一種用於癌症檢測的標誌物及應用的製作方法

2023-10-24 01:15:57 2

專利名稱：一種用於癌症檢測的標誌物及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種癌症檢測的分子標識和技術方法，在醫學遺傳學以及臨床診斷領域具有廣泛的應用前景。
背景技術：
1.癌症分子標記
人體正常細胞經過一系列基因突變，最終擺脫細胞正常生長調控而癌變。這些突變涉及到染色體易位、基因擴增、基因缺失、點突變等。癌症組織遺傳學改變，最終會導致癌症個體中某些基因mRNA和蛋白的差異表達。因此儘管對於這些遺傳學改變功能不明確，我們仍可通過基因的mRNA和蛋白表達水平的差異來獲得癌症組織的生物學信息。癌症分子標記物是在癌症患者的血液，尿液，淋巴液，唾液，腫瘤實體或者其他組織中特異表達的基因產物(McShane and Altman 2005)。癌症標記物可能由癌細胞產生,也可能由正常細胞產生。雖然大多數的癌症分子標記物的最終產物是蛋白質，但是DNA，mRNA和蛋白分子的變化都可以用作癌症分子標記的檢測。在臨床上癌症分子標記物常常用於癌症的早期診斷，中期分期以及輔助治療。到目前為止，有超過20種的癌症標記物用於臨床。常見的有,Alpha-fetoprotein (AFP)檢測肝癌和精原細胞瘤，BRAF mutation V600E檢測結腸癌，CA15-3/CA27. 29檢測乳腺癌，CA-125檢測卵巢癌，Calcitonin檢測前列腺癌，Cytokeratin fragments 21-1 檢測肺癌,Fibrin/fibrinogen 檢測膀胱癌，CD20 檢測淋巴ヲB5寺。現階段，癌症分子標記的局限在於
I)有的時候非癌症的內 環境也可能產生癌症分子標記物，對診斷結果造成影響。2)並不是每ー個患同種類型癌症的個體都伴隨該類型癌症分子標記物的高水平表達。3)某些類型的癌症缺少相應的分子標記物。4)至今沒有一種癌症分子標記物可以檢測所有類型的癌症。2. RT-PCR 檢測 mRNA 表達
RT-PCR可以精確地反映受檢基因在癌症組織中的mRNA表達水平，從而能精確地評估癌症的相關信息。RT-PCR目前已廣泛應用於臨床實踐。相對於蛋白水平的免疫印跡(Western blot)而言，RT-PCR體現出的是體內相關基因的mRNA表達量的信息，檢測靈敏度和準確性都比較高，並且所需時間和成本較低。3.免疫印跡(Western blot)測定蛋白表達
免疫印跡(Western Blot)中，經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。隨後固相載體上的蛋白質作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術廣泛應用於檢測癌症中特定蛋白水平的表達。
4.免疫突光(Immunofluorescence)檢測蛋白表達
為了檢測癌症組織中蛋白表達水平和表達部位，目前臨床上可以採用免疫螢光的技木。免疫螢光是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過螢光標記的ニ抗顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量分析。

發明內容
本發明的目的是提供ー種新型的用於癌症檢測的標誌物；
本發明的另ー個目的是提供一種用於癌症檢測的試劑組合。本發明首次發現是ー種新型的內層核膜蛋白(見圖1)，在多數正常組織中不表達，在早期腫瘤中低表達，隨著腫瘤的惡化M/rむ 一直保持高水平的表達。而在腫瘤晚期，Nurim不僅存在於細胞核膜，在細胞質和細胞核中也可以觀察到的表達。Nurim對維持細胞內層核膜的完整性起著非常重要的作用。同時，幹渉可以大大提高UV誘導的細胞凋亡，提示M/ri 可能具有抑制凋亡的功能(見圖2)。據此，為實現上述目的，本發明提供一種用於癌症檢測的標誌物，其為Nurim基因的mRNA或其表達產物。基因有三個轉錄本,包括Nurim a, Nurim b和Nurim c,其核酸序列如SEQID No. 5^7 所示。相應的也存在三個蛋白表達產物,包括Nurim a,Nurim b和Nurim c,其胺基酸序列如SEQ ID No. 8 10所示。根據上述的標誌物可以開發出癌症的檢測相關試劑，包括mRNA檢測試劑、免疫印跡試劑以及組織免疫熒 光試劑等等。進ー步本發明提供用於癌症檢測的試劑組合，其包括特異性檢測M/ri基因mRNA的試劑或特異性檢測Nurim基因表達產物的試劑。所述特異性檢測基因mRNA的試劑至少包括不同轉錄本mRNA之一的RT-PCR引物。進ー步還可包括RT-PCR相關試劑，例如RNA提取試劑、反轉錄試劑、PCR試劑
坐坐寸寸o所述特異性檢測Nurim基因表達產物的試劑包括至少ー種與Nurim基因表達產物特異性結合的抗體。此外還包括與所述特異性抗體結合的酶標ニ抗或者與所述特異性抗體結合的突光標記ニ抗。具體地，RT-PCR檢測、免疫印跡檢測以及免疫螢光檢測的方法如下
一、RT-PCR檢測Nurim的不同轉錄本
提取病例腫瘤組織總RNA，然後逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板擴增M/ri 的不同轉錄本片段。同時擴增人類的///び(基因作為陽性對照，並取適量正常組織或者癌旁組織作為陰性對照。擴增結束後，可以取5yL樣品用於電泳檢測。該方法用以檢測不同轉錄本的轉錄情況。 ニ、免疫印跡檢測Nurim的蛋白表達
提取待檢測病例的總蛋白質，蛋白變性準備上樣。Wurim的三個蛋白都比較小，所以我們採用濃度是15%的SDS-PAGE凝膠電泳。半乾轉移法將蛋白質轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉I小吋，ー抗4°C孵育過夜，再與HRP標記ニ抗結合。最後用ECL系統顯色觀察。同時檢測人類的Actin蛋白作為陽性對照，並取適量正常組織或者癌旁組織作為陰性對照。該方法用以檢測Nuritn的蛋白表達情況。三、免疫螢光檢測的蛋白表達和細胞定位
製備冰凍切片，井置於甲醇中4°C固定20分鐘。正常羊血清室溫封閉I小吋。按照I比100的比例加入—抗，4°C孵育過夜。陰性對照中，加入正常的兔血清。第二天,按照I比100的比例加入Cy3標記的ニ抗。Hoechest 33258室溫下染核3分鐘。封片以後用雷射掃描共聚焦顯微鏡觀察並照相。取適量正常組織或者癌旁組織平行實驗作為陰性對照。該方法用以檢測在癌症病例中的蛋白表達和細胞定位。本發明與已有的方法相比優點
I) Nurim是ー種新型的的癌症診斷分子標記，可以檢測多種不同的類型的惡性腫瘤，具體涉及到皮膚癌，肝癌，肺癌，腎透明細胞癌，食道癌，胃癌，腸癌，膀胱癌，睪丸癌，宮頸癌，卵巣癌，甲狀腺癌，前列腺癌，胰腺癌，乳腺癌。而大多數傳統的癌症分子標記只能檢測其中的一種或者幾種腫瘤。2) Nurim的表達和腫瘤的惡化密切相關，隨著腫瘤惡化，M/ri 的表達量增加。該方法檢測結果可以反映腫瘤惡化程度。3)該方法快速方便，準確率高，對臨床診斷有較高的參考價值。


圖1的三個轉錄本在HeLa細胞中的亞細胞定位,a和b定位在細胞核膜，c核質均一表達。圖2在UV處理下，幹涉以後細胞凋亡增加。

圖3 RT-PCR檢測到在精原細胞瘤中Nurim表達，在正常睪丸中無表達，其中I為正常睪丸，2為睪丸精原細胞瘤。圖4免疫印跡檢測到在肺癌，肝癌，甲狀腺癌，食道癌，結腸癌，膀胱癌，睪丸癌和卵巢癌中Nurim有表達，在胃癌癌旁組織中無表達。圖5免疫螢光檢測到三期肺癌組織中Nurim有較高表達，正常肺組織中無表達。
具體實施例方式下面結合具體的實施例來進ー步闡述本發明，但本發明並不限於本實施例。下述實施例中，如果無特殊說明，均為常規方法。實施例1 RT-PCR檢測睪丸精原細胞瘤 一、總RNA提取
I)立即取50mg新鮮腫瘤組織，置於研砵中，小心倒入適量液氮，迅速研磨，直至組織成白色粉末狀為止。2)加入ImL的Trizol (購於Invitrogen公司),混合均勻，室溫裂解5分鐘。3)加入0. 2mL氯仿，混合均勻，12000rpm離心15分鐘，取上層水相於ー個新的離心管。4)加入0. 5mL異丙醇，混合均勻，12000rpm離心15分鐘，丟棄上清，沉澱物為RNA。5)用新鮮配置的75%的こ醇洗滌，12000rpm離心15分鐘，棄上清。
6)加入20-25 U L的去離子水，沉澱溶解後測OD計算RNA濃度。ニ、cDNA模板的製備。逆轉錄加樣體系見表I。37°C，反應2小時。表1.逆轉錄加樣體系
權利要求
1.一種用於癌症檢測的標誌物,其為Μ/ri 基因的mRNA或其表達產物。
2.根據權利要求1所述的標誌物，其特徵在於，所述Μ/ri 基因的mRNA為Nurima,Nurim b 或 Nurim C，其核苷酸序列分別為 SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7 所示的序列。
3.根據權利要求1所述的標誌物,其特徵在於,所述Μ/ri 基因的表達產物為Nurima,Nurim b 或 Nurim c 其胺基酸序列分別為 SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 10。
4.權利要求1或2所述的標誌物在製備癌症診斷試劑中的應用。
5.用於癌症檢測的試劑，其包括特異性檢測基因mRNA的試劑或特異性檢測Nurim基因表達產物的試劑。
6.根據權利要求5所述的試劑，其特徵在於，所述特異性檢測基因mRNA的試劑至少包括Μ/ri 不同轉錄本mRNA之一的RT-PCR引物。
7.根據權利要求6所述的試劑，其特徵在於，其還包括RT-PCR試劑。
8.根據權利要求5所述的試劑，其特徵在於，所述特異性檢測基因表達產物的試劑包括至少一種與基因表達產物特異性結合的抗體。
9.根據權利要求8所述的試劑，其特徵在於，其還包括與所述特異性抗體結合的酶標二抗。
10.根據權利要求8所述的試劑，其特徵在於，其還包括與所述特異性抗體結合的螢光標記二抗。
全文摘要
本發明公開了一種用於癌症檢測的標誌物及應用，所述標誌物為Nurim基因的mRNA或其表達產物，所述試劑包括特異性檢測Nurim基因mRNA的試劑或特異性檢測Nurim基因表達產物的試劑。通過RT-PCR檢測Nurim的不同轉錄本或者免疫印跡或免疫螢光檢測Nurim的蛋白表達可以診斷病人是否患有癌症。本發明標誌物具有通用性，可以檢測多種不同的類型的惡性腫瘤，同時根據mRNA或表達產物的量能夠反映腫瘤惡化程度，利用本發明分子標誌物或檢測試劑可以方便快速地診斷癌症，準確率高，對臨床診斷有較高的參考價值。
文檔編號C12Q1/68GK103045737SQ20121055574
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年12月19日
發明者周榮家, 程漢華, 陳恆玲 申請人:武漢大學