蛇足石杉內生真菌及其應用的製作方法

2023-10-24 18:27:42 2

專利名稱：蛇足石杉內生真菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，特別涉及蛇足石杉內生真菌及其應用。
背景技術：
石杉鹼甲作為新一代治療早老性痴呆的特效藥，市場前景非常可觀，其衍生物 ZT-1在歐洲EMEA的註冊認證正進入III期臨床，產品開發也在積極進行。目前，石 杉鹼甲主要來源於蛇足石杉(i/w/7e^/a ^rrato)全草。雖然蛇足石杉資源區域廣闊，但 分布星散，資源更新周期長，可供商業開採的天然資源比較少。經過多年的大量開採， 中國浙江、江西、福建等省的蛇足石杉資源幾近枯竭。湖南、廣西、四川等省的資源 也將在兩、三年內面臨枯竭的危險。這些地區作為蛇足石杉區域化優勢品種地位的逐 漸喪失，因而通過直接採收蛇足石杉天然資源已不能滿足市場對石杉鹼甲的需求。另 一方面，石杉鹼甲的化學合成因得率低、成本昂貴，也難以實現產業化。研究者們試 圖通過生物技術方法來獲得石杉鹼甲，因此，近年來這已成為人們關注的課題。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在於設計一種能夠通過微生物發酵產生石杉鹼甲類 似物。
本發明提供了一種蛇足石杉內生真菌，命名為內生枝頂孢黴(Arewom'"附
本發明所述的蛇足石杉內生真菌是從蕨類植物蛇足石杉(/m/^rz/a^rrato)植物 活體中採用內生真菌分離純化技術分離獲得的，經微生物分類學鑑定為內生枝頂孢黴 (爿cremom'ww e"cto如Www)。該菌株已經保藏，保藏日期為2006年11月13 R，保
藏號為CCTCCM206118，保藏單位為中國典型培養物保藏中心，地址湖北省武漢 市珞珈山武漢大學，郵編430072。
本發明所述的蛇足石杉內生真菌的固體培養特徵為
在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上28t:培養，最初氣生菌絲無色，漸變白 色；菌落圓形，白色，絨毛狀，邊緣不整齊，背面淡黃褐色。
本發明所述的蛇足石杉內生真菌的液體培養特徵為-
(1) 培養基PDA，搖瓶培養7天，培養溫度28士rC;
(2) 發酵培養特徵培養第l-2天，未見明顯生長現象；培養第3天，有少許
白色菌絲出現；培養第三天，形成直徑l-2mm白色菌絲球；培養第4天菌球直徑增 大到2-4mm;培養第5天，菌球數量增多；培養第6天，發酵液黏稠；培養第7天， 菌絲球集結。
本發明所述的蛇足石杉內生真菌的形態特徵為
1、 無性世代，菌絲分枝，平滑，有隔，粗1.2-1.5^;在年幼菌落的產孢區域， 菌絲側生較短的孢子梗，長1(M3^im;分生孢子卵形至梭形，無色， 3.53-5.44x1.16-1.32nm，鏈狀串生。
2、 有性世代，未發現
本發明所述的蛇足石杉內生真菌的18SrDNA鹼基序列為 TGCATTATACAGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTT
CGTGCACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCATACCCTTCACTG
complex formula see original document page 7
本發明的另一目的是提供了蛇石杉內生真菌的應用。
本發明所述的蛇足石杉內生真菌，經發酵可得石杉鹼甲類似化合物，其工藝歩驟
如下
菌種活化^種子培養 發酵培養_ 發酵產物細胞破碎 總
生物鹼提取~~ HPLC和LC-MS分析 石杉鹼甲類似化合物
其中，發酵原料為改良的馬鈴薯培養基(PDA)，發酵方式為液體搖瓶培養；菌 種活化採用試管斜面培養，培養基為馬鈴薯葡萄糖固體培養基(固體PDA);種子培
養為馬鈴薯葡萄糖液體培養基(液體PDA);發酵培養基為改良馬鈴薯葡萄糖液體培
養基(液體PDA);培養時間菌種斜面培養活化72小時，種子搖床培養72小時， 發酵培養7天；培養溫度:試管斜面培養溫度為28±1 °C ，種子搖床培養溫度為28±1 'C ， 發酵培養溫度為28±rc;發酵物提取發酵完畢，收集發酵產物，破碎細胞，用常
規提取方法提取總生物鹼，採用HPLC分離獲得石杉鹼甲類似化合物。
本發明所述的蛇足石杉內生真菌，通過菌株液體發酵能夠產生石杉鹼甲類似化合 物，是尋找治療早老性痴呆活性成分石杉鹼甲新資源的重要微生物，有較大的應用價 值。


圖1為本發明所述的蛇足石杉內生真菌的菌落形態
圖2為本發明所述的蛇足石杉內生真菌在100倍顯微鏡下觀察到的菌絲和孢子形
態
圖3為本發明所述的蛇足石杉內生真菌在電子顯微鏡下的菌絲形態
圖4為本發明所述的蛇足石杉內生真菌在電子顯微鏡下觀察到的孢子形態
圖5為本發明所述的蛇足石杉內生真菌生物鹼成分色譜圖(a)與石杉鹼甲標準
品色譜圖(b)的對照
圖6為本發明所述的蛇足石杉內生真菌生物鹼目標組分紫外吸收光譜圖(左)與
石杉鹼甲標準品紫外吸收光譜圖(右)的對照，兩者在Agilent化學工作站上用Match
程序進行匹配比較，匹配因子達994.568。
圖7為本發明所述的蛇足石杉內生真菌生物鹼目標組分質譜掃描圖(上)與石杉
鹼甲標準品質譜掃描圖(下)，兩者的準分子離子峰分別為243.10和243.11，可初步
認定兩者是同一組分。
具體實施例方式
實例1:
(1) 取本發明的蛇足石杉內生真菌菌種，在無菌條件下，用接種針挑取少量菌
絲，接入已滅菌的固體PDA培養基試管，於28士rC活化培養72小時；
(2) 取活化培養後的菌種，無菌條件下，轉接入已滅菌的液體PDA種子培養 基中，28il'C下140rpm搖床培養72小時，得種子；
(3) 配製好的改良PDA液體培養基，按20%裝料比，分裝入500ml的三角瓶 中，滅菌處理，冷卻備用。無菌條件下，按照10%的接種量接入2F09P03B種子，28±rC 下140rpm搖床培養7天；
(4) 發酵完畢，收集培養物，調PH值至4.0左右，破碎細胞，靜置過夜，調 PH值至10.0左右，離心收集上清液，調PH值至9.0，按l/2比例用氯仿萃取5次， 收集萃取液，8(TC回收氯仿，用甲醇溶解殘留物得到石杉鹼甲類似物。
(5) HPLC色譜條件如下色譜柱——Kromasil C18反相柱(4.6x250mmx5nm)， 流動相——CH3CN-KH2PO4(0.02mol/L) 10:90，流速——1.0mL/min，檢測波長310畫。
(6) LC-MS檢測色譜條件色譜柱——BDS Hypersil C18反相柱(2.1mm
xl00mmx3nm )， 流動相-H20(1% formic acid)- methanol ， 梯度洗脫-=
-[10.00:80.0]-[15.00:5.0〗，流速——0.2mL/min，進
樣量-0.5pL。質譜檢測參數-shealth flow rate(arb)~60， aux gas flow rate(arb) _5，
I spray voltage(kv) —5.00, capillary temp(。C) —275.00， capillary voltage(v) —31.00， tube lens offset(v卜l 0.00。
(7) 經以上HPLC和LC-MS分析，表明本發明的蛇足石杉內生真菌菌種液體 發酵能夠產生石杉鹼甲類似化合物。
權利要求
1.一種蛇足石杉內生真菌，其特徵在於它的命名為內生枝頂孢黴Acremoniumendophytium，其保藏登記號為CCTCC M 206118。
2. 根據權利要求l所述的一種蛇足石杉內生真菌，其特徵在於它的顯微形態為菌絲分枝，平滑，有隔，粗1.2-1.5pm;在年幼菌落的產孢區域，菌絲側生較短的孢 子梗，長10-13fim;分生孢子卵形至梭形，無色，3.53-5.44xU6-1.32pm，鏈狀串生。
3. 根據權利要求l所述的一種蛇足石杉內生真菌，其特徵在於它的固體培養為 在PDA培養基上28'C培養，最初氣生菌絲無色，漸變白色；菌落圓形，白色，絨毛 狀，邊緣不整齊，背面淡黃褐色。
4. 根據權利要求l所述的一種蛇足石杉內生真菌，其特徵在於它的液體培養為(1) 培養基PDA，搖瓶培養7天，培養溫度28士rC;或(2) 發酵培養特徵培養第1_2天，未見明顯生長現象；培養第3天，有少許 白色菌絲出現；培養第三天，形成直徑l-2mm白色菌絲球；培養第4天菌球直徑增 大到2-4mm;培養第5天，菌球數量增多；培養第6天，發酵液黏稠；培養第7天， 菌絲球集結。
5. 根據權利要求1所述的一種蛇足石杉內生真菌，其特徵在於它的基因組18S rDNA鹼基序列為AACTACCACCCAGGGCCGGATATAGCTGTCCAAATTCGAG 。
6. —種如權利要求1所述的蛇足石杉內生真菌在製備石杉鹼甲類似物中的應用， 其特徵在於該製備方法包括下列步驟-(1) 取本發明的蛇足石杉內生真菌菌種，在無菌條件下，用接種針挑取少量菌 絲，接入已滅菌的固體PDA培養基試管，於28土rC活化培養72小時；(2) 取活化培養後的菌種，無菌條件下，轉接入已滅菌的液體PDA種子培養 基中，28士rC下140rpm搖床培養72小時，得種子；(3) 配製好的改良PDA液體培養基，按20%裝料比，分裝入500ml的三角瓶 中，滅菌處理，冷卻備用。無菌條件下，按照10%的接種量接入種子，28士rC下140rpm 搖床培養7天；(4) 發酵完畢，收集培養物，調PH值至4.0左右，破碎細胞，靜置過夜，調PH值至10.0左右，離心收集上清液，調PH值至9.0，按l/2比例用氯仿萃取5次， 收集萃取液，8(TC回收氯仿，用甲醇溶解殘留物得到石杉鹼甲類似物。
全文摘要
本發明公開了一種蛇足石杉內生真菌，它是從蕨類植物蛇足石杉(huperzia serrata)植物活體中採用內生真菌分離純化技術分離獲得的，經微生物分類學鑑定為內生枝頂孢黴(Acremonium endophytium)。該菌株保藏號為CCTCC M 206118。本發明通過蛇足石杉內生真菌菌株液體發酵，產生了石杉鹼甲類似化合物，是尋找治療早老性痴呆活性成分石杉鹼甲新資源的重要微生物。
文檔編號C12N1/14GK101195804SQ200610119149
公開日2008年6月11日 申請日期2006年12月5日 優先權日2006年12月5日
發明者周吉燕, 王崢濤, 胡之璧, 黎萬奎 申請人:上海中醫藥大學