一種大白菜游離小孢子誘導培養基配方的製作方法

2023-10-24 00:41:47

本發明涉及一種大白菜游離小孢子誘導培養基配方，具體涉及一種可以大大提高大白菜游離小孢子誘導為胚性愈傷組織效率的培養基配方，屬於蔬菜培育高新技術領域。

背景技術：

大白菜（Brassica campestris ssp. pekinensis Lour.）屬於十字花科蕓薹屬蕓薹種大白菜亞種，是原產於我國的一種重要蔬菜作物。大白菜生態類型多樣，分布廣，產量高，耐貯運，供應期長，營養全面，食用方法多樣，且種植簡易、省工、成本低，在我國菜籃子中居不可替代的重要地位。我國大白菜的栽培面積和產量均為各種蔬菜作物之首，大白菜生產在蔬菜業中佔有主導地位。由於歷史、生態、生產和消費習慣差異的原因，我國北方地區是大白菜的主產區。

隨著人們生活質量的提高，對大白菜品質也提出了更高的要求，這就迫切需要育種工作者選育出更多的優質、抗病、豐產的優良品種。大白菜為異花授粉植物，具有顯著的雜種優勢，目前主要採用雜交育種方法進行大白菜新品種培育。傳統雜交育種方法育成了一系列大白菜品種，為蔬菜生產做出了卓越的貢獻。然而，大白菜雜交育種方法存在周期長、效率低等突出問題，育成一個穩定優良自交系一般需要6-8年，甚至更長時間，選育自交系非常費事、費工。近年來隨著人工成本的增加，常規育種的不足在實際工作中日漸明顯。因此，各國學者開始尋找育種的新途徑和新方法。

游離小孢子培養，是指直接從花蕾或花葯中獲得游離的、新鮮的小孢子群體進行培養，經由胚狀體或愈傷組織的誘導，再生出完整的單倍體植株，再經過人工或自然加倍，成為正常可育、純合的二倍體植株的技術。游離小孢子培養具有純單倍性、單細胞性和培養細胞數量大等特點，因此越來越受到育種工作者的青睞。該技術用於育種可在1-2年內獲得優良自交系和自交不親和純系，因此可大大縮短育種年限，從而提高育種效率。游離小孢子培養技術，目前比較成功的研究領域是禾本科和茄科，多種禾本科和茄科作物均驗證成功出高效的誘導和分化體系。十字花科蔬菜的游離小孢子培養技術也進行了一系列研究，對大白菜小孢子胚胎發生的機制、影響因素做了大量的研究探索，並取得了許多重要的研究進展。

我國的大白菜游離小孢子培養研究始於20世紀80年代後期。1988年，河南省農科院園藝研究所慄根義等在國內首次將大白菜游離小孢子誘導成胚和胚再生成功。隨後，河南省農科院將該技術應用於DH純系和親本材料的培養，成功育成了豫白菜7號，成為國內外首個大白菜游離小孢子培養方法培育成的新品種。之後，又先後選育出14個通過省級以上審（鑑）定的不同類型大白菜新品種，其中豫白菜7號在1994-1997年間推廣面積達到3.01萬hm2。2002年北京市蔬菜研究中心利用小孢子培養技術育成的橘紅心品種獲得國家發明專利。雖然大白菜游離小孢子培養育種技術取得了一系列研究進步，也培育出豫白菜7號、豫新3號、豫園5號、橘紅心等優良品種，但是大白菜游離小孢子培養技術並不完善，主要是大白菜游離小孢子誘導率不高，胚狀體成苗率低等問題一直沒有得到很好的解決。小孢子誘導率低將導致難以獲得足夠的選擇群體，直接限制了大白菜游離小孢子培養技術在育種上的應用。

培養基是游離小孢子培養的物質基礎，直接關係到小孢子的生長與分化，培養基組分對小孢子的刺激和啟動，是游離小孢子能否誘導成功的最關鍵的因素。培養基組分的合適配比，可顯著影響小孢子誘導效率，一些有機和無機添加物，可以顯著提高小孢子誘導效率。目前有研究發現，相對於禾本科和茄科作物，低離子濃度的基本培養基配方對十字花科小孢子誘導更加有利，胺基酸和活性炭可以顯著提高大白菜游離小孢子的誘導能力。因此，繼續優化組合基本培養基配比，發掘和試驗針對於提高大白菜游離小孢子成胚誘導能力的有機無機添加物，是建立大白菜游離小孢子高效誘導培養體系的關鍵。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種可以大大提高大白菜游離小孢子胚性愈傷組織的誘導效率、具有重要的應用價值的大白菜游離小孢子誘導培養基配方。

本發明的目的是通過以下技術方案解決的：

一種大白菜游離小孢子誘導培養基配方，其特徵在於：該培養基的配方如下：

KNO3 56-64mg/L，MgSO4∙7H2O 60-65mg/L，KH2PO4 65-70mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 200-250mg/L，Na2-EDTA 11-14mg/L，FeSO4∙7H2O 12-15mg/L，MnSO4∙4H2O 23-27mg/L，AgNO3 7-9mg/L，H3BO3 8.0-8.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5-9.5mg/L，KI 0.4-0.45mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.2-0.3mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02-0.03mg/L，CoCl2∙6H2O 0.02-0.03mg/L，L-穀氨醯胺 750-850mg/L，維生素B1 0.45-0.55mg/L，維生素B6 0.45-0.55mg/L，煙酸 4.5-5.5mg/L，葉酸 0.04-0.06mg/L，生物素 0.04-0.06mg/L，肌醇 90-110mg/L，甘氨酸 3.5-4.5mg/L，脯氨酸 17-23mg/L，絲氨酸 70-90mg/L，L-穀胱甘肽 27-33mg/L，甲基亞硝基脲 1.2-1.8g/L，蔗糖 120-140g/L，植物凝膠 3.0-3.5g/L，6-BA 0.2-0.3mg/L，復酞核酸 0.15-0.25mg/L，水解蛋白 0.5-0.7g/L，秋水仙鹼 0.06-0.08mg/L，活性炭 0.04-0.06g/L，植物硫化激動素PSK-α 30-40pmol/L，pH 5.6-5.8。

本發明相比現有技術有如下優點：

本發明根據禾本科和茄科小孢子誘導培養基配方，針對於大白菜游離小孢子的孢子體發育特性，繼續優化並組合基本培養基配比，低離子濃度基本培養基的組配，有利於大白菜游離小孢子的誘導；採用低含量的植物凝膠，使配製成的培養基半固體化，對大白菜游離小孢子的誘導更有利；發掘和試驗針對於提高大白菜游離小孢子成胚誘導能力的有機添加物和無機添加物，水解蛋白、L-穀氨醯胺、葉酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、L-穀胱甘肽、甲基亞硝基脲、秋水仙鹼、活性炭、植物硫化激動素PSK-α等物質的合適濃度的添加，均不同程度的提高了大白菜游離小孢子的誘導率；6-BA和復酞核酸的復配，顯著提高了大白菜游離小孢子的誘導能力。

本發明所提供的大白菜游離小孢子誘導培養基，是在現有研究發現基礎之上進一步創造性改良的成果，是經過大量單因子、多因子試驗所篩選的最優組合，我們進行了大量的實驗研究亦得出本發明的組分配比是最優的。採用本發明所提供的培養基可以大大提高游離大白菜小孢子胚性愈傷組織的誘導效率，因此具有較高的產業推廣價值。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明。

一種大白菜游離小孢子誘導培養基配方，其特徵在於：該培養基的配方如下：

KNO3 56-64mg/L，MgSO4∙7H2O 60-65mg/L，KH2PO4 65-70mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 200-250mg/L，Na2-EDTA 11-14mg/L，FeSO4∙7H2O 12-15mg/L，MnSO4∙4H2O 23-27mg/L，AgNO3 7-9mg/L，H3BO3 8.0-8.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5-9.5mg/L，KI 0.4-0.45mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.2-0.3mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02-0.03mg/L，CoCl2∙6H2O 0.02-0.03mg/L，L-穀氨醯胺 750-850mg/L，維生素B1 0.45-0.55mg/L，維生素B6 0.45-0.55mg/L，煙酸 4.5-5.5mg/L，葉酸 0.04-0.06mg/L，生物素 0.04-0.06mg/L，肌醇 90-110mg/L，甘氨酸 3.5-4.5mg/L，脯氨酸 17-23mg/L，絲氨酸 70-90mg/L，L-穀胱甘肽 27-33mg/L，甲基亞硝基脲 1.2-1.8g/L，蔗糖 120-140g/L，植物凝膠 3.0-3.5g/L，6-BA 0.2-0.3mg/L，復酞核酸 0.15-0.25mg/L，水解蛋白 0.5-0.7g/L，秋水仙鹼 0.06-0.08mg/L，活性炭 0.04-0.06g/L，植物硫化激動素PSK-α 30-40pmol/L，pH 5.6-5.8。

在4-5月份的大白菜初花期，採取2.2mm-3.0mm的花蕾帶回實驗室，置於4℃冰箱內低溫預處理1-2d。接種前，將花蕾轉移入超淨工作檯無菌燒杯中，倒入70%酒精進行表面消毒，浸泡1min後倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然後用無菌水衝洗三次以充分除去氯化汞殘毒。瀝乾水分後，在B5液體洗滌培養基中用平頭玻棒碾壓花蕾，擠出小孢子。懸浮液經30μm無菌微孔紗布過濾，收集濾液於10ml離心管，1000rpm下離心3min，沉澱物加5mL B5洗滌培養基，搖勻，800rpm下離心2min，重複兩次，所得沉澱物即為大白菜游離小孢子。將大白菜游離小孢子轉移入本發明的大白菜游離小孢子誘導培養基中，33℃熱激處理24h後轉入25℃暗培養直至胚性愈傷組織形成。

實施例

配製本發明所述的一種大白菜游離小孢子誘導培養基，培養基配方具體如下：

KNO3 60mg/L，MgSO4∙7H2O 62.5mg/L，KH2PO4 67.5mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 225mg/L，Na2-EDTA 12.5mg/L，FeSO4∙7H2O 13.5mg/L，MnSO4∙4H2O 25mg/L，AgNO3 8mg/L，H3BO3 8.25mg/L，ZnSO4∙7H2O 9.0mg/L，KI 0.425mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.25mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl2∙6H2O 0.025mg/L，L-穀氨醯胺 800mg/L，維生素B1 0.5mg/L，維生素B6 0.5mg/L，煙酸 5mg/L，葉酸 0.05mg/L，生物素 0.05mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 4mg/L，脯氨酸 20mg/L，絲氨酸 80mg/L，L-穀胱甘肽 30mg/L，甲基亞硝基脲 1.5g/L，蔗糖 130g/L，植物凝膠 3.25g/L，6-BA 0.25mg/L，復酞核酸 0.2mg/L，水解蛋白 0.6g/L，秋水仙鹼 0.07mg/L，活性炭 0.05g/L，植物硫化激動素PSK-α 35pmol/L，pH 5.7。

2015年4月份在大白菜品種魯白17號和全勝的初花期，採取2.2mm-3.0mm的魯白17號和全勝花蕾帶回實驗室，置於4℃冰箱內低溫預處理2d。接種前，將花蕾轉移入超淨工作檯無菌燒杯中，倒入70%酒精進行表面消毒，浸泡1min後倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然後用無菌水衝洗三次以充分除去氯化汞殘毒。瀝乾水分後，在B5液體洗滌培養基中用平頭玻棒碾壓花蕾，擠出小孢子。懸浮液經30μm無菌微孔紗布過濾，收集濾液於10ml離心管，1000rpm下離心3min，沉澱物加5mL B5洗滌培養基，搖勻，800rpm下離心2min，重複兩次，所得沉澱物即為大白菜游離小孢子。將魯白17號和全勝的游離小孢子分別轉移入本發明的大白菜游離小孢子誘導培養基中，33℃熱激處理24h後轉入25℃暗培養，胚性愈傷組織形成後分別統計魯白17號和全勝的小孢子愈傷組織誘導率。小孢子愈傷組織誘導率=愈傷塊數/接種花蕾總數×100%。

為了比較本發明所提供的大白菜游離小孢子誘導培養基與前人採用的培養基對大白菜游離小孢子胚性愈傷組織誘導效率的差異，我們另外選擇了2種前人採用過的大白菜游離小孢子誘導培養基，試驗品種亦採用魯白17號和全勝，游離小孢子的分離方法、組培操作方法、培養方法均相同，胚性愈傷組織形成後分別統計魯白17號和全勝的小孢子在該2種培養基內的小孢子愈傷組織誘導率。

其它2種大白菜游離小孢子誘導培養基配方為：

NLH基本培養基+30mg/L穀胱甘肽+100mg/L絲氨酸+800mg/L谷醯胺+0.4mg/L 6-BA，pH為5.8（對比文件來自於韓陽等《大白菜小孢子培養影響因素研究》）；

NLN-13培養基+0.1g/L活性炭，pH為5.8（對比文件來自於孫丹等《大白菜小袍子培養再生成株及其差異性初步分析》）。

培養基對比實驗

將採用本發明所提供的培養基誘導魯白17號和全勝游離小孢子統計所得小孢子愈傷組織誘導率與對比實施例的魯白17號和全勝小孢子愈傷組織誘導率進行比較，比較的結果如下表1所示。

由表1可以發現，本發明所提供的大白菜游離小孢子誘導培養基對大白菜品種魯白17號和全勝的小孢子愈傷組織誘導率平均值達到了30.2個/蕾，而前人所採用的兩種培養基對大白菜品種魯白17號和全勝的小孢子愈傷組織誘導率平均值分別僅為9.2個/蕾和13.0個/蕾，可以發現本發明所提供的大白菜游離小孢子誘導培養基對大白菜游離小孢子的誘導能力做出了顯著的提升。

本發明所提供的大白菜游離小孢子誘導培養基，是在現有研究發現基礎之上進一步創造性改良的成果，是經過大量單因子、多因子試驗所篩選的最優組合，我們進行了大量的實驗研究亦得出本發明的組分配比是最優的。採用本發明所提供的培養基可以大大提高游離大白菜小孢子胚性愈傷組織的誘導效率，因此具有較高的產業推廣價值。

以上實施例僅為說明本發明的技術思想，不能以此限定本發明的保護範圍，凡是按照本發明提出的技術思想，在技術方案基礎上所做的任何改動，均落入本發明保護範圍之內；本發明未涉及的技術均可通過現有技術加以實現。