石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白tctp及其編碼基因在抗魚類神經壞死病毒方面的應用的製作方法

2023-10-19 13:09:52 4

石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白tctp及其編碼基因在抗魚類神經壞死病毒方面的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP及其編碼基因在抗魚類神經壞死病毒方面的應用。本發明利用病毒滴度和實時定量PCR檢測了石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP對NNV病毒複製的抑制作用。本發明的石斑魚Ec-TCTP是一種具有抗病毒功能的翻譯控制腫瘤蛋白基因，用該基因構建真核表達載體，並將表達載體通過轉染方法導入石斑魚腦細胞中，得到能過量表達Ec-TCTP的穩定細胞，具有提高細胞對病毒感染的耐受能力；經實驗證明了石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白確實具有抑制RNA病毒複製的特點，石斑魚Ec-TCTP基因克隆和功能分析的研究將對進一步研究和開發抗病功能蛋白具有重要的科學價值和應用價值。
【專利說明】石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP及其編碼基因在抗魚類神 經壞死病毒方面的應用

【技術領域】：
[0001] 本發明屬於基因工程領域，具體涉及石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP及其編碼基 因在抗魚類神經壞死病毒方面的應用。

【背景技術】：
[0002] 翻譯控制腫瘤蛋白（Tranlationally Controlled Tumor Protein, TCTP)，又稱 P21、P23以及fortilin。對TCTP蛋白序列研宄分析發現，TCTP蛋白亞基具有2個典型的 特徵序列，TCTPl和TCTP2,並且帶有一個微管結合區（Gachet et al.，1999)和Ca2+結合區 域（Kim et al.，2000)。
[0003] 石斑魚，隸屬於自盧形目（Perciformes)、齠科（Settauida)、石斑魚亞科 (Epinephelina)。廣泛分布於印度洋和太平洋的熱帶海域，我國南海及東海南部均有分布， 其中南海較多，常年均可捕獲，以春、夏季為漁獲旺季。據魚類學家研宄記載，石斑魚屬種類 較多，全世界有400種以上，我國產的石斑魚亞科有13屬，79種，但目前僅有約6種石斑魚 可人工飼養，石斑魚肉質鮮美蛋白含量高，是一種經濟價值很高的食用魚類，也是我國創匯 的優良魚類品種（陸忠康，1996)。從20世紀90年代開始，石斑魚養殖進入了產業化養殖 階段。隨著石斑魚飼養密度的增加，魚體抵抗病原的侵襲和感染的能力有所降低，從而使一 些魚類疾病頻繁爆發，造成了重大的經濟損失。由於病毒具有的獨特生物學特性和魚類特 有的水生環境特點，使得魚類病毒性疾病具有很強的傳染性、致病性和嚴重的破壞力，已經 成為魚類重要的致病病源之一。魚類神經壞死病毒（nervous necrosis virus，NNV)，是一 種世界範圍內流行的海水魚類病毒病，主要發生在海水魚類種苗生產階段，是近幾年來石 斑魚苗種培育中危害最大的病原，魚苗死亡率高達90%以上，給石斑魚養殖業的發展帶來 嚴重的危害。目前對魚類病害的防治，主要是採用抗生素和化學藥物，造成了藥物殘留、耐 藥性及環境汙染等嚴重問題。為此，開展魚類免疫抗病的基礎研宄及研製新型抗病基因工 程製品已經成為當務之急。翻譯控制腫瘤蛋白TCTP廣泛存在於動物、植物和真菌中，參與 多種生物學過程，具有多種生物學功能，如抗凋亡、抗病毒等（Th aw et al.，2001)，應用潛 力很大。目前，石斑魚TCTP對神經壞死病毒的抗病毒作用還未見報導。


【發明內容】
：
[0004] 本發明的第一個目的是提供石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP在抗魚類神經壞死病 毒方面的應用。本發明利用病毒滴度和實時定量PCR檢測了石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP 對NNV病毒複製的抑制作用。
[0005] 所述的石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP，其胺基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0006] 本發明的第二個目的是提供石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP的編碼基因 Ec-TCTP 在抗魚類神經壞死病毒方面的應用。
[0007] 所述的石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP的編碼基因 Ec-TCTP，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1 所示。
[0008] 本發明是通過以下步驟來檢測石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP及其編碼基因對魚 類神經壞死病毒複製的抑制作用的：
[0009] (1)、根據已知的石斑魚Ec-TCTP基因 CDNA全長序列，設計如下構建真核表達載體 的特異性引物：
[0010] pcDNA-TCTP-S ：CCCAAGCTTATGATCATCTACAGGTGCA
[0011] pcDNA-TCTP-R ：CGGGATCCTTAGCATTTCTCTTCCACCAG
[0012] 引物pcDNA-TCTP-S含有限制性內切酶Hind III識別位點，pcDNA-TCTP-R含有限制 性內切酶BamHI識別位點；
[0013] (2)、提取石斑魚肝臟組織RNA，並以RNA為模板用反轉錄酶合成cDNA，再以石斑魚 cDNA為模板，採用步驟（1)中設計的特異性引物，在PCR擴增體系中對Ec-TCTP基因的cDNA 進行擴增，同時回收純化Ec-TCTP基因片段；
[0014] (3)、使用Hind III和BamHI對步驟⑵純化得到的Ec-TCTP基因片段進行雙酶切 獲得帶有兩個酶切位點的Ec-TCTP基因，同時用HindIII和BamHI對真核表達載體pcDNA3. 1 進行雙酶切，連接轉化大腸桿菌，抽質粒進行PCR和雙酶切檢測，確定真核重組表達載體構 建成功；
[0015] (4)、培養石斑魚腦細胞（GB)，轉染去內毒素質粒pcDNA3. 1和pcDNA3. 1-Ec-TCTP， 用G418篩選過表達細胞系；
[0016] (5)、NNV感染穩定篩選的細胞系，於12和24小時收集樣品，提取RNA，反轉錄成 cDNA，利用實時定量PCR檢測Ec-TCTP對NNV病毒複製的作用，同時檢測病毒滴度變化。
[0017] 所述的真核表達載體為pcDNA3. 1。
[0018] 本發明的石斑魚Ec-TCTP是一種具有抗病毒功能的翻譯控制腫瘤蛋白基因，用該 基因構建真核表達載體，並將表達載體通過轉染方法導入石斑魚腦細胞中，得到能過量表 達Ec-TCTP的穩定細胞，具有提高細胞對病毒感染的耐受能力；經實驗證明了石斑魚翻譯 控制腫瘤蛋白確實具有抑制RNA病毒複製的特點，石斑魚Ec-TCTP基因克隆和功能分析的 研宄將對進一步研宄和開發抗病功能蛋白具有重要的科學價值和應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0019] 圖1為石斑魚肝組織RNA電泳檢測圖，1和2泳道為RAN ;
[0020] 圖2為Ec-TCTP基因擴增電泳圖，M為DL2000,1-7泳道為PCR產物；
[0021] 圖3為真核重組表達載體pcDNA3. I-Ec-TCTP PCR檢測電泳圖，M為DL2000,1-3泳 道為菌落PCR產物，4泳道為對照；
[0022] 圖4為穩定篩選GB細胞系，1為GB細胞，2為穩定篩選pcDNA3. 1細胞系，3為穩定 篩選 pcDNA3. I-Ec-TCTP 細胞系；
[0023] 圖5為PCR檢測穩定篩選細胞系，1為對照，2為pcDNA3. 1，3為 pcDNA3. I-Ec-TCTP ；
[0024] 圖6為病毒滴度檢測Ec-TCTP基因對病毒複製的影響，其中，pcDNA3. 1和 pcDNA3. I-Ec-TCTP 的顯著性差異用 one-way ANOVA 分析，分別用# 表示（ρ〈0· 01) (N= 3);
[0025] 圖7為NNV感染穩定篩選細胞系後的RNA檢測圖，1-2為pcDNA3. 1細胞系12和 24小時樣品，3-4為pcDNA3. I-Ec-TCTP細胞系12和24小時樣品；
[0026] 圖8為NNV病毒CP和RdRp基因的表達，其中，A為NNV病毒CP基因的表達，B為 NNV病毒RdRp基因的表達；pcDNA3. 1和pcDNA3. I-Ec-TCTP的顯著性差異用one-way ANOVA 分析，分別用**表示（P〈〇. 01) (N = 3)。

【具體實施方式】：
[0027] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制.
[0028] 實施例中所涉及的試劑主要分為分子生物學實驗試劑。各種限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為日本寶生物工程有限公司（大連）產品，感受態細胞、 宿主菌及質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑和反 轉錄酶購自invitrogen公司，其餘試劑均為國產分析純；PCR儀為Veriti? 96孔PCR儀購 自ABI (美國Applied Biosystems by Life Technologies)儀器，瓊脂糖電泳系統購自北 京六一儀器廠，蛋白質電泳購自BiaRacL抗生素及培養基等均為分子生物學以及基因工程 實驗室常用國產試劑。
[0029] 所有引物序列均在英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。本發明實施例中所用方 法如無特別說明均為常規方法。
[0030] 實施例1 :
[0031] 真核重組表達載體pcDNA3. I-Ec-TCTP的構建
[0032] 首先根據已經報導的TCTP序列（JN413677)，設計一對引物，並以石斑魚肝組織提 取RNA，反轉錄cDNA為模板擴增，PCR擴增得到Ec-TCTP基因的序列，回收並純化Ec-TCTP 全長基因片段；利用HindIII和BamHI對空載體pcDNA3. 1進行雙酶切，回收純化Ec-TCTP 基因片段以及載體大片段PCDNA3. 1，然後連接、化學法轉化DH5a菌株獲得重組質粒 pcDNA3. 1-Ec-TCTP。具體構建過程如下：
[0033] 一、石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP基因 Ec-TCTP的cDNA擴增
[0034] URNA 提取
[0035] 根據實驗室已經報導的Ec-TCTP(JN413677)基因 cDNA全長序列，設計如下構建真 核重組表達載體的特異性引物：
[0036] pcDNA-TCTP-S ：CCCAAGCTTATGATCATCTACAGGTGCA
[0037] pcDNA-TCTP-R ：CGGGATCCTTAGCATTTCTCTTCCACCAG
[0038] 下劃線標註分別為酶切位點HindIII和BamHI。
[0039] 同時以石斑魚肝組織為材料，使用Trizol法提取總RNA，具體操作如下：用液氮將 0. Ig石斑魚肝組織研磨成粉末以後，加入Iml Trizol提取液，室溫放置5min，使其充分裂 解，再加入氯仿，振蕩混勻15分鐘，室溫放置15min。4°C 12000g離心15min。加入0. 5ml 異丙醇混勾，室溫放置5-1〇111；[11。4<€ 1200(^離心10111；[11，加入1111175%乙醇，溫和振蕩離心 管，懸浮沉澱。4°C 8000g離心5min，室溫晾乾。加入50ul DEPC H2O待溶解充分後測0.D 值定量RNA濃度。RNA提取的結果如圖1所示。
[0040] 2、cDNA 合成
[0041 ] 以RNA為模板，用Superscript? III反轉錄酶合成cDNA，具體步驟為：總RNA 2 μ 1 (約 5 μ g)、01igo(d Τ)201 μ l、10mM dNTP 1 μ 1、DEPC 處理水補足總體積 13 μ I ;65°C 處理5min後，轉至冰上IOmin ;加入5X第一鏈緩衝液4 μ 1、0. IMDTT 1 μ 1、RNA酶抑制劑 1 μ 1，1 μ 1 反轉錄酶（invitrogen)，25 度 5min 後，50°C反應 60min 後；70°C 15min 使反轉 錄酶失活，得到cDNA序列。
[0042] 3、擴增Ec-TCTP基因的cDNA序列
[0043] 以反轉錄總cDNA為模板、使用引物pcDNA-TCTP-S和pcDNA-TCTP-R進行PCR擴 增 Ec-TCTP 基因。PCR 的 20 μ 1 體系為：Ex_Taq 緩衝液（10Χ)2· 5 μ l、Ex_TaqO. 2 μ l、cDNA 模板 1 μ I、IOmM dNTP 0· 4 μ I、10 μ M pcDNA-TCTP-S 引物 1 μ I、10 μ M pcDNA-TCTP-R 引物 1以1、使用(1(1!120補足2(^1。反應條件為：94°0 21^11，30個循環，94°0變性3〇8,60°0退火 30s，72°C有延伸30s，72°C反應5min。將PCR產物在I. 0%的瓊脂糖凝膠上進行瓊脂糖凝膠 電泳檢測（如圖2所示）。
[0044] 電泳後，對目的條帶進行回收，回收使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Axygen DNA片段 純化試劑盒）具體操作步驟參照產品說明書。取3μ1用於瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0045] 二、回收DNA片段後，使用BamHI和HindIII對質粒pcDNA3. 1和目的片段進行雙酶 切分別獲得Ec-TCTP基因和pcDNA3. 1雙酶切片段，電泳回收純化後，分別在16°C連接16h， 獲得真核重組表達載體PcDNA3. 1-Ec-TCTP。
[0046] 具體操作如下：向0. 5ml的離心管中分別加入質粒DNA(K)Ong/ μ 1) 2 μ 1、 BamHI (Takara)0.5yl、HindIII 0·5μ1、10ΧΚ buffer 2μ1，使用ddH20 補足 20μ1;37? 反應8h ;使用I. 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收Ec-TCTP基因和pcDNA3. 1載體，將回收 片段進行連接，其具體步驟為：Ec-TCTP DNA 3 μ 1 (約300ng)、pcDNA3. 1載體1 μ I (IOOng/ μ 1)、Ligation Solution I 4μ1，金屬浴中 16°C 過夜連接。
[0047] 使用化學法將pcDNA3. I-Ec-TCTP大腸桿菌DH5 α中，具體步驟為：將感受態大腸 桿菌大腸桿菌DH5 α 100 μ 1加入6 μ 1質粒體系中；混合液冰浴20min，42°C熱刺激90s，冰 浴2min ;加入900 μ I SOC液體培養基，37°C、150rpm搖床培養60min ;然後在超淨臺上吸取 300 μ 1轉入帶有Amp抗性、IPTG、X-Gal的LB平板上，用無菌三角玻璃棒塗布均勻；37°C過 夜培養；挑取白斑於加有Amp抗性液體LB培養基中37°C、200rpm搖床培養12h ;提取質粒， 進行電泳檢測。利用引物pcDNA-TCTP-S和pcDNA-TCTP-R對菌液進行PCR擴增，所有擴增 條件和之前菌落PCR相同（結果如圖3所示）。
[0048] 過量表達Ec-TCTP穩定細胞系的篩選
[0049] 1、細胞培養
[0050] (1)、凍存細胞的復甦：石斑魚腦細胞GB細胞株保存於液氮之中，在使用之前，從 液氮中取出，並且將其轉移到培養液中培養。實驗準備：將水浴鍋溫度調至37°C，將有血清 的培養液（即完全培養液）置於其中預熱。並且在記錄本中查到所要復甦的細胞存於液氮 罐中的位置；準備好超淨臺內的所需的一些儀器。從液氮罐中取出所要的細胞，立即置於 37°C水浴鍋中，使其快速解凍；將凍存管及培養液瓶外表面用75%酒精擦拭後放入超淨工 作臺；將細胞懸液移到IOml離心管中，並加入2-3ml培養液，用吸管輕輕吹打均勻，用封口 膜密封；IOOOrpm離心3min ;吸去上清，加入2-3ml培養液，吹打均勻，使細胞懸浮；將細胞 懸液移到25cm2培養瓶，補加少量培養液；擰松培養瓶蓋，置於25°C的培養箱中培養。
[0051] (2)、細胞的傳代：培養的細胞生長到一定密度之後，由於培養液中營養逐漸消耗、 代謝物逐步積累（可見到培養液變黃），並且細胞的生長空間也受到限制，就會影響到細胞 的繼續生存，這時就需要分離出一部分細胞和更新培養液，進行傳代。將消化液和培養液 從冰箱中取出，37°C解凍和預熱；吸出培養液，緩緩加入約I. 5ml的消化液；置於37°C消化 2-5min，期間在顯微鏡下觀察，消化至細胞收縮變圓、部分脫落即可加入約4ml消化液終止 消化，防止消化過度；用吸管輕輕吹洗培養瓶有細胞的一面，以使細胞脫落乾淨，將細胞懸 液轉移至IOml離心管內，密封；IOOOrpm離心3min，期間用培養液再清洗一下培養瓶；吸去 上清，加入約2ml培養液，吹打均勻，滴加2-3滴至已加入新鮮培養液的培養瓶中，置於培養 箱中培養。
[0052] (3)、細胞的凍存：當細胞生長到一定程度的時候，可以將一部分凍存起來，長期保 存，以備下次需要用的時候可以使用。將凍存液、消化液和培養液從冰箱中取出，37°C解凍 和預熱；細胞經過消化、離心收集；大約IO 6個細胞加入Iml凍存液，用吸管吹打，使細胞分 散成單細胞懸液；加入到凍存管中，通常I. 8ml的凍存管不加超過I. 5ml的細胞懸液；在凍 存管上標明細胞名稱和凍存日期，用紗布包裹後，置於4°C 0. 5h，然後置於-20°C 2h，再置 於-80°C過夜；第二天將細胞置於液氮中；記下凍存管存放的位置，作好凍存記錄。
[0053] 2、重組質粒的轉染
[0054] (1)鋪板：傳代三到四次後達到細胞良好的狀態的時候，可以按照約IXlO5個細 胞/孔的細胞密度接種於24孔板中。將消化液和培養液從冰箱中取出，37°C解凍和預熱； 吸出培養液，緩緩加入約I. 5ml的消化液；置於37°C消化2-5min，期間在顯微鏡下觀察，消 化至細胞收縮變圓、部分脫落即可加入兩吸管消化液終止消化，防止消化過度；用吸管輕 輕吹洗培養瓶有細胞的一面，以使細胞脫落乾淨，將細胞懸液轉移至IOml離心管內，密封； IOOOrpm離心3min，期間用培養液再清洗一下培養瓶；吸去上清，加入約2ml培養液，吹打均 勻，吸取10 μ 1到細胞計數板上，在顯微鏡下計數，並且計算細胞的密度；預先在孔中放入 一塊IcmX Icm的蓋玻片；用完全培養液稀釋細胞懸液，在24孔板的每個孔加入0. 5ml。
[0055] (2)轉染：鋪板過後大約24h，細胞完全貼壁，且密度達到大約70%的時候，即可以 進行轉染，轉染的時候，在50 μ 1稀釋液中加入0. 8-1 μ g的質粒；在50 μ 1稀釋液中加入 2 μ 1的Lipofectamine2000,輕輕地吹打均勾，在室溫下放置5min ;將質粒稀釋液和脂質體 稀釋液混合，輕柔吹打均勻，室溫下放置20min ;吸去24孔板每個孔中的細胞培養液，沿孔 壁加入0. 5ml的無血清培養液；將混合液加入到每個加了無血清培養液的孔中，每個孔約 加100 μ 1，輕柔晃動，使之混合；放在25°C的培養箱中培養6-8h後將無血清培養液更換成 完全培養液。
[0056] 3、篩選穩定表達細胞系
[0057] 利用引物pcDNA-TCTP-S和pcDNA-TCTP-R構建了 Ec-TCTP基因的真核重組表達質 粒pcDNA3. 1-Ec-TCTP。採用去內毒素質粒微量提取試劑盒（Omega，USA)提取真核表達重組 質粒和空載體質粒pcDNA3. 1 (+)，然後使用Lipofectamine 2000試劑（Invitrogen)將所提 取的質粒分別轉染培養在24孔板中的GB細胞，轉染後48h，將轉染的細胞按1:3的比例稀 釋後傳代，並在培養液中加入終濃度為800 μ g/mL G418 (Amresco)進行篩選培養。每隔3 天更換培養液一次，按上述濃度加入G418繼續篩選。經過約4周的篩選培養後，用PCR方 法進行穩定轉染細胞的檢測，引物採用載體pcDNA3. 1的通用引物T7和BGH，結果如圖4所 示。篩選得到的穩定細胞系分別命名為pcDNA3. I-Ec-TCTP和pcDNA3. 1，結果如圖5所示。
[0058] T7 ：TAATACGACTCACTATAGGG
[0059] BGH ：TAGAAGGCACAGTCGAGGC
[0060] 石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP對病毒複製的影響實驗
[0061] 將穩定細胞系pcDNA3. I-Ec-TCTP和pcDNA3. 1傳至24孔板，每孔接種約I X IO5個 細胞。16-24h後，細胞長滿單層。棄去培養液，每孔接入0. 5MOI的NNV，置於25°C下吸附 lh，期間每隔15min輕輕搖動細胞板一次。吸附完畢後，棄去孔中病毒，然後用新鮮培養基 500 μ 1漂洗一次，接著加入培養基後繼續培養。在感染後12和24h，分別收取感染後的細胞 培養物，每個時間點實驗組和對照組分別收取三個重複孔，然後置於_20°C凍存。將收取的 樣品凍融三次，然後採用TCID50方法對其滴度進行測定（如圖6所示）。同時，收取平行實 驗樣品用於後續總RNA提取（如圖7所示），檢測病毒核心基因轉錄情況（如圖8所示）。
【權利要求】
1. 石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP在抗魚類神經壞死病毒方面的應用。
2. 石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP的編碼基因 Ec-TCTP在抗魚類神經壞死病毒方面的 應用。
【文檔編號】A61P31/14GK104497120SQ201410783832
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月16日 優先權日:2014年12月16日
【發明者】魏京廣, 秦啟偉, 周勝, 許濛 申請人:中國科學院南海海洋研究所