一種培養蘭花的方法及其專用菌株的製作方法

2023-10-19 15:12:52

專利名稱：：一種培養蘭花的方法及其專用菌株的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種培養蘭花的方法及其專用菌株。
背景技術：
：蘭科植物是植物界最大的類群之一，廣泛分布於溫帶、亞熱帶及熱帶區域，其中多數種是名貴藥用植物和著名的觀賞花卉。蘭花集觀賞和藥用於一身，不僅擁有廣大愛好者，而且還成為中國傳統文化的一個重要組成部分——蘭花文化。蘭科植物是典型的內生菌根植物，通過與其共生的菌根真菌菌絲從周圍環境中吸收礦質營養和水分等，再通過菌絲內部的原生質環流快速地將營養轉運到蘭花根系內部，從而為其生長提供所需。蘭花本身還可以通過消解侵染到其細胞內部的菌根真菌菌絲來吸收營養。菌根真菌能夠增加蘭花植株的抗性，增強其根的吸收能力。因此，蘭花的正常生長發育離不開菌根真菌。近年來，隨著蘭花市場需求的日益增長，蘭花組織培養技術迅速發展。但是，目前的問題是，組培苗移栽後的成活率低，生長緩慢，開花遲緩，花小甚至不開花，這嚴重影響了後續的蘭花成活數量，從而不能滿足市場的需要。存在以上問題的根本原因在於蘭花組培苗的菌根化技術不成熟，具體如下一、缺少優良的與蘭花共生的菌根真菌，不能形成有效的菌根，導致蘭花營養吸收的匱乏；二，缺少有效的菌根真菌接種菌劑，接種後不能保證真菌的營養來源，需多次接種，對蘭花苗的根系破壞較大；三，接菌時機及接菌量不容易控制，易造成人為接種導致的蘭花苗死亡現象。
發明內容本發明的一個目的是提供一株菌，該菌可用於蘭科植物的培養。本發明所提供的菌株為瘤菌根菌(^Wor力^a)GDB181。該菌株GDB181已於2008年07月03日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心地址是北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編是100101，保藏編號為CGMCCNo.2574。本發明所提供的菌株GDB181屬於瘤菌根菌屬(fp^02^^s)，其菌絲為有隔菌絲，隔間距長，隔膜明顯，近直角分枝，分支處部分縊縮，菌絲直徑約3.46-3.79Um，為多核菌絲；菌落白色近無色，正反面顏色一致，較稀疏，不易觀察，菌落邊緣不規則，菌絲稍長且向外延伸，老菌絲打結，佔的面積較大，氣生菌絲較多白色巻曲。本發明的又一個目的是提供一種培養基，該培養基可用於培養瘤菌根菌。本發明所提供的瘤菌根菌培養基，是由PDA液體培養基、蛭石和支持物組成；所述支持物可以是胡桃科植物樹葉剪成的面積為20-30mm2的塊狀物；所述PDA液體培養基、所述蛭石和所述支持物的體積比可以為0.8-1.2:1-2:0.5-1.5;優選為1:1:1;所述胡桃科植物具體可以是胡桃、楓楊或黃杞。每升所述PDA液體培養基是由200g去皮馬鈴薯、20g葡萄糖和1L水組成。本發明的另一個目的是提供一種培養基質，該基質可用於蘭科植物的培養。本發明所提供的蘭科植物培養基質，是由沙子、蛭石和苔蘚組成；所述沙子、所述蛭石和所述苔蘚的體積比可以為0.5-1:0.8-1.2:1-2，優選為1:1:1。其中，苔蘚具有透氣和保持水份的功能，蛭石有透水性，沙子有一定的保水性。本發明的最後一個目的是提供一種培育蘭科植物的方法。本發明所提供的培育蘭科植物的方法，是將上述瘤菌根菌(fpWoi^fzs印.)GDB181與蘭科植物的根共培養。在所述共培養中，可以使用上述蘭科植物培養基質。在所述共培養中，可以通過調節接種時所述菌與所述植物根的距離，來控制所述菌侵染所述組培苗根的時機，具體可以在共培養起始時，將菌放置在距離所述蘭科植物根l-3cm處，優選為1.5-2cm處。所述菌具體可以是用上述瘤菌根菌培養基在25-27。C的溫度下避光培養10-20天後得到的位於支持物上的菌；每條所述蘭科植物根所對應的所述支持物的面積可以為20-60mm2，所述支持物的面積優選為25mm2。所述共培養過程中要補充營養液；所述營養液具體是由終濃度為120mg/L的Ca(N03)2，終濃度為80mg/L的(NH4)2S04，終濃度為100mg/L的KH2P04，終濃度為50mg/L的MgS04，終濃度為0.5mg/L的H肌終濃度為0.17mg/L的MnS04，終濃度為0.28mg/L的ZnS04，終濃度為0.025mg/L的CuS04，終濃度為1.1mg/L的FeC6'H507組成，用水定容。補充營養液的方法為常規方法即可，如葉面噴灑、根部灑施等，補充營養液的次數及頻率可因苗的大小、生長情況等靈活選擇。所述共培養的條件為溫度為25-27°C、溼度為75-85%、光強為2000-3000Lux、光照明暗周期為12—14h光照/10-12h黑暗；所述溫度優選為25t:、所述溼度優選為85%、所述光強優選為2000Lux、所述光照明暗周期優選為14h光照/10h黑暗。上述方法適合於一般的蘭花的培養，具體可如春蘭(Q^6W"mgoen7^7)。本發明菌株適合於蘭花菌根化培養，是與蘭花建立有效共生的優良菌根真菌菌株。本發明的瘤菌根菌培養基質地疏鬆，透氣性好，營養分布均勻，適合菌絲生長和蔓延，是培養菌根真菌的最佳培養基，而且在人工接種組培苗的時候可以有效控制接種量。本發明的盆栽蘭花的基質成本低、原料易於獲得，還具有疏鬆、透氣透水性好、保水能力強的特點，在接菌的時候能很好的支撐和固定染菌菌支持物，使接菌位置保持不變，有利於以後內生真菌對蘭花根部的入侵和建立共生關係，而且能與蘭花幼嫩的根緊密結合，使蘭花從基質中吸收到水分等營養。本發明培養蘭花的方法，能很好的控制接種量，並能固定接種位置，充分保證了蘭花組培苗與優良菌根真菌建立共生關係，同時還簡化了接種步驟，減少了接種次數，接種一次就可達到一勞永逸，避免了人為多次接種造成的死苗現象，從而提高了移栽的成活率，得到了生長旺盛健壯的菌根化蘭花苗。因此，本發明菌株、菌培養基、蘭花培養基質及蘭花培養方法具有重要的經濟價值，適合於推廣應用。圖1為菌株GDB181CGMCCNo.2574的生長情況。圖2為接菌後苗的生長情況。圖3為未接菌的苗的生長情況。圖4為接菌與未接菌苗的對比。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法，如無特殊說明均為常規方法。實施例1、利用組培苗菌根化技術培養蘭花實施例中用到的蘭花營養液的組成如下Ca(N03)2120mg/L，(MI4)2S0480mg/L，KH2P04100mg/L，MgS0450mg/L，H3B030.5mg/L，MnS040.17mg/L，ZnS040.28mg/L，CuS040.025mg/L，FeC6H5071.1mg/L，其餘為水。一、菌的分離及培養1、菌的分離從採自安徽嶽西的蕙蘭(0^力fW咖/WeW)中分離菌株GDB181，其方法如下選取長勢健壯旺盛的野生蕙蘭的新鮮營養根段，流水衝洗掉根表面的泥土和腐殖質後，在超淨工作檯上將根段浸入ly。的次氯酸鈉(NaC10)溶液中8-10min進行表面滅菌，然後用無菌水衝洗4-5次，將根段切成2-3Mn的薄片，放置在1/5的PDA培養基上，25-27。C避光培養，待菌絲從根片中長成菌落後，挑取菌絲轉移至PDA培養基上進行純化，沒有汙染，轉入PDA斜面培養基，4"C短期保存。每升1/5PDA培養基是由40g去皮馬鈴薯、4g葡萄糖、5-6g瓊脂和1L水組成。本發明所提供的菌為瘤菌根菌(f/w7o/^z'M邵.)GDB181。該菌株GDB181已於2008年07月03日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心地址是北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編是100101，保藏編號為CGMCCNo.2574。2、菌的培養(1)一級菌種培養將保存在斜面培養基上的菌株GDB181移接到PDA平板培養基上，25-27"避光培養，待菌絲長滿平板後作為一級菌種。(2)二級菌種培養將充分生長的一級菌種接種到二級菌種培養基上，25-27'C避光培養，定期觀察記錄，待菌絲長滿整個培養基後轉入冰箱保存備用。二級菌種培養基是由楓楊樹葉、蛭石和PDA液體培養基組成，其體積配比為1:1:1;二級菌種培養基的製備方法如下採集新鮮的楓楊樹葉，洗淨，剪成5X5mm的小塊，滅菌lh;蛭石衝洗乾淨，滅菌2h;然後將1L的剪成5X5腿的新鮮幼嫩楓楊樹葉與1L蛭石混合均勻後，邊攪拌邊加入1LPDA液體培養基，混勻後，滅菌30min。結果表明，二級菌種的培養中，菌很快從接種點向四周蔓延，半個月後，菌絲已布滿整個培養基中的蛭石和楓楊樹葉(圖l)。二、蘭花的培養本實施例中以春蘭(6y歷Z^^哪卵eri/^ii)的組培苗為實驗材料，組培苗是按照常規方法獲得的。本實施例中所用的蘭花的盆栽基質是由河砂、蛭石和苔蘚組成，其體積比為1:1:1;該基質的配製方法為將苔蘚充分浸泡，擰乾，剪成l-2cra長的小段；將約1L河砂和1L蛭石混合均勻，然後加入lL的剪成l-2cm的小段苔蘚，充分攪拌混勻(可用特定大小的容器量取上述基質)，裝袋密封，滅菌2h，在無菌條件下分裝到花盆中。蘭花培養方法如下煉苗將待移栽的組培苗從恆溫光照培養室移到光照較弱，溫度為18—2(TC的環境培養l周左右，出瓶前24—48h打開封口膜。盆栽從瓶中取出組培苗洗去粘附在根上的瓊脂，然後在無菌條件下栽入蘭花盆栽基質中，每盆4株，25。C恆溫培養，光照強度為2000Lux，光照明暗周期為14h光照/10h黑暗，每天向苗的葉面噴灑蒸餾水，保持室內溼度在85%以上，定植2周後開始補充營養液，每隔半個月補充一次，每次每株定量10ml，定期觀察記錄。待苗適應外部環境後(大約一個月)，進行接菌。接菌選取按照步驟一2中菌培養方法培養菌GDB181，培養10-20天後，培養基中的楓楊樹葉上有菌，將約5X5mm的方形楓楊樹葉，放置在距苗新鮮營養根1.5-2cm處，每條根各放1-2片樹葉，繼續培養，培養條件同上，定期觀察記錄。同時以不接菌的組培苗為對照。培養6個月後，將苗取出並再次稱重，計算平均鮮重增長率。平均鮮重增長率(。/。)"處理後鮮重一處理前鮮重)X100/處理前鮮重。每種處理重複3次。三、結果1、組培苗接菌後的生長狀況組培苗在基質中生長勢一直很旺盛，葉色翠綠，葉舒展，總體很健壯，高生長迅速，舊根伸長生長明顯，僅在舊根的中上部形成角質層，產生大量新生根，新伸長的根嫩綠色，有的根先端出現分叉(圖2，圖4A)，死亡率低；未接菌的對照苗生長緩慢，高生長不明顯，外圍葉發黃乾枯，新生根極少(圖3和圖4B)。圖4A為接菌苗，圖4B為未接菌苗。2、接菌後的春蘭苗生長量(即成活率和鮮重增長率)的變化對接菌並培養6個月後的春蘭蘭花苗及對照(未接菌的春蘭苗)進行生長量的測定，成活率ft卜處理後植株數X100/處理前植株數；平均鮮重增長率(%)=(處理後鮮重一處理前鮮重)X100/處理前鮮重；再對接菌苗的營養根進行重分離。實驗設3次重複，結果取平均數。結果如表l所示，表明接菌的蘭花苗的成活率高於對照，平均鮮重增長率高於對照，應用SPSS統計軟體分析，與對照差異己達到顯著水平；並且接菌苗的營養根重分離獲得了原接種菌株GDB181。表l、菌株對蘭花組培苗生長量的影響tableseeoriginaldocumentpage8注*含量低3F檢測線未檢出，**含量高於檢測會l未檢出。綜上表明，GDB181菌株接種的春蘭盆栽苗，不僅生長勢旺盛，苗色翠綠，葉舒展健壯，新生根多，根系發達，在苗生物量和各礦質元素含量上也有明顯提高；重分離基本獲得原接種菌株，它是春蘭在盆栽條件下的共生菌根真菌。菌根真菌還誘導蘭花產生大量新根，不僅有利於真菌的大量入侵，而且蘭花也能吸收到更多的菌提供的營養，從而達到互惠互利的共生目的。權利要求1、瘤菌根菌(Epulorhizasp.)GDB181，其保藏編號為CGMCCNo.2574。2、一種瘤菌根菌培養基，由PDA液體培養基、蛭石和支持物組成；所述支持物是胡桃科植物樹葉剪成的面積為20-30nrai2的塊狀物；所述PDA液體培養基、所述蛭石和所述支持物的體積比為0.8-1.2:1-2:0.5-1.5;優選為1:1:1;所述胡桃科植物是胡桃、楓楊或黃杞。3、一種蘭科植物培養基質，由沙子、蛭石和苔蘚組成；所述沙子、所述蛭石和所述苔蘚的體積比為0.5-1:0.8-1.2:1-2，優選為1:1:1。4、一種培育蘭科植物的方法，是將權利要求1所述菌與蘭科植物的根共培養。5、根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述共培養中使用權利要求3所述的培養基質。6、根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述共培養起始時，所述菌放置在距離所述蘭科植物根1-3cm處。7、根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述菌是用權利要求2所述培養基在25-27。C的溫度下避光培養10-20天後得到的位於支持物上的菌；每條所述蘭科植物根所對應的所述支持物的面積為20-60mm2。8、根據權利要求4-7中任一所述的方法，其特徵在於所述共培養過程中要補充營養液；所述營養液由終濃度為120mg/L的Ca(N0》2，終濃度為80mg/L的(NH4)2S04，終濃度為100mg/L的KH2P04，終濃度為50mg/L的MgS04，終濃度為0.5mg/L的H3B03，終濃度為0.17mg/L的MnS04，終濃度為0.28mg/L的ZnS04，終濃度為0.025mg/L的CuS04，終濃度為1.1mg/L的FeC6，H507組成，用水定容。9、根據權利要求4-8中任一所述的方法，其特徵在於所述共培養的條件為溫度為25-27°C、溼度為75-85%、光強為2000-3000Lux、光照明暗周期為12—14h光照/10-12h黑暗；所述溫度優選為25。C、所述溼度優選為85%、所述光強優選為2000Lux、所述光照明暗周期優選為14h光照/10h黑暗。10、根據權利要求4-9中任一所述的方法，其特徵在於所述蘭科植物為春蘭(Cjm6/(i/w附goen力g77)。全文摘要本發明公開了一種培育蘭科植物的方法及其專用菌株。本發明菌株名稱為GDB181，保藏編號為CGMCCNo.2574。本發明方法包括將本發明菌株與所述蘭科植物根共培養的步驟。本發明菌株適合於蘭花菌根化培養，是與蘭花建立有效共生的優良菌根真菌菌株。本發明培養蘭花的方法，能很好的控制接種量，並能固定接種位置，充分保證了蘭花組培苗與優良菌根真菌建立共生關係，同時還簡化了接種步驟，減少了接種次數，接種一次就可達到一勞永逸，避免了人為多次接種造成的死苗現象，從而提高了移栽的成活率，得到了生長旺盛健壯的菌根化蘭花苗。因此，本發明菌株、菌培養基、蘭花培養基質及蘭花培養方法具有重要的經濟價值，適合於推廣應用。文檔編號C12N1/20GK101338290SQ200810118128公開日2009年1月7日申請日期2008年8月12日優先權日2008年8月12日發明者暉丁,輝金,韓素芬申請人:輝金