水稻OsSPX1蛋白及其編碼基因在調控植物抗氧化性中的應用的製作方法

2023-10-19 22:17:17

專利名稱：水稻OsSPX1蛋白及其編碼基因在調控植物抗氧化性中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種水稻OsSPXl蛋白及其編碼基因在調控植物抗氧化性中的應用。
背景技術：
非生物脅迫是影響水稻產量的ー個重要因素，包括乾旱、鹽鹼、極端溫度、養分缺乏、紫外射線和大氣汙染。這些脅迫的傷害作用都和對生物大分子如脂類、酶、核酸的氧化損傷有關，因此在水稻中挖掘具有抗氧化作用的優異基因，並把它們應用於水稻育種生產中具有十分重要的理論意義和實踐價值，也是解決當前水稻抗逆育種的一條行之有效的途徑。本發明人研究小組在研究耐低溫和響應低磷脅迫相關的水稻SPX基因功能時發現該基因同時具有提高水稻抗氧化性的效能，在農業生產上具有較強應用價值的基因。已有ー些研究表明含有SPX (SYGl/Pho81/XPRl)結構域的基因參與磷的信號轉導和調節途徑。SPX是約180個胺基酸長，存在於3種已知蛋白(SYGl、Pho81和XPRDN末端的一個結構域，其名稱來源於這三種蛋白的首字母。早在1995年，Spain等人研究發現酵母SYGl的N末端可與G-蛋白結合從而抑制交配信息素(mating pheromone)的信號轉導；在磷飢餓條件下，有報導CDK抑制子Pho81可抑制PH080-PH085及Pcl7_Pho85複合體的酶活性；Poleg等人(1996),在真菌Neurospora crassa中發現，與PH081結構相似的NUC-2蛋白可感知磷的存在並參與磷轉運的調節途徑。2002年，Hamburger等人在擬南芥中亦發現ー類SPX基因，即PHOl (具有SPX結構域和EXS結構域)基因和PHOl類似蛋白，它們可參與磷由根到莖的運輸，並在根的微管束細胞中特異表達。本發明人研究小組經研究發現水稻的SPX基因OsSPXl還可提高植物的耐凍性。

發明內容
本發明的ー個目的是提供水稻OsSPXl蛋白的新用途，該蛋白質的胺基酸序列如序列表序列3所示，所述新用途為序列表序列3所示蛋白可用於調控目的植物的抗氧化性，或調節序列表序列3所示蛋白表達量的物質或方法可用於調控目的植物的抗氧化性。本發明的另ー個目的是提供一種培育低抗氧化性轉基因植物的方法，該方法是降低目的植物中序列表序列3所示蛋白的編碼基因的表達，得到抗氧化性低於所述目的植物的轉基因植物。在上述方法中，所述降低目的植物中序列表序列3所示蛋白的編碼基因的表達是通過將序列表序列3所示蛋白編碼基因的反向互補序列導入目的植物中實現的。
本發明還提供另ー種培育高抗氧化性轉基因植物的方法，該方法是將序列表序列3所示蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到抗氧化性高於所述目的植物的轉基因植物。在上述兩種方法中，所述序列表序列3所示蛋白的編碼基因為如下I)或2)或3)的基因
I)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；2)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且編碼序列表序列3所示蛋白的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼序列表序列3所示蛋白的DNA分子；所述嚴格條件可為如下50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0. 1%SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,O. 5MNa3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC, O. 1%SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,O. 5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，O. 5XSSC,O. 1%SDS 中漂洗； 還可為50°C，在 7% SDS,O. 5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，O. I X SSC,O. 1%SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,O. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65。。，O. 1XSSC,0. 1%SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然後用 2 X SSC, O. 1%SDS 和 1XSSC,0. 1%SDS 各洗膜一次。在上述應用和方法中，所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。在上述應用和方法中，所述單子葉植物具體可為水稻。在上述應用和方法中，所述抗氧化性表現為所述目的植物經氧化劑(如甲基紫精，MV)處理後其葉綠素和/或過氧化物含量；即所述抗氧化性高於所述目的植物的轉基因植物表現為經氧化劑處理後，所述轉基因植物的葉綠素含量高於所述目的植物，和/或所述轉基因植物的過氧化物含量低於所述目的植物；所述抗氧化性低於所述目的植物的轉基因植物表現為經氧化劑處理後，所述轉基因植物的葉綠素含量低於所述目的植物，和/或所述轉基因植物的過氧化物含量高於所述目的植物。實驗證明，經10 μ M甲基紫精溶液處理後，轉pCOU OsSPXl_antisense的水稻株系植株葉片變黃較明顯、葉綠素相對含量最低(為O. 86-7. 89SPAD)且過氧化物的積累最多，其次是非轉基因日本睛(葉綠素相對含量為11.04SPAD)，_pC0U OsSPXl的水稻株系植株葉片顏色較綠、葉綠素相對含量最高(為14. 69— 22. 09SPAD)且過氧化物的積累最少。本發明在研究植物抗氧化性進而提高植株抗逆性方面具有重要應用價值。


圖I為水稻OsSPXl基因的正反義重組表達載體T-DNA區的結構示意圖。其中，圖A為正義重組表達載體，圖B為反義重組表達載體，圖A和B中的LB和RB分別代表T-DNA的左臂和右臂，Nos代表胭脂鹼合酶終止子，Hpt II代表潮黴素磷酸轉移酶基因，CaMV35s代表花椰菜花葉病毒35s啟動子，Ubi代表玉米泛素啟動子，OsSPXl代表序列表序列2所示的水稻OsSPXl編碼基因。圖2為轉基因水稻株系的PCR鑑定電泳圖。其中，圖A為轉pCOU 0sSPXl_antisense的Ttl代轉基因水稻株系的鑑定結果，泳道M為分子量標準，從上到下的片段依次為5kb，3kb, 2kb, lkb, 750bp, 500bp, 250bp, lOObp，泳道8為非轉基因日本睛，泳道1-7為待鑑定的Ttl代轉pCOU 0sSPXl_antisense水稻株系；圖B為轉pCOU OsSPXl的Ttl代轉基因水稻株系的鑑定結果，泳道M為分子量標準，從上到下的片段依次為5kb，3kb，2kb, lkb, 750bp，500bp, 250bp, lOObp,泳道9為非轉基因日本睛，泳道1_8為待鑑定的Ttl代轉pCOU OsSPXl水稻株系。圖3為實時定量RT-PCR檢測轉pCOU OsSPXl水稻株系中OsSPXl基因的相對表達水平。其中，CKl代表對照組，低溫代表實驗組。圖4為實時定量RT-PCR檢測轉pCOU 0sSPXl_antisense水稻株系中OsSPXl基因的相對表達水平。其中，CKl代表對照組,低溫代表實驗組。圖5為轉基因水稻株系植株幼苗經甲基紫精(MV)溶液處理後的表型。其中，上一 排為實驗組，下一排為對照組。圖6為轉基因水稻株系植株幼苗經甲基紫精溶液處理後葉片的葉綠素含量測定結果。其中，CK2代表對照組，MV代表實驗組。圖7為轉基因水稻株系植株幼苗經甲基紫精溶液處理後葉片進行DAB (3，3』 - ニ氨基聯苯胺)染色後的表型。其中，圖A為整株的表型，圖B為對葉尖進行顯微拍照圖(標尺長度為Icm ；Anti-2的結果與Anti-I相同，Οχ-4和0χ_5的結果與Οχ-l相同)；CK2代表對照組，MV代表實驗組。在上述圖中，WT代表非轉基因日本睛，Anti-I和Anti_2分別代表轉pC0U0sSPXl_antisense的水稻株系，0χ-1、0χ-2、0χ-3、0χ_4和0χ_5分別代表轉pCOU OsSPXl的水稻株
系O
具體實施例方式下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物合成及測序工作均由北京奧科生物科技有限責任公司完成。日本睛(Oryza sativa L. cv. Nipponbare):中國農業大學保證向公眾提供；參考又獻bene expression profiles deciphering rice phenotypic variation betweenNipponbare(Japonica) and 93-11 (Indica) during oxidative stress. PLoS One. 2010 Jan8,5(1)。根癌農桿菌EHA105 (Agrobacterium tumefaciens EHAlO5):中國農業大學保證向公眾提供；參考文獻Toki S，Hara N, Ono K, Onodera H, Tagiri A, Oka S，TanakaH. 2006. Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speedtransformation of rice. Plant. J. 47(6):969-76。實施實例I、水稻OsSPXl基因及其蛋白的獲得以4°C低溫處理12h的水稻日本睛(Oryza sativa L. cv. Nipponbare)芽期(發芽7-10天的幼苗)植株為材料，利用TRIZOL試劑提取總RNA，並以總RNA為模板，使用M-MLV反轉錄酶進行反轉錄得到cDNA，再以此cDNA為模板，在引物⑶S-PF和引物⑶S-PR的引導下，用常規PCR法擴增水稻SPX基因的cDNA序列，反應結束後，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收並純化約900bp的DNA片段，對該片段進行測序。引物CDS-PF :5』 -ATAGATCTATGAAGTTTGGGAAGAGCCTG-3> (帶下劃線部分序列為限制性內切酶Bgl II識別位點及保護鹼基)；引物CDS-PR :5』 -GCGGTACCTCATTTGGCGGCCTGCTCAAT-3』 (帶下劃線部分序列為限制性內切酶KpnI識別位點及保護鹼基)。測序結果表明，上述約900bp的DNA片段含有序列表序列2所示的888bp核苷酸序列，該888bp核昔酸序列為OsSPXl基因的編碼序列，編碼具有序列表序列3所不的由295個胺基酸組成的蛋白，將該蛋白命名為OsSPXl，該蛋白自氨基端(N端)第1-169位胺基酸殘基為SPX蛋白結構域。OsSPXl的基因組DNA定位於水稻第六號染色體的23，875，408bp至23，879，965bp (其序列如序列表序列I所示)，其NCBI定位號為NP_001058013，NCBI基因號(GENEID)為0s06g0603600，TIGR 號為 L0C_0s06g40120。實施例2、水稻OsSPXl基因正反義重組表達載體的構建將步驟I中PCR擴增得到的約900bp的含有序列表序列2所示核苷酸序列的DNA片段用Bgl II和KpnI進行雙酶切，回收純化後插入到植物表達載體PCambial301-UbiN(GenBank號AF234297)多克隆位點的Bgl II和KpnI酶切位點之間，得到OsSPXl基因的正 義重組表達載體，將該正義重組表達載體進行酶切和測序鑑定，將鑑定表明含有序列表序列2所示核苷酸序列的正義重組表達載體命名為pCOU OsSPXl，其T-DNA區的結構示意圖如圖I中的A所示。同時，構建OsSPXl的反義重組表達載體，具體方法如下設計引物5』 -GCGGTACCATGAAGTTTGGGAAGAGCCTG-3』 (帶下劃線部分序列為限制性內切酶KpnI識別位點及保護鹼基)和5』 -ATAGATCTTCATTTGGCGGCCTGCTCAAT-3』 (帶下劃線部分序列為限制性內切酶Bgl II識別位點及保護鹼基)，按照實施例I相同的方法進行PCR擴增，回收純化約900bp的PCR產物，用Bgl II和KpnI進行雙酶切，回收純化後插入植物表達載體pCambial301-UbiN多克隆位點的Bgl II和KpnI酶切位點之間，得到OsSPXl基因的反義重組表達載體，將該反義重組表達載體進行酶切和測序鑑定，將鑑定表明含有與序列表序列2所示核苷酸序列互補的序列的反義重組表達載體命名為pCOU OsSPXl_antisense，其T-DNA區的結構示意圖如圖I中的B所示。實施例3、轉基因水稻的獲得將實施例2構建的水稻OsSPXl的正義重組表達載體pCOU OsSPXl、反義重組表達載體pCOU OsSPXl_antisense用農桿菌轉化法轉化水稻日本睛(Oryza sativa L. cv.Nipponbare)的成熟胚誘導的愈傷組織,具體方法如下I、將pCOU OsSPXl和pCOU 0sSPXl_antisense分別用電擊法轉化根癌農桿菌EHA105 得到含有 pCOU OsSPXl 的重組農桿菌 EHA105/pC0U OsSPXl 和含有 pCOU 0sSPXl_antisense的重組農桿菌EHA105/pC0U 0sSPXl_antisense共兩種重組農桿菌。將上述兩種重組農桿菌分別接種於YEB液體培養液(含100μ g/ml卡那黴素和75 μ g/ml利福平)中，28°C振蕩培養至OD600為0. 6-0. 8 ;以10，OOOrpm室溫離心Imin,用MS鹽溶液(pH 5. 8)重懸菌體並稀釋至原培養液菌濃度的20-50倍，得到兩種重組農桿菌的菌懸液。上述MS 鹽溶液的配方=NH4NO3 I. 65g、KN03 I. 9g,KH2PO4 0. 17g、MgS04 ·7Η20 O. 7g、CaCl2 · 2Η20 0· 44g、MnSO4 · 4Η20 22. 3mg、ZnSO4 · 7Η20 8. 6mg、H3BO3 6. 2mg、KI 0. 83mg、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg、CoCl2 · 6H20 0. 025mg、CuSO4 · 5H20 0. 025mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg、Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg、肌醇 100mg、煙酸(B5)O. 5mg、鹽酸吡哆醇(維生素 B6) 0. lmg、鹽酸硫胺素(維生素1^)0. 5mg、甘氨酸2. Omg,用水定容至1し
2、將滅菌後的水稻日本睛(WT, Oryza sativa L. cv. Nipponbare)種子接種於N6D培養基(PH5. 8)上，32°C培養1-5天，去除芽和殘留胚乳後再繼代培養10-20天，得到成熟胚愈傷組織。上述N6D 培養基的配方KN03 2. 83g/L、(NH4)2SO4 O. 463g/L,MgSO4 · 7H20 0. 185g/L、CaCl2 0. 166g/L、KH2PO4 0. 4g/L ；MnSO4 · 4H20 4. 4mg/L、ZnSO4 · 7H20 I. 5mg/L、KI 0. 8mg/L、H3B03 I. 6mg/L、FeS04 · 7H20 27. 8mg/L, Na2EDTA · 2H20 37. 3mg/L ；2, 4_D 2mg/L, CH: 0. 3g/L, L-脯氨酸2. 878g/L，蔗糖30g/L，固化劑4g/L。3、將步驟2得到的成熟胚愈傷組織平均分成2組，每組分別浸於步驟I得到的兩種農桿菌菌懸液中，輕輕晃動約I. 5min，接種於含有10-20mg/Lこ醯丁香酮的N6D培養基(ρΗ=5· 2)上，該培養基上預先墊有一層浸有O. 5毫升AAM培養基(Hiei，Y.，S. Ohta, TKomari ana T. Kumashiro. 1994. Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T—DNA. Plant J. 6:271-282.)的無菌濾紙，25°C黑暗條件下共培養3天。4、將經過步驟3共培養的愈傷組織接種於含有50mg/L潮黴素(hygromycin B)和250mg/L羧苄青黴素(carbenicillin)的RE分化培養基(pH 5. 8)中培養1-2周後，選取生長旺盛的抗性愈傷組織進行分化、壯苗，獲得分別轉pCOU OsSPXl和pC0U0sSPXl_antisense的Ttl代轉基因水稻株系。上述RE 分化培養基的配方=NH4NO3 I. 65g/L、KNO3 I. 9g/L、KH2PO4 0. 17g/L、MgSO4 · 7H20 0. 7g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg/L、肌醇 100mg/L、煙酸(B5)O. 5mg/L、鹽酸吡哆醇(維生素Β6)0· 5mg/L、鹽酸硫胺素(維生素B1) 0. lmg/L，蔗糖30g/L，山梨醇30g/L，酸水解酪蛋白2g/L，a-萘こ酸0. 02mg/L,激動素2mg/L，呋喃甲基腺嘌呤2mg/L，植物凝膠4g/L。T0代表示轉基因當代植株，T1代表示Ttl代自交產生的種子及由它所長成的植株，T2代表示T1代自交產生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產生的種子及由它所長成的植株。5、轉基因水稻株系的PCR鑑定將步驟4獲得的兩種水稻轉基因株系內的所有植株葉片分別提取基因組 DNA，進行 PCR 擴增，引物為 HPT-F :5』 -TACTTCTACACAGCCATC-3 』 和 HPT-R :5』 -CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3』，靶序列為潮黴素磷酸轉移酶基因的部分序列，預測目的產物片段長度947bp，含有目的產物的為陽性轉基因植株，部分植株擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示。共獲得陽性轉pCOU OsSPXl的Ttl代轉基因水稻株系8個，陽性轉pCOU0sSPXl_antisense的Ttl代轉基因水稻株系9個。實施例4、轉基因水稻的實時定量RT-PCR檢測隨機取非轉基因日本睛(WT)、按實施例3中步驟5的PCR鑑定方法鑑定為純合轉 pCOU OsSPXl 的 T3 代水稻株系(Οχ-1、0χ_2、0χ_3、Οχ-4, 0χ-5)和純合轉 pC0U0sSPXl_antisense的T3代水稻株系(Anti_l、Anti_2、Anti_3)的種子,進行如下兩種處理(姆個株系每種處理3次重複，每個重複20-30粒種子)
處理I (實驗組，低溫)28°C 12小時光照12小時黑暗發芽I周，取芽長5mm的幼苗置於4-5°C低溫處理24h ；處理2 (對照組，CKl) :28V 12小時光照12小時黑暗發芽I周，取芽長5mm的幼苗繼續在該條件下處理24h ；將經過上述兩種處理的幼苗利用TRIZOL試劑提取總RNA，以此RNA為模板，使用M-MLV反轉錄酶進行反轉錄得到cDNA，以此cDNA為模板，利用表I所示的專用引物，進行實時定量RT-PCR檢測。表I、水稻各轉基因株系的實時定量RT-PCR擴增引物
權利要求
1.序列表序列3所示蛋白在調控目的植物抗氧化性中的應用。
2.一種培育低抗氧化性轉基因植物的方法，是降低目的植物中序列表序列3所示蛋白編碼基因的表達，得到抗氧化性低於所述目的植物的轉基因植物。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述降低目的植物中序列表序列3所示蛋白的編碼基因的表達是通過將序列表序列3所示蛋白編碼基因的反向互補序列導入目的植物中實現的。
4.一種培育高抗氧化性轉基因植物的方法，是將序列表序列3所示蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到抗氧化性高於所述目的植物的轉基因植物。
5.根據權利要求I所述的應用或權利要求2-4中任一所述的方法，其特徵在於所述序列表序列3所示蛋白的編碼基因為如下I)或2)或3)的基因 1)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子； 2)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且編碼序列表序列3所示蛋白的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼序列表序列3所示蛋白的DNA分子。
6.根據權利要求2-5中任一所述的方法，其特徵在於所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述單子葉植物為水稻。
全文摘要
本發明公開了一種水稻OsSPX1蛋白及其編碼基因在調控植物抗氧化性中的應用。該蛋白質的胺基酸序列如序列表序列3所示，可用於調控目的植物的抗氧化性，或調節序列表序列3所示蛋白表達量的物質或方法可用於調控目的植物的抗氧化性。實驗證明，經氧化劑甲基紫精處理後，轉pCOU OsSPX1_antisense的水稻株系植株葉片變黃較明顯、葉綠素含量最低且過氧化物的積累最多，其次是非轉基因日本晴，轉pCOUOsSPX1的水稻株系植株葉片顏色較綠、葉綠素含量最高且過氧化物的積累最少。本發明在研究植物抗氧化性進而提高植株抗逆性方面具有重要應用價值。
文檔編號C07K14/415GK102675440SQ20121016681
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月25日 優先權日2012年5月25日
發明者於靜娟, 劉鳳霞, 徐文英, 王玲, 蘇震, 譚遠軍, 趙琳娜, 魏強 申請人:中國農業大學