大腸桿菌熱敏毒素b亞單位的真核表達方法

2023-10-23 22:37:32 1

專利名稱：：大腸桿菌熱敏毒素b亞單位的真核表達方法
技術領域：
：本發明涉及一種大腸桿菌熱敏毒素B亞單位(E.coliheat-labileenterotoxinBsubunit，LT-B)的真核表達方法。
背景技術：
：早在上世紀四十年代，人們就發現某些血清型的大腸桿菌(Escherichacoli，E.coli)會引起幼畜及嬰兒的流行性腹瀉，意識到E.coli不都是腸道「正常」寄生菌，並把可以引起人和動物發生腹瀉的E.coli稱為腸道病原性E.coli(Enteropathogenic，E.coli，EPEC)。進一步研究表明EPEC引起人和動物腹瀉的主要原因是由於其產生腸毒素，因此，又把這種可產生腸毒素的E.coli稱為腸毒素原性E.coli(EnterotoxingenicE.coli，ETEC)。ETEC主要產生兩種類型的腸毒素其一為E.coli耐熱毒素(E.coliheat-stableenterotoxin，ST)，其二為E.coli熱敏毒素(E.coliheat-labileenterotoxin，LT)。LT分子是由1個約28kDa的A亞基(LT-A)和5個約11.5KDa的B亞基(LT-B)組成的6聚體毒素蛋白，其分子量約為74～91KDa。完整LT-A可由胰酶裂解成LT-A1與LT-A2，二者分子量分別為24KDa和526Da。LT-A2位於LT-A1的C末端，二者以二硫鍵連接，在進入靶細胞後，二硫鍵被還原，LT表現出毒性。現已基本明確LT-A和LT-B在LT分子毒素活性中的功能，LT-A有ADP-核糖基轉移酶的作用，它能透過細胞膜，激活細胞的腺苷酸環化酶(AC)，引起細胞內cAMP升高，刺激腸黏膜細胞過度分泌水和電解質，導致腹瀉，是LT的毒力活性部分；LT-B可與靶細胞上的特異受體GM1結合，打開通道，介導LT-A進入靶細胞，以產生毒素活性。全LT分子及無毒的LT-B均具有良好的抗原性，在免疫學上具有重要意義。具有黏膜免疫活性的大腸桿菌熱敏毒素B亞單位(LT-B)已被採用多種方式表達過，如有大腸桿菌、枯草桿菌或轉基因番茄等表達法(1.Clements，J.D.，Hartzog，N.M.，Lyon，F.L.，1988.AdjuvantactivityofEscherichiacoliheat-labileenterotoxinandeffectontheinductionoforaltoleranceinmicetounrelatedproteinantigens.Vaccine6，269.，2.WangJ，LiL，ZhengJ，etal.Highlyefficientexpression，purificationofrecombinantLTBproteinanditsactivityagainstmucosalimmunoadjuvantbynasalimmunization.ChinMedJ(Engl).2003Jul；116(7)1115-1117.，3.WalmsleyAM，AlvarezML，JinY，etal.ExpressionoftheBsubunitofEscherichiacoliheat-labileenterotoxinasafusionproteinintransgenictomato.PlantCellRep.2003Jun；21(10)1020-1026.)，但無論是在蛋白表達量、轉錄後加工與高級結構形成方面，還是在蛋白的純化及檢測方面存在不同程度的缺陷。因此，尋求一種大腸桿菌熱敏毒素B亞單位表達量高且所表達的蛋白易於純化及檢測的大腸桿菌熱敏毒素B亞單位的表達法成為本發明需要解決的技術問題。
發明內容本發明的目的在於，提供一種高表達且所表達的蛋白易於純化及檢測的大腸桿菌熱敏毒素B亞單位的表達法，以此克服現有技術中存在的缺陷。本發明所說的大腸桿菌熱敏毒素B亞單位(LT-B)的表達方法，其主要步驟是首先將LT-B的核酸序列通過限制性核酸內切酶與表達載體連接得重組表達載體，然後將重組表達載體導入宿主細胞經發酵表達獲得目標蛋白(大腸桿菌熱敏毒素B亞單位)，其特徵在於，其中所說的LT-B具有SEQIDNO1所示的核酸序列，所說的表達載體為穿梭質粒pPICZαA，所說的宿主細胞為畢赤酵母(Pichiapastoris)X-33或KM71(由從美國英駿公司購得)。本發明大腸桿菌E.coliO6H16(LT+，ST+)LT-B全基因為模板，以引物Pb15』-ATGAATAAAGTAAAATGTAT-3』和Pb25』-GAATTCTAGTTTTCCATACTGATTGCC-3』，經過高保真PCR擴增出帶信號肽的LT-B核酸序列，亞克隆入pGEM-T(購自美國Promega公司)再以pGEM-LT-B為模板，利用引物P15』-GAATTCCTCGAGAAAAGAGCTCCCCAGACTATTACAGAA-3』(引入EcoRI和XhoI限制性酶切位點)和P25』-GCGGCCGCCTAGTTTTCCATACTGATTGCCGC-3』(引入NotI限制性酶切位點)，經過高保真PCR擴增出不帶信號肽序列的LT-B。同時，在pPICZaA-LT-B的構建過程中，考慮到畢赤分泌時的正確識別與切割LT-B，在引物P1的LT-B的N末端引入了Kex2signalcleavage可識別的LeuGluLysArg胺基酸，以XhoI和NotI位點定向亞克隆入以同樣酶完全切割的畢赤酵母(Pichiapastoris)分泌型表達載體pPICZαA構建了包含LT-B目的基因、酵母信號肽α因子、合適的酶切位點及HIS(6)-tag純化標籤的畢赤酵母(Pichiapastoris)pPIC-ZαA-LT-B表達載體，(構建過程請參見圖2和圖3)，該表達載體經電轉化和一系列篩選、鑑定，包括抗性篩選、表型篩選、基因水平和蛋白水平鑑定，獲得了可分泌表達LT-B-6×HIS於培養基的畢赤酵母基因工程株X-33/pPIC-ZαA-LT-B和KM71/pPIC-ZαA-LT-B，發酵培養了表達LTT-B的畢赤酵母工程菌，並採用鎳性的親和層析柱簡單、快捷地分離純化到了免役佐劑LT-B。本發明的特點與優點在於(1)首次對原核生物大腸桿菌來源的熱敏毒素B亞基通過基因工程手段在真核表達系統畢赤酵母基因工程株X-33/pPIC-ZαA-LT-B和KM71/pPIC-ZαA-LT-B中實現了表達，並均可分泌於培養基上清，以可溶性蛋白存在，而且具有比天然產毒素性大腸桿菌有較高的表達水平，因此採用本系統比大腸桿菌生產更具有實用價值(2)在酵母表達載體構建方法上，在去除LT-B自身信號肽的基礎上，採用了畢赤酵母容易識別的釀酒酵母信號肽α因子，並在LT-B的N末端除了引入了酶切位點外，還引入了Kex2signalcleavage識別位點LeuGluLysArg胺基酸，使LT-B在畢赤酵母分泌表達時能夠正確進行切割加工，而能夠有效地分泌表達入培養基上清。同時在目的蛋白質的C末端還帶有His-Tag純化標籤，以便於檢測和純化；(3)在目的蛋白的純化與檢測方法上，採用Zeocin作為抗性標記和多拷貝篩選檢測手段，比採用通過所用的其它抗生素幹擾因素少、特異性強和簡便快捷。由於目的基因片段與His-Tag純化標籤以融合蛋白的形式被分泌表達於培養基上清，而酵母分泌表達入培養基上清的本體蛋白較胞內表達蛋白少得多，這使得所表達的融合蛋白易於分離純化和檢測，只要使用鎳性的親和層析柱分離就可以簡便地純化，利用His酶標抗體便可方便地檢測到目的蛋白的表達，使得其應用更加方便、快速、低廉；(4)由該系統表達生產的黏膜免疫佐劑LT-B，對所有與其一同用於黏膜免疫的疫苗抗原具有顯著的通用性，即由此系統表達生產的LT-B可以與非特異性的與特定的易於從黏膜侵入的病原微生物抗原一起通過各種黏膜途徑進行免疫，均可激發產生針對特異性病原的免疫預防作用。圖1是不帶信號肽序列的LTB的高保真PCR擴增結果電泳圖；其中lane1和2為經高保真PCR擴增的不帶信號肽序列的LTBlane3為DNAMarker.圖2是分泌型畢赤酵母表達載體/pPICZαA-LT-B構建圖；圖3是表達與畢赤酵母中的LT-B序列分析與構建策略圖；圖4是酵母表達載體的酶切鑑定與酵母表達菌株PCR鑑定結果電泳圖；其中A為酵母表達載體pPICZαA-LT-B的XhoI-NotI雙酶切鑑定結果lane1-4為表達載體pPICZαA-LT-B經XhoI-NotI雙酶切鑑定電泳條帶。Lane5為DNAMarker.B為畢赤酵母表達株的菌落PCR鑑定結果lane1為DNAMarer.Lane2-5為利用LT-B特異性引物對畢赤酵母表達株的菌落PCR鑑定的電泳條帶。圖5是畢赤酵母表達株表達結果的SDS-PAGE與WesternBlotting鑑定結果圖。其中(A)為WesternBlotting分析結果(B)為SDS-PAGE分析結果lane1，lane4分別為對照菌株誘導的培養基上清lane5，lane8的WesternBlotting分析結果；lane2為陽性菌株X-33/pPICZαA-LT-B甲醇誘導的培養基上清lane6的WesternBlotting分析結果；lane3為陽性菌株KM71/pPICZαA-LT-B甲醇誘導的培養基上清lane7的WesternBlotting分析結果；lane9為標準蛋白。圖6經Ni+ChelatingSepharose純化後的LT-B的電泳圖。具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步闡述，其目的僅在於更好理解本
發明內容而非限制本發明的保護範圍。實施例1.帶信號肽序列的LT-B基因的克隆與序列測定以插入pGEM-T載體上的克隆自致病性大腸桿菌E.coliO6H16(LT+，ST+)LTB全基因為模板，以引物Pb15』-ATGAATAAAGTAAAATGTTAT-3和Pb25』-GAATTCTAGTTTTCCATACTGATTGCC-3，經過高保真PCR擴增出帶信號肽序列的LT-B(如下所附序列)，亞克隆入pGEM-T，經測序帶信號肽序列的LT-B正確，其序列如下，共372bp，可編碼成熟肽LT-B的103個胺基酸。1atgaataaagtaaaatgttatgttttatttacggcgttactatcctctctatgtgcatac71ggagctccccagtctattacagaactatgttcggaatatcgcaacacacaaatatatacg121ataaatgacaagatactatcatatacggaatcgatggcaggtaaaagagaaatggttatc181attacatttaagagcggcgcaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaacatatagac241tcccaaaaaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatctgaccgag301accaaaattgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgcggcaatc361agtatggaaaac2.pPICZαA-LT-B的構建以pGEM-LT-B模板，利用引物P15』-GAATTCCTCGAGAAAAGAGCTCCCCAGACTATTACAGAA-3(引入EcoRI和XhoI限制性酶切位點)和P25』-GCGGCCGCCTAGTTTTCCATACTGATTGCCGC-3(引入NotI限制性酶切位點)，經過高保真PCR擴增出不帶信號肽序列的LTB。同時，在pPICZaA-LTB的構建過程中，考慮到畢赤分泌時的正確識別與切割LTB，在引物P1的LTBd的N末端引入了Kex2signalcleavage可識別的LeuGluLysArg胺基酸，以XhoI和NotI位點定向亞克隆入以同樣酶完全切割的畢赤酵母分泌型表達載體pPICZαA(參見構建圖2和圖3)，通過轉化大腸桿菌Top10F』，按《分子克隆》(科學出版社，第二版)方法製備和轉化感受態方法，獲得大量大腸桿菌轉化子，利用常規方法提取質粒進行鑑定。3.重組酵母表達載體鑑定從加有100mMZeocin的LB平皿上選取生長的菌落，提取質粒進行酶切鑑定，用XhoI和NotI雙酶切，用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳鑑定的結果可見(如圖4A所示)，除約3.6kb的載體片段外，可看到約300bp大小的目的條帶，利用酵母通用引物測序結果與構建分析結果如圖4，結果表明，LT-B片段已正確插入pPICZαA載體，即pPICZαA-LT-B已經構建成功。4.重組酵母表達株的篩選與鑑定與多拷貝篩選按Invitrogen操作手冊製備畢赤酵母野生型X-33和突變型KM71菌株的感受態細胞。將pPICZαA-LT-B用SalI酶切線性化後電轉入以上感受態細胞中(750伏、25uF、400歐)，立刻加入1ml預冷的1M山梨醇，轉移至管中離心，塗布在含200mMZeocin的YPD平板上，30℃培養2-3天。選擇不同生長速度的酵母轉化子分別接種YPD液體培養基，過液生長後，根據《精編分子生物學實驗指南》，利用特異性引物P1和P2進行菌落PCR法擴增同源重組入酵母基因組的LT-B目的基因，擴增結果的1％的瓊脂糖凝膠電泳顯示，如圖4B獲得了預期大小的目的條帶。對菌落PCR法鑑定正確的重組酵母菌株，分別逐級接種於含有500、1000、1500、2000、5000mMZeocin的YPD平板上，各自30℃培養2-3天，通過對抗生素Zeocin的不同耐受性來篩選多拷貝重組子，最終獲得可以存活於含5000mMZeocin的YPD平板上的少數幾株X-33和KM71高拷貝菌株。5.目的蛋白的小量表達與表達產物的SDS-PAGE分析從含5000mMZeocin的YPD平板上取挑X-33和KM71各2個克隆，分別培養在10mlBMGY培養基中(1％酵母粉，2％蛋白腖，100mM磷酸鉀緩衝液，pH＝6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油)，30℃，250rpm下培養至OD600＝2.0-6.0。細胞離心後重懸在2mlBMMY培養基中(1％酵母粉，2％蛋白腖，100mM磷酸鉀緩衝液，pH＝6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)以誘導蛋白表達。30℃、250rpm條件下培養6天，每隔24小時添加甲醇至終濃度為0.5(v/v)％。6天後離心收集上清，取少量進行15％的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，結果如圖5(B)所示。6.WesternBlotting檢測LT-B蛋白活性將X-33/pPIC-ZαA-LT-B或KM71/pPIC-ZαA-LT-B兩株工程菌的加醇誘導表達的培養基上清中的蛋白質進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，SDS-PAGE電泳結束時，切出含待轉移蛋白的凝膠，剪6張同樣大小的Whatman3mm濾紙和1張硝酸纖維素膜(MilliporeHAWP)，用軟鉛筆在纖維膜一角做好標記。將它們漂浮於ddH2O水平面上，潤溼後浸於水中5min，驅除膜上的氣泡，再浸泡於轉移緩衝液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/LTris，0.037％SDS，20％甲醇)中。在塑料支架上依次疊放浸溼的海綿、3層濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、3層濾紙和海綿，使濾紙、凝膠和硝酸纖維素膜對齊，且各層之間無氣泡存在；將塑料支架夾緊插入電轉移槽中；硝酸纖維素膜一側接陽極，凝膠一側接陰極，加轉移液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/LTris.Cl，0.037％SDS，20％甲醇)沒過凝膠，以30V～35V電壓，4℃轉移14～16h。轉移完畢，將硝酸纖維素膜浸於封閉液(5％脫脂奶粉或3％BSA，150mmol/LNaCl，0.02％Tween-20)中約室溫2h，以封閉無關蛋白結合位點，同時對凝膠進行染色，檢查蛋白轉移是否完全。封閉後，用洗滌液(10mmol/LTris.ClpH7.5，0.15mol/LNaCl，0.05％Tween-20)洗膜3次，每次5min；將一抗(兔抗GPV或MPV的血清)用抗體稀釋液(0.01mol/LTBS，1％BSA，0.05％Tween-20)作適當稀釋，滴在保鮮膜上，然後將硝酸纖維素膜正面(吸附抗原面)向下覆蓋在加抗體的保鮮膜上，室溫反應2h；用洗滌液洗膜3次，每次5min；同樣方法加酶標二抗(鹼性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG)，室溫反應2h；用洗滌液洗膜3次，每次5min；膜稍幹，加酶底物反應液進行反應。將洗滌過的膜移入淺託盤中，按0.1mL/cm2加入底物反應液，平緩搖動於室溫進行溫育顯色。顯色結束後，將硝酸纖維素膜移至蒸餾水中，終止顯色。7.目的蛋白的大量表達挑選表達量最高的KM71/pPIC-ZαA-LT-B工程菌克隆進行大量表達，即在3.7升發酵罐中進行發酵。具體操作按Invitrogen的發酵手冊(PichiaFermentationProcessGuidelines，Invitrogen2002)進行。120小時後離心收集上清，-80℃保存。取上清液分別少量進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，經面積積分掃描分析軟體可知其最高表達量可達分泌入上清總蛋白的17％。8.表達於培養基上清中的LT-B蛋白的純化取1升發酵上清液，加入PMSF至終濃度為1mM，以防止蛋白降解。並加入1/10總體積的1.0MTris(pH8.0)將培養基的pH值調至8.0。然後加入硫酸銨至飽和度為60％以沉澱蛋白質，在冰浴下攪拌2小時。沉澱離心後重懸在40ml20mMTris-HCl，pH為7.9中，透析過夜。加入imidazole和NaCl至終濃度分別為0.5M和5mM。然後將樣品上Ni+ChelatingSepharose(BBSTNTAResin)柱，經洗滌液(20mMTris/HCl，pH7.9，60mMimidazole，0.5MNaCl)充分洗淨雜質後，用洗脫液(20mMTris/HCl，pH7.9，0.5Mimidazole，0.5MNaCl)將目的蛋白洗下。利用15％的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳結果如圖6所示。結果表明具體實施過程中將LT-B克隆入pPICZαA載體及宿主酵母系統後，獲得了比較高的表達，同時採用Zeocin抗生素作為篩選標記，不僅簡便快速、假陽性幹擾少，而且可以簡便地篩選多拷貝轉化子。分泌表達入培養基是清中的LT-B以可溶性蛋白存在，具有較強的免疫活性，而且因酵母分泌的自身蛋白較少且表達產物帶有組氨酸純化標籤，因此是目的蛋白質的純化工藝大大簡化，這些也驗證了利用真核畢赤酵母完全可以較好地實現原核來源的毒素基因的表達，可以產生具有較強免疫活性的LT-B，因此，是一個有價值、有前景的表達系統。SEQUENCELISTING110華東理工大學120大腸桿菌熱敏毒素B亞單位的真核表達方法130說明書，權利要求書1601170PatentInversion3.12101211372212DNA213人工序列4001atgaataaagtaaaatgttatgttttatttacggcgttactatcctctctatgtgcatac60ggagctccccagtctattacagaactatgttcggaatatcgcaacacacaaatatatacg120ataaatgacaagatactatcatatacggaatcgatggcaggtaaaagagaaatggttatc180attacatttaagagcggcgcaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaacatatagac240tcccaaaaaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatctgaccgag300accaaaattgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgcggcaatc360agtatggaaaac37權利要求1.一種大腸桿菌熱敏毒素B亞單位(E.coliheat-labileenterotoxinBsubunit，LT-B)的表達方法，其主要步驟是首先將LT-B的核酸序列通過限制性核酸內切酶位點與表達載體連接獲得重組表達載體，然後將重組表達載體導入宿主細胞經發酵表達獲得目標蛋白，其特徵在於，其中所說的LT-B具有SEQIDNO1所示的核酸序列，所說的表達載體為穿梭質粒pPICZαA，所說的宿主細胞為畢赤酵母(Pichiapastoris)X-33或KM71。2.如權利要求1所說的表達法，其特徵在於，其中克隆LT-B核酸序列的引物序列為5』-ATGAATAAAGTAAAATGTTAT-3』和5』-GAATTCTAGTTTTCCATACTGATTGCC-3』。3.如權利要求1所說的表達法，其特徵在於，其中LT-B核酸序列與穿梭質粒pPICZαA重組的引物序列為P15』GAATTCCTCGAGAAAAGAGCTCCCCAGACTATTACAGAA-3』和P25』-GCGGCCGCCTAGTTTTCCATACTGATTGCCGC-3』。4.如權利要求3所說的表達法，其特徵在於，其中在P1的LT-B的N末端引入了Kex2signalcleavage可識別的LeuGluLysArg胺基酸。全文摘要本發明涉及一種大腸桿菌熱敏毒素B亞單位(E.coliheat－labileenterotoxinBsubunit，LT－B)的真核表達方法，其主要步驟是首先將LT－B的核酸序列(如SEQIDNO1所示)通過限制性核酸內切酶位點與穿梭質粒pPICZαA連接獲得重組表達載體，然後將重組表達載體導入畢赤酵母(Pichiapastoris)X－33或KM71經發酵表達獲得目標蛋白(LT－B)。本發明為開發具有商業價值的大腸桿菌熱敏毒素B亞單位奠定了基礎。文檔編號C12N15/81GK1746308SQ20051002795公開日2006年3月15日申請日期2005年7月21日優先權日2005年7月21日發明者魏東芝,馬興元,鄭文雲,王天文,羅晨,馬昱澍申請人:華東理工大學