抑制雞肌肉生成抑制素基因表達的siRNA及其應用的製作方法

2023-10-19 15:36:42

專利名稱：抑制雞肌肉生成抑制素基因表達的siRNA及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種抑制雞肌肉生成抑制素基因表達的siRNA及其應用。
背景技術：
2006年我國禽肉產量1506. 6萬噸，僅次於美國，位居世界第二，比1985年增長了 6. 5倍，而同期世界禽肉產量只增長了 1.4倍。據FAO統計，我國肉雞屠宰量從1990年的 21. 29億隻增加到2006年的76. 95億隻，淨增加55. 66億隻。雞肉產量從1990年的266. 32 萬噸增加到2006年的1070. 1萬噸，淨增加803. 78萬噸。目前我國禽肉產量佔肉類總量的 18. 7%，人 均佔有量1. 5千克，同比世界禽肉產量比例30. 3%還有很大的上升空間。白羽肉雞是快大型商品化選育的雞種，具有生長快，產肉多的特點，但肉質較差。 地方優質雞品種肉質鮮嫩，風味佳，但是生長緩慢，產肉較少。二戰以後，快大型白羽肉雞的 育種進展很快，與1957年相比，快大肉雞達到上市體重的時間縮短了 69天，目前只需32天 即可上市。優質雞在我國有豐富的種質資源，粗略統計約有100多個地方雞種，如三黃雞， 麻雞，狼山雞，油雞等。這些雞肉質鮮嫩，色香味美，其中烏雞還具有很高的藥用價值。優質 雞種長期作為我國肉雞生產的特色產業，具有廣闊的市場空間，深受消費者歡迎。雖然價格 相較於快大型白羽肉雞要貴一倍甚至更多，但是其需求量仍在不斷增長。國外知名的肉雞 育種公司也一直在覬覦這個龐大市場。但是優質雞的育種進展緩慢，達到1.5Kg時日齡不 少於50天。目前優質雞育種工作遵循世代傳遞清晰的傳統育種方法，父系、母系均採用一 年一個世代的育種方案，憑經驗選取質量性狀，建立育種群進行世代雜交來選育。這樣不僅 世代間隔長，選擇強度低，並且產肉量和肉質性狀與其它質量性狀雜交亂配，導致育種效率 低下，遺傳進展緩慢。因此目前亟需加快我國優質雞育種技術體系創新。國家對此也相當 重視，自從1980年國家科委設立優質黃羽肉雞選育計劃以來，其後每個五年計劃都有涉及 優質雞育種攻關計劃，以期提高優質肉雞的產肉量和肉品質。1998年Fire等將雙鏈RNA(dsRNA)注入線蟲體內，相關基因的表達被特異性的 抑制，產生了與基因敲除一樣的缺陷型。他們把這種基因轉錄後卻被抑制表達的現象叫 做 RNAi (RNA interference)。其機制是生物細胞內的長雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)被Dicer酶結合併切成長度為21_23bp的小幹擾RNA分子(small interfering RNA, siRNA)。siRNA識別並結合靶基因轉錄後的mRNA上的同源序列，引導RNA誘導沉默 複合物(RNA-induced silencing complex, RISC)將mRNA降解，導致轉錄後的基因沉默 (posttranscriptional gene silencing, PTGS)。近年來的研究發現，RNAi 現象廣泛存在 於動植物體內。除了 siRNA以外，具有莖環結構的短髮夾RNA(short hairpin RNA, shRNA) 在細胞內經過加工後也可以變成siRNA，並誘導RNA幹擾，而且作用時間更為持久。這樣使 得針對一些具有潛在利用價值的基因構建shRNA表達載體，並導入生物體內，特異性的對 靶基因表達進行幹擾，從而使動植物相關基因的表達被長期沉默成為可能。也預示著動植 物在醫學醫藥，生物科技和畜牧業生產中潛在的巨大實用價值。肌肉生成抑制素基因(Myostatin，MSTN)是1997年McPherron等從小鼠骨骼肌cDNA文庫中篩選出的一種負性調控骨骼肌生長的基因。

發明內容
本發明的目的是提供一 種抑制雞肌肉生成抑制素基因表達的SiRNA及其應用。本發明提供的作用於肌肉生成抑制素基因的小幹擾RNA，為如下a)或b)或c)a)由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA ；b)由序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA ；c)由序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA。本發明還保護以上任一所述小幹擾RNA在抑制細胞的肌肉生成抑制素基因表達 中的應用。所述肌肉生成抑制素基因可為GenBank Accession Number :ΝΜ_001001461 自 5， 末端第1至1128位核苷酸。所述細胞具體可為雞胚成肌細胞。本發明還保護以上任一所述小幹擾RNA在抑制雞的肌肉生成抑制素基因表達中 的應用。所述肌肉生成抑制素基因可為GenBank Accession Number :ΝΜ_001001461 自 5， 末端第1至1128位核苷酸。以上任一所述方法均可應用於雞的育種。本發明獲得了有效抑制雞MSTN基因表達的小幹擾RNA，在分子生物學上通過實時 螢光定量PCR證明它有效的降低了 MSTN的表達；在胚胎學上通過顯微注射試驗成功獲得了 骨骼肌明顯增大的雛雞。以上結果說明，本發明的小幹擾RNA可用於雞的育種，從而提高肉 雞尤其是優質雞的產肉量。


圖1為實施例2中SiRNA轉染雞胚成肌細胞(CEM)後MSTN基因螢光定量實驗結^ ο圖2為實施例3中注射siRNA-9的實驗組雛雞(a)與對照組雛雞(b)及相應的解 剖照。圖3為實施例3中實時螢光定量PCR檢測雞胚胎期肌肉MSTN基因的表達量的結^ ο
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的「 ％ 」，如無特殊說明，均為質量百分含量。實施例1、siRNA的設計和合成根據NCBI公布的肌肉生成抑制素基因(MSTN)設計三對siRNA如下第一對(siRNA-9):5，-GCUAGCAGUCUAUGUUUAUTT-3，(序列 1)；3，-TTCGAUC⑶CAGAUACAAAUA-5，(序列 2)；
第二對(siRNA-338):5，-CCACAACCGAGACGAUUAUTT-3，(序列 3)；3，-TTGGUGUUGGCUCUGCUAAUA-5，(序列 4)；第三對(siRNA-926):5，-GCUCCGGAGAAU⑶GAAUUTT-3，(序列 5)；3，-TTCGAGGCCUCUUACACUUAA-5，(序列 6)；對照siRNA(siRNA-NC) 5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUTT-3，；
3 』 -TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5 』。化學合成以上4對SiRNA，化學合成的siRNA為減壓離心乾燥品，製品乾燥於管底， 成乾粉狀。分別將3對siRNA進行實施例2和實施例3的實驗。實驗前，分別將siRNA離心 後加入適量DEPC水震蕩器混勻製成濃度為20 μ M溶液。實施例2、siRNA轉染後雞胚成肌細胞中MSTN基因的表達量分別用實施例1製備的三對siRNA對雞胚成肌細胞進行轉染實驗，具體步驟如 下1、取發育到9天的白來航種蛋(購自中國農業大學動物科技學院試驗雞場)用滅 菌彎頭鑷撕破雞蛋內殼膜、尿囊膜和羊膜，夾出雞胚，放於已加入DPBS的無菌培養皿中漂 洗去血汙、雜質。2、將胚胎移至解剖鏡下，用眼科鑷去除雞胚胸部皮膚，露出胸肌，從胸腔肋骨處剪 取肌肉。放進裝有DPBS溶液的培養皿中。以同樣方式分離另一半胸肌肉組織。3、用眼科剪將肌肉組織剪碎成1立方毫米的肉塊，加入適量DPBS，用去尖頭的移 液器吹打幾次，靜置後去上清。4、向肌肉糜中加入含15% FBS的DMEM培養基，漩渦振蕩器上振蕩30s，靜置後吸 取上清細胞懸液，重複該步驟3-5次。5、將收集到的細胞懸液吹打數次，使細胞分散均勻，經四層紗布過濾後收集細胞 濾液。6、將細胞濾液接種於大的細胞培養瓶中，37°C CO2培養箱中培養半小時。使其中 混雜的成纖維細胞貼壁。7、輕輕拿出細胞培養瓶，吸出上層細胞培養液，適度稀釋後，經臺盼藍染色，計數 其中的活細胞數(雞胚成肌細胞)。按照3X105細胞/mL的濃度接種到已經0.01%多聚 賴氨酸包被的細胞培養板中。8、六孔板中原代培養雞胚成肌細胞，當細胞融合度達到50%時，進行轉染。9、轉染前用DPBS洗去原培養基，換為OPTI-MEM培養基(無血清)；轉染液(A液 siRNA 100pmol+250 μ L OPTI-MEM 培養基，室溫 5 分鐘；B 液脂質體 2000 3 μ L+250 μ L OPTI-MEM培養基，室溫放置5分鐘；將A、B液混合，室溫放置20分鐘)逐滴加入每個培養 孔中；同時設對照孔(NC)，用等體積的無菌水代替siRNA;繼續培養，6小時後換正常完全培 養基。10,36小時後收集細胞，提取RNA，實時螢光定量進行MSTN基因表達幹擾效果檢 測。結果見圖1(反應設 立β-actin為內對照基因，目的基因與β-actin基因的起始 拷貝數之比，作為該基因的相對表達量)。結果顯示轉染了 3對siRNA的成肌細胞的MSTN基因表達量顯著低於對照組；siRNA-9，siRNA-338的抑制效果達到了 70%。在分子水平上 證明了本發明的siRNA幹擾序列可以有效抑制MSTN基因的表達，間接證明了其促進肌肉的 生長的作用，具有活體應 用價值。實施例3、siRN A轉染後活體雞胚中MSTN基因的表達量分別用實施例1製備的三對siRNA和對照siRNA (siRNA-NC)對活體雞胚進行轉染 實驗，實驗情況見表1。表1活體雞胚轉染實驗情況
權利要求
1.作用於肌肉生成抑制素基因的小幹擾RNA，為如下a)或b)或c)a)由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA；b)由序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA；c)由序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA。
2.權利要求1所述小幹擾RNA在抑制細胞的肌肉生成抑制素基因表達中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述肌肉生成抑制素基因為 GenBankAccession Number :ΝΜ_001001461 自 5，末端第 1 至 1128 位核苷酸。
4.如權利要求2或3所述的應用，其特徵在於所述細胞為雞胚成肌細胞。
5.權利要求1所述小幹擾RNA在抑制雞的肌肉生成抑制素基因表達中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述肌肉生成抑制素基因為 GenBankAccession Number :NM_001001461 自 5，末端第 1 至 1128 位核苷酸。
7.權利要求2至6中任一所述應用在雞的育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抑制雞肌肉生成抑制素基因表達的siRNA及其應用。本發明提供了作用於肌肉生成抑制素基因的小幹擾RNA，為如下a)或b)或c)a)由序列表的序列1和序列表的序列2組成的雙鏈RNA；b)由序列表的序列3和序列表的序列4組成的雙鏈RNA；c)由序列表的序列5和序列表的序列6組成的雙鏈RNA。本發明獲得了有效抑制雞MSTN基因表達的小幹擾RNA，在分子生物學上通過實時螢光定量PCR證明它有效的降低了MSTN的表達；在胚胎學上通過顯微注射試驗成功獲得了骨骼肌明顯增大的雛雞。以上結果說明，本發明的小幹擾RNA可用於雞的育種，從而提高肉雞尤其是優質雞的產肉量。
文檔編號C12N15/11GK102041257SQ20091023540
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月13日 優先權日2009年10月13日
發明者孫研研, 楊寧, 蔣斌, 鄭江霞, 陳思睿 申請人:中國農業大學