一種高產茶褐素的黑麴黴菌株及其應用的製作方法
2023-10-23 18:58:55
本發明屬於微生物發酵領域，具體涉及一種高產茶褐素的黑麴黴菌株及應用。
背景技術：
：黑麴黴是一種廣泛存在於自然界的腐生真菌，其分生孢子頭呈褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一，頂囊球形，雙層小梗，多見於糧食、植物性產品和土壤中。黑麴黴又是重要的工業發酵微生物，在工業酶製劑、有機酸發酵方面應用廣泛。可生產澱粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶等超過30種酶製劑。因為黑麴黴出色的蛋白質分泌能力，黑麴黴也被開發為通用的異源蛋白表達載體。黑麴黴是檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等的主要生產菌。黑麴黴具有強大的聚合物降解酶系，賦予其在各種廉價的培養基上快速生長和發酵的能力，能夠在極低的pH下保持旺盛的代謝活性因而不易染菌，能夠適應工業發酵中粗放的物料和理化環境，這些品質使黑麴黴成為一種不可多得的工業生產宿主菌，即細胞工廠。茶葉中的多酚類物質是茶葉中的重要活性物質，是茶葉中多種酚類化合物的總稱，是茶樹鮮葉的主要組成成分，其中以兒茶素為其主體成分，佔多酚類物質總量的60％～80％，與茶的湯色、滋味和香氣都有著密切的關係。多酚類物質的水溶性產物主要是茶黃素、茶紅素和茶褐素。茶褐素是兒茶素氧化聚合形成的一類結構十分複雜的產物的總稱，在普洱茶的加工過程中80％的茶黃素和茶紅素氧化、聚合，形成茶褐素，並使其含量成倍增加，從而使茶湯的收斂性和苦澀味降低。研究表明茶褐素是黑茶中主要功能和特徵性成分，其含量對黑茶品質至關重要。研究表明，茶褐素能夠降低小鼠血清中血糖，膽固醇，甘油三酯含量，具有較強的清除自由基能力，具有抗氧化作用。對減肥降脂，預防高血脂症具有顯著的作用。毒理學實驗證明，茶褐素無毒安全。這些結果表明，茶褐素具有較好的應用前景。技術實現要素：本發明的目的提供一種黑麴黴菌株，該菌株具有高產茶褐素的特點，可用於製備茶褐素提取物，該菌株已於2015年8月26日保藏於黑麴黴菌種保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，該黑麴黴菌株的保藏號為：CGMCCNo.11276，拉丁名：Aspergillusniger，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。本發明還提供了一種黑麴黴菌株在綠茶濃縮液液態發酵中的應用，不僅能提高綠茶濃縮液液態發酵茶褐素的產量。本發明的黑麴黴菌株來源於室溫放置1年的速溶綠茶粉中，具體分離方法為：在超淨工作檯中，取適量貯藏1年速溶綠茶粉溶於100mL無菌水中，置於溫度37℃，轉數150r/min的搖床中培養4天後，挑取培養液中的菌絲接種於PDA平板；將接種菌絲的PDA平板置於37℃恆溫培養箱中培養4天，然後挑取單一的黑色孢子於查氏選擇培養基中重複劃線培養2-3次，進一步分離純化，直至查氏選擇培養基平板上只有單一黴菌為止。挑取該純種的黴菌，接種至PDA平板上並置於37℃恆溫培養箱中培養4天，得到本發明保藏的黑麴黴菌株。將菌种放置於4℃保存，備用。菌落形態特徵：菌落在20～30mm之間，菌落較大，地毯式蔓延生長，呈同心輪紋狀，菌落正面黑色，邊緣產生白色次生菌絲，反面灰黑色；在在顯微鏡下觀察，菌絲有隔，在菌絲的壁厚而膨大成「足細胞」，產生分生孢子梗，無隔，梗頂端膨大成球狀泡囊，即為分生孢子頭。同時，本發明還提供了一種高茶褐素速溶黑茶的製備方法，所述高茶褐素速溶黑茶的製備方法包括以下步驟：採用綠茶為原料，用水提取綠茶，並濃縮得到綠茶濃縮液；取保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的黑麴黴菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276，活化培養，調整黑麴黴孢子液濃度；混合綠茶濃縮液與黑麴黴孢子液，逐級擴大培養，得到2級或3級種子液並接種到綠茶濃縮液中；在溫度26～37℃的條件下，有氧液態發酵6～12天，得到黑麴黴發酵液；膜過濾，乾燥得到粉末狀固體，即為高茶褐素速溶黑茶。其中，所述用水提取綠茶具體條件為：溫度60～95℃；料液比為1:8～1:25；提取時間20～60min。所述綠茶濃縮液的可溶性固形物含量為2～15％。所述活化培養的條件是：置於PDA平板培養基培養72-120h。所述黑麴黴孢子液濃度調整為1.0～5.0×106個/mL。所述2級或3級種子液接種到綠茶濃縮液中的接種量為2.0～12.0(v/v)％。所述乾燥得到粉末狀固體優選冷凍乾燥或減壓乾燥。有益效果其一，本發明解決了傳統黑茶發酵過程中茶褐素含量不高，陳香味不被接受的問題。本發明製備的發酵液及速溶茶產品的茶褐素含量高，具有消除炎症，調整腸道細菌，調解血脂代謝，預防心腦血管疾病、抗癌、抗病毒等功效。具有良好的營養價值和養生保健作用。其二，本發明從存放1年的速溶綠茶粉中分離出一種黑麴黴，並將此黑麴黴保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：CGMCCNo.11276，此黑麴黴具有如下優勢：第一：利用本保藏的黑麴黴菌種在綠茶發酵液中生長旺盛，適應液態發酵環境能力強，短時間內可以產生大量的茶褐素；第二，本發明保藏的黑麴黴發酵速度快，可快速達到發酵終點；第三，本發明分離的黑麴黴發酵綠茶提取液產色素能力明顯高於其它黑麴黴，產品色澤紅亮且品質明顯好於其它黑麴黴發酵的產品；第四，綠茶濃縮液的發酵液中，茶褐素的總量較高。其三，本發明保藏的黑麴黴可以應用於低檔綠茶、粗老的茶葉及碎茶液態發酵，以製備茶褐素或直接製備高茶褐素含量的速溶黑茶，提高低檔綠茶、粗老的茶葉及碎茶的經濟價值；本發明的黑麴黴適應在發酵罐中進行的純菌發酵，應用於綠茶提取液液態發酵，液態發酵可提高產品的安全性，生產工藝簡單，發酵成本低，適合於工業化大規模生產。附圖說明：圖1為一種黑麴黴菌株菌落形態圖。具體實施方式下面結合具體實施例子進一步闡明本發明，應理解這些實施例僅用於說明本發明，而不用於限制本發明的範圍，在閱讀了本發明之後，本領域的技術人員對本發明各種等價形式的修改均落於本申請所附權利要求所規定的範圍。實施例1一種黑麴黴菌株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276。其中，本發明實施例所用的試劑均為分析純，速溶綠茶粉由大閩食品(漳州)有限公司提供。本發明的黑麴黴菌株來源於室溫放置1年的速溶綠茶粉中，具體分離方法為：在超淨工作檯中，取適量貯藏1年速溶綠茶粉溶於100mL無菌水中，置於溫度37℃，轉數150r/min的搖床中培養4天後，挑取培養液中的菌絲接種於PDA平板；將接種菌絲的PDA平板置於37℃恆溫培養箱中培養4天，然後挑取單一的黑色孢子於查氏選擇培養基中重複劃線培養2-3次，進一步分離純化，直至查氏選擇培養基平板上只有單一黴菌為止。挑取該純種的黴菌，接種至PDA平板上並置於37℃恆溫培養箱中培養4天，得到本發明保藏的黑麴黴菌株。將菌种放置於4℃保存，備用。活化培養基製備：稱取去皮馬鈴薯200g，切塊，加1L水煮爛，用紗布過濾，然後在加熱的條件下加入20g瓊脂粉，繼續加熱並攪拌，待瓊脂粉溶解完後，加入20g葡糖糖，攪拌均勻，冷卻後再補足水分至1000mL，包紮，121℃滅菌20min，冷卻後，倒入平板。菌種活化：將保藏號為CGMCCNo.11276的黑麴黴菌株，在無菌條件下，於上述培養基製備的平板上劃線，劃線結束後將平板倒置於37℃的恆溫培養箱中培養4天。菌落形態：菌落在20～30mm之間,菌落較大,地毯式蔓延生長,呈同心輪紋狀,菌落正面黑色,邊緣產生白色次生菌絲,反面灰黑色；在在顯微鏡下觀察,菌絲有隔,在菌絲的壁厚而膨大成「足細胞」,產生分生孢子梗,無隔,梗頂端膨大成球狀泡囊,即為分生孢子頭,菌落和孢子形態。菌落形態圖見圖1，其中，自左至右分別為菌落正面圖、菌落背面圖和菌落放大圖。實施例2製備綠茶提取液：採用60～95℃水提取綠茶，其中，料液比為1:8～1:25；提取時間20～60min，過濾取濾液，得到綠茶提取液；製備綠茶濃縮液：將綠茶提取液濃縮至可溶性固形物為2～15％，製得綠茶濃縮液。將保藏號為CGMCCNo.11276的黑麴黴菌株，經過活化後，無菌條件下，置於綠茶濃縮液中液態發酵培養。實施例3一種用黑麴黴液態發酵製備含茶褐素茶湯發酵液的應用。本實施例利用黑麴黴液態發酵方法得到茶褐素，具體方法如下：1.製備綠茶提取液：採用60～95℃水提取綠茶，其中，料液比為1:8～1:25；提取時間20～60min，過濾取濾液，得到綠茶提取液；2.濃縮綠茶提取液：將綠茶提取液濃縮至可溶性固形物為2～15％，製得綠茶濃縮液。3.黑麴黴孢子液製備：取保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276。置於PDA平板培養基培養72-120h，培養結束後取PDA平板培養基上的黑麴黴孢子，溶解於水中並調整黑麴黴孢子濃度至1.0～5.0×106個/mL，得到黑麴黴孢子液。4.種子液製備：混合綠茶濃縮液與黑麴黴孢子液，綠茶濃縮液：黑麴黴孢子液(v/v)＝10:1～50:1。於溫度37℃，轉數150r/min恆溫搖床中培養48小時，獲得1級種子液，用1級種子液和綠茶濃縮液混合，同樣的條件培養，得到2級種子液，同理得到3級種子液。5.接種：將2級或3級黑麴黴種子液接種到綠茶提取液中，接種量為2.0～12.0(v/v)％。6.有氧液態發酵：控制發酵罐中綠茶發酵液溫度26～37℃並通入無菌空氣，發酵6～12天後停止發酵，得到黑麴黴茶湯發酵液。發明人為測定本實施例得到的黑麴黴發茶湯酵液中的茶褐素含量，將黑麴黴發酵得到的發酵茶湯液乾燥，得到黑麴黴發酵液乾粉。同時，從菌種保藏中心購買了兩株普通黑麴黴做對照，分別為普通黑麴黴1號和普通黑麴黴2號，發酵原料和發酵方法同本實施例，檢測方法如下：茶褐素的測定方法取1g黑麴黴發酵液乾粉，用純淨水定容至100mL的容量瓶中，用移液管分別吸取25mL黑麴黴發酵溶液和25mL正丁醇放入125mL分液漏鬥中，充分搖震3min，帶分層後將水層(下層)放於50mL三角瓶中，取水層液2mL於25mL容量瓶中，分別加2mL飽和草酸溶液和6mL蒸餾水，再用95％乙醇定容至刻度，得溶液。空白對照的反應混合液中的水層液用蒸餾水代替，其他條件相同。用10mm比色皿在波長380nm處測吸光度。茶褐素(TB)濃度(gTB/100g茶粉)按下式計算：m—1g茶粉中水分質量(g)；0.72—發酵前與發酵後，茶粉與水的比例變化的校正係數；7.06—為同等操作條件下的換算係數。測試結果如下：表1不同菌種發酵不同時間茶湯茶褐素的變化由上述數據可知，本發明保藏的菌株發酵綠茶濃縮液，可以快速發酵產生茶褐素，增加發酵液的活性成分。實施例4一種用黑麴黴液態發酵茶濃縮液製備茶褐素的應用本實施例利用黑麴黴液態發酵方法得到茶褐素，具體方法如下：1.製備綠茶提取液：採用60～95℃水提取綠茶，其中，料液比為1:8～1:25；提取時間20～60min，過濾取濾液，得到綠茶提取液；2.濃縮綠茶提取液：將綠茶提取液濃縮至可溶性固形物為2～15％，製得綠茶濃縮液。3.黑麴黴孢子液製備：取保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276。置於PDA平板培養基培養72-120h，培養結束後取PDA平板培養基上的黑麴黴孢子，溶解於水中並調整黑麴黴孢子濃度至1.0～5.0×106個/mL，得到黑麴黴孢子液。4.種子液製備：混合綠茶濃縮液與黑麴黴孢子液，綠茶濃縮液：黑麴黴孢子液(v/v)＝10:1～50:1。於溫度37℃，轉數150r/min恆溫搖床中培養48小時，獲得1級種子液，用1級種子液和綠茶濃縮液混合，同樣的條件培養，得到2級種子液，同理得到3級種子液。5.接種：將2級或3級黑麴黴種子液接種到綠茶提取液中，接種量為2.0～12.0(v/v)％。6.有氧液態發酵：控制發酵罐中綠茶發酵液溫度26～37℃並通入無菌空氣，發酵6～12天後停止發酵，得到黑麴黴發酵液。7.茶褐素的製備：將發酵後的液體過濾網去除渾濁物，離心，得濾液Ⅰ和濾渣Ⅰ，取濾液Ⅰ，加入4倍95％食用乙醇溶液攪拌後靜置3小時，離心過濾，得到濾渣Ⅱ和濾液Ⅱ，其中濾渣Ⅱ為茶褐素粗提物；再用20％(v/v)酒精水溶液溶解茶褐素粗提物，得到的溶液經濃縮和乾燥工藝提純後即得茶褐素。實施例5本發明的實施例均使用保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的黑麴黴菌株，其保藏號為：CGMCCNo.11276。實施例中所用的試劑均為分析純，綠茶和速溶綠茶粉均由大閩食品(漳州)有限公司提供。一種高茶褐素速溶黑茶及其製備方法，具體方法如下：1.製備綠茶提取液：採用80℃水提取綠茶，其中，料液比為1:15；提取時間40min，過濾取濾液，得到綠茶提取液；2.濃縮綠茶提取液：將綠茶提取液濃縮至可溶性固形物為8％，製得綠茶濃縮液。3.黑麴黴孢子液製備：取保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276。置於PDA平板培養基培養100h，培養結束後取PDA平板培養基上的黑麴黴孢子，溶解於水中並調整黑麴黴孢子濃度至3.0×106個/mL，得到黑麴黴孢子液。4.種子液製備：混合綠茶濃縮液與黑麴黴孢子液，綠茶濃縮液：黑麴黴孢子液(v/v)＝30:1。於溫度37℃，轉數150r/min恆溫搖床中培養48小時，獲得1級種子液，用1級種子液和綠茶濃縮液混合，同樣的條件培養，得到2級種子液，同理得到3級種子液。5.接種：將2級或3級黑麴黴種子液接種到綠茶提取液中，接種量為8.0(v/v)％。6.有氧液態發酵：控制發酵罐中綠茶發酵液溫度37℃並通入無菌空氣，發酵10天後停止發酵，得到黑麴黴發酵液。7.膜過濾：採用過濾網先去除菌絲等渾濁物，再用0.22微米除菌膜過濾，獲得澄清無菌的黑麴黴發酵液。8.乾燥：將膜過濾後的黑麴黴發酵液進行乾燥處理，得到粉末狀固體，即為高茶褐素速溶黑茶。測定本實施例得到的高茶褐素速溶黑茶茶褐素含量的檢測方法同上：表2不同菌種發酵不同時間茶湯茶褐素的變化表3本實施例高茶褐素速溶黑茶含量表茶褐素％游離胺基酸含量mg/g碳水化合物含量mg/g紅度25.31120.38116.5743.6本發明的高茶褐素速溶黑茶的茶褐素含量高，具有消除炎症，調整腸道細菌，調解血脂代謝，預防心腦血管疾病、抗癌、抗病毒等功效。速溶茶中具有很好的養生保健作用。實施例6一種高茶褐素速溶黑茶及其製備方法，具體方法如下：1.製備綠茶提取液：採用60℃水提取綠茶，其中，料液比為1:8；提取時間20min，過濾取濾液，得到綠茶提取液；2.濃縮綠茶提取液：將綠茶提取液濃縮至可溶性固形物為15％，製得綠茶濃縮液。3.黑麴黴孢子液製備：取保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276。置於PDA平板培養基培養72h，培養結束後取PDA平板培養基上的黑麴黴孢子，溶解於水中並調整黑麴黴孢子濃度至1.0×106個/mL，得到黑麴黴孢子液。4.種子液製備：混合綠茶濃縮液與黑麴黴孢子液，綠茶濃縮液：黑麴黴孢子液(v/v)＝10:1。於溫度37℃，轉數150r/min恆溫搖床中培養48小時，獲得1級種子液，用1級種子液和綠茶濃縮液混合，同樣的條件培養，得到2級種子液，同理得到3級種子液。5.接種：將2級或3級黑麴黴種子液接種到綠茶提取液中，接種量為2.0(v/v)％。6.有氧液態發酵：控制發酵罐中綠茶發酵液溫度26℃並通入無菌空氣，發酵6天後停止發酵，得到黑麴黴發酵液。7.膜過濾：採用過濾網先去除菌絲等渾濁物，再用0.22微米除菌膜過濾，獲得澄清無菌的黑麴黴發酵液。8.冷凍乾燥：將膜過濾後的黑麴黴發酵液進行冷凍乾燥處理，得到粉末狀固體，即為高茶褐素速溶黑茶。經檢測：本實施例得到的高茶褐素速溶黑茶的茶褐素含量為17.3％。實施例7一種高茶褐素速溶黑茶及其製備方法，具體方法如下：1.製備綠茶提取液：採用95℃水提取綠茶，其中，料液比為1:25；提取時間60min，過濾取濾液，得到綠茶提取液；2.濃縮綠茶提取液：將綠茶提取液濃縮至可溶性固形物為2％，製得綠茶濃縮液。3.黑麴黴孢子液製備：取保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276。置於PDA平板培養基培養120h，培養結束後取PDA平板培養基上的黑麴黴孢子，溶解於水中並調整黑麴黴孢子濃度至5.0×106個/mL，得到黑麴黴孢子液。4.種子液製備：混合綠茶濃縮液與黑麴黴孢子液，綠茶濃縮液：黑麴黴孢子液(v/v)＝50:1。於溫度37℃，轉數150r/min恆溫搖床中培養48小時，獲得1級種子液，用1級種子液和綠茶濃縮液混合，同樣的條件培養，得到2級種子液，同理得到3級種子液。5.接種：將2級或3級黑麴黴種子液接種到綠茶提取液中，接種量為12.0(v/v)％。6.有氧液態發酵：控制發酵罐中綠茶發酵液溫度37℃並通入無菌空氣，發酵12天後停止發酵，得到黑麴黴發酵液。7.膜過濾：採用過濾網先去除菌絲等渾濁物，再用0.22微米除菌膜過濾，獲得澄清無菌的黑麴黴發酵液。8.減壓乾燥：將膜過濾後的黑麴黴發酵液在20～50kpa的氣壓下進行減壓乾燥處理，得到粉末狀固體，即為高茶褐素速溶黑茶。經檢測：本實施例得到的高茶褐素速溶黑茶的茶褐素含量為25.4％。當前第1頁1 2 3