基於癌抑制基因wt1的產物的癌抗原的製作方法

2023-10-23 20:30:17 4

專利名稱：基於癌抑制基因wt1的產物的癌抗原的製作方法
技術領域：
本發明涉及Wilms腫瘤的癌抑制基因WTl的產物為基礎的癌抗原。該癌抗原作為針對白血病、骨髓異形成綜合症、多發性骨髓瘤、惡性淋巴瘤等血癌或實體瘤，例如胃癌、大腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細胞瘤、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等以及WTl表達的所有癌的抗癌疫苗上有用的。
背景技術：
用於排除異物的免疫機構一般包括與識別抗原作為抗原提示細胞作用的巨噬細胞、識別該巨噬細胞的抗原提示產生各種淋巴因子使其他T-細胞等活化的輔助T細胞、通過該淋巴因子的作用分化成抗體產生細胞的B淋巴細胞等有關的體液免疫以及接受抗原提示分化成的殺傷T細胞攻擊破壞靶細胞的細胞免疫。現在，認為癌的免疫主要是與殺傷T細胞有關的細胞性免疫引起的。在殺傷T細胞引起的癌免疫中，識別以主要組織適合抗原(Major Histocompatibility Complex，MHC)第 I類與癌抗原形成的複合體形式提示的癌抗原的前體T細胞分化增殖生成的殺傷T細胞攻擊破壞癌細胞。這時，癌細胞在其細胞表面提示MHC第I類抗原與癌抗原形成的複合體，它成為殺傷 T 細胞的靶細胞(Cur. Opin, Immunol. ,5,709,1993 ；Cur. Opin, Immunol. ,5,719, 1993 ；Cell,82,13，1995 ；Immunol. Rev,146，167，1995)。作為靶細胞的癌細胞上通過MHC第I類抗原提示的上述癌抗原可以認為是癌細胞內合成的抗原蛋白質被細胞內蛋白酶處理生成的約8 12個胺基酸構成的肽(Cur. Opin, Immunol. ,5,709,1993 ；Cur.Opin. Immunol. , 5, 719,1993 ；Cell,82,13, 1995 ；Immunol. Rev. ，146，167，1995)。現在，對於各種癌進行了抗原蛋白質的檢索，證明是癌特異抗原的物質較少。Wilms腫瘤的癌抑制基因WTl (WTl基因)是根據對Wilms腫瘤、無紅彩、泌尿生殖器異常、精神發達遲滯等並發的WAGR綜合症的解析，作為Wilms腫瘤的一種原因基因從染色體 11ρ13 分離出的物質(Gessler, M.等，Nature, Vol.343，p. 774-778 (1990))，基因組 DNA通過約501Λ由10個外顯子構成，其cDNA為約31Λ。由cDNA推測出的胺基酸序列如序列號 1 所示(Mol. Cell. Biol.，11，1707，1991)。WTl基因在人白血病中高度表達，用WTl反義低聚物(antisense oligomer)處理白血病細胞能夠抑制其細胞增殖(特開平9-104627號公報)等提示WTl基因可以促進白血病細胞的增殖。而且，WTl基因在胃癌、大腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等實體瘤中高度表達(特願平9-191635)，判斷出WTl基因是白血病和實體瘤中新的腫瘤標識物。但是，尚未證明WTl基因表達產物是作為癌疫苗有用的癌特異抗原。
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發明公開因此，本發明確認了 WTl基因表達產物作為癌抗原的可能性，提供了一種新型癌抗原。本發明人為了解決上述問題進行了各種研究，結果合成了 WTl基因表達產物的胺基酸序列中含有被預測在小鼠和人的I類MHC和II類MHC的結合中作為錨定胺基酸 (anchor amino acid)起作用的至少1個胺基酸的連續7 30個胺基酸構成的多肽，確認這些肽與MHC蛋白質結合，同時確認與I類MHC抗原結合時誘導殺傷T細胞，而且對靶細胞具有殺細胞效果，從而完成了本發明。因此，本發明提供小鼠WTl表達產物或含有其一部分的癌抗原。在優選的方式中， 本發明提供以與WTl的CDNA對應的序列號1所示的胺基酸序列中包括用於與MHC抗原結合的錨定胺基酸在內的6 30個胺基酸構成的肽作為活性成分的癌抗原。而且本發明提供以與人WTl的cDNA對應的序列號2所示的胺基酸序列中包括用於與MHC抗原結合的錨定胺基酸在內的7 30個胺基酸構成的肽作為活性成分的癌抗原。本發明還提供含有上述癌抗原的癌疫苗。附圖的簡單說明

圖1表示實施例1中用DbU6肽免疫的細胞與非免疫細胞在流式細胞測量法中 ⑶4+細胞與⑶8+細胞的比例。圖2是比較實施例2中用Db126肽免疫的細胞對於用Db126肽脈衝的靶細胞和未脈衝的靶細胞的殺細胞作用。圖3是與圖2含義相同的圖。圖4中A表示實施例3中使用Db126肽誘導的CTL對於用Db126肽脈衝的T2細胞的殺細胞效果，B表示實施例3中使用WH187肽誘導的CTL對於用WH187肽脈衝的T2細胞的殺細胞效果。圖5表示由Db126肽誘導的CTL的表面標識物通過FACS解析的結果(⑶19細胞以及CD3細胞)。圖6表示⑶4細胞以及⑶8細胞與圖5同樣的圖。圖7表示⑶56細胞與圖5同樣的圖。圖8表示WH187肽誘導的CTL的表面標識物通過FACS解析的結果(⑶19細胞和 CD3細胞)。圖9表示CD4細胞和CD8細胞與圖8同樣的圖。圖10表示⑶56細胞與圖8同樣的圖。圖11表示抗HLA-A2. 1抗體對Db126肽特異性CTL引起的對於用Db126肽脈衝的 T2細胞的特異性細胞溶解的影響。圖12是比較Db126肽特異性CTL對於表達WTl的靶細胞或不表達WTl的靶細胞的細胞溶解活性。a表示E T比為7. 5 1的情況下的結果，b表示E T比為15 1的情況下的結果。圖13是比較Db126肽特異性CTL對於先天表達WTl的腫瘤細胞(FBL3)或不表達 WTl的腫瘤細胞(RMA)的細胞溶解效果。圖14是比較Db126肽特異性CTL對於用WTl基因胞質轉移的細胞以及未進行胞質轉移的同一細胞的細胞溶解效果。圖15表示I類抗H-2抗體對Db126肽特異性CTL的細胞毒性的影響。圖16表示使用DbU6肽作為疫苗使用，免疫小鼠時的體內免疫效果。圖17表示將表達WTl的質粒作為DNA疫苗投給小鼠時的免疫效果。圖18是圖17的對照，是表示投給不表達WTl的質粒時不產生免疫效果的圖。發明的實施方式本發明中，作為設計癌抗原肽時的基礎，選擇小鼠I類MHC的Kb和Db，以及人HLA 的A*0201，選擇預測與它們具有高親和性的肽。根據Immunogenetics Vol. 41, p. 178-228(1995)的記載，預測與 Kb 結合的錨定胺基酸是5號的Phe和Tyr以及8號的Leu和Met等，另外預測與Db結合的錨定胺基酸是5 號的Asn以及9號的Met和Ile等。另夕卜，已知癌細胞表面上I類MHC提示的癌抗原肽的大小為約8 12個。因此， 本發明的癌抗原肽是序列號1所示WTl基因產物的胺基酸序列中包括錨定胺基酸在內的連續7 30個胺基酸構成的肽。胺基酸的數目優選為8 12個，例如8或9個。在本發明中，作為其具體例子，I類MHC與Kb結合的肽使用由8個胺基酸構成的下述肽Kb 45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu (序列號 3)Kb 330 Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu (序列號 4)I類MHC與Db結合的肽使用由9個胺基酸構成的下述肽Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列號 5)Db 221 Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met (序列號 6)Db 235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (序列號 7)上述序列中帶下劃線的胺基酸是被預測作為錨發揮作用的胺基酸。其次，使用未提示抗原肽(empty)但表達Kb以及Db的細胞線測定這些肽中Kb45以及Kb330與I類MHC的Kb的結合性，Db 126、Db221和Db235與I類MHC的Db的結合性。也就是說，在下培養RMA-S，使I類MHC高度表達，在37°C下培養該培養細胞與被測肽溶液1小時。這樣，不與肽結合的MHC分子變得不穩定，從細胞表面消失，僅殘留與肽結合的I類MHC分子。其次，用識別I類MHC(Kb，Db)的螢光標識單克隆抗體給RMA-S 細胞染色。最後，通過FACS解析，由每個細胞的平均螢光量計算結合解離常數(Immimol. Lett. ，47，1，1995)。結果，得到了下述結果。
Kb45-4.5784838(log)
Kb330-5.7617732
Db126-6.2834968
Db221-5.7545398
Db235-6.1457624
如上所述，與Kb或Db具有強-
-中度的結合親和性(kd值)但顯示最高結合親和性的Db126肽在以後的實驗中被使用。另外，對於人，根據 Immunogenetics Vol. 41，ρ, 178-228 (1995)的記載，預測與人
5HLA-A*0201結合的錨定胺基酸是N-末端至2號Leu和Met以及N-末端至9號Val和Leu。 因此合成了人WTl蛋白質的胺基酸序列(Mol. Coll. Biol. Vol. 11，p. 1707-1712，1991)(序列號2)中符合上述條件的9個胺基酸構成的2種肽。Db 126 ；ArgJfet Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (序列號 5)(與小鼠中Db126的序列相同)WH 187 ；Ser Leu Gly Glu Gln Gin Tyr Ser Val (序列號 8)(下劃線表示錨定胺基酸)如下所述測定上述肽與HLA_A*0201的結合能。在37°C下培養上述肽與具有 empty 的 HLA_A*0201 的 T2 細胞(J. Immunol.，150， 1763，1993 ；Blood，88，2450，1996) 1小時後，用識別HLA-A2. 1的螢光標識單克隆抗體給T2 細胞染色，通過FACS解析，由每個細胞的平均螢光量計算結合解離常數。結合能
權利要求
1.編碼示於SEQID NO :1或2的蛋白質或其部分肽的核酸在製備癌症疫苗中的用途， 所述肽由序列號2所示胺基酸序列的9個連續胺基酸所組成，其中2位上胺基酸殘基是亮氨酸或甲硫氨酸，9位上胺基酸殘基是纈氨酸或亮氨酸，該肽可結合I類MHC抗原。
2.權利要求1的用途，其中的核酸編碼示於SEQID NO :1或2的蛋白質用於所述製備。
3.如權利要求1所述的用途，其中的核酸編碼的部分肽選自下組 位置 126-134 :Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (Db 126)， 位置 235-243 :Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (Db 235)， 位置 187-195 ；Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (WH 187)， 位置 7-15 Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val,位置 10-18 Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu, 位置 225-233 :Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu, 位置 242-250 :Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val, 位置 441-449 :Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu。
4.如權利要求3所述的用途，所說的部分肽為以下任意一種 Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (序列號 5) Db 235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (序列號 7) WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (序列號 8)。
5.如權利要求4所述的用途，所說的部分肽為Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (序列號 5)或 WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (序列號 8)。
全文摘要
本發明涉及Wilms腫瘤癌抑制基因WT1的產物，以該胺基酸序列中包括與I類主要組織適合性抗原(MHC)結合的錨定胺基酸在內的連續7～30個胺基酸構成的肽作為有效成分的癌抗原，以及含有它們的癌疫苗。
文檔編號C07K14/82GK102198266SQ20111010288
公開日2011年9月28日 申請日期1999年7月30日 優先權日1998年7月31日
發明者岡芳弘, 杉山治夫 申請人:株式會社國際癌症免疫研究所