蛋白質的選擇性還原的製作方法

2023-10-23 21:08:58 2

本申請要求2014年2月11日提交的美國專利申請號61/938,378的優先權，其內容通過引用全文納入本文。

發明背景

選定的胺基酸被突變成半胱氨酸Cys的單克隆抗體(例如工程化的半胱氨酸mAbs，即ecmAbs)特別適合用於偶聯物(例如抗體藥物偶聯物(ADCs))，因為這些由其衍生的偶聯物具有有利的特性，其中包括同質性、有利的藥物動力學、穩定性和溶解性。這些半胱氨酸突變被置於在抗體胺基酸序列中的某些位置，這些位置通常不會形成鏈間或者鏈內的二硫鍵，並且在細胞內產生突變mAb的表達機制會將半胱氨酸殘基作為未配對的半胱氨酸進行處理。因此，工程化半胱氨酸，通常會用非編碼的半胱氨酸分子以混合的二硫鍵產物形式表達(例如，工程化半胱氨酸通常用封端劑(例如半胱氨酸、半胱氨醯甘氨酸、穀胱甘肽)進行「封端(capped)」)。

因此，為了從ecmAbs出發製備偶聯物(例如ADC)，通常需要將ecmAb置於還原條件下，從而將工程化半胱氨酸從混合的二硫鍵產物轉化為自由巰基，通常這一「脫封端」或者「活化」伴隨著ecmAb鏈間二硫鍵的還原。儘管鏈間二硫鍵可以通過溫和氧化重新形成，但是這種再氧化步驟增加了ADC製備過程中複雜性和費用。選擇性還原方法是難以實現的，因為已證明難以還原工程化半胱氨酸殘基的同時而不還原鏈間二硫鍵。因此，需要開發用於對工程化半胱氨酸殘基的進行脫封端的選擇性還原方法。本發明解決了這個和其它需求。

發明概述

在本發明中，提供了一種選擇性還原工程化的半胱氨酸抗體的方法。這種方法包括：將一還原劑與工程化的半胱氨酸抗體分子接觸，每個抗體分子含有至少一個封端的工程化的半胱氨酸殘基和至少一個鏈間二硫鍵，以及將還原劑與抗體分子在足以使工程化的半胱氨酸殘基「脫封端」並且形成封端副產物的條件下進行反應。封端副產物在還原反應的過程中被移去。這種方法導致形成脫封端的工程化半胱氨酸抗體製劑。這種脫封端的工程化半胱氨酸抗體製劑可以包含封端的和脫封端的工程化半胱氨酸抗體。還原反應前存在於抗體分子中基本上所有的鏈間二硫鍵，在脫封端的工程化半胱氨酸抗體製劑中仍然保留。所述方法可以進一步包括以下步驟：在移除封端副產物時，向還原反應補充額外的還原劑。在還原反應過程中從反應混合物中移除封端副產物，可以通過例如透析或滲濾進行。在優選的實施方式中，在還原反應混合物中，封端副產物濃度被維持低於如下濃度：在該濃度下，再封端阻止了工程化半胱氨酸殘基被進一步活化。

在某些方面，所述方法提供一種非封端的工程化半胱氨酸抗體製劑。典型地，在抗體製劑中至少60％的工程化的半胱氨酸是非封端工程化的半胱氨酸殘基。在某些方面，在抗體製劑中至少70％，至少75％或者至少80％的工程化的半胱氨酸殘基是非封端工程化的半胱氨酸殘基。在某些方面，採用本發明方法，在抗體分子中至少85％的還原反應前就存在的鏈間二硫鍵在脫封端工程化的半胱氨酸抗體製劑中仍然保留。在某些方面，選擇還原劑和還原條件，使得不超過20％，不超過15％，不超過10％或者不超過5％的抗體分子中存在的鏈間二硫鍵，在還原反應過程中被轉化成一對自由巰基。

在相關方面，這個發明提供抗體偶聯物，包括抗體藥物偶聯物，和採用脫封端抗體製備抗體偶聯物的方法。在製備抗體藥物偶聯物之前，抗體製劑中殘留的還原劑被移除。

本發明還提供一種選擇性還原含有非配對半胱氨酸殘基的非抗體蛋白質的方法。這種方法包括：將一還原劑與蛋白質分子接觸，每個蛋白質分子含有至少一個封端的工程化的半胱氨酸殘基和至少一個鏈間二硫鍵，以及將還原劑與蛋白質分子在足以使半胱氨酸殘基「脫封端」並形成封端副產物的條件下進行反應。封端副產物在還原反應的過程中被移去。所述方法導致形成脫封端的半胱氨酸蛋白質製劑。這種脫封端的半胱氨酸蛋白質製劑可以包含封端和脫封端的半胱氨酸殘基的蛋白質分子。蛋白質分子中在還原反應前就存在的基本上所有的鏈間二硫鍵，在脫封端的半胱氨酸蛋白質製劑中仍然保留。這種方法可以進一步包括以下步驟：在移除封端副產物時，向還原反應補充額外的還原劑。在還原反應過程中從反應混合物中移除封端副產物可以通過例如透析或滲濾進行。在優選的實施方式中，在還原反應混合物中，封端副產物濃度被維持低於如下濃度：在該濃度下，再封端阻止了工程化半胱氨酸殘基被進一步活化。所述方法提供一種非封端的半胱氨酸蛋白質製劑。典型地，採用所述方法，至少60％的半胱氨酸是脫封端(或者，換言之，是活化的)。在某些方面，採用所述方法，至少70％，至少75％或者至少80％的封端的半胱氨酸殘基是被脫封端的。在某些方面，採用本發明方法，蛋白質分子中至少85％的還原反應前就存在的鏈間二硫鍵，在脫封端工程化的半胱氨酸抗體製劑中仍然保留。在某些方面，選擇還原劑和還原條件，使得不超過20％，不超過15％，不超過10％或者不超過5％的蛋白質分子中存在的鏈間二硫鍵，在還原反應過程中被轉化成一對自由巰基。

附圖說明

圖1顯示了用三種不同的單巰基還原劑(半胱氨酸、N-乙醯半胱氨酸(NAC)和半胱胺)，在相同的條件下(低濃度2mM)處理一種ecmAb(溶液濃度99μM)，對所得的樣品進行rPLRP柱分析的結果。Y軸代表可用的總工程化的半胱氨酸的活化百分比。沒有一種還原劑能夠達到對可用的工程化的半胱氨酸殘基的100％激活。沒有證據表明，在這些實驗中，鏈間二硫鍵被還原。

圖2顯示了一種S239C ecmAb mcMMAF ADC的重鏈的rPLRP柱分析結果。S239C ecmAb用本發明中的方法選擇性地還原，並且偶聯到mcMMAF藥物接頭。還原劑是0.8mM半胱氨酸。工程化的半胱氨酸殘基的活化基本上進行到完成。標註為％H0的柱表示沒有與藥物接頭偶聯的重鏈。標註為％H1的柱表示偶聯有1個藥物接頭的重鏈；而標註為％H2的柱表示偶聯有2個藥物-接頭的重鏈。

圖3顯示了S239C ecmAb mcMMAF ADC重鏈的rPLRP柱分析結果。S239C ecmAb用本發明中的方法選擇性地還原，並且偶聯到mcMMAF藥物-接頭上。還原劑是0.55mM半胱氨酸。只有小百分比的工程化的半胱氨酸殘基保持封端(％H0)，而未封端工程化的半胱氨酸殘基的百分比接近100％(％H1)，而且非特異性還原(％H2)的量保持在低位。

圖4顯示了通過S239C ecmAbs選擇性實現了工程化的半胱氨酸的活化，該活化與重鏈和輕鏈可變區的種類無關。mAb 1是人源化2H12ecMAb，mAb2是人源化的h1F6ecMab(活化:％H0；選擇性:％H2)。對於兩種mAbs而言，脫封端速率是類似的。工程化半胱氨酸殘基的選擇性活化，在mAb1的三個變異位點S239,K326和A327上得到證明。這些結果表明，工程化半胱氨酸的活化可以在不同位點選擇性地實現。這些實驗中採用約0.9mM的半胱氨酸。

圖5顯示了mAb1的S239C突變體的工程化的半胱氨酸的活化。反應混合物中mAb的濃度與圖4反應中類似，但是半胱氨酸的濃度更低一些，在整個時間進程中大約為0.5mM。這個實驗顯示，採取低濃度的半胱氨酸可獲得最大選擇性，並且在給予足夠時間的情況下，可以以非常高的選擇性實現完全活化。這次實驗最終時間點所製備得到的偶聯物的平均載藥量是1.93，這與標稱值2.0很接近，並且落在通過傳統非選擇性還原然後再氧化所得的數值範圍內。

發明詳細描述

Ⅰ.綜述

在本發明中，提供了一種選擇性移除抗體(包括單克隆抗體)中工程化的半胱氨酸上硫化物封端的方法。儘管在將抗體長時間暴露於低濃度小分子硫醇中後觀察到某些選擇性移除，但是在靜態反應混合物中不會發生完全的脫封端。有利地，用本發明的方法，其中當還原副產物被移除時維持還原劑濃度，能夠實現工程化的半胱氨酸的近乎完全活化。在不需要活化基本上所有工程化半胱氨酸的實施例中，本方法可以用於控制活化水平。令人意外的是，獲得的脫封端的抗體具有完整的鏈間二硫鍵，從而維持了抗體結構，並消除了在將抗體與藥物或者其它功能劑進行偶聯前的再氧化步驟。通過本發明方法，對製備抗體偶聯物(包括抗體藥物偶聯物)的目前生產操作進行了大幅簡化。

Ⅱ.定義

如本文所用，術語「抗體」泛指完整的單克隆抗體、多克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，和那些表現出所需生物活性(例如特異性結合到目標抗原)和那些至少具有一個天然鏈間二硫鍵的抗體片段。典型的片段包括，例如，Fabs，迷你抗體(minibodies)及其類似物。一個完整的抗體通常由4個多肽鏈組成(兩個重鏈和兩個輕鏈)，每個多肽主要有2個區域：可變區和恆定區。可變區特異性地結合於目標抗原並與目標抗原反應。可變區包括互補決定區(CDRs)，所述互補決定區識別和結合到某一特定抗原的特異性結合位點。恆定區可以被免疫系統識別和發生相互作用(見例如，Janeway et al.,2001,Immuno.Biology,第5版,Garland Publishing,New York)。這4個多肽通過鏈間二硫鍵相互共價連接。抗體可以是任何型(例如IgG，IgE，IgM,IgD和IgA)，類別(例如IgG1，IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2)或亞類。抗體可以來自任何合適的物種。在某些實施方式中，抗體是人或者鼠來源的。單克隆抗體可以是例如，人的，人源化的，或者嵌合的。根據上下文，術語「抗體」可以指一個單一的抗體分子，或者抗體分子的集合，例如在抗體溶液中。

如本文所用，術語「鏈間二硫鍵」指一個抗體相鄰多肽鏈上的兩個半胱氨酸殘基之間的共價鍵。二硫鍵具有結構式R1-S-S-R2，其中S原子位於半胱氨酸的側鏈，R1和R2代表半胱氨酸殘基的其餘部分以及所在的多肽鏈。鏈間二硫鍵通常位於一個抗體分子的重鏈和輕鏈之間，或者兩條重鏈之間。

如本文所用，術語「工程化的半胱氨酸殘基」指被引入到蛋白質(例如抗體)多肽序列中的半胱氨酸殘基。含有半胱氨酸殘基的單克隆抗體，可以稱為「ecmAb」。工程化的半胱氨酸殘基通常在蛋白質的天然(自然存在的)肽序列中是不存在的。工程化的半胱氨酸殘基可以取代多肽序列某一給定位點的自然存在的胺基酸，並通過重組技術例如定點誘變被引入到多肽序列上。工程化的半胱氨酸殘基可以是封端或者非封端的。

如本文所用，術語「非封端(或脫封端)半胱氨酸殘基」指一半胱氨酸殘基，其α側鏈含有一個自由的巰基，其具有結構R1-SH。R1代表半胱氨酸殘基的非巰基部分。非封端半胱氨酸殘基可以是非封端的工程化的半胱氨酸殘基。

如本文所用，術語「封端的半胱氨酸殘基」指一個半胱氨酸殘基，其α側鏈含有一個二硫鍵化部分，其具有結構式R1-S-S-R3。R1代表半胱氨酸殘基的非巰基部分，並且R3代表分子量小於或等於500Da的封端劑的非巰基部分。封端劑可以是，例如，半胱氨酸、半胱氨醯甘氨酸、或者穀胱甘肽(R3分別代表自由半胱氨酸、半胱氨醯甘氨酸的非巰基部分，或者穀胱甘肽的非巰基部分)或者其它可用的單硫醇。封端半胱氨酸殘基可以是封端的工程化的半胱氨酸殘基。

如本文所用，術語「還原反應」指這樣的反應，其中具有結構式R1-S-S-R3的封端半胱氨酸殘基(例如封端的工程化的半胱氨酸殘基)被還原，並且形成具有結構R1-SH的硫醇部分。R1和R3如上定義。

如本文所用，術語「還原劑」指能夠還原二硫鍵的化合物。還原劑包括但不限於：硫醇例如半胱氨酸、半胱胺、和β-硫基乙醇。

如本文所用，術語「氧化劑」指能夠將一對自由巰基轉化為二硫鍵的化合物。氧化劑的例子包括但不限於：5,5′-二硫代(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、脫氫抗壞血酸(DHAA)和硫酸銅(CuSO4)。「再氧化步驟」是使得一對自由巰基轉化為二硫鍵的確定性步驟。該確定性步驟包括：引入外源氧化劑和/或有意的保持一段時間,以便發生自氧化。

如本文所用，從包含抗體和某一物質的混合物中術語「移除」該物質(例如封端副產物)，是指從混合物中移除該物質的任一部分，包括該物質的全部。移除這種物質還可以包括：將所述抗體從包含該物質的第一混合物中轉移到不包含該物質的第二混合物中。從混合物中移除某一物質，可包括步驟例如透析、滲濾、色譜法等。

如本文所用，術語「抗體藥物偶聯物」和「ADC」指可任選地通過接頭而偶聯有治療劑(例如藥物)的抗體。

如本文所用，術語「藥物-接頭化合物」，或「藥物-接頭」指具有藥物部分和連接在其上的接頭的分子，其中所述接頭含有適合於連接到抗體中的胺基酸殘基(例如半胱氨酸殘基)的反應性基團。

Ⅲ.具體實施方式描述

在本發明中，提供了一種選擇性還原工程化的半胱氨酸抗體從而形成非封端抗體製劑的方法。這種方法包括：將還原試劑與工程化的半胱氨酸抗體分子接觸，其中每個抗體分子具有至少一個封端的工程化的半胱氨酸殘基和至少一個鏈間二硫鍵，以及將還原劑與抗體分子在足以使工程化的半胱氨酸殘基脫封端並形成封端副產物的條件下進行反應。在還原反應過程中，封端副產物被移除，從而阻止新形成的硫醇被再次發生封端。隨著封端副產物一起被移除的還原劑，被替換以驅動還原反應向前進行。選擇還原劑和還原條件，使得工程化的半胱氨酸殘基被選擇性地還原(即，選擇性地活化)。因此，不需要為了重新形成鏈間二硫鍵而在還原步驟之後採取單獨的再氧化步驟。具有工程化的半胱氨酸殘基的抗體分子中的基本上所有鏈間二硫鍵，在脫封端的抗體中都被保留。使用術語「保留」，並不表示鏈間二硫鍵在還原反應中保持不變。鍵在還原反應過程中可以被破壞，但是在轉化為一對自由巰基之前重新形成鍵。鍵的重新形成不依賴於單獨的再氧化步驟，而是在還原反應過程中發生，如圖2所示。

流程1顯示了採用本發明的方法，對半胱氨酸殘基進行脫封端的示意圖，其中用單克隆抗體作為示範的蛋白質。如反應(i)所示，還原劑(1)與具有封端工程化的半胱氨酸殘基(2)的抗體反應，結果產生具有脫封端的半胱氨酸殘基的抗體(3)和封端副產物(4)。反應(i)能夠向兩個方向進行，並且脫封端的工程化胺基酸殘基與封端副產物之間反應，能夠導致工程化的半胱氨酸殘基被再次封端。逆反應的結果是形成一組合物，在該組合物中只有一部分抗體具有脫封端的工程化的半胱氨酸殘基。根據本發明方法，向反應混合物中補充額外的還原劑，如在反應(ii)所示，並且將反應副產物從反應混合物中移除。補充還原劑和移除反應副產物能夠驅動正反應和防止逆反應，從而促使形成所需的具有脫封端工程化的半胱氨酸殘基的抗體(3)。

流程1

在正常(即「靜態溶液」)條件下，在再封端反應限制了工程化的半胱氨酸被活化的程度。圖1中的圖顯示了在相同條件下用三種不同的單硫醇處理ecmAb的結果。Y軸代表總的可用的工程化的半胱氨酸活化的百分比。這張圖顯示：每種還原劑都不能活化近乎100％的可用的工程化的半胱氨酸，而這種限制是因為二硫鍵副產物(流程1中的4)會將生成的硫醇再封端，如上所述。

還原劑

任何合適的還原劑都可以用於本發明的方法。還原劑的例子包括但不限於：單硫醇還原劑例如半胱氨酸、N-乙醯半胱氨酸、半胱胺、β-巰基乙醇、2-巰基乙磺酸鈉鹽等。溫和的還原劑例如半胱氨酸等特別適合於移除封端半胱氨酸殘基(例如封端的工程化的半胱氨酸殘基)的封端，並不破壞鏈間二硫鍵。強還原劑，例如二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)和雙(2-巰基乙基)碸，在大多數情況下，能夠過快還原鏈間二硫鍵。具體地，對於還原劑例如TCEP和DTT是不可能選擇性地使封端半胱氨酸的發生脫封端，對於所述還原劑而言流程2中混合二硫鍵化物的中間產物6或者不形成，或者僅僅暫時形成。在一些實施方式中，還原劑選自半胱氨酸、半胱胺、β-巰基乙醇、2-巰基乙磺酸鈉鹽及其混合物。

反應條件

儘管多種單硫醇可以用於選擇性活化，圖1中的圖表顯示，不同的硫醇以不同的速率活化工程化的半胱氨酸，並達到不同的最大化程度。因此，確定工程化的半胱氨酸殘基活化的合適條件，包括確定合適的還原劑和確定合適的還原劑濃度。

反應條件的確定，部分地是根據工程化的半胱氨酸的位置，封端劑的種類，或者特定抗體上的殘基。例如，溶劑暴露的工程化的半胱氨酸殘基，較之被掩埋或者部分掩埋的工程化的半胱氨酸殘基，更容易被脫封端。

有利於選擇性還原蛋白中非配對半胱氨酸殘基的條件，可以基於流程2中的反應來理解。如果還原劑與工程化的半胱氨酸殘基反應(如在反應(a)所示)比其與鏈間二硫鍵(如在反應(b)所示)的反應快得多，那麼選擇性活化是相對簡單的。這種情形僅僅只發生在，如果有的話，半胱氨酸高度暴露於抗體表面的溶劑。然而，經常地，在抗體偶聯物例如ADCs中使用的ecmAbs中的工程化的半胱氨酸而言，低暴露的位點是優選的。還原劑可以與這些低暴露的工程化的半胱氨酸殘基以及與二硫鍵以可比較的速率進行反應。因此，當反應(a)和反應(b)以可比較的速率發生時，常常需要找到選擇性的活化條件。

在反應(a)和反應(b)以可比的速率發生—或者反應(b)比反應(a)更快的情形下，選擇性活化工程化的半胱氨酸殘基就要求確保當鏈間二硫鍵被還原劑攻擊的時候，重新形成二硫鍵的反應(c)要快於第二還原步驟(d)，該步驟(d)會導致不希望的鏈間二硫鍵的斷裂。通常，不可能影響反應(c)的速率，因為它是單分子反應。硫醇和混合二硫鍵產物(如6所示)是同一抗體的部分。但是反應(d)的速率取決於還原劑的濃度，因此可以通過使用一個足夠低濃度的還原劑使得反應(d)比反應(c)慢。當然，反應(a)和反應(b)也取決於還原劑的濃度，所以在這種條件下，所述活化也很慢。因此，通過在一段長的時間內維持非常溫和的還原條件(低還原劑濃度和相對溫和的還原劑)，通常有利於選擇性活化工程化的半胱氨酸。

流程2

還原反應混合物可以包括任何合適量的蛋白質。典型地，在還原反應混合物中蛋白質濃度(不管是抗體還是非抗體蛋白質)的濃度範圍為：大約0.01mg/mL到大約150mg/mL，更典型地，從大約1mg/ml到大約50mg/ml。所述還原反應混合物可以包含，例如：大約0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.5、15、17.5、20、22.5、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或大約150mg蛋白質(不管是抗體還是非抗體蛋白質)/每mL還原反應混合物。蛋白質濃度(不管是抗體還是非抗體蛋白質)可以更高或更低，這取決於採用的特定反應條件。一個本領域技術人員能夠將質量濃度(例如mg/mL)換算為摩爾濃度(例如摩爾/L)。

任何合適量的還原劑可以應用於本發明的方法。通常，還原反應混合物中還原劑濃度足夠高以至於還原反應能夠發生，但是足夠低以至於鏈間二硫鍵的還原緩慢到幾乎可以忽略。典型地，採用一起始量的還原劑在起始濃度下，從而形成還原反應混合物。通過在還原反應持續過程中連續或分批向還原反應混合物補充額外的還原劑，基本上維持這種起始濃度。在某一實施方式中，在整個還原反應過程中，以連續方式向還原反應混合物中補充額外的還原劑。優化還原劑濃度可以採用這裡描述的教導通過實驗加以確定，並且對不同的硫醇可以是不同的，因為它們的還原能力不同。已確定，在實施例所描述的條件下，半胱氨酸的最優濃度為大約0.5mM到大約1.5mM。依據還原劑的還原能力和ecmAb的濃度，這一濃度可以提高或降低。在某些實施例中，還原劑的濃度被維持在高於總抗體的濃度。最優的還原劑相對於總抗體的濃度比，也取決於還原劑的還原能力。在某些方面，還原反應混合物中還原劑的濃度，比還原反應混合物中總抗體濃度高大約5倍到大約25倍，5倍到大約20倍，5倍到大約15倍，5倍到大約10倍。例如，在某些實施方式中，還原反應混合物中還原劑與總抗體的濃度比為大約5∶1、6∶1、7∶1、8:1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、16∶1、17∶1、18∶1、19∶1，或20∶1。在某些實施方式中，包括某些實施方式中，當還原劑是半胱氨酸的時候，還原反應混合物中還原劑與總抗體濃度比為從5∶1到大約12∶1，從7∶1到大約12∶1,優選地大約8∶1。在一些方面，工程化的半胱氨酸殘基位於重鏈的239位(命名根據歐洲索引)。其它濃度比也可應用於本發明的方法，這取決於多種因素，例如採用的特定的還原劑，或者工程化的半胱氨酸在抗體上的位置。

進行半胱氨酸殘基(工程化的或者天然的半胱氨酸殘基)脫封端的還原反應，從而減少鏈間二硫鍵的還原和後續自由巰基的產生。採用本發明方法形成的脫封端蛋白質製劑中，在具有封端半胱氨酸殘基的蛋白質上存在的基本上所有鏈間二硫鍵都被保留。通常，至少約80％鏈間二硫鍵被保留在脫封端蛋白質製劑中。在某些實施方式中，至少大約85％鏈間二硫鍵被保留在脫封端蛋白質製劑中。在某些實施方式中，至少大約90或者大約95％鏈間二硫鍵被保留在脫封端蛋白質製劑中。在某些實施方式中，所有鏈間二硫鍵被保留在脫封端蛋白質製劑中。或者，換言之，在代表性的實施方式中，不超過大約20％，不超過大約15％，不超過大約10％，或者不超過大約5％的鏈間二硫鍵在還原反應中被轉化為一對自由巰基。當它應用於抗體時，存在於具有封端工程化的半胱氨酸殘基的抗體分子(例如還原反應前的抗體分子)上的基本上所有鏈間二硫鍵，都被保留在用本發明方法形成的脫封端抗體製劑中。通常，脫封端抗體製劑中，至少約80％的鏈間二硫鍵被保留。在某些實施方式中，脫封端抗體製劑中，至少約85％的鏈間二硫鍵被保留。在某些實施方式中，脫封端抗體製劑中，至少約90％或者大約95％的鏈間二硫鍵被保留。在某些實施方式中，脫封端抗體製劑中，全部的鏈間二硫鍵被保留。或者，換言之，在代表性實施方式中，不超過大約20％，不超過大約15％，不超過大約10％，或者不超過大約5％的鏈間二硫鍵，在還原反應中被轉化為一對自由巰基。

在還原反應混合物中還原劑濃度被維持時，還原副產物從還原反應混合物中被移除。還原劑的添加和副產物的移除可以連續或分步的方式進行。在某些實施方式中，還原劑的添加和副產物的移除以連續的方式進行。還原劑的添加和副產物的移除可以採用技術包括但不限於：切向流過濾(例如滲濾)、尺寸排阻色譜法、固相固定法和透析。在滲濾過程中，還原劑水溶液通常是以給定的速率添加到還原反應混合物中，而一部分混合物以同樣的速率被移除。半透膜可以用於將蛋白質(例如抗體)保留在還原反應混合物中。或者，所述蛋白質(例如抗體)可以被固定在固相載體上(例如蛋白質A的瓊脂糖珠)，而水相還原劑溶液可以流經固定化的蛋白質(例如抗體)。也可以使用能夠和封端副產物反應的活性樹脂。例如，封端副產物可以用具有反應性基團(例如孔內具有二硫鍵產物)的樹脂進行捕獲，其中這些孔足夠小從而將蛋白質(例如抗體)排除在外。

相應地，本發明一些實施方式中提供了如上所述的方法，其中，從還原反應混合物中移除封端副產物包括：在還原反應過程中，透析或者滲濾所述的還原反應混合物。在一些實施方式中，從還原反應混合物中移除封端副產物包括：在還原反應過程中，滲濾所述的還原反應混合物。

通常，實施本發明方法為了最大化進行半胱氨酸殘基的脫封端。然而，任一種蛋白質分子可具有封端的半胱氨酸殘基以及非封端的殘基。通常，脫封端抗體製劑將包含兩種或兩種以下物質：一種具有至少二個脫封端工程化的半胱氨酸殘基且沒有封端工程化的半胱氨酸殘基的抗體分子；一種具有至少二個封端工程化的半胱氨酸殘基且沒有脫封端工程化的半胱氨酸殘基的抗體分子；和一種具有至少一個封端工程化的半胱氨酸殘基和至少一個脫封端工程化的半胱氨酸殘基的抗體分子。有利的是，本發明方法提供高水平的選擇性脫封端工程化的半胱氨酸殘基。例如，執行所述方法以至於至少40％的工程化的半胱氨酸殘基被脫封端。在某些方面，執行所述方法以至於至少40％，至少大約45％，至少大約50％，至少大約55％，至少大約60％，至少大約65％，至少大約70％，至少大約75％，至少大約80％，至少大約85％，至少大約90％的工程化的半胱氨酸殘基被脫封端。在某些實施方式中，至少60％的工程化的半胱氨酸殘基被脫封端。高或者低水平的脫封端都可能發生，這部分取決於特定抗體以及工程化的半胱氨酸殘基在抗體上的位置。儘管，本發明的方法通常被執行，從而使得半胱氨酸殘基的脫封端最大化，但是在有些情況下，使半胱氨酸殘基脫封端最大化並不需要，例如，當一個抗體具有二個半胱氨酸殘基，並只需要將一個半胱氨酸殘基與功能性試劑偶聯的時候。在某些這樣的實施方式中，本發明方法可以用於嚴格控制工程化的半胱氨酸的活化程度。本發明方法的有利的方面是，中等程度的脫封端很容易實現，只要將活化停止在所需要的水平並進行偶聯即可。當採用全還原後再氧化的方法時，難以獲得這種中等水平的偶聯物。

反應混合物可以包含額外的反應試劑或化合物。作為非限制性例子，反應混合物可以包含緩衝劑(例如2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)，2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)，3-嗎啉丙磺酸(MOPS)，三羥甲基氨基甲烷(TRIS)，磷酸鉀，磷酸鈉，磷酸鹽緩衝液，檸檬酸鈉，乙酸鈉，和硼酸鈉)，共溶劑(例如二甲亞碸、二甲基甲醯胺、乙醇、甲醇、異丙醇、丙三醇、四氫呋喃、丙酮、乙腈和乙酸)，鹽(例如NaCl，KCl，CaCl2，Mn2+和Mg2+的鹽)，變性劑(例如尿素和鹽酸胍)，清潔劑(例如十二烷基磺酸鈉，和Triton-X100)，和螯合劑(例如乙二醇雙(2-氨基乙醚)-N，N，N』，N』-四乙酸(EGTA)、2-({2-[雙(羧甲基)氨基]乙基}(羧甲基)氨基)乙酸(EDTA)，以及1,2-雙(鄰氨基苯氧基)乙烷-N，N，N』，N』-四乙酸(BAPTA))。緩衝溶液、共溶劑、鹽、變性劑、清潔劑和螯合劑可以採用任何合適的濃度，這些對於本領域技術人員而言是很容易確定的。通常，如果存在緩衝劑、共溶劑、鹽、變性劑、清潔劑和螯合劑，其被包含在在反應混合物中的濃度範圍為大約1μM到大約1M。例如，緩衝劑、共溶劑、鹽、變性劑、清潔劑和螯合劑可以被包含在反應混合物中，其濃度為大約1μM，或大約10μM，或大約100μM，或大約1mM，或大約10mM，或大約25mM，或大約50mM，或大約100mM，或大約250mM，或大約500mM，或大約1M。具體地，共溶劑可以被包含在反應混合物中，其含量範圍為，例如大約1％v/v到大約75％v/v，或更高。共溶劑可以被包含在反應混合物中，例如含量為大約5，10，20，30，40或50％v/v。

在足以形成脫封端半胱氨酸殘基的條件下進行反應。反應可以在任何合適溫度下進行。通常，反應在大約4℃到大約40℃的溫度範圍內進行。反應可以在例如，大約25℃到大約37℃的溫度範圍內進行。反應可以在任何pH條件下進行。通常，反應在大約6.5到大約10的pH範圍內進行。在某些情況下，pH範圍為大約7.0到大約8.5。反應可以在任何合適的時長下進行。時長的選擇取決於還原劑的能力。因為溫和的還原條件(低濃度還原劑和相對溫和的還原劑)被應用於本發明方法，因此還原反應將會延長到大於典型的還原鏈間二硫鍵(所需)預期時間。在一些優選的方面，還原反應將會繼續直到至少大約60％，至少大約70％或至少大約80％或至少大約85％封端的工程化的半胱氨酸殘基被脫封端。在某些方面，還原反應在合適的條件下溫育至少1h，至少2h，至少3h，至少4h，至少5h，或者至少6h。反應可以在惰性氣體氛圍下進行，例如氮氣氛圍或者氬氣氛圍。其它的反應條件可應用於本發明，這取決於某一特定抗體的種類，或者還原劑。

在某些實施方式中，反應混合物的pH範圍從大約6.5到大約8.5。在某些實施方式中，本發明方法包括：維持反應混合物的溫度在大約4℃到大約37℃的範圍。在某些實施方式中，反應混合物在期望的溫度下維持一段時間，從大約1h到大約8h。

一些已知的純化技術可以應用於本發明方法中的不同節點。這些技術可以根據需要，被用於移除過量的還原劑，將緩衝溶液或者其它組分更換入或者更換出所述的反應混合物，以及濃縮或者稀釋抗體組分。用於本發明方法的純化技術包括但不限於：切向流過濾(TFF)，凝膠過濾，免疫沉澱，親和色譜法等。優選地，減少純化時間，從而防止不必要的氧化或者脫封端工程化的半胱氨酸殘基被再封端。

抗體偶聯物

抗體上脫封端工程化的半胱氨酸殘基可充當有用的基座，以用於安裝多種功能基團，其中包括成像試劑(例如發色基團和螢光基團)，診斷試劑(例如MRI對比劑和放射性同位素)，穩定劑(例如乙二醇聚合物)和治療劑。具有脫封端半胱氨酸殘基的抗體可以被偶聯到功能劑以形成抗體-功能劑的偶聯物。功能劑(例如藥物，檢測試劑，穩定劑)被偶聯(共價連接)至抗體上的工程化的半胱氨酸殘基位點。功能劑可以通過功能劑上的活性巰基直接地、或者是通過接頭間接地進行連接。

具有脫封端的半胱氨酸殘基的抗體，可以偶聯藥物從而形成抗體藥物偶聯物(ADCs)。典型地，ADC包含位於藥物和抗體之間的接頭。接頭可以是可降解的或者是不可降解的接頭。可降解的接頭典型地在細胞內環境下容易降解，例如在目標位點處接頭發生降解，從而使藥物從抗體上釋放出來。合適的可降解的接頭包括，例如酶降解的接頭，其中包括可以被細胞內蛋白酶(例如溶酶體蛋白酶或者內體蛋白酶)降解的含有肽基的接頭，或者糖接頭例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接頭。肽基接頭可以包括，例如二肽，例如纈氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-賴氨酸或者纈氨酸-丙氨酸。其它合適的可降解的接頭包括，例如，pH敏感接頭(例如pH小於5.5時水解的接頭，例如腙接頭)和在還原條件下會降解的接頭(例如二硫鍵接頭)。不可降解的接頭典型地在抗體被蛋白酶水解的條件下釋放藥物。

連接到抗體之前，接頭具有能夠和脫封端的工程化的半胱氨酸殘基反應的活性反應基團，連接通過活性反應基團實現。巰基特異性的活性反應基團是優選的，並包括：例如馬來醯亞胺類化合物，滷代醯胺(例如碘、溴或氯代的)；滷代酯(例如碘、溴或氯代的)；滷代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基滷代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基碸，吡啶基二硫化物；二硫化二氧化衍生物(disulfide dioxide derivatives)；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六環，而對離子是醋酸根、氯離子或者硝酸根；和聚亞甲基二甲基硫醚硫代磺酸鹽。接頭可以包括，例如，通過硫代丁二醯亞胺連接到抗體上的馬來醯亞胺。

藥物可以是任何細胞毒性，抑制細胞生長或者免疫抑制的藥物。在實施方式中，接頭連接抗體和藥物，而藥物具有可以和接頭成鍵的功能性基團。例如，藥物可以具有可以和連接物成鍵的氨基，羧基，巰基，羥基，或者酮基。在藥物直接連接到接頭的情況下，藥物在連接到抗體之前，具有能夠與脫封端的半胱氨酸殘基反應的活性基團。

有用的藥物類別包括，例如，抗微管蛋白藥物、DNA小溝結合試劑、DNA複製抑制劑、烷化試劑、抗生素、葉酸拮抗物、抗代謝藥物、化療增敏劑、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼等。特別有用的細胞毒性藥物類的例子包括，例如，DNA小溝結合試劑、DNA烷基化試劑、和微管蛋白抑制劑、典型的細胞毒性藥物包括、例如奧瑞他汀(auristatins)、喜樹鹼(camptothecins)、多卡黴素/倍癌黴素(duocarmycins)、依託泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素類化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓類(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的藥物(benzodiazepine containing drugs)(例如吡咯並[1,4]苯二氮卓類(PBDs)，吲哚啉苯並二氮卓類(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷並苯並二氮卓類(oxazolidinobenzodiazepines))和長春花生物鹼(vinca alkaloids)。選擇的含有苯並二氮卓類的藥物在WO 2010/091150,WO 2012/112708,WO 2007/085930,和WO 2011/023883中有描述。

在某些典型的實施方式中，合適的細胞毒性試劑包括：DNA小溝結合試劑(例如，烯二炔類(enediynes)和萊希菌素(lexitropsins)、CBI化合物；見美國6,130,237號專利)，多卡黴素/倍癌黴素(duocarmycins)(見美國專利公開號為20060024317)、紫杉烷(例如紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(docetaxel))、嘌呤黴素(puromycins)、長春花生物鹼、CC-1065,SN-38、拓撲替康(topotecan)、嗎啉代-阿黴素/多柔比星(morpholino-doxorubicin)、根黴素(rhizoxin)、氰基嗎啉基代-阿黴素/多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、棘黴素(echinomycin)、考布他汀(combretastatin)、紡錘菌素(netropsin)、埃博黴素(epothilone)A和B、雌莫司汀(estramustine)、念珠藻素(cryptophysins)、西馬多丁(cemadotin)、美登素類化合物(maytansinoids)、迪斯德莫來/圓皮海綿內酯(discodermolide)、艾榴塞洛素(eleutherobin)和米託蒽醌(mitoxantrone)。

所述藥物可以是抗微管蛋白藥物(anti-tubulin agent)。抗微管蛋白藥物的例子包括，但不限於，紫杉烷(例如(紫杉醇)，泰索帝/多西(多烯紫杉醇))，T67(杜拉瑞克(Tularik))和長春花生物鹼(例如長春新鹼(vincristine)，長春花鹼(vinblastine)，長春地辛(vindesine)和長春瑞濱(vinorelbine))。其它抗微管蛋白藥物包括，例如漿果赤黴素衍生物(baccatinderivatives)、紫杉烷類似物(例如埃博黴素A和B)、諾考達唑(nocodazole)、秋水仙鹼(colchicine)和秋水仙胺(colcimid)、雌莫司汀(estramustine)、念珠藻素(cryptophysins)、西馬多丁(cemadotin)、美登素類化合物(maytansinoids)、考布他汀(combretastatins)、迪斯德莫來/圓皮海綿內酯(discodermolide)、奧瑞他汀(auristatins)、和艾榴塞洛素(eleutherobin)。

藥物可以是美登木素或美登醇，另外類別的抗微管蛋白藥物(ImmunoGen,Inc.；還可參見Chari等人，1992,Cancer Res.52∶127-131以及U.S.專利No.8,163,888)。

藥物可以是奧瑞他汀(auristatin)。奧瑞他汀(Auristatins)包括，但不限於，AE,AFP,AEB,AEVB,MMAF,和MMAE。奧瑞他汀(Auristatins)的合成和結構描述見美國專利申請公開號2003-0083263和2009-0111756；國際專利申請公開號WO 04/010957；國際專利申請公開號WO 02/088172；美國專利號6,884,869；美國專利號7,659,241；美國專利號7,498,298；美國專利號8,343,928；和美國專利號8,609,105；出於各種目的，每一篇通過引用方式整體引入。

在某些實施方式中，藥物部分選自下組：抗微管蛋白試劑，DNA結合試劑，和DNA烷化試劑。在某些實施方式中，藥物選自下組：奧瑞他汀(auristatin)，吡咯並苯並二氮卓類(pyrrolobenzodiazepine)，多卡黴素/倍癌黴素(duocarmycin)，美登醇，紫杉烷，卡奇黴素(calicheamicin)和蒽環黴素(anthracycline)。

藥物-接頭可以用於在一個簡單步驟中形成ADC。在其它實施方式中，雙功能連接物化合物可以用於在兩步或多步方法中形成ADC。例如，脫封端的工程化的半胱氨酸殘基在第一步驟中與接頭的反應活性部分反應，並且在隨後的步驟中，接頭上的功能性基團與藥物反應，從而形成ADC。

通常，選擇接頭上功能性基團，以利於特異性地與藥物部分上的合適的反應活性基團進行反應。作為非限制性的例子，基於疊氮化合物的部分可以用於特異性地與藥物部分上的反應性炔基基團反應。藥物通過疊氮和炔基之間的1,3-偶極環加成，從而共價結合於接頭。其它的有用的功能性基團包括，例如酮類和醛類(適合與醯肼類和烷氧基胺反應)，膦(適合與疊氮反應)；異氰酸酯和異硫氰酸酯(適合與胺類和醇類反應)；和活化的酯類，例如N-羥基琥珀醯亞胺酯(適合與胺類和醇類反應)。這些和其它的連接策略，例如在《生物偶聯技術》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本領域技術人員所熟知的。本領域技術人員能夠理解，對於藥物部分和接頭的選擇性反應，當選擇了一個互補對的反應活性功能基團時，該互補對的每一個成員既可以用於接頭，也可以用於藥物。

相應地，本發明的某些實施例提供了製備如上所述的脫封端抗體製劑的方法，其可進一步地包括：將脫封端抗體(例如將脫封端抗體製劑)與藥物-接頭化合物，在足以形成抗體偶聯物(ADC)的條件下進行結合。

在某些實施方式中，本發明方法包括：在足以形成抗體-接頭偶聯物的條件下，將脫封端抗體與雙功能接頭化合物進行結合。在這些實施方式中，本發明方法還進一步地包括：在足以將藥物部分通過接頭共價連接到抗體的條件下，將抗體接頭偶聯物與藥物部分進行結合。

在某些實施方式中，抗體藥物偶聯物ADC如下分子式所示：

其中：

Ab是抗體，

LU是接頭；

D是藥物；

而且下標p是選自1到8的值。

在上式中，接頭LU，通過脫封端的工程化的半胱氨酸殘基連接到抗體上。下標p的數值取決於可用於偶聯的脫封端半胱氨酸殘基的數量。例如，對於一個具有2個脫封端的工程化半胱氨酸殘基的抗體(例如每個重鏈上有1個或者每個輕鏈上有1個位點)，p值可以是2。類似地，對於一個具有4個脫封端的工程化半胱氨酸殘基的抗體(例如每個重鏈上有2個位點，或者每個輕鏈上有2個位點)，p值可以是4。在某些優選的實施方式中，p值為1到4的值。

載藥量

抗體上藥物-接頭分子的平均數量(或者平均載藥量)是ADC組分的一個重要特性，因為它基本決定了能夠輸送到目標細胞的藥物量。平均載藥量包括偶聯到工程化的半胱氨酸殘基的藥物，還有偶聯到目標工程化的半胱氨酸殘基之外的其它位點的藥物，以及在組合物中未偶聯的抗體的量。如果目標是平均載藥量為每個抗體有2個藥物，那麼可以用具有2個半胱氨酸殘基的抗體(例如每個重鏈上1個位點或者每個輕鏈上1個位點)來製備ADC組分。如果目標是平均載藥量為每個抗體有4個藥物，那麼可以用具有4個半胱氨酸殘基的抗體(例如每個重鏈上2個位點或者每個輕鏈上2個位點，或者每個重鏈上1個位點並且每個輕鏈上1個位點)來製備ADC組分。本領域技術人員能夠理解，治療用的其它載藥量水平取決於特定抗體或特定藥物(包括，例如，載藥量小於2或者載藥量大於4)。用於藥物偶聯的結合位點可以被引入抗體，這可以通過在重鏈上1個以上或者2個以上位點設置工程化的半胱氨酸殘基，或者在輕鏈上設置工程化的半胱氨酸殘基，或者兼而有之。重要的是，上述工程化的半胱氨酸殘基脫封端水平，導致可以製備具有有用載藥量的ADC組合物。

典型地，採用具有2個工程化的半胱氨酸殘基的抗體所製備的ADC組合物，其平均載藥量為每個抗體有大約1.5到2.5個藥物。每個抗體上的平均藥物量可以是，例如，大約1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,或2.5。在某些實施方式中，採用具有2個工程化的半胱氨酸殘基的抗體所製備的ADC組合物，其平均載藥量為每個抗體有大約1.5到大約2.2個藥物。典型地，採用具有4個工程化的半胱氨酸殘基的抗體所製備的ADC組合物，其平均載藥量為每個抗體有大約3.4到大約4.5個藥物。每個抗體上的平均藥物數量可以是，例如，大約3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9或4.0。在某些實施方式中，採用具有4個工程化的半胱氨酸殘基的抗體所製備的ADC組合物，其平均載藥量為每個抗體有大約3.6到大約4.2個藥物，或者每個抗體有從大約3.8到大約4個藥物。

典型地，實施本發明方法，以便選擇性修飾未封端的工程化的半胱氨酸殘基，但是常常觀察到不同程度的非工程化的(例如天然)半胱氨酸殘基的修飾。根據需要，可以控制反應條件以限制非工程化的半胱氨酸殘基的修飾。在某些特定情形下，可以實行所述方法以消除或者減低非工程化的半胱氨酸殘基的修飾。例如，實行所述方法以至於ADC組合物中不超過大約20％，不超過大約15％，不超過大約10％，不超過大約5％的抗體分子中，藥物部分被共價連接到非工程化的半胱氨酸殘基上。也可以採用上述方法製備ADC組合物，其中具有修飾的非工程化的半胱氨酸殘基的抗體數量不超過抗體分子總量的大約5％,10％,15％,20％,25％，或30％。

可以採用多種分析方法確定偶聯物的產量和同分異構體混合物。在將藥物偶聯到抗體之後，偶聯的藥物-抗體種類可以被分離出來。在某些實施方式中，偶聯的抗體種類可以基於抗體、藥物和/或偶聯物的特性加以分離。其它用於分析ADC組合物的技術包括但不限於：反相色譜，毛細管電泳和質譜。ADC組合物可以例如通過酶解聯合LC/MS進行分析，以確定藥物部分在ADC上的位置。

抗體

大量的合適的抗體可以用於本發明方法。用於本發明方法的抗體在許多應用領域都有用處，包括體外或者體內診斷，體內成像，以及治療與獨特抗原相關的疾病和症狀。5種人的抗體類型(IgG,IgA,IgM,IgD和IgE)，和這些類型的多種亞型(例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2)，可基於結構差異進行識別，例如單個抗體分子中免疫球蛋白單元的數量，單個單元上的二硫橋的結構，以及鏈長度和序列的差異。抗體的類和亞類被稱為抗體的同種異型。

抗體可以是完整的抗體或者是抗原結合抗體片段，只要抗體片段含有至少一個鏈間二硫鍵。

典型地，抗體是人，齧齒動物(例如小鼠和大鼠)，驢，綿羊，兔，山羊，豚鼠，駱駝，馬和雞。抗體可以是，例如，用本領域技術人員熟知技術所製備的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗體。重組抗體，例如嵌合的和人源化的單克隆抗體，包括人的和非人的部分，可以通過標準的DNA重組技術獲得，它們都是有用的抗體。嵌合抗體是一個分子，其中不同的部分來自不同的動物種，例如具有來自鼠的單克隆抗體的可變區，和來自人免疫球蛋白的恆定區的嵌合抗體(見例如美國專利4,816,567和美國專利4,816,397,在此通過引用方式整體引入本文)。人源化的抗體是指來源於非人物種的抗體分子，具有一個或多個來源於非人物種的互補決定區(CDRs)和來源於人免疫球蛋白分子的框架區域(見美國專利5,585,089，在此通過引用方式整體引入本文)。這些嵌合和人源化的單克隆抗體可以採用本領域熟知的DNA重組技術製備。如本文所用，「人」抗體包括具有人免疫球蛋白序列，以及包括分離自人免疫球蛋白庫，分離自人B細胞，或者分離自具有一個或多個人免疫球蛋白的轉基因動物(例如美國專利5,939,598和6,111,166中所述)的抗體。

抗體可以是單特異性、雙特異性、三特異性、或者更多的多重特異性。

在某些情況下，恆定區具有效應子功能。如本文所用，術語「抗體效應子功能」指一種由Ig的Fc區域貢獻的功能。這一功能可以，例如通過Fc效應子區域結合到具有吞噬或裂解活性的免疫細胞上的Fc受體，或者通過Fc效應子區域結合到補體系統中的成分來實現。效應子功能可以是，例如，「抗體依賴的細胞毒性」即ADCC，「抗體依賴的吞噬作用」即ADCP，或者「補體依賴性細胞毒性」即CDC。在某些情況下，恆定區缺乏一個或多個效應功能。通過將藥物-接頭化合物偶聯到效應子功能結合區域內的工程化的半胱氨酸殘基，能夠調控效應子功能。

抗體可以直接針對任何感興趣的抗原，例如醫學和/或治療興趣。例如，抗原可以是與以下有關的抗原：病原體(例如但不限於病毒，細菌，真菌和原生動物)，寄生蟲，腫瘤細胞，或者特定醫療症狀。在腫瘤相關抗原(TAA)情況下，癌症可能是免疫系統的、肺、結腸、直腸、乳腺、卵巢、前列腺、頭部、頸部、骨頭、或任何其他解剖位置。感興趣的抗原包括，但不限於，CD30、CD40、LewisY、CD70、CD2、CD20、CD22、CD33、CD38、CD40、CD52、HER2、EGFR、VEGF、CEA、HLA-DR、HLA-Dr10、CA125、CA15-3、CA19-9、L6、Lewis X、甲胎蛋白、CA242、胎盤鹼性磷酸酶、前列腺特異抗原、前列腺酸性磷酸酶、表皮生長因子、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、轉鐵蛋白受體抗體、p97、MUC1-KLH、gp100、MART1、IL-2受體、人體絨毛膜促性腺激素、粘蛋白、P21、MPG、和Neu致癌基因產物。

一些具體有用的抗體包括但不限於：針對CD33抗原的抗體(例如，國際專利申請WO 2013/173496所描述的人源化2H12抗體)，針對CD70抗原的抗體(例如，國際專利申請WO2006/113909所描述的人源化1F6抗體)，針對CD30抗原的抗體(例如，國際專利申請WO2008/025020所描述的人源化AC10抗體)，針對CD19抗原的抗體(例如，國際專利申請WO 2009/052431所描述的人源化BU12抗體)，針對LIV-1,NTBA,或αVβ6的抗體。許多其它可以和腫瘤特異性抗原結合的內化抗體都可以採用，見綜述(參見,例如,Franke等人(2000),Cancer Biother Radiopharm.15∶459-76；Murray(2000),Semin Oncol.27∶64-70；Breitling等人,重組抗體(Recombinant Antibodies),John Wiley,and Sons,New York,1998)。這些參考文獻和國際申請中的披露內容在此通過引用引入並用於所有目的。

在某些實施方式中，本發明提供了用於製備具有如上所述具有脫封端的半胱氨酸殘基的抗體的方法，其中在抗體中包含至少3個鏈間二硫鍵。在某些實施方式中，所述抗體包含至少4個鏈間二硫鍵。在某些實施方式中，所述抗體包含1、2、3、4或者5個鏈間二硫鍵。在某些實施方式中，工程化的半胱氨酸殘基位於抗體的重鏈恆定區或者輕鏈恆定區。

工程化的半胱氨酸位置

工程化的半胱氨酸位置可對ADC的性質有影響。例如，全部包埋入蛋白結構的工程化的半胱氨酸殘基難以被偶聯，因為難以接觸溶劑，而位於抗體外表面的工程化的半胱氨酸殘基則因為延長暴露於血漿中的物質，導致ADCs具有受損的穩定性。此外，從具有高的表面暴露的工程化的半胱氨酸殘基的ecmAbs製備的ADCs，可能對藥物的疏水性敏感；而位於更加受保護的位置的工程化的半胱氨酸殘基對藥物特性更不敏感，因為與溶液中其它物質接觸是受限制的。工程化的半胱氨酸殘基的位置也可以用於調節效應子功能，這對於一些特定ADC是必要的。例如，將藥物-接頭偶聯到位於效應子功能結合區域的工程化半胱氨酸殘基，可以用於封閉與效應子功能調節受體的結合。

在某些實施方式中，工程化的半胱氨酸殘基位於重鏈恆定區、重鏈可變區、輕鏈可變區、輕鏈恆定區、或其組合。優選的半胱氨酸殘基是位於這樣的位點，所述位點是可偶聯的並且導致穩定的連接。「可偶聯」的意思是工程化的半胱氨酸殘基能夠偶聯到功能試劑(例如成像試劑，診斷試劑，穩定劑或治療劑)而不會先使抗體變性。選擇引入半胱氨酸殘基位點的方法為本領域技術人員熟知,而所述殘基隨後被偶聯於功能性試劑(例如，見，舉例來說,Junutula等人，2008,Nature Biotechnology,26(8),925-932)。

在某些方面，工程化的半胱氨酸殘基的分數溶劑可及性(fractional solvent accessibility)為10％或者更高，20％或者更高，30％或者更高，40％或者更高，50％或者更高。在某些方面，半胱氨酸殘基具有分數溶劑可及性範圍從大約10％到95％，從大約10％到85％，從大約10％到75％，從大約10％到60％，從大約20％到95％，從大約20％到85％，從大約20％到75％，從大約20％到60％，從大約40％到95％，從大約40％到85％，從大約40％到75％，從大約40％到60％。確定某一特定位點殘基的分數溶劑可及性的方法為本領域熟知並且能夠例如採用在線伺服器getarea加以確定，該伺服器採用Fraczkiewicz和Braun,1998,J.Comp.Chem.,19,319-333(參見http://curie.utmb.edu/getarea.html)中所描述的方法。示例的殘基包括位於輕鏈上的位點15,114,121,127,168,205(根據Kabat編號)，或者位於重鏈的位點112,114，或116(根據Kabat編號法進行編號)。示例的殘基包括那些位於IgG1抗體的Fc區域的位點，例如那些位於Fc區域的位點239，326，327或者269(根據EU索引進行編號)。位於位點239，326，327的殘基的分數溶劑可及性分別為大約50％，大約94％，和大約23％。

本領域技術人員能夠識別，選擇性活化工程化的半胱氨酸殘基所需要的條件將取決於工程化的半胱氨酸殘基在抗體上的位置。流程2的化學式為選擇能夠選擇性活化工程化的半胱氨酸殘基的還原條件提供了一個框架，不管它們發生在蛋白序列的什麼位置。在某些實施方式中，一個抗體具有從1至8個，或者從2至8個，或者從2至4個工程化的半胱氨酸殘基。

非抗體蛋白質

本領域技術人員熟知，儘管這裡描述的過程以抗體作為示例，它也可以成功應用於任何具有非配對、在表達或者生產的過程中被硫醇封端的、工程化的或者天然的半胱氨酸殘基(在蛋白質上通常不形成鏈間或者鏈內鍵的半胱氨酸)的蛋白質。所述方法特別有幫助的蛋白質是這樣的蛋白質，所述蛋白質除了包含非配對的半胱氨酸殘基，還包含天然的半胱氨酸殘基並形成鏈間二硫鍵，特別是那些可以被切斷並不立刻導致蛋白去摺疊的鍵。當涉及到非抗體蛋白質時，術語「鏈間二硫鍵」是指相鄰肽鏈上的2個半胱氨酸殘基之間的共價鍵。候選的非抗體蛋白質包括：那些具有暴露於溶劑的二硫鍵，且所述二硫鍵在天然摺疊構象中的穩定性與那些被封端的硫醇的穩定性具有可比性。如本文所用，工程化的半胱氨酸蛋白質，是指選定的胺基酸被突變為半胱氨酸的蛋白質。代表性的蛋白質還包括Fc-融合蛋白，例如包含一個抗體的Fc區域的蛋白質，其共價連接於提供針對目標靶點的特異性的蛋白質。

Ⅳ.實施例

實施例1：實施選擇性還原的代表性方法

一個反應容器與一切向流過濾(TFF)設備相連接，並且安裝超濾膜(例如，88cm2,Millipore Pelicon 3,再生纖維素)。(許多不同類型的具有合適大小的膜可以應用於上述過程。對於還原劑添加速率計算所需要的流出速率和篩分因素，應該根據方法中採用的膜的滲透通量和膜的類型以及表面積來確定。)根據製造商的說明，對膜進行衝洗和平衡。設置滲濾緩衝液池，它含有緩衝劑(例如，50mM Tris/5mM EDTA,pH 8.0)。它是通過管道與反應容器相連，並且液體流經管道是通過蠕動泵加以控制(例如滲濾緩衝泵)。包含封端的工程化半胱氨酸殘基的mAb被放置在反應容器中。反應在室溫下進行，反應混合物被連續泵送通過超濾膜，控制滯留線以保證跨膜壓力為約20psi。

包含還原劑的溶液池通過管道連接於滲濾緩衝液管線，或者連接於流路或者反應容器的其它位置。計算流速，在該流速下包含還原劑的原液被添加到反應混合物中以維持反應混合物中起始的(或所需要的)還原劑濃度(反應混合物中最優的還原劑濃度採用本文描述的方法並通過實驗確定，並且對不同的硫醇是不同的，因為它們具有不同的還原能力，如圖1所示)。還原劑濃度在整個反應時間基本上保持不變。滲濾緩衝液也以可控的速率被泵送到反應容器中，以便整個反應體積保持不變(即在恆體積滲濾中)，即，還原劑和滲濾緩衝液被引入反應器的速率與通過滲透所導致的體積損失速率相匹配。

實施例2採用半胱氨酸、N-乙醯基半胱氨酸和半胱胺作為還原劑，並在不移除封端副產物的情況下，對工程化的半胱氨酸殘基進行脫封端

將S239C工程化的半胱氨酸抗體(IgG1抗體，其在239位為工程化的半胱氨酸殘基，根據EU索引進行編號)，20mg(135nmol，15mg/mL)，用33μL 100mM(3.3μmol)半胱氨酸、N-乙醯基半胱氨酸或者半胱胺，在pH 8.0和室溫下處理8h。按每1h間隔取出樣品，純化，與過量SGD-1269偶聯，並冷凍儲存。純化和偶聯終止了還原反應，保存了在還原過程中產生的二硫鍵。偶聯的樣品在變性條件下通過反相HPLC(「rPLRP」)進行分析，由此可以推導出工程化的半胱氨酸殘基的脫封端程度(從H0轉換為H1)。鏈間二硫鍵的斷裂程度也可以通過具有偶聯有>1mcMMAF(mcMMAF是連接於藥物單甲基奧瑞他汀F的馬來醯亞胺己酸接頭)的重鏈量加以確定。沒有觀察到偶聯有>2mcMMAF分子的重鏈。靜態溶液還原實驗中得出的結果見圖1。結果顯示，三種硫醇中每一種都能夠與ecmAb反應，將工程化的半胱氨酸殘基脫封端，但是三者表現很不同。NAC的表現形式可用流程1中的第一個反應最直接地加以描述：反應進行直至富集足夠濃度的二硫鍵產物4，然後因為正反應和逆反應以相同的速率發生而發生停止。半胱氨酸是比NAC更強大的還原劑，但是，與停止在部分活化ecmAb不同，反應發生逆轉，再產生ecmAb。這一逆轉表明，採用半胱氨酸，會涉及額外的反應，即還原劑的自氧化。

2R-SH+O2→R-S-S-R (iii)

因此，半胱氨酸的自氧化所產生的胱氨酸，也會將活化的工程化的半胱氨酸殘基再封端，從而逆轉最初的還原。對圖1進行仔細查閱，可顯示出，採用半胱胺時，也發生了同樣的現象(即起始還原後伴隨著再封端)，但是半胱胺是一種更弱的還原劑，因此起始還原程度沒有採用半胱氨酸或者N-乙醯半胱氨酸時高。

實施例3選擇性活化ecmAbs上的工程化的半胱氨酸殘基

反應容器與一切向流過濾(TFF)設備相連接，並且安裝超濾膜(例如，88cm2,Millipore Pelicon 3,再生纖維素)。根據製造商的說明書，對膜進行衝洗和平衡。設置滲濾緩衝液池，它含有緩衝劑(例如，50mM Tris/5mM EDTA,pH 8.0)。它是通過管道與反應容器相連，並且液體流經管道通過蠕動泵加以控制(例如滲濾緩衝泵)。包含封端工程化的半胱氨酸殘基的mAb(h2H12S239C ecMab,h1F6 239ecMab,h2H12K326C ecMab或h2H12A327C ecMab,根據EU索引進行編號)被放置在反應容器中，濃度大約為15mg/mL並且pH被調至8.0.。反應在室溫下進行，反應混合物被連續泵送通過超濾膜，控制滯留線以保證跨膜壓力為約20psi。

包含半胱氨酸的溶液池通過管道與滲濾緩衝液管線連接。計算流速，在該流速下，將包含半胱氨酸的原液添加到反應混合物中以維持反應混合物中起始的(或所需要的)半胱氨酸濃度。如下計算注入到反應混合物中的半胱氨酸原液濃度和添加速率，以便於半胱氨酸濃度在整個反應時間基本上保持不變。在圖2-5所示的例子中，半胱氨酸的反應濃度範圍為0.5-0.9mM(如圖中所描述的說明)；半胱氨酸原液濃度為100mM,10mM,或者5mM，並且半胱氨酸被泵送到反應器中的流速也被調節以根據下述化學式維持實驗中的半胱氨酸濃度。半胱氨酸的篩分因素經測定是0.8-0.9。在整個實驗中，反應混合物中半胱氨酸的濃度採用DTNB分析法周期性地測定，以保證半胱氨酸水平維持在需要的濃度(未顯示)。

滲濾緩衝液也以可控的速率被泵送到反應容器中，以便整個反應體積保持不變(即在恆體積滲濾中)，即，將半胱氨酸和滲濾緩衝液引入反應器的速率與通過滲透所導致的體積損失速率是相匹配的。

樣品在圖中所示的時間間隔被移出，在PD-10柱中洗脫純化，並且與SGD-1269偶聯。偶聯的樣品然後通過rPLRP進行分析。rPLRP圖譜分析提供了維持封端(％H0)的重鏈比例，工程化的半胱氨酸殘基被選擇性地還原(％H1)的比例，或者工程化的半胱氨酸位點並且額外地在鏈間二硫鍵位置被還原(％H2；非選擇性還原)的比例。

半胱氨酸添加速率計算

半胱氨酸被添加到反應混合物中的速率與半胱氨酸通過滲透所損失的速率相同。分析物通過滲透所導致初始損失速率可用方程式2計算，這可以來自恆定體積速率的清除率理論方程(即方程式1)推導出。半胱氨酸原液被泵送到反應混合物中以維持起始半胱氨酸濃度的速率見方程式3。

方程式1：C/C0＝e(-NS)。C是在任一時間t的濃度；C0是初始濃度；N是時間t時的置換體積數，並且S是分析物的篩分因子(經驗值)。置換體積數N，是r*t/Vd，其中r是滲透流速，Vd是批量體積。進行替換，求導，並且評估在t＝0時的導數，得到方程式2。

方程式2:dC/dt＝-C0*(r/Vd)*S,：其中，dC/dt是半胱氨酸在t0時的損失速率。

在反應混合物中添加半胱氨酸溶液以實現給定濃度的速率見方程式3。

方程式3:R＝-dC/dt*Vd/[Cys]，其中[Cys]是半胱氨酸的原液濃度。

因此，替換方程式2中的表達式dC/dt，給出了用於添加速率的方程式4，

方程式4:R＝C0*r*S/[Cys]＝(0.8mM)*(720mL/hr)*(0.8)/(100mM)＝4.61mL/hr。

結果

通過在反應過程中連續滲濾ecmAb，並在全過程中將半胱氨酸加入到滲濾緩衝液中，可以實現選擇性活化ecmAb上的工程化的半胱氨酸殘基。連續滲濾清除了反應副產物。半胱氨酸的添加速率，基於半胱氨酸通過滲濾的理論中半胱氨酸的理論清除率來計算，以便為反應混合物中提供恆定的半胱氨酸濃度。圖2顯示4.5hr後，約80％可用的工程化的半胱氨酸殘基被活化(「％H1」)，而鏈間二硫鍵的斷裂幾乎可以忽略(由％H2表示)。這一實驗採用0.6mM半胱氨酸在更長的時間下進行重複，得到了類似的結果(圖3)。在更高的濃度下，反應更快但是特異性較低。應理解，在整個過程中，反應混合物處於流動狀態，伴隨半胱氨酸溶液通過半胱氨酸添加泵進入反應混合物，以及通過TFF膜(滲透)離開反應混合物，因此，在整個反應過程中，濃度可以稍微波動，但是活化條件通常可以接近標稱濃度。1.5-2mM或者更高濃度的半胱氨酸，會導致鏈間二硫鍵斷裂增加。圖4顯示了工程化的半胱氨酸殘基活化可以在許多位點選擇性地獲得，而與抗體的種類無關。K326突變體的活化時間曲線表明，這一位點的活化比S239或A327位點快。這很可能是由於以下事實：K326是更加溶液可及的，但儘管如此，該方法仍獲得了理想的選擇性活化。圖5顯示通過採用低濃度的還原劑並在較長時間下反應，可以使得反應被驅動到工程化的半胱氨酸殘基被近乎100％活化，並且具有很好的選擇性。

儘管為了清楚和理解的目的，通過闡述和例子，對上述內容進行了詳細說明，本領域技術人員應理解，在所附權利要求的範圍內，可以進行某些改變和變動。此外，在本文中所提供的每個文獻，都同樣程度地通過引用被整體引入本文，就好比每個文獻被單獨地引用而引入本文。