含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品的製作方法
2023-10-25 01:36:22 2
專利名稱：含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品的製作方法
技術領域：
本發明涉及預防和治療用生物製品，尤其涉及用硫柳汞作防腐劑的生物製品。
背景技術：
目前很多生物製品採用硫柳汞作防腐劑，其目的在於殺滅在製造過程和/或使用過程中可能出現的偶爾的微生物，或抑制微生物在生物製品中的生長。硫柳汞作為一種抗微生物製劑，含有49.6％的汞，代謝後變成二乙基汞和硫基水楊酸鹽。採用硫柳汞作為防腐劑預防生物製品的細菌或其它微生物汙染始於20世紀30年代，至今已沿用70多年，根據報導，生物製品中的硫柳汞是接種生物製品後引起遲發性過敏反應和皮膚過敏反應的主要原因之一。但是隨著時間的推移，人們開始懷疑使用硫柳汞可能存在某些其它安全隱患。有文獻指出高含量的汞在關鍵的發育期是一種神經毒劑，並且研究表明含有硫柳汞的疫苗會使新生兒體內的汞含量增高(參見《生物製品快訊》，2000年第3期，摘自Vaccine Weekly，2000，May 24，p10)；還有文獻指出大劑量硫柳汞可引起神經和腎臟毒性。EPA(美國環境保護管理局)和WHO(世界衛生組織)分別作出關於汞的安全水平規定為0.7μg/kg體重/周和3.3μg/kg體重/周。據統計，在美國，嬰兒出生14周內接種3劑百白破疫苗(相當於含75μg二乙汞)、B肝疫苗(相當於含37.5μg二乙汞)、Hib(B型嗜血桿菌)疫苗(相當於含75μg二乙汞)，二乙汞總量高達187.5μg，超過了各機構界定的高限(參見《國外醫學，預防、診斷、治療用生物製品分冊》，2000，23(3)，pp105-107，譯自Wkly Epidem Rec 2000；75(2)12-16)。1999年國際疫苗顧問委員會組織的有關硫柳汞的會議認為嬰兒缺乏去除汞的能力。2002年的全球疫苗安全諮詢委員會第六次會議作出關於疫苗安全的結論中提及B肝疫苗中的硫柳汞可能與美國加利福尼亞州334名兒童急性淋巴細胞性白血病有關(參見《國外醫學》，2002年第3期第128-130頁，譯自Wkly Epidem Rec 2002；77(47)389-394)。但由於目前還沒有經過試驗的、有效的和安全的替代品，WHO仍然繼續推薦使用含有硫柳汞防腐劑的疫苗，如百白破、白喉破傷風、破傷風類毒素和某些品牌的B肝疫苗、B型嗜血桿菌疫苗。
FDA(美國食品藥品管理局)和EMEA(歐洲藥物管理局)要求企業在嬰幼兒使用的疫苗中減少或不用硫柳汞，如美國默克公司(Merck)和史克公司(SmithKline Beecham)的無硫柳汞B肝疫苗。其中史克公司的無硫柳汞B肝疫苗在生產的前期加入了硫柳汞，在後期為保證最終產品無硫柳汞進行了去除硫柳汞的處理(參見「史克」B肝疫苗的說明書)。但無硫柳汞的生物製品對生產環境的潔淨度和無菌操作要求很高，從而造成生產製作成本高；而另一方面還存在不含硫柳汞防腐劑在使用過程中微生物汙染的風險。尤其是在多劑劑型疫苗中，如果在疫苗中停止使用硫柳汞，則多劑疫苗瓶汙染的危險性增加，使兒童處於發生中毒性休克綜合症的危險之中(參見《國外醫學》，2002年第3期第128-130頁，譯自Wkly Epidem Rec2002；77(47)389-394)。WHO也強調，由於實施上的限制和價格昂貴，美國對新生嬰兒使用無硫柳汞疫苗的方案不適合於發展中國家(參見《國外醫學》，2000，23(3)譯自WklyEpidem Rec 2000；75(2)12-16)。
目前國內的含硫柳汞的生物製品中硫柳汞含量在50-100微克/毫升之間，如取消硫柳汞等防腐劑，現行生物製品將不能同時滿足較好的安全性和較低的製作成本的要求。
發明內容
本發明要解決的技術問題在於，在具有足夠的安全性的前提下，大幅度降低生物製品中的硫柳汞含量，利用現有的生產條件，提供較為廉價的生物製品。
本發明解決上述技術問題採用的技術方案是，提供一種含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，其中硫柳汞防腐劑的含量為0.5-10微克/毫升；優選值為1-5微克/毫升；最優選值為1-2微克/毫升。所述生物製品包括預防用生物製品，如B型肝炎疫苗，狂犬疫苗、百白破疫苗等，和治療用生物製品，如B肝免疫球蛋白，人狂犬免疫球蛋白等。所述的製劑可以單劑劑型或多劑劑型。
同現有技術相比較，採用本發明的含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，其硫柳汞含量僅為現行標準的幾十分之一，將大大降低對使用者特別是對嬰幼兒帶來的潛在危害，並且可利用現有設備和車間進行生產，製作成本低。
具體實施例方式
以下對本發明作進一步詳述。
為了選擇、確定生物製品中硫柳汞的合適濃度，我們選擇了B肝疫苗和美國Difco公司的大豆酪素消化培養基(符合USP《美國藥典》標準)這兩種最具有代表性的基質，加入不同含量硫柳汞來進行滅菌抑菌效果試驗，以便從中找出最佳的硫柳汞含量。B肝疫苗是目前世界上銷售量最大的疫苗，僅在中國，每年B肝疫苗的銷售量就達到1億支以上。而大豆酪素消化培養基則是中國和世界衛生組織GMP《藥品生產質量管理規範》驗證指南中規定的無菌分裝驗證用培養基。
一、超低濃度硫柳汞在B肝疫苗中的滅菌抑菌試驗1、試驗方法對不同濃度硫柳汞在B型肝炎疫苗中的滅菌抑菌效力進行挑戰性試驗測定，試驗方法參考美國藥典(USP 24 Microbiological Tests/Antimicrobial-Effectiveness Testing)和英國藥典(BP2000 1STGALLEY FILE86 C.EFFICACY OF Antimicrobial Preservation)。
2、試驗材料準備所述挑戰性試驗所用菌種、培養基、溶液和生物製品樣品1、黑麴黴；2、白色念珠菌；3、銅綠假單孢菌；4、葡萄球菌；5、胰酪腖大豆瓊脂平皿及斜面；6、含4％W/V(重量/體積)葡萄糖的沙氏瓊脂平皿及斜面；7、含有0.9％W/V氯化鈉和有利於分散的0.1％W/V蛋白腖的滅菌懸浮液；8、含有0.9％W/V氯化鈉和0.05％W/V聚山梨醇酯80的無菌懸浮液；9、滅菌3.7mM(毫摩爾)硼酸緩衝液；10、自製的無菌無硫柳汞酵母重組B肝疫苗；11、自製的1％W/V硫柳汞溶液。
3、試驗步驟進行含有不同濃度硫柳汞的B型肝炎疫苗的滅菌抑菌效力試驗，包括的步驟有1、準備硫柳汞含量分別為50、30、10、5、2、1、0.5微克/毫升的B型肝炎疫苗；2、製備試驗用菌體濃度為108個/毫升的銅綠假單孢菌、葡萄球菌、黑曲酶和白色念珠菌菌懸液。
3、含有不同濃度硫柳汞B肝疫苗對不同濃度微生物滅菌抑菌效力試驗3a、含有不同濃度硫柳汞(2、1、0.5、0微克/毫升)的B型肝炎疫苗對低濃度(101、102個/毫升)微生物的滅菌抑菌效力試驗將濃度為108個/毫升菌懸液稀釋為104個/毫升和103個/毫升；取每一硫柳汞濃度的B型肝炎疫苗8瓶(20毫升/瓶)，分別接種銅綠假單孢菌、葡萄球菌、黑曲酶和白色念珠菌的104個/毫升和103個/毫升菌懸液，使菌體終濃度達101個和102個/毫升。接種的菌懸液的體積不能超過產品體積的0.5％-1.0％，即0.1-0.2毫升。混合均勻。
接種好避光放置於室溫，定期進行無菌試驗。
無菌試驗方法按照中國《生物製品規程》2000年版所載無菌試驗方法進行。
試驗結果見表1-4。
3b、含有不同濃度硫柳汞(50、30、10、5、2、1、0.5、0微克/毫升)的B型肝炎疫苗對高濃度(105-106個/毫升)微生物的抑菌效力試驗取每一硫柳汞濃度的B型肝炎疫苗4瓶(20毫升/瓶)，分別接種銅綠假單孢菌、葡萄球菌，黑曲酶和白色念珠菌的108個/毫升菌懸液，使終濃度達105-106個/毫升。接種的菌懸液的體積不能超過產品體積的0.5％-1.0％，即0.1-0.2毫升。混合均勻。
接種好避光放置於室溫。分別於7、14、28天從每一試驗容器中取樣1毫升，適當稀釋，用膜過濾法進行活微生物計數。
膜過濾法活微生物計數用孔徑0.22微米的濾膜，將樣品轉移到兩個過濾器內，每個過濾器1.0毫升，立即過濾。銅綠假單孢菌、葡萄球菌和白色念珠菌用含0.9％W/V氯化鈉和0.1％W/V蛋白腖的滅菌懸浮液洗3次，每次100毫升。黑麴黴用含有0.9％W/V氯化鈉和0.05％W/V聚山梨醇酯80的無菌懸浮液洗3次，每次100毫升。將銅綠假單孢菌、葡萄球菌濾膜覆蓋在胰酪腖大豆瓊脂平皿表面，將黑曲酶、白色念珠菌濾膜覆蓋在沙氏瓊脂平皿表面。銅綠假單孢菌、葡萄球菌在30-35℃培養3-5天，白色念珠菌在20-25℃培養3-5天，黑曲酶在20-25℃培養5-7天，進行菌落計數。計算兩平皿菌落數的平均值，由其計算菌液濃度。
試驗結果見表5-8。
(注+代表陽性，表示有活菌生存；-代表陰性，表示無活菌生存)。
表(1)含有不同濃度硫柳汞B型肝炎疫苗對低濃度黑麴黴的滅菌抑菌效力
表(2)含有不同濃度硫柳汞B型肝炎疫苗對低濃度白色念珠菌的滅菌抑菌效力
表(3)含有不同濃度硫柳汞B型肝炎疫苗對低濃度銅綠假單孢菌的滅菌抑菌效力
表(4)含有不同濃度硫柳汞B型肝炎疫苗對低濃度葡萄球菌的滅菌抑菌效力
表(5)含有不同濃度硫柳汞B型肝炎疫苗對高濃度黑麴黴的滅菌抑菌效力
表(6)含有不同濃度硫柳汞B型肝炎疫苗對高濃度白色念珠菌的滅菌抑菌效力
表(7)含有不同濃度硫柳汞B型肝炎疫苗對高濃度銅綠假單孢菌的滅菌抑菌效力
表(8)含有不同濃度硫柳汞B型肝炎疫苗對高濃度葡萄球菌的滅菌抑菌效力
結論美國藥典第24版所規定的1A類注射劑微生物挑戰性試驗的合格標準為與開始試驗相比，細菌濃度在第7天要下降1個對數值以上，在第14天要下降3個對數值以上，第28天與第14天相比較，細菌濃度無增長；酵母菌和黴菌則在任何時候與試驗開始時相比較，菌體濃度無增長。
從以上試驗結論可見，含有50、30、10、5、2、1、0.5微克/毫升硫柳汞的B型肝炎疫苗均符合美國藥典對注射劑微生物挑戰試驗的標準，對101、102和105個/毫升濃度的黑麴黴、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌的滅菌抑菌效力都大大超過了美國藥典的要求。而根據中國和世界衛生組織的GMP(藥品質量管理規範)中的百級層流罩潔淨度要求和實際分裝時間計算，1毫升安瓿瓶裝生物製品在分裝的過程中，其微生物負荷(每支灌裝容器在灌裝過程中可能落入的微生物個數)為≤1.0個微生物/支成品。2毫升西林瓶為≤6.7個微生物/支成品，遠小於我們此次試驗加入菌的數量。因此，在生產環境中，0.5-10微克/毫升的超低含量硫柳汞已經能夠滿足滅菌抑菌的需要。
二、超低含量硫柳汞在培養基中的滅菌抑菌試驗1.簡介為進一步考察超低含量硫柳汞在其它生物製品中的滅菌抑菌作用，我們選用了營養成分最豐富，最適合於細菌生長的大豆酪素消化培養基作為基質，加入不同濃度的硫柳汞，然後用在十萬級與萬級的環境中長時間暴露已被微生物汙染的安瓿瓶來進行分裝，以此來考察超低含量硫柳汞的滅菌抑菌作用。由於大豆酪素消化培養基比任何生物製品都適合於細菌的生長，國內符合GMP標準的分裝車間的百級層流罩環境遠好於萬級與十萬級環境，因此如果含超低硫柳汞的大豆酪素消化培養基的試驗結果能夠達到生物製品規程對無菌分裝過程中微生物挑戰試驗的安全要求，則相同濃度的硫柳汞對於生物製品就更能起到令人滿意的滅菌抑菌作用。
試驗按照我國和世界衛生組織GMP驗證指南中建議的無菌分裝線驗證程序進行。
2.試劑和培養基2.1.硫柳汞Merck(默克)產，符合USP標準。
2.2.1％的硫柳汞溶液1克硫柳汞溶於100毫升硼酸緩衝液中，0.22μm濾膜除菌過濾。
2.3.大豆酪素消化培養基幹粉Difco產，符合USP標準。
3.步驟3.1.培養基的配製根據說明書要求，配製大豆酪素消化培養基，靈敏度測試合格後，分別加入終濃度為0、0.5、1、1.5、2、5微克/毫升的硫柳汞，以無硫柳汞培養基作為對照。對無硫柳汞的培養基進行無菌試驗培養基靈敏度試驗和無菌試驗，結果合格。
3.2.將滅菌安瓿暴露於萬級與十萬級區域將至少36000支滅菌安瓿分為12份，標為對照1、2；A樣品1、2；B樣品1、2；C樣品1、2；D樣品1、2；E樣品1、2。對照1和樣品1對稱地平置於萬級的分裝間地面，暴露半小時(因為在實際分裝時安瓿在分裝機百級層流罩下敞口時間通常不超過半小時)，期間分裝操作人員的活動如常，同時質檢部門進行環境監測，監測項目包括1)沉降菌；2)浮遊菌；3)塵埃粒子，採樣時間與安瓿暴露時間一致。將暴露後的安瓿運回層流罩待用。然後將對照2和樣品2平置於十萬級洗瓶間的地面，暴露半小時並同時進行環境監測，暴露期間分裝洗瓶人員活動如常。
操作人員的著裝按不同潔淨級別的相應規定執行，敞口安瓿在運送和存放過程中不疊放。
3.3.模擬分裝用對照1和對照2分裝無硫柳汞的培養基，0.5毫升/支，各3200支；用A樣品1、2分裝含0.5微克/毫升硫柳汞培養基0.5毫升/支，各3200支；用B樣品1、2分裝含1微克/毫升硫柳汞培養基0.5毫升/支，各3200支；用C樣品1、2分裝含1.5微克/毫升硫柳汞培養基0.5毫升/支，各3200支；用D樣品1、2分裝含2微克/毫升硫柳汞培養基0.5毫升/支，各3200支；用E樣品1、2分裝含5微克/毫升硫柳汞培養基0.5毫升/支，各3200支；。
3.4.培養和觀察取對照1和樣品1各14支，分成兩份，每份7支，一份每支加＜100個的枯草桿菌，置30-35℃培養7天，一份每支加＜100個的白色念珠菌，置20-25℃培養7天。將其餘安瓿上下顛倒，使培養基接觸整個安瓿內表面，安瓿置培養箱中，30-35℃培養7天，然後20-25℃培養7天，觀察微生物生長情況。
4.結果安瓿暴露期間環境監測結果和模擬灌封培養基的培養結果分別見表9和表10。不含硫柳汞的培養基在萬級和十萬級染菌率分別為0.5％和2.28％，加入0.5微克/毫升硫柳汞，染菌率為0％和0.06％，加入1.5微克/毫升硫柳汞，染菌率為0％和0.03％，其它含硫柳汞的樣品染菌率均為0％。
表(9)安瓿暴露區域的環境監測結果
合格標準參見「藥品生產質量管理規範」(1998年)表(10)無硫柳汞和含不同濃度硫柳汞的培養基模擬灌封后的培養結果比較
* 汙染率％＝生長安瓿總數×100/安瓿總數5.結論根據中國和世界衛生組織GMP驗證指南的相關規定，在進行無菌分裝線的驗證時，在培養基無菌分裝試驗中，分裝容器的汙染率應＜0.1％(分裝容器數量不少於3000支)。從本次培養基灌封試驗的結果來看，在萬級和十萬級區域內的無硫柳汞培養基對照的汙染率已大大超出上述標準，達到0.5％和2.25％，而含0.5-5微克/毫升硫柳汞培養基的汙染率卻低於0.06％，說明培養基中0.5-5微克/毫升硫柳汞就可以起到足夠的滅菌抑菌效果。因大豆酪素消化培養基是我國和世界衛生組織GMP指南中用於驗證無菌分裝線的培養基，含有豐富的營養，合適的pH值，在適宜的溫度下，比一般生物製品更適於微生物的生長。而無菌注射劑分裝機百級層流罩的中國GMP標準和WHO的GMP標準分別為浮遊菌＜5個/立方米(中國GMP標準)、＜1個/立方米(WHO的GMP標準)，平均沉降菌＜1個/皿·0.5小時，較萬級與十萬級區域要少2個數量級，而據此推算出來的1毫升安瓿和2毫升西林瓶的微生物負荷分別為≤1個和6.7個/支成品。因此可以推斷，在一般生物製品中，0.5-5微克/毫升硫柳汞就能起到足夠的滅菌抑菌效果。
上述的一般生物製品可以是單劑劑型，也可以是多劑劑型；可以包括百日咳疫苗，或白喉疫苗，或破傷風疫苗，或吸附霍亂類毒素疫苗，或I型腎綜合症出血熱疫苗，或II型腎綜合症出血熱疫苗，或狂犬疫苗，或B型肝炎疫苗等預防用生物製品，這些生物製品可以是單價疫苗，也可以是二價及多價疫苗，其中B型肝炎疫苗可以是酵母重組B型肝炎疫苗或者CHO(中國倉鼠卵巢細胞)重組B型肝炎疫苗；還可以包括注射用人免疫球蛋白，或注射用人B肝免疫球蛋白，或人狂犬病免疫球蛋白，或人破傷風免疫球蛋白，或治療用疫苗等治療用生物製品，其中治療用疫苗包括治療用B型肝炎疫苗。
以上所述之最佳實施例意在具體說明本發明的設計思路在確保安全性的前提下，利用現有生產工藝、設備和環境，大幅度降低生物製品中的硫柳汞含量。本發明之實施，並不限於以上最佳實施例所公開的方式，凡基於上述設計思路，進行簡單推演與替換，得到的具體的含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，都屬於本發明的實施。
權利要求
1.一種含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，其特徵在於其中硫柳汞防腐劑的含量為0.5-10微克/毫升。
2.如權利要求1所述的含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，其特徵在於其中硫柳汞防腐劑的含量的優選值為1-5微克/毫升。
3.如權利要求2所述的含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，其特徵在於其中硫柳汞防腐劑的含量的優選值為1-2微克/毫升。
4.如權利要求1至3任一所述的含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，其特徵在於所述生物製品是單劑劑型或多劑劑型。
5.如權利要求4所述的含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，其特徵在於所述生物製品包括預防用生物製品。
6.如權利要求5所述的含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，其特徵在於所述預防用生物製品包括百日咳疫苗，或白喉疫苗，或破傷風疫苗，或吸附霍亂類毒素疫苗，或I型腎綜合症出血熱疫苗，或II型腎綜合症出血熱疫苗，或狂犬疫苗，或B型肝炎疫苗。
7.如權利要求6所述的含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，其特徵在於所述B型肝炎疫苗包括酵母重組B型肝炎疫苗或者CHO重組B型肝炎疫苗。
8.如權利要求4所述的含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，其特徵在於所述生物製品包括治療用生物製品。
9.如權利要求8所述的含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，其特徵在於所述治療用生物製品包括注射用人免疫球蛋白，或注射用人B肝免疫球蛋白，或人狂犬病免疫球蛋白，或人破傷風免疫球蛋白，或治療用疫苗。
10.如權利要求9所述的含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，其特徵在於所述治療用疫苗包括治療用B型肝炎疫苗。
全文摘要
一種含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，其中硫柳汞防腐劑的含量為0.5－10微克/毫升。所述生物製品包括預防用生物製品和治療用生物製品，可以是單劑劑型或多劑劑型。同現有技術相比，本含超低濃度硫柳汞防腐劑的生物製品，大大降低了硫柳汞給使用者特別是嬰幼兒帶來的潛在危害，可利用現有工藝和設備進行生產，製作成本低。
文檔編號A01N59/16GK1562371SQ200410026719
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月30日 優先權日2004年3月30日
發明者汪恩浩, 朱徵宇, 張嵐, 羅翀, 鄭禮群, 王軍 申請人:深圳康泰生物製品股份有限公司