一種利用喜樹aoc基因轉化提高菸草抗凍性能的方法
2023-10-27 20:41:42
專利名稱：一種利用喜樹aoc基因轉化提高菸草抗凍性能的方法
—種利用喜樹AOC基因轉化提高菸草抗凍性能的方法技術領域
本發明屬於分子生物學以及基因工程技術領域，具體涉及一種利用基因工程技術提高菸草抗凍性能的方法。
背景技術：
茉莉酸類物質是植物界中普遍存在的一種激素，參與植物發育和逆境脅迫下應激反應的信號傳導過程。內源和外源的茉莉酸類化合物能顯著提高植物對機械損傷、動物撕咬、病蟲害侵染、低溫、高鹽等不利外界環境的耐受能力。在植物中，茉莉酸類物質的合成途徑是從細胞膜上釋放的亞麻酸開始，在脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化物環化酶、OPDA (12-0X0-(10, 15Z)-phytodienoic acid)還原酶、β _氧化酶、茉莉酸甲基化酶等一系列酶的催化生成茉莉酸和甲基茉莉酸。其中由於丙二烯氧化物會自發水解，由此丙二烯氧化物環化酶的作用在茉莉酸類物質的合成途徑中尤為重要。
作為一種重要的模式植物，且易於進行遺傳轉化，菸草是植物的信號途徑研究中的熱門對象；作為一種廣泛種植的經濟作物，菸草的抗逆性能在物種品質和經濟價值上具有非常重要的意義。菸草的抗凍研究目前涉及葡萄糖醛酸苷酶(GUS)蛋白，超氧物岐化酶(SOD)蛋白等。
相比較而言，利用來源於喜樹的茉莉酸類物質合成途徑的關鍵酶丙二烯氧化物環化酶的基因工程來系統性地提高菸草的抗凍性能具有很大的優勢(I)在茉莉酸類物質的合成和信號傳導研究領域，全世界的研究人員已經進行了幾十年的深入研究，其生理作用和生化機制比較清楚，為在基因工程中利用茉莉酸類物質生物合成途徑的基因打下了良好的理論和實踐基礎。(2)提供一種全新的思路，採用轉aoc基因提高菸草抗凍性能的方法。 喜樹是一種和菸草親緣關係比較遠的植物，來源於喜樹的丙二烯氧化物環化酶在菸草中能順利表達並達到高活性效果，提高了尼古丁含量。這為開展植物基因工程研究提供了一個新的方向。
目前，尚未有任何與本專利申請中所提及的應用基因工程技術把喜樹的茉莉酸物質生物合成途徑的酶基因尤其是丙二烯氧化物環化酶轉到菸草中，提高菸草抗凍性能的相關報導，包括專利和文獻。發明內容
本發明的第一目的就是提供一種利用基因工程技術提高菸草抗凍性能的方法，該方法將來源於喜樹的丙二烯氧化物環化酶基因轉到菸草中。
本發明的第二目的是提供一種高效表達載體，它包含上述喜樹的丙二烯氧化物環化酶基因片斷。
本發明的第三目的是提供一種用上述高效表達載體轉化的宿主細胞。在實例中該宿主細胞是菸草。
本方法的技術方案如下本發明分離出的DNA分子，具有編碼丙二烯氧化物環化酶的核苷酸序列的核心片斷， 該核心片斷來源於由申請人在GenBank中登錄的喜樹iCamptotheca丙二烯氧化物環化酶基因(登錄號AY863428)的核苷酸序列,用引物Pl (5』-gg actaRt Atg get get tea tea act tc_3』，酶切位點用下劃線表示)和 P2 (5』-ga ggttacc Tea gtc agt gaa gtt agg aa_3』，feiEII酶切位點用下劃線表示),採用PCR法可以從喜樹cDNA文庫中擴增出該核心片斷，喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的cDNA序列見SEQ ID N0:1，其全長 1129bp，開放閱讀框位置為第72位鹼基到第812位鹼基。
本發明提出的利用轉基因技術提高菸草抗凍能力的方法，是利用具有編碼喜樹丙二烯氧化物環化酶(AOC)的核苷酸序列(Genbank No. :AY863428)的植物表達載體,採用轉基因方法在菸草細胞、組織、器官、植株中過量表達喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的DNA分子。
其具體步驟如下(1)採用任何可能的手段(如基因克隆、人工合成基因等方法)獲得喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的核心片斷；(2)把喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷可操作地連於表達調控序列，形成表達載體；(3)採用任何轉基因方法轉移喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷到菸草細胞、組織、器官、植株中；(4)在特定的條件下篩選和鑑定轉化子；(5)在適合的條件下培養抗凍性能提高的菸草轉化子，獲得轉基因後代。
本發明涉及的載體包含具有編碼喜樹丙二烯氧化物環化酶的核苷酸序列的核心片斷的DNA。
用上述方法獲得的生命體，它是抗凍性能提高了的菸草的細胞、組織、器官、植株。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒等。在本發明中，術語「生命體」指菸草的細胞、組織、器官，或植株。
在本發明中，術語「任何可能的手段」為獲得喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的方法，具體包括同源性克隆(如RT-PCR、RACE等)、文庫篩選而後人工合成喜樹丙二烯氧化物環化酶基因及其變異體。
在本發明中，術語「任何轉基因方法」包括根癌農桿菌Ti質粒介導基因轉化、髮根農桿菌Ri質粒介導基因轉化、植物病毒載體介導基因轉化、PEG介導基因轉化、脂質體介導基因轉化、電擊法介導基因轉化、超聲波介導基因轉化、顯微注射介導基因轉化、雷射微束介導基因轉化、基因槍介導基因轉化、花粉管通道介導基因轉化、生殖細胞浸泡法介導基因轉化。
在本發明中，術語「在特定的條件下篩選和鑑定轉化子」是指在離體培養的條件下用抗生素(卡那黴素、潮黴素、G418等)選擇出有抗生素抗性的轉化子；可以使用PCR、 Southern雜交、Northern雜交和Western印跡等方法來鑑定轉化子。
在本發明中，術語「在適合的條件下培養抗凍性能提 高的菸草轉化子，獲得轉基因後代」是指對經過鑑定的轉化子離體培養，並檢測抗凍性能，篩選抗凍性能提高的優良轉化子進行培養，獲得轉基因後代。
本發明從喜樹中克隆丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷，並構建了植物高效表達載體，導入農桿菌並遺傳轉化菸草，以提高菸草的抗凍性能，提高了菸草的種質，增強了栽培適宜性。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件， 例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例1 喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷的合成，及表達載體和工程菌的構建。
1、喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷的獲得根據喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的全長序列，在該基因的內部第72鹼基至第812鹼基之間設計引物，擴增741bp序列作為基因片斷，並根據植物表達載體PCAMBIA1304的多克隆酶切位點，分別設計兩條含有5^1和^siEII限制性內切酶位點以及保護鹼基的PCR擴增引物，其引物序列為Pl 5' -ggactagtAtggctgcttcatcaacttc-3' (SEQ ID NO:2) ,酶切位點用下劃線表示P2 5' -gaggttaccTcagtcagtgaagttaggaa-3' (SEQ ID NO 3) , ifeiEII 酶切位點用下劃線表示從喜樹的葉片抽提總RNA (上海華舜生物工程有限公司植物RNA提取試劑盒)，反轉錄成cDNA(TaKaRa RNA PCR Kit)，然後進行PCR擴增，PCR反應體系為50 μ L，包含去離子水， 10XPCR 緩衝液 5yL，dNTP I μ LjMgCl2 3 μ L，引物各 I μ L，cDNA 模板 I μ L，Taq 酶 O. 5 μ L。 PCR條件為94° C 3分鐘，隨之以94° C 50秒、60° C 50秒、和72° C 50秒進行28個循環，最後在72° C延伸8分鐘。1%瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產物，獲得擴增片斷長度為 758bp0
電泳分離後，回收(上海華舜生物工程有限公司PCR產物回收試劑盒)目的片斷， 取適量回收產物與pMD 18-T載體(TaKaRa PMD 18-T Vector試劑盒)連接後轉入大腸桿菌 DH5a，在LB+氨苄青黴素(lOOmgL—1)固體培養基上抗性篩選陽性克隆，PCR鑑定後測序(上海博亞生物工程公司完成)。
2、CaMV35S組成型啟動子表達載體pCAMBIA-CaAOC的構建將經過測序驗證正確後的DH5 α (已經轉入帶有喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷的pMD 18-T載體)搖菌，擴大培養，提取質粒，用5^1和fciEII雙酶切，1%瓊脂糖電泳後回收小片斷。
將pCAMBIA1304用5^1和fciEII雙酶切，1%瓊脂糖電泳後回收大片斷。
將回收的pCAMBIA1304大片斷和喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷用T4連接酶連接後，轉化DH5a感受態細胞，LB+卡那黴素(100 mgL—1)固體培養基上篩選陽性抗性克隆，PCR和雙酶切鑑定。獲得轉喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷的重組質粒並命名為 pCAMBIA1304-CaA0C。
3、pCAMBIA1304-CaA0C 轉化農桿菌 EHA105將pCAMBIA1304-CaA0C轉化入農桿菌菌株EHA105，劃板挑取陽性單菌落搖菌，取少量菌液抽提質粒，進行PCR和酶切鑑定。陽性克隆定義為EHA105-CaA0C。
實施例2獲得抗凍能力提聞的轉基因菸草。
1、農桿菌EHA105-CaA0C。使用前自冰箱取出，接種於50 ml YEB液體(Rif+，Str+， Kan+), 28度，200rpm振蕩培養兩次。
2、第二次活化OD600達O. 3時加100 μ mo I Γ1乙醯丁香酮，繼續28度，200rmp振蕩培養，OD600達O. 6時室溫下4000rpm離心10分鐘。
3、棄上清，菌體用MS (加100 μ mo I Γ1乙醯丁香酮)液體培養基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的0D_=0. 3左右，稱轉化液。
4、取菸草無菌苗的幼嫩、健壯葉片，去主脈，將葉片剪成O. 8 cmX0.8 cm左右的葉盤，放在MS (加I mg Γ1 6-苄氨基嘌呤，I mg L—1萘乙酸)培養基上，防止葉盤脫水；將葉盤放入農桿菌培養液中，190 rpm, 28°C搖床上浸染10 min ;用藥勺撈出葉盤，放在滅菌的吸水紙上，吸乾葉盤上的多餘菌液；將吸乾的葉盤平放在加蓋一層濾紙的MS (加I mg Γ1 6-苄氨基嘌呤，I mg L—1萘乙酸)培養基上，25°C左右，於暗處共培養約2天。
5、共培養後，按以下步驟將葉盤表面的農桿菌洗掉，其間不時搖動，使葉盤充分接觸溶液a)無菌水15分鐘 b)無菌水+羧節青黴素(500mg L—1)15分鐘c)MS+羧苄青黴素(500 mg I/1)20分鐘接著用藥勺撈出葉盤，放在吸水紙上，吸乾多餘水分；將葉盤放在MS (含30 mg Γ1潮黴素和250 mg Γ1羧苄青黴素)培養基上，葉盤邊緣輕壓入培養基中；25°C左右，16 h/24 h光照培養；約20天後可見分化芽長出，待芽長大後，切下，置於MS(含O. 5 mg Γ1萘乙酸、 30 mg/T1潮黴素和250 mg/T1羧苄青黴素)培養基上進行生根培養；約14天之後將幼苗移栽到裝有1:1:1的泥炭土、蛭石和珍珠巖混合物小型的塑料花盆中在25 °C、14 h光/24 h 的條件下生長。
6、用PCR分別檢測潮黴素抗性基因和喜樹丙二烯氧化物環化酶基因在轉基因菸草的基因組中的整合，確認轉基因事件。
實施例3轉基因菸草和非轉基因菸草對照的抗凍能力檢測1、比較轉基因和非轉基因菸草抗凍能力，用菸草葉片低溫處理後的離子洩漏率來表徵其對低溫的耐受性能。(參考文獻Wallis，J. G., Wang, H. Y., and Guerra, D. J. (1997) Expression of a synthetic antifreeze protein in potato reduces electrolyte release at freezing temperatures. Plant Mo1. Biol. 35, 323-330 ； Nunes, M. E. S. and Smith, G. R. (2003). Electrolyte leakage assay capable of quantifying freezing resistance in rose clover. Crop ScL 43, 1349-1357)；2、分別稱取對照和轉基因菸草生長期和生長狀態較一致的葉片每份0.5克，用去離子的蒸餾水衝洗三次，放入一 20° C處理30分鐘；3、在室溫解凍I小時，每份樣品中加入30ml超純水，再於25°C、100 rpm振蕩2小時，用數字式電導率儀測定溶液的電導率Re ；4、接著將樣品在原溶液中煮沸30min，再測定溶液的電導率Re』 ；5、定義相對電導率=Rc/Rc』X 100% ；6、六個被檢測的轉基因系都顯示出對低溫處理較高的耐受性。經過-20°C處理後， 六個轉基因系植株的葉片離子的洩漏率分別為15. 04% (1. 81%)，15. 51% (1. 94%)，12. 82% (1. 18%), 17. 28 % (3. 64%), 11. 07% (O. 86%), 23. 45% (4. 96%);野生型菸草-20。C 處理後的離子洩漏率為75. 65% (2. 62%);轉空載體對照菸草-20° C處理後的離子洩漏率為74. 36% (3.52%)。其中括號中為標準偏差。轉基因菸草的離子洩漏率水平為空白對照和空載體對照的四分之一左右。
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，具有編碼丙二烯氧化物環化酶的核苷酸序列的核心片斷， 該核心片斷來源於丙二烯氧化物環化酶基因的核苷酸序列，用引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO: 3，採用PCR法從喜樹cDNA文庫中擴增獲得，喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的cDNA序列見SEQ ID NO :1，其全長1129bp，開放閱讀框位置為第72位鹼基到第812位鹼基。
2.—種高效表達載體,其特徵在於它包含如權利要求1所述的DNA分子。
3.一種用如權利要求2所述高效表達載體轉化的宿主細胞。
4.一種利用基因工程方法增強菸草抗凍性能的方法，其特徵在於利用具有編碼喜樹丙二烯氧化物環化酶的核苷酸序列的植物表達載體，採用轉基因方法在菸草細胞、組織、器官或植株中過量表達喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的DNA分子；其具體步驟如下(1)採用基因克隆或人工合成基因方法獲得喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的片斷；(2)把喜樹丙二烯氧化物環化酶基因片斷連於表達調控序列，形成植物高效表達載體；(3)採用轉基因方法轉移喜樹丙二烯氧化物環化酶基因片斷到菸草的細胞、組織、器官或植株中；(4)篩選和鑑定轉化子；(5)培養轉化子，獲得轉基因後代；(6)測定轉基因後代的抗凍性能。
全文摘要
本發明屬於分子生物學以及基因工程技術領域，具體為一種利用喜樹AOC基因轉化提高菸草抗凍性能的方法。本發明包含利用喜樹丙二烯氧化物環化酶(AOC)基因構建植物表達載體，利用基因工程技術在菸草中過量表達喜樹AOC基因，增強菸草抗凍性能。其過程是從喜樹中克隆AOC基因，構建了植物高效表達載體，導入農桿菌並遺傳轉化菸草，測定轉基因菸草葉片低溫處理後的電導率。本方法可以在菸草中過量表達喜樹AOC基因，提高菸草的抗凍性能。
文檔編號C12N15/61GK102994533SQ20121057805
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者皮妍, 崔勇, 蔣科技, 孫小芬 申請人:復旦大學