物的非單一性及標準化難的障礙，應用於一類變態反應特應性人群，以降低疫苗的變應原性而提高免疫原性，縮短治療周期，從而替代花粉浸提液。
本發明的另一個目的在於提供該重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的製備方法。
本發明所獲得的重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的胺基酸序列如圖1所示，其製備方法如下所示(1)從花粉中提取總RNA；(2)合成引物Sg1p55′-ATGTCGTGGCAGGCGTACGT-3′，Sg1p35′-CCTCTCAACAA(T/G)CA(C/T)GTTGCATTG TCC-3′；(3)以上述總RNA為模板，通過RT-PCR獲得重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的5′基因片段；(4)設計引物PD105′-GGAGCTGTGATTCGAGGGAAAAAGG-3′以及PD035′-CTGCATCAAGAAAACAGGCCAAGC-3′；進行重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的5′基因片段的cDNA末端擴增，獲得肌動蛋白結合蛋白基因的3′基因片段，(5)利用5′及3′基因片段獲得全長基因；(6)將所得全長基因的開放閱讀框與原核表達載體酶切連接，構建重組質粒載體；
(7)將所得重組質粒載體轉化宿主菌；(8)培養經轉化的宿主菌並誘導其表達重組過敏原肌動蛋白結合蛋白；(9)純化重組過敏原肌動蛋白結合蛋白。
上述步驟(1)所述的花粉為葎草或/和豚草花粉。
上述步驟(3)所述的PCR過程的退火溫度為45～72℃。
上述步驟(6)所述的原核表達載體為pET-44。
上述步驟(6)所述酶切的酶切位點為EcoRI和PstI。
上述步驟(7)所述的宿主菌為BL21(DE3)。
上述步驟(8)是採用IPTG誘導經轉化的宿主菌表達重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的上述步驟(9)是採用親和層析的方法對重組過敏原肌動蛋白結合蛋白進行純化。
本發明的有益效果本發明從過敏原基因的全長cDNA出發，採用基因工程的方法，合成了重組過敏原肌動蛋白結合蛋白，所得重組蛋白純度高，治療效果好，可用於製備一種具有廣譜性治療作用的重組花粉泛過敏原疫苗，以降低疫苗的變應原性而提高免疫原性，縮短治療周期，從而替代花粉浸提液。同時本製備方法具有表達量高，生產條件穩定，成本低的特點，方便進行過敏原的標準化，有利於臨床的診斷和治療。
圖1為重組過敏原肌動蛋白結合蛋白胺基酸序列圖；
圖2為重組過敏原肌動蛋白結合蛋白D106誘導表達及純化電泳圖；圖3為重組過敏原肌動蛋白結合蛋白D03的誘導表達及純化電泳圖；圖4為重組過敏原肌動蛋白結合蛋白LCM9的免疫印跡結果圖；圖5為重組過敏原肌動蛋白結合蛋白LCS13的免疫印跡結果圖；圖6為重組過敏原肌動蛋白結合蛋白D03的免疫印跡結果圖。
其中，在圖2中，M為蛋白分子量標準(218-6.8kD)；第1泳道，經IPTG誘導，在約14kD處有一新條帶，與第2泳道不經IPTG誘導明顯不同，純化後，得到一條帶；圖3中，M為蛋白分子量標準(97-14.4kD)；第1泳道，IPTG誘導表達的蛋白純化後，得到一條帶，胺基酸測序為預期蛋白。
具體實施例方式
實施例1、基因克隆a)按照Invitrogen公司的TRIZOL Reagent說明書，從豚草花粉中提取總RNA。
b)從SWISS-PROT及TrEMBL21(http//www.expasy.org)、NCBI的GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)等資料庫取得花粉過敏原序列數百條，以CLUSTAL W(http//www.ebi.ac.uk/clustalw/)進行序列對比和聚類，以聚類後各大簇中的主要亞簇的代表性過敏原之cDNA序列為基礎，設計引物Sg1p55′-ATGTCGTGGCAGGCGTACGT-3′；Sg1p35′-CCTCTCAACAA(T/G)CA(C/T)GTTGCATTGTCC-3′，以總RNA為模板，通過RT-PCR獲得肌動蛋白結合蛋白的5′基因片段，PCR過程中的退火溫度為45～72℃。其中所說的主要亞簇的代表性過敏原是指在聚類過程中優先聚類的過敏原，即以對齊後的順序排列聚類結果時，排在每一亞簇的最裡層的過敏原。
c)依據所得基因序列設計特異引物PD105′-GGAGCTGTGATTCGAGGGAAAAAGG-3′以及PD035′-CTGCATCAAGAAAACAGGCCAAGC-3′，採用cDNA末端快速擴增技術獲得肌動蛋白結合蛋白基因的3′基因片段。從而獲得全長cDNA基因序列。
2、載體構建及蛋白表達獲得全長cDNA基因序列，對開放閱讀框進行擴增，從而在序列的兩端引入EcoRI和PstI酶切位點，確定開放閱讀框(ORF)；與pET-44原核表達載體酶切、連接，使得插入片段的起始密碼子位於翻譯的起始密碼子位置，構建重組質粒。
3、轉化培養將構建的重組質粒，轉化BL21(DE3)菌株，然後選擇陽性克隆，用IPTG誘導其進行蛋白的表達。
調整基本LB培養基中的葡萄糖等的含量(0.1％-2％)以及培養溫度(15-38℃)，從而獲得目標蛋白的最大表達量及最佳的水溶性。
4、蛋白的純化通過CNBr活化的瓊脂糖為固定相的親和層析系統經透析等步驟獲得純的目標蛋白質。具體來說，其操作步驟如下。細菌經裂解液(15-100mM Tris-HCl，50-300mM NaCl，0.01％-0.5％Triton X 100)在室溫條件下完全裂解後，以10000-40000g/min的離心力進行離心，上清液即為上柱樣品。上樣完後，以1-5M尿素洗柱，之後以4-8M尿素洗脫蛋白。洗脫產物經8-4M、5-1M、0.1-3M、0.01-0M尿素+1×PBS透析共30-56小時，產物再次上親和柱，重複上述衝洗、洗脫及透析步驟，即為純的重組蛋白，定量後凍幹保存。純化後的蛋白上SDS-PAGE後，看到只有一單條帶。
5、重組蛋白的純化與鑑定經加入和不加入IPTG的重組過敏原肌動蛋白結合蛋白表達結果進行對比，發現在預期大小處有一濃的條帶為誘導表達產物。以親和柱進行蛋白純化，純化蛋白經胺基酸N末端測序，顯示與cDNA推測的胺基酸順序一致。表明該蛋白D106及D03即為重組蛋白肌動蛋白結合蛋白，如圖2及圖3所示。
6、重組蛋白肌動蛋白結合蛋白的過敏原性鑑定所得到的純化蛋白或未經純化的蛋白混合物，經SDS-PAGE分離後並轉印到硝酸纖維素膜或PVDF膜上，以花粉過敏病人血清中的特異性IgE為檢測一抗，兔抗人的anti-IgE為二抗，進行免疫印跡分析，結果顯示重組蛋白能不同程度地與病人血清中特異性IgE結合，表明其具有過敏原性，如圖4、圖5及圖6所示。
權利要求
1.重組過敏原肌動蛋白結合蛋白，其胺基酸序列如圖1所示。
2.權利要求1所述的重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的製備方法如下所示(1)從花粉中提取總RNA；(2)合成引物Sg1p55′-ATGTCGTGGCAGGCGTACGT-3′，Sg1p35′-CCTCTCAACAA(T/G)CA(C/T)GTTGCATTG TCC-3′；(3)以上述總RNA為模板，通過RT-PCR獲得重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的5′基因片段；(4)設計引物PD105′-GGAGCTGTGATTCGAGGGAAAAAGG-3′以及PD035′-CTGCATCAAGAAAA CAGGCCAAGC-3′；進行重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的5′基因片段的cDNA末端擴增，獲得重組過敏原肌動蛋白結合蛋白基因的3′基因片段，(5)利用5′及3′基因片段獲得全長基因；(6)將所得全長基因的開放閱讀框與原核表達載體酶切連接，構建重組質粒載體；(7)將所得重組質粒載體轉化宿主菌；(8)培養經轉化的宿主菌並誘導其表達重組過敏原肌動蛋白結合蛋白；(9)純化重組過敏原肌動蛋白結合蛋白。
3.根據權利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的製備方法，其特徵在於步驟(1)所述的花粉為葎草或/和豚草花粉。
4.根據權利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的製備方法，其特徵在於步驟(3)所述PCR的退火溫度為45～72℃。
5.根據權利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的製備方法，其特徵在於步驟(6)所述的原核表達載體為pET-44。
6.根據權利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的製備方法，其特徵在於步驟(6)所述酶切的酶切位點為EcoRI和PstI。
7.根據權利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的製備方法，其特徵在於步驟(7)所述的宿主菌為BL21(DE3)。
8.根據權利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的製備方法，其特徵在於步驟(8)是採用IPTG誘導經轉化的宿主菌表達重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的。
9.根據權利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結合蛋白的製備方法，其特徵在於步驟(9)是採用親和層析的方法對重組過敏原肌動蛋白結合蛋白進行純化。
全文摘要
本發明公開了重組過敏原肌動蛋白結合蛋白及其製備方法。本發明從葎草或/和豚草花粉中提取總RNA，以總RNA為模板，根據生物信息學數據設計通用簡併引物，通過RT－PCR獲得肌動蛋白結合蛋白的5′基因片段；再合成肌動蛋白結合蛋白基因特異性引物，採用cDNA末端快速擴增技術獲得肌動蛋白結合蛋白基因的3′基因片段；利用5′及3′基因片段從而獲得基因全長；然後將基因克隆入pET－44原核表達載體中，轉化BL21(DE3)，進行蛋白質的表達；接著採用親和層析的方法對目標蛋白進行純化，從而獲得純的肌動蛋白結合蛋白。本製備方法具有表達量高，生產穩定，成本低的特點。
文檔編號C07K14/415GK1687121SQ200410052290
公開日2005年10月26日 申請日期2004年11月19日 優先權日2004年11月19日
發明者何韶衡, 陶愛林 申請人:汕頭大學醫學院