調控植物株高的基因及其應用的製作方法

2023-10-27 14:35:52 1

專利名稱：：調控植物株高的基因及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於基因技術和植物學領域；更特別的，本發明涉及調控植物株高的基因及其應用。
背景技術：
：當前，對於農作物高產育種的選育主要集中在株型和穗部性狀的改良。由於品種的改良，目前已經培育出多種高產農作物品種。然而，當前的許多高產作物如水稻高產栽培品種尤其超級雜交稻存在一定的株高過高問題，導致容易倒伏、產量潛力受到限制的問題。這在很大程度上影響了作物產量的進一步提高和高產品種的推廣。因此，本領域有必要研究可調節農作物株高的方法，從而進一步改良農作物的性狀，提高農作物的產量。
發明內容本發明的目的在於提供調控植物株高的基因及其應用。在本發明的第一方面，提供一種分離的作物株高調節多肽，該多肽選自下組(a)具有SEQIDNO:3所示胺基酸序列的多肽；或(b)將SEQIDNO:3所示胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有調節作物株高功能的由(a)衍生的多肽。在另一優選例中，該多肽是具有SEQIDNO:3所示胺基酸序列的多肽。在本發明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼所述多肽的多核苷酸；或(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。在另一優選例中，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO:3所示胺基酸序列的多肽。在另一優選例中，該多核苷酸的序列具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列。在本發明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體。在本發明的第五方面，提供一種多肽的製備方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出作物株高調節多肽。在本發明的第六方面，提供所述的多肽的用途，用於調節作物的株高、體積、分櫱、產量、花器大小或種子大小；或製備調節作物的株高、體積、分櫱、產量、花器大小或種子大小的物質。在本發明的第七方面，提供一種調節作物株高、體積、分櫱、產量、花器大小或種子大小的方法，所述方法包括調節作物中作物株高調節基因的表達或活性。在另一優選例中，通過提高作物中作物株高調節基因的表達或活性，降低作物株高、體積，增加作物分櫱、產量；通過抑制作物中作物株高調節基因的表達或活性，增加作物花器大小，增加種子大小，提高作物株高或體積。在本發明的第八方面，提供一種所述的作物株高調節多肽或其編碼基因的激動劑或拮抗劑。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1顯示了野生型擬南芥(WT)和AtEuilb過表達轉基因擬南芥植株(AtEuilb-0E)的俯視圖。其中，AtEuila過表達轉基因擬南芥植株(AtEuila-0E)和0sEui過表達轉基因擬南芥植株(OsEui-0E)植株作為對照。圖2顯示了野生型擬南芥(WT)和AtEuilb/AtEuilaRNAi擬南芥植株的生長狀況比較圖。圖3顯示了AtEuilb/AtEuilaRNAi擬南芥植株與野生型擬南芥植株(WT)的花器官和種子生長狀況比較圖。圖4顯示了AtEuilb啟動子啟動GUS報告基因的組織特異性表達。其中，箭頭所指處區域為顯示藍色的區域。圖5顯示了野生型水稻植株(TP309)和AtEuilb過表達水稻植株(AtEuilb-0E)的生長狀況比較。圖6顯示了野生型水稻植株(TP309)和AtEuilb過表達水稻植株(AtEuilb-OE)的株高的統計值。圖7顯示了野生型水稻植株(TP309)和AtEuilb過表達水稻植株(AtEuilb-OE)的有效分櫱數的統計值。圖8顯示了野生型水稻植株(TP309)和AtEuilb過表達水稻植株(AtEuilb-OE)的單株粒重的比較。具體實施例方式本發明人經過廣泛的研究，揭示了一種對於調節作物株高、體積、分櫱、產量、花器官大小或種子大小有用的基因AtEuilb。提高該基因的表達可降低作物的株高、體積，增加作物的有效分櫱和產量；降低該基因的表達可增大作物的花器和種子。在此基礎上完成了本發明。如本文所用，所述的"作物"包括但不限於禾本科植物、十字花科植物、木本科植物等。更優選的，所述的禾本科植物包括但不限於水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等；或所述的十字花科植物包括但不限於擬南芥。如本文所用，"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境〉。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，"分離的作物株高調節多肽"、"分離的AtEuilb蛋白"或"分離的AtEuilb多肽"是指AtEuilb蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化AtEuilb蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選的是重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括AtEuilb蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發明的AtEuilb蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。在本發明中，術語"AtEuilb蛋白"指具有AtEuilb蛋白活性的SEQIDNO:3序列的多肽。該術語還包括具有與AtEuilb蛋白相同功能的、SEQIDN0:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為l-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1-8個或1-5個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括AtEuilb蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與AtEuilb蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗AtEuilb蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含AtEuilb蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了AtEuilb蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有AtEuilb蛋白序列的至少約20個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。本發明還提供AtEuilb蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然AtEuilb蛋白的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如e、Y-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，"AtEuilb蛋白保守性變異多肽"指與SEQIDNO:3的胺基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。表1tableseeoriginaldocumentpage7本發明還提供了編碼本發明AtEuilb蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。MA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQIDNO:2所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，"簡併的變異體"在本發明中是指編碼具有SEQIDNO:3的蛋白質，但與SEQIDNO:2所示的編碼區序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDNO:3的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，"嚴格條件"是指(l)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS，60°C;或(2)雜交時加有變性劑，如50。/。(v/v)甲醯胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，"。C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO:3所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少IOO個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼AtEuilb蛋白的多聚核苷酸。應理解，雖然本發明的AtEuilb基因優選獲自擬南芥，但是獲自其它植物的與擬南芥AtEuilb基因高度同源(如具有80y。以上，如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它基因也在本發明考慮的範圍之內。比對序列相同性的方法和工具也是本領域周知的，例如BLAST。本發明的AtEuilb蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，己經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或AtEuilb蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。通過常規的重組DNA技術(Science,1984;224:1431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的AtEuilb蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼AtEuilb蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。本發明中，AtEuilb蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語"重組表達載體"指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含AtEuilb蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的卡那黴素或氨苄青黴素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、水稻幼胚轉化法等。對於轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得性狀發生改變的植物。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。重組的AtEuilb蛋白有多方面的用途。例如用於篩選促進或對抗AtEuilb蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組AtEuilb蛋白篩選多肽庫可用於尋找有價值的能抑制或刺激AtEuilb蛋白功能的多肽分子。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(raicroarray)或DNA晶片(又稱為"基因晶片")上，用於分析組織中基因的差異表達分析。用AtEuilb蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測AtEuilb蛋白的轉錄產物。本發明還涉及一種改良作物的方法，該方法包括調節所述植物中AtEuilb基因或其同源基因的表達或活性。促進還是抑制AtEuilb的表達或活性主要取決於作物所需改良的性狀而定。當需要降低作物株高、體積，增加作物分櫱、產量時，可通過提高作物中AtEuilb的表達或活性來實現；當需要增加作物花器大小，增加種子大小，或提高作物株高或體積時，可通過抑制作物中作物株高調節基因的表達或活性來實現。增加AtEuilb基因或其同源基因表達的方法是本領域周知的。例如，可通過轉入攜帶AtEuilb編碼基因的表達構建物使植株過表達AtEuilb;或可通過用強啟動子驅動從而增強AtEuilb基因或其同源基因的表達；或者通過增強子(如水稻waxy基因第一內含子、Actin基因第一內含子等)來增強該AtEuilb基因的表達。適用於本發明方法的強啟動子包括但不限於35s啟動子、水稻、玉米的Ubi啟動子等。抑制AtEuilb基因或其同源基因表達的方法也是本領域周知的。例如，可通過RNA幹擾(RNAi)或基因沉默(敲除)的技術來實現。作為本發明的一種優選方式，獲得AtEuilb高表達的植株的方法如下(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有AtEuilb蛋白的DNA編碼序列；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(l)中的農桿菌接觸，從而使該AtEuilb蛋白DNA編碼序列轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入所述AtEuilb蛋白DNA編碼序列的植物細胞或組織；和(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織再生成植株。其中，可採用任何適當的常規手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實施此方法。本發明還包括AtEuilb蛋白或其編碼基因的拮抗劑或激動劑。由於AtEuilb的拮抗劑或激動劑可調節AtEuilb的活性或表達，因此，所述的AtEuilb的拮抗劑或激動劑也可通過對AtEuilb的影響來調節作物株高、體積、分櫱、產量、花器大小或種子大小等，從而達到性狀改良的目的。所述的AtEuilb的拮抗劑是指任何可降低AtEuilb的活性、降低AtEuilb的穩定性、下調AtEuilb的表達、減少AtEuilb有效作用時間、或抑制AtEuilb的轉錄和翻譯的物質，這些物質均可用於本發明，作為增加作物花器大小，增加種子大小，或提高作物株高或體積有用的物質。所述的AtEuilb的激動劑是指任何可提高AtEuilb的活性、維持AtEuilb的穩定性、促進AtEuilb表達、延長AtEuilb有效作用時間、或促進AtEuilb的轉錄和翻譯的物質，這些物質均可用於本發明，作為降低作物株高、體積，增加作物分櫱、產量有用的物質。在本發明的一個實例中，提供了一種AtEuilb基因，其基因組序列如SEQIDN0:1所示，其中開放閱讀框(ORF)位於第61-353，1363-1585，1690-1943'2028-2414，2559-2979位，全長cDNA(SEQIDNO:1)為1578bp，編碼一個含有525個胺基酸的蛋白質(SEQIDNO:3)。所述的AtEuilb基因可以為作物的株高、體積、產量、分櫱等方面的改良提供新的途徑，因而具有巨大的應用前景。本發明的主要優點在於(1)首次分離得到一種新的作物株高調節基因，該基因具有調節作物株高、體積、分櫱、產量、花器大小或種子大小的作用，因而可極好地應用於作物品種的改良。(2)適當的矮杆和有效分櫱的增加是高產品種育種的理想株型，本發明的基因轉入作物後可降低作物株高，用於矮化育種；例如在禾本科作物上通過不同的表達水平，對品種進行不同程度株高的降低、增加有效分櫱、提高產量。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)或PCR引物實驗室指南(CarlW.Dieffenbach禾口GabrielaS.Devkslereds.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。材料1.植物材料1.1擬南芥(Arabidopsisthaliana),生態型為Columbia(Col-0)。T-DNA插入突變體AtEuila(SALK—016089)。水稻品禾中-臺北309(0ryzasativasspJaponica.cvTaipei309)1.2菌種和質粒載體農桿菌(Agrobacteriumt騰faciens):GV3101(參見Narasimhulu,S.B等，Gelvin.1996.Earlytranscriptionofvigro/a"e"'腳t-讓genesintobaccoandmaize.PlantCell8:873-886)、EHA105(參見Hood,E.E.等，1993，New爿gro/a"ej"i咖helperplasmidsforgenetransfertoplants.Transgen.Res.2:208-218)。質粒載體pBluescriptSK(pSK):購自Invitrogen公司。pCambial300S:pCambial300RS購自CAMBIA公司。pBI101.1:購自Invitrogen公司。pGEM-TEasy載體購自Promega公司。RNAi載體1300RS:購自美國Arkansas州立大學。1.3試劑和酶T4DNA連接酶、各種核酸限制性內切酶和化《畫A聚合酶購自MBIFerment,TaKaRa、NewEnglandBiolabs、Promega。DNA片段的割膠回收試劑盒購自Omega。ReverseTranscriptionSystem購自GIBC0BRL。核酸分子量標準為MBI產品。pGEM-Teasy載體購自Promega(Madison，USA)。(a-32P)dCTP購自亞輝生物工程公司(北京)。反轉錄試劑盒採用SuperscriptFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR(#11904-018,Invitrogen)系統。其它常規化學試劑均為進口原裝、進口分裝或國產分析純。各種脫氧核苷酸引物由上海Sangon合成。DNA序列由上海基康，上海英俊公司測定，序列分析用Genedoc,DNAStar等軟體完成。方法1.擬南芥種植、轉化擬南芥無菌培養時，種子經表面(70%乙醇，30秒；無菌水衝洗4次)和深層(7%次氯酸鈉，IO分鐘；無菌水衝洗3次)消毒後，播於1/2MS(1/2XMurashigeandSkoogbasalmedium,0.8%瓊脂粉，pH5.8)固體培養基上，4i:放置72h，然後轉入22。C培養。一周後，將幼苗移栽於浸透營養液(3g/10L花無缺，上海永通化工有限公司)的人工土壤(蛭石、黑土和珍珠巖為3:1:0.5)中，然後轉入人工氣候室在光周期為14/10(L/D)中培養。擬南芥轉化採用噴灑法，取生長狀況良好的4-5周齡植株(轉化前一周剪去主苔，利於側苔抽出產生更多的花苞，提高轉化效率)。將含有轉基因載體的農桿菌於28。C培養至0D6。。"2.0，4,000rpm離心10min，菌體沉澱懸浮於新鮮配製的轉化液(1/2MS液體培養基含5%蔗糖，0.02%SilwetL-77)中，至終濃度OD6。。"0.6-0.8。轉化前，將已授粉花以及果莢去除，並使土壤吸足水。轉化時將菌液均勻噴灑擬南芥，至葉片上有液滴落下，將植物用黑色的塑膠袋覆蓋保持溼度，避光過夜。24小時候後將植物轉移到正常條件下生長。7天(d)後按上述方法重複轉化1次。待種子成熟後將植株混合採收於紙袋中，在乾燥器中放置7d後脫粒。Tl代種子消毒後播種在含有50Pg/mlKan或者潮黴素的1/2XMS培養基上，4'C放置72h，然後正常光照培養。2農桿菌介導的水稻成熟胚愈傷的基因轉化(1)水稻成熟胚愈傷的誘導水稻307T種子去殼，70%乙醇浸泡1分鐘，20%(v/v)NaCL0浸泡20-30分鐘，並不停搖晃，用無菌水漂洗5-6次。無菌濾紙洗幹，播於MSD培養基誘導愈傷，26。C暗培養。一周後，剔去胚乳、胚芽、胚根等，剝取愈傷組織，並繼代於MSD上暗培養。每2-3周繼代一次。如用TP309種子剝取愈傷，培養基用腳。(2)準備轉化用菌液第一天上午從-70。C保存的菌種中挑少許於5mlYEB(Rif20mg/L+Kan50mg/L)液體培養基，28"C振蕩培養過夜。第二天上午從含有農桿菌的YEB培養液中吸取1-2ml，轉入25-50mlAB(20mg/LRif+50mg/LKan)液體培養基中培養，28。C培養4小時左右至0D6。。=0.5左右。(3)共培養第二天下午測OD,值，菌液離心5，000rpm，15分鐘，菌體沉澱懸浮於AAM(含AS100)至菌液006。。=0.4-0.6。將菌液倒入裝有水稻愈傷的三角瓶中，使愈傷浸泡其中20分鐘，並不時搖晃；用無菌紙吸乾菌液(或用吸管吸乾菌液)，把已浸泡過的愈傷組織轉移到墊有一層無菌濾紙的含2.5%Phytagel的NBD(AS100)培養基上共培養2-3天。每皿再加lralAAM(+AS100)培養液充分溼潤無菌濾紙。(4)篩選將愈傷組織用無菌濾紙吸乾(換一次濾紙)，轉至含潮黴素(hygroraycin，Hyg)的篩選培養基上篩選抗性愈傷(暗培養30天左右，中間換一次篩選培養基)。篩選培養基第一次篩選用含0.26%PhytagelMS+Timentin100mg/L+Hyg30mg/L;第二次篩選用含0.26%PhytagelNBD+Timentin100mg/L+Hyg50mg/L;第三次篩選用含0.26%PhytagelMS+Timentin100mg/L+Hyg50mg/L。(5)預分化將篩選的水稻愈傷轉至預分化培養基，培養io天。預分化培養基含0.45%Phytagel的MS+BAP2mg/L+NAA1mg/L+ABA5mg/L+Hyg50mg/L，pH5.7，無2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。(6)分化將經過預分化的水稻愈傷轉至分化培養基上分化成苗(光照，15-30天)。分化培養基含0.45%Phytagel的NB+BAP3mg/L+NAA0.5mg/L，pH5.7，無2,4-D。(7)生根將綠色小苗轉至生根培養基上長根。生根培養基含0.45%Phytagel的1/2MS+Hyg50mg/L，pH5.7，無2，4-D。3.載體構建A55".vJMw76載體構建利用RT-PCR的方法擴增AtEuilb的cDNA編碼區序列。具體步驟如下使用脂easyPlantMinikit(Qiagen)，按照說明書提供的方法分離擬南芥的總賺，分離到的總RNA使用M-MLVreversetranscriptase(Promega)進行反轉錄產生AtEuilb的cDNA。使用TakaraperobestDNA聚合酶以cDNA作為模板進行PCR反應擴增AtEuilb的cDNA編碼區序列。所用引物上遊(SEQIDNO:7):5'-TGAGGATCCAAATAAAATAAAAAG-3，(劃線部分分別為萬^zHI位點)；下遊(SEQIDNO:8):5，-AAAGTCGACCACACACAAAGCAAA-3，(劃線部分分別為67al位點)。PCR條件94。C變性3min;94。C變性30s，58。C復性30s，72。C延伸2min擴增35個循環；72。C保溫10min。16。C保溫。PCR產物回收，然後用5s歷HI和"3l進行雙酶切，回收並與進行了同樣雙酶切與回收過程的pSK載體連接，轉化大腸桿菌DH5a，選酶切正確的克隆測序。測序正確後，再用和C7sl切下^^/i"的cDNA編碼區序列，連入同樣經5aMH和C7al雙酶切的雙元表達載體pCambial300S構建轉基因克隆，轉大腸桿菌DH5a。提質粒，酶切鑑定正確的質粒轉入農桿菌GV3101和EHA105。從農桿菌中提取質粒再轉入DH5a中，提取質粒並且酶切驗證，確定正確的質粒已經轉入農桿菌中。分別採用噴灑法轉化擬南芥產生轉基因植株和農桿菌介導的水稻成熟胚愈傷的基因轉化獲得水稻轉基因植株。pAtEuilbpromoter::GUS載體構建根據Genbank上檢索到的序列(GeneID:832559)，在爿Ww7力基因翻譯起始位點上遊1.4kb範圍內設計上下遊引物，以擬南芥Columbia野生型7天小苗提取的基因組DNA為模板進行PCR。引物如下上遊(SEQIDNO:9):5'-CTGCTGCAGACTCTATTTCCA-3,(下劃線處為酶切位點Pstl);下遊(SEQIDNO:10):5'-TTCAGGATCCTTTACTTTTTATTTT-3'(下劃線為酶切位點BamHI)。擴增條件為94。C變性3min;然後94。C變性30s，58。C退火30s，72。C延伸2rain擴增35個循環；72。C保溫10min。16。C保溫。PCR產物Pstl/BamHI酶切後連入pSK載體的Pstl/BaraHI相應位點。選酶切正確的克隆測序，測序正確的克隆再用Pstl/BamHI切下力^^7Z;啟動子部分，連入同樣經Pstl/BamHI雙酶切的雙元表達載體pBI101.1，轉大腸桿菌DH5a。提質粒，酶切鑑定正確的質粒轉入農桿菌GV3101。從農桿菌中提取質粒再轉入DH5a中，提取質粒並且酶切驗證，確定正確的質粒已經轉入農桿菌中。同時將pBI101.1載體轉入GV3101分別作為陰性和陽性對照。AtEuilb在AtEuila的T-DM插入突變體背景下的RNAi轉基因植株構建使用RNAi載體1300RS構建轉基因克隆，在/IM"iM基因的第四外顯子上擴增約500bp的序列，以擬南芥Columbia野生型7天小苗提取的基因組DNA為模板進行PCR。引物如下上遊(SEQIDNO:11):5'-AATGGTACCACAAGAAACAA-3，(下劃線處為酶切位點Kpnl);下遊(SEQIDNO:12):5'-TCTAGATTTGAGCTGAAAAAA-3，(下劃線為酶切位點Xbal)。擴增條件為94。C變性3min;然後94。C變性30s，5(TC退火30s，72。C延伸30s擴增35個循環；72。C保溫10min。16。C保溫。PCR產物Kpnl/Xbal酶切後連入pSK載體Kpnl/Xbal相應位點。選酶切正確的克隆測序，測序正確的克隆再用Kpnl/Xbal切下AtEuilb部分片斷，同樣經Kpnl/Xbal雙酶切的雙元表達載體1300RS，轉大腸桿菌DH5a。提質粒，酶切鑑定正確的質粒轉入農桿菌GV3101。從農桿菌中提取質粒再轉入DH5a中，提取質粒並且酶切驗證，確定正確的質粒已經轉入農桿菌中。採用噴灑法轉化AtEuila的T-DNA插入突變體，從而獲得在AtEuila的T-DNA插入突變體背AtEuilbRNAi轉基因擬南芥植株(AtEuilb/At:EuilaRNAi)。JWW76基因的克隆本發明人通過擬南芥基因組序列的搜索和生物信息學的研究，發現2個P450單加氧酶714A1與714A2基因，初步預計它們參與赤黴素控制的植物生長發育，本發明人將它們命名為AtEuila和AtEuilb。其中，AtEuilb基因編碼區基因組序列(genomicDNA)如SEQIDNO:1所示;AtEuilb基因編碼區cDNA序列如SEQIDNO:2所示;AtEuilb蛋白序列如SEQIDN0:3所示。AtEuila基因編碼區基因組序列如SEQIDNO:4所示；AtEuila基因編碼區c腦A序列如SEQIDNO:5所示；AtEuila蛋白序列如SEQIDNO:6所示。實施例2AtEuilb過表達轉基因擬南芥降低株高與體積本實施例中，本發明人分別製備了可過表達擬南芥AtEuilb、AtEuila和水稻OsEui的轉基因擬南芥植株。以野生型(wt)、過表達擬南芥AtEuila(AtEuila-OE)和水稻0sEui的轉基因植株為對照。在培養各植株約4周後，檢測植株的生長狀況，結果見圖l。由該圖可見，野生型的擬南芥生長得最大；過表達擬南芥AtEuilb的植株比野生型明顯小；而過表達擬南芥AtEuila和水稻OsEui的植株生長得最小。本發明人在培養各植株約7周後分別測量了野生型、過表達擬南芥AtEuilb、AtEuila和水稻OsEui的轉基因擬南芥植株的株高，它們的株高平均值依次是26.2cm，14.2cm，9.63cm，3.7cra，因此AtEuilb過表達轉基因擬南芥的株高明顯低於野生型。實施例3AtEuilbRNAi或敲除突變體增加植株髙度或體積本實施例中，本發明人製備了在Xti;'"ih的T-DNA插入突變體背景F力f，&乃RNAi轉基因擬南芥植株(AtEuilb/AtEuilaRNAi)，和AtEuilb被敲除(konckout)的擬南芥植株變異體。培養兩種植株約10天後，觀察AtEuilbRNAi或敲除突變體對於株高或體積的影響，以相同培養條件的野生型植株為對昭。AtEuilbRNAi的植株與野生型植株的生長狀況見圖2所示，與野生型植株相比，AtEuilbRNAi的植株的葉片面積明顯增加，株高明顯增加，體積明顯增加。另外，與野生型植株相比，AtEuilb敲除突變體也存在明顯的葉片面積增加、株高增加、體積增加現象。由此可見，降低或沉默AtEuilb的表達可增加植株高度和體積。也即AtEuilb是一種與降低植株高度和體積相關的基因。實施例4AtEuilbRNAi或敲除突變體增加花器與種子大小本實施例中，本發明人觀察了AtEuilbRNAi的擬南芥植株或AtEuilb被敲除的擬南芥植株的花器和種子的生長狀況，以野生型擬南芥的花器和種子為對照。AtEuilbRNAi的擬南芥植株與野生型擬南芥植株的花器和種子生長狀況如圖3所示，與野生型相比，AtEuilbRNAi的擬南芥植株的花器明顯增大，種子明顯增大。另外，與野生型植株相比，AtEuilb敲除突變體也存在明顯的花器增大，種子增大現象。由此可見，降低或沉默AtEuilb的表達可增加植株的花器和種子。也即AtEuilb是一種與減小花器和種子大小相關的基因。實施例5AtEuilb啟動子啟動GUS報告基因的組織特異性表達本實施例中，本發明人構建了p^fi/i76pr咖otejv.'05"載體，轉入農桿菌後製備擬南芥基因植株。利用常規的GUS報告基因檢測法觀察植株中GUS報告基因的表達情況。結果如圖4所示，可見GUS報告基因可在植株的莖、葉生長旺盛的部位表達，在植株的根部基本上沒有表達。因此，AtEuilb基因是一種組織特異性基因。實施例6AtEuilb過表達轉基因水稻降低株高本實施例中，本發明人製備了AtEuilb過表達的轉基因水稻植株(AtEuilb-0E)，觀察AtEuilb過表達對於水稻植株的影響，以相同條件下培養的野生型水稻植株TP309作為對照。在培養植株約110天後，植株的生長情況如圖5所示，可見AtEuilb過表達的轉基因水稻植株的株高明顯低於野生型。對於過表達AtEuilb植株和野生型植株的株高的統計圖見圖6所示。實施例7AtEuilb過表達轉基因水稻增加有效分櫱與產量本實施例中，本發明人檢測了AtEuilb過表達的轉基因水稻植株(AtEuilb-OE)和野生型植株TP309的分櫱數與產量，以論證AtEuilb過表達對於水稻分櫱與產量的影響。在培養植株抽穗後對有效分櫱進行分櫱數計數，統計結果如圖7所示。野生型植株的分櫱數約10個，而AtEuilb過表達植株的分櫱數為約20-22個。可見AtEuilb過表達可明顯增加植株的有效分櫱數。在植株成熟後，本發明人還統計了AtEuilb過表達植株和野生型植株的產量情況。結果如圖8所示，可見AtEuilb過表達的轉基因水稻植株的單株粒重明顯增加。實施例8AtEuilb蛋白變異體的功能用一編碼序列替換A55V.'力^^'M載體中的AtEuilbcDNA編碼區，所述編碼序列編碼的蛋白具有SEQIDNO:3類似的序列，不同處僅在於第522位為Leu的(AtEuilb野生型蛋白中為Ile)。同前述方法將該載體轉化農桿菌，製備轉基因植物。結果顯示，該轉基因植株的株高比野生型降低。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。序列表中國科學院上海生命科學研究院調控植物株髙的基因及其應用074112<160〉12Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉3040<212〉DNA<213〉擬南芥(Arabidopsisthaliana)<400〉160atggagagtttggttgttcagc犯tttggtgcatagttattgtcgg肌tc120ttcagcgtaggttatcatgtgtatgga卿gcggtggtggagcagtggaggatgcggagg180agtttaaagttgcaaggcgtgaagggtcctccaccgtcgatctttaacggcaatgtgtcg240gagatgcaacggattcagtcggaggctaaacactgttccggcgataacatcatttctcat300gactattcttcttctctatttcctcatttcgatcactggccggtttgttt360tttaaatctcgtttagtaca犯atgcatacEitataacaMtcatttaaat420cgtaaacteigaacaacat11ataaatctattaactacatatgaagtttcatttacacagt480ttttaagtttatgggtttgatattcgagccatatcatcgc540a犯tgcactagtggtt肌犯犯tatattgttttttgatag600ttttcattatatcttggcttctcatacattttaaataataaatccttc犯660tttttatggattttagaggtacttatcatttcaacttaggttttgaatggatcttgtggt720tagtgcggactaatccgtcagcggtgt犯tccatattatttttggggcgg780gctgtggatttagtct幼aggttagtgtgtagtgttttttUttgttttt840ttttagtcccactataatttatgaatggtaaat肌a肌gcgatccggttt900gtaaatgttattattcgtttggaccgctgtaaccattcaaaagtttctca960atacattttttattgttcEiaaagttaatgttcttcatagtagggtccatc1020ggcattgaacgtttcacttgaagacagctttgcaagcttt1080ttctcagttaacgttac3Cgcattaccagstag犯ga犯atatcccatca11403t3tatagaagaaacgtctgcatataggttattctaaatt1200aattagagaaatatgatccacgcacatatttacttaattg犯ttcaatacaaataaaagt1260tgtgcatgagcatgatgattgtgatttgggcgtggctgaacttgaacc犯gtttgatatt1320ggtttggagtaatttttttttaatacaaa3^cggt肪tgaagg卿g3tttacacatactc1380aagcagcaccccacccggaaatggtgaaggagcttagcca1440cttaaccttggtagaatcactcacatcaccaaacgccttaaccccattct1500cggcaatggcatcatcacctctaatgggcctcattgggcccatcaacgtcgtatcattgc1560cteitgagtttetcccetcg3C3tctattcacattgcgaact33tt333g3t31620tggatgtagatatatattgatttgaeieitattgttgtgattgcctgattgg1680tgaatggtgaagggaatggttggtttaatggtggaatctgccatgccaatgttgaacaaa1740tggga卿gatggtga肌eigaggag眺犯atgggttgtggicataagagtggacgaagac1800ctt犯ggatgtctcagctgatgtcatcgctaaggcttgctttgggagctctttttcaaaa1860tattctct3tcttttasccgacgaagcgtc1920ctcttcagattc犯tggcttcacgt鄉tttcgatatatttatUUtctetcttcttcca1980tgcaaaactatttctctatataa/tatagttgagtatacggtggcaagtgatatggtgttt2040ggaagtaagaagcatggtgatgtggatattgatgcgcttgagaatcttct2100atatgggaaacggtt卿gagaatgt犯ggatactcacaag33gg3tCt32160atgcagttgatactcgagggagcgatgcga鄉tgcgatggtaacttgtgggacaagtca2220gcctatagacaccgcagtctaaaattcgcgcctaatctcacattgaatgaacaatgagaccttggagacccgagaccccgggaatctcta3C3tgCgt3gtcaaagttcagtagagcctccttttataatggtttgtggtcagtgtcttgatg犯atcttatttatacactgttaatatatatacccaccttgtggtgcc卿tctgggg3ggcttgcaagcaaaaacttgttttactctaacatggtgtgatttaatttggacaattgcgtgccttatggagttcttgccttttatttaagcaccaatc犯卿gagtgaccagacgcaataccctcagtggtatgatgttccccgacttgtcattagggctttgtgtgaagagcatctctcctcgctc犯gaatggcagtgggaagagtgcatttgga犯cgacttcatcatacatcctatcagcactgttgtttgacttcgaatttcatttcgccggtcaatcctagttcccgacgcgaa犯cgttagcttattttatgacaatggtaagcatccaacactcattccagccag柳gcatttggccttgcttgtttcctccaagccatgtgttacgtacatgattcattggcaggttagaatcaattgag犯tttta犯tac33gaaagacataagatgccttacacgtttagtgagtgg3cc犯gaacttattgtctaaactccttgatccgtaga22802340240024602520258026402700276028202880294030003040〈210〉2〈211〉1578<212〉脆擬南芥(Arabidopsisthaliana)〈400〉2atgg卿gttttcagcgtagagtttaaagtgagatgcaacgactattctttacacatactgagcttagccaaccccattccgtatcattggaatctgccaggttgtgacagcttgctttgttaaccgccatttggaagtatctatstgggctaatgcagttcagcctatatcaaccgcaggttaaaattcattcctaatcgcaccaatcga卿gagtgtccagacgcaataccctcagtggtatgatggtccccgacttgtcattagggtggttgttcagttatcatgttgc卿gcgtggeittcagtccttctctattcaacggggtttcggc犯tggcctatgagtttgccaatgtttaagagtggaggagctctttttactaaacg卿agcatgga貼cggtt犯tgatactcgagacggtttgttctcagtgtcgcgatgaaattca犯acggttgggaagagagcatttggaccatacatccc肌gtga犯gtatcagcactcttgtttgagtatgg犯gag卿ggtcctggaggct犯atcctcatttcaaagcagcacacttaaccttcatcatcacctacccacgacg犯ca犯tggcgaagaccttttc￡i￡iaaggcaagcgtcctctgatgtggatgg卿ggg犯gggagcgatgggtggacaatttggtgccttcttgagttctactcattcctgcceigagaggatttggccttgcttgtttcatccaagccatgcaatttggtgcggtggtggccaccgtcgacactgttccggatcactggcctttacat犯ggtagaatcatctaatgggcg肌g柳tggaaggatgtctttcagattcaattgatgcgcattgaatgtacgaagctgcgtgc犯gagcaatgctcctcgtgcaagaatggeicataagacgccttacaccUtagtgaggcttattgtctaaactccttggcatagttatagcagtggagtctttaacgggcgataacataccacccggactcacatcacctcattgggcgaatggttggtgaaaagaggcagctgatgttctctatgatatggcttcacttgagatggaaggatactcaatggtaactttctatttcgcctctcaertccgcattcccgattggagacctgagaccccgagaatctct犯catgcgtaggc犯agttcagtagagcctcatgtcggaatcgatgcggaggcaatgtgtcgcatttctcatcggaaggattaatggtgaagca犯cgccttccatcaacgttttaatggtgcatcgctaagtagggatctttg由tggtgattag犯tctc犯g^ggatgtgggacaagcggacatgattagUggcagcgcagaatcatgtggtgccagatctggggaggcttgca犯caaaaac111ttttactcttacatggtgtt60120180240300360420480540600660720780840900960l咖1080114012001260132013801440150015601578<210〉3<211〉525〈212〉PRT<213〉擬南芥(Arabidopsisthali咖)3Met1lieValGlylie65AspTyrlieAsnGly145ArgGlyMetAspSer225LeuThrAlaArglie305SerAlaLeuSerLys385AlaLeuGluValGluPro50GinTyrGlyAsnLeu130AsnlieLeuValLeu210SerThrAspLeuGlu290LeuSerGlyGin35ProSerSerArgHis115GlyGlylieMetLys195lysPheAlaMetGlu275lieGluAlaTyrGlyHisAla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