一種提高植物種子脂肪酸含量的轉錄因子及其應用的製作方法

2023-09-22 12:10:40 1

專利名稱：一種提高植物種子脂肪酸含量的轉錄因子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種與提高植物種子脂肪酸含量相關的轉錄因子及其編碼基因與應用，特別涉及ー種來源於棉花的與提高植物種子脂肪酸含量相關的轉錄因子及其編碼基因與應用。
背景技術：
棉花是我國重要的經濟作物與油料作物。我國常 年植棉600萬公頃，約產皮棉760萬噸、棉籽1300萬噸。作為棉花生產的主要副產品，棉籽富含油脂與蛋白(許紅霞，楊偉華，王延琴，周大雲，匡猛，馮新愛。我國油用棉子質量狀況分析。中國棉花，2009，36 (7) : 2-3)，剝殼後的棉仁脂肪含量30% 40%，可生產油脂。近年來，隨著世界油脂資源和能源資源的日益緊迫，棉籽油等油料作物的生產越來越受到重視，擴大油料作物的種植面積已經成為解決我國油脂資源緊張的重要途徑。本著「不與糧食作物爭地」的原則，為增加單位種植面積內棉花種子的油脂含量，通過克隆調控植物脂肪酸合成的轉錄因子，應用遺傳轉化手段導入棉花受體植株中，從而提高植物的脂肪酸含量，進而增加棉籽仁中的油脂含量，提高油料作物的油脂產量。這對增加我國油脂供應具有重要經濟效益與社會效益。通過利用轉錄因子調控種子中脂肪酸合成等途徑相關的基因表達，從而提高脂肪酸含量與油脂含量的研究越來越受到重視。LECl編碼CCAAT結合因子HAP3亞基的同源物，是植物胚胎發育過程中重要的轉錄調節因子，Mu等(Mu et al. . LEAFYC0TYLED0N1 is akey regulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis. 2008, 148(2):1042-105
4)的研究表明，擬南芥LECl基因的過表達導致脂肪酸合成基因表達量整體水平的増加，在LECl過表達的轉基因植株中，超過58%已知的參與質體脂肪酸合成途徑的酶基因表現出正調控。WRINKLEDl(WRIl)轉錄因子直接調控糖酵解和脂肪酸代謝過程，能提高脂肪酸合成相關基因的整體表達水平，提高脂肪酸和油脂含量(Baud et al. . WRINKLED lspecifies theregulatory action of LEAFY C0TYLED0N2towards fatty acid metabolism during seedmaturation in Arabidopsis, Plant Journal, 2007，50 (5) : 825-838)。在擬南芥中過表達Bnwril使種子的含油量増加了 10%-40%，進ー步分析發現轉基因擬南芥幼胚的細胞體積變大而非數量變多(Liu et al. . Increasing seed mass and oil content in transgenicArabidopsis by the overexpression of wril-like gene from Brassica napus. PlantPhysiology and Biochemistry, 2010，48:9-15)。但是，目前還沒有關於調控棉花脂肪酸含量的轉錄因子的研究。在國內有關調節脂肪酸含量或成份的專利技術報導中，禹山林等(花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其編碼的蛋白質以及克隆方法，申請號200810002795. 4)公開了花生籽粒中脂肪酸脫飽和反應過程中花生硬脂醯-載體蛋白脫飽和酶基因及其編碼蛋白質，該基因的表達可以提高花生中不飽和脂肪酸的含量，並且還能増加花生的抗寒性。目前尚未見有棉花轉錄因子調控脂肪酸含量或成份的具體技術發表。

發明內容
本發明的目的是提供一種與提高植物種子脂肪酸含量相關的蛋白及其編碼基因與應用，該蛋白具有轉錄因子功能。本發明所提供的蛋白質，來源於棉花(Gossypium hirsutum L.),名稱為GhWRIl,是如下(a)或(b)(a)羧基端至少含有序列表中序列2的第221-438位胺基酸序列，並且從序列2的第221位開始，按照序列2的胺基酸序列方向向序列2的氨基端延長，得到長度為218至438個胺基酸的任意ー個蛋白片段；所述蛋白片段具有轉錄活性。(b)將(a)所限定的胺基酸序列經過ー個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且具有轉錄活性或與提高植物種子脂肪酸含量相關的由(a)所限定的胺基酸序列衍生的蛋白質。·在本發明的中，所述蛋白質具體為如下(C)或(d)(c)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；Cd)由序列表中序列2的第221-438位胺基酸序列組成的蛋白質。序列表中序列2由438個胺基酸組成。為了便於所述蛋白質的純化，可在由序列表中序列2或序列2的第221-438位的氣基酸殘基序列組成的蛋白質的氣基末端或竣基末端連接上如下表所不的標籤。表標籤的序列
標籤殘基序列
Poly-Arg5-6 (通常為 5 個)RRRRR
Poly-His2-10 (通常為 6 個)HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL編碼所述蛋白質的核酸分子也屬於本發明的保護範圍。所述核酸分子可以是DNAjB cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。在本發明中，所述核酸分子是編碼所述蛋白質的基因；所述基因是如下I)或2)或
3)1)3'端至少含有序列表中序列3的第685-1341位的核苷酸序列，並且從序列3的第685位開始，按照序列3的核苷酸序列向序列3的5'端延長，和/或從序列3的第685位開始，按照序列3的核苷酸序列向序列3的3'端延長，得到長度為657至1341bp的任意ー個DNA片段；
2)3'端至少含有序列表中序列I的第661-1317位核苷酸序列，並且從序列I的第661位開始，按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為657至1317bp的任意ー個DNA片段；3)與I)或2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且與提高植物種子脂肪酸含量相關的DNA片段。更為具體的，所述基因是如下4) -8)中的任ー種4)編碼序列為序列表中序列I所示的DNA分子；5)序列表中序列I所示的DNA分子；6)序列表中序列I的第661-1317位所示的DNA分子； 7)序列表中序列3所示的DNA分子；8)序列表中序列3的第25-1383位所示的DNA分子。序列3由1539個核苷酸組成，其中第25-1341位為編碼序列，即序列表中序列1，由1317個核苷酸組成，編碼序列表中序列2所示的蛋白質；其中，序列I的第661-1317位核苷酸對應序列2的第221-438位胺基酸。含有所述核酸分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬於本發明的保護範圍。所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。所述重組表達載體可用現有的植物表達載體或酵母表達載體構建。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用於植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA230U pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達載體。所述酵母表達載體如PGBT9等。所述植物表達載體或所述酵母表達載體還可包含外源基因的3』端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3』端。使用所述核酸分子(基因)構建重組表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，例如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、泛素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)、脅迫誘導型啟動子Rd29A等，它們可単獨使用或與其它的啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用重組表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。也可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。在本發明的實施例中，所述重組表達載體中啟動所述基因轉錄的啟動子具體為如下(I)或(2)(I)Padhi 啟動子；(2) 35S啟動子，如CaMV 35S啟動子。更為具體的，所述重組表達載體可為如下(I)或(2):(I)在pGBT9載體(P_啟動子)的多克隆位點處插入所述基因(得到的重組質粒；所述多克隆位點具體為EcoR I和BamHI。(2)在p2301M載體(CaMV 35S啟動子)的多克隆位點處插入所述基因得到的重組質粒。所述多克隆位點具體為BamH I和Spe I。p2301M載體經由pCAMBIA2301載體(中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心，產品目錄號Biovec-07)的多克隆位點Hind III與EcoR I之間插入帶有多克隆位點的表達盒改造而成，具體步驟如下將PCAMBIA2301以Hind III與EcoR I雙酶切，與以相同酶酶切的帶有多克隆位點的表達盒連接，獲得P2301M載體。所插入的帶有多克隆位點的表達盒的核苷酸序列如序列表中序列4所示。所述表達盒由能夠啟動所述基因表達的啟動子，所述基因，以及轉錄終止序列組成。在本發明的一個實施例中，所述重組菌具體為攜帶有所述基因的重組酵母；所述酵母具體可為酵母菌株Y187。·所述蛋白質，或所述核酸分子，或所述重組表達載體、表達盒或重組菌在如下al) -a6)中任一的應用也屬於本發明的保護範圍al)調控植物種子脂肪酸含量；a2)調控植物種子千粒重；a3)調控植物種子細胞大小；a4)選育種子脂肪酸含量高的植物品種；a5)選育種子千粒重增加的植物品種；a6)選育種子細胞大小增大的植物品種。在本發明的一個實施例中，所述調控植物種子脂肪酸含量具體為提高植物種子脂肪酸含量；所述調控植物種子千粒重具體為增加植物種子千粒重；所述調控植物種子細胞大小具體為增大植物種子細胞大小。所述選育種子脂肪酸含量高的植物品種的方法，所述選育種子千粒重增加的植物品種的方法，以及所述選育種子細胞大小増大的植物品種的方法，均可包括將所述蛋白質表達量較高的植株作為親本進行雜交的步驟。本發明的另ー個目的是提供ー種培育轉基因植物的方法。該方法可包括將編碼所述蛋白質的基因導入目的植物中的步驟；所述轉基因植物與所述目的植物相比，滿足如下bl)-b3)中的至少ー種bl)種子脂肪酸含量提高；b2)種子千粒重增加；b3)種子細胞大小増大。所述蛋白質在所述轉基因植物中的表達量高於所述目的植物；編碼所述蛋白質的基因是所述基因是如下I)或2)或3):1)3'端至少含有序列表中序列3的第685-1341位的核苷酸序列，並且從序列3的第685位開始，按照序列3的核苷酸序列向序列3的5'端延長，和/或從序列3的第685位開始，按照序列3的核苷酸序列向序列3的3'端延長，得到長度為657至1341bp的任意ー個DNA片段；2)3'端至少含有序列表中序列I的第661-1317位核苷酸序列，並且從序列I的第661位開始，按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為657至1317bp的任意ー個DNA片段；3)與I)或2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且與提高植物種子脂肪酸含量相關的DNA片段。更為具體的，所述基因是如下4) -8)中的任ー種4)編碼序列為序列表中序列I所示的DNA分子；5)序列表中序列I所示的DNA分子；6)序列表中序列I的第661-1317位所示的DNA分子；7)序列表中序列3所示的DNA分子；8)序列表中序列3的第25-1383位所示的DNA分子。所述基因具體可通過上述任一所述重組表達載體(植物表達載體)導入所述目的植物中，得到所述轉基因植物。具體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導、基因槍等常規生物學方法將所述重組表達載體轉化植物細胞或組織，並將轉化的植物組織培育成植株。農桿菌介導等生物學方法轉化到植物細胞或組織中。·所述植物可為雙子葉植物，也可為單子葉植物，所述雙子葉植株如擬南芥。在本發明的一個實施例中，所述植物具體為Col型擬南芥。所述蛋白質在作為轉錄因子中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明從棉花中得到的轉錄因子GhWRIl能夠顯著提高植物種子的脂肪酸含量，增加種子的千粒重，增大種子細胞大小，該轉錄因子具備良好的應用前景。


圖I為GhWRIl基因(含0RF)的擴增。其中，泳道I為D2000DNA Ldder分子量標準；泳道I和泳道2為GhWRIl基因(含0RF)的PCR擴增結果。圖2為GhWRIl蛋白P -半乳糖苷酶活性的定性檢測。其中，A為三種酵母載體簡圖，a-e 分別為 pGBT9、pGBT9_GhWRI I、pGBT9_GhWRIl_N、pGBT9_WRIl_C、pGBT9-ffER ；B 為酵母濾紙顯色情況，轉化載體a-e同上，「左」表示酵母菌落在SD/-Trp缺陷型培養基上生長情況，「右」表示酵母菌落在濾紙上顯色情況，1-3表示3個單菌落。圖3為GhWRIl蛋白P -半乳糖苷酶活性的定量檢測。其中，PGBT9-WRI即表示pGBT-GhffRIl, pGBT9-WRI-N 即表示 pGBT-GhWRIl-N，pGBT9_WRI_C 即表示 pGBT-GhWRIl-C。圖4為不同含油量棉花品種GhWRIl基因表達量分析。圖5為重組表達載體p2301M-WRIl酶切鑑定。其中，泳道M為D15000DNA plusladder分子量標準；泳道I為重組表達載體p2301M_WRIl的雙酶切產物。圖6為重組表達載體p2301M-WRIl轉化農桿菌菌落PCR陽性克隆鑑定。其中，泳道M為D2000DNALadder分子量標準；泳道1_6為六個陽性單克隆菌落的PCR檢測結果。圖7為T1代擬南芥抗性植株陽性轉化子PCR鑑定。其中，泳道M為D2000DNALadder分子量標準；泳道I為陽性對照(重組表達載體P2301M-WRI1);泳道2為陰性對照(未轉基因的野生型擬南芥植株)；泳道3-7為7個陽性轉GhWRIl基因植株的PCR檢測結果。圖8為擬南芥轉基因株系T3代種子千粒重分析結果。其中，WT表示未轉基因的野生型擬南芥對照；Wl-7、Wl-10、W2-l、W2-8和W3-3是五個T3代轉GhWRIl基因擬南芥株系。圖9為掃描電鏡下觀察轉GhWRIl基因擬南芥種子細胞大小。其中，a為掃描電鏡下觀察轉GhWRIl基因擬南芥種子細胞圖片；b為轉GhWRIl基因擬南芥種子細胞大小的定
量分析。圖10為T3代純合轉GhWRIl基因株系的生長表型。圖11為擬南芥轉GhWRIl基因株系T3代種子脂肪酸含量分析結果。其中，Col表示未轉基因的野生型擬南芥植株對照；Wl-7、Wl-10、W2-l、W2-8和W3-3分別表示5個T3代轉GhWRIl基因擬南芥株系。*表示在0. 05水平上與Col組差異顯著。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、棉花轉錄因子GhWRIl的編碼基因GhWRIl的獲得I、總 RNA 提取選用陸地棉(Gossypium hirsutum L.)品種 Coker201 (武秀明，劉傳亮，張朝軍，李付廣。棉花體細胞胚胎發生的研究進展。植物學通報，2008，25 (4) :469-475)為實驗材料，取開花後20天的幼胚材料，速凍於液氮中，應用CTAB法(參考文獻劉洋，何心堯，馬紅波，吳泳歷，楊佑明。用CTAB-PVP法提取棉花各組織總RNA的研究。中國農業大學學報，2006，11 (I) :53-56)提取RNA。2、利用Promaga的RT-PCR反應體系將步驟I提取的RNA反轉錄合成cDNA。3、RT-PCR 擴增根據NCBI資料庫中棉花的EST信息拼接成contig，設計如下引物I和引物2 引物I :5』 -ATGAAGAGGTCACCGAGITGT-3』(序列 3 的第 25-45 位)引物2 :5』 -CTCCGAATTATCAGAAACTCT-3』(序列 3 的第 1361-1381 位的反向互補序列)以步驟2獲得的陸地棉品種Coker201的cDNA為模版，用引物I和引物2進行PCR擴增。反應體系2.5iil 10XPCR緩衝液(含MgCl2),各0.5 iil弓丨物I和引物2 (IOuM),4u I 2. 5mM dNTPs, I u I cDNA 樣品，0. 25 y I LA 酶(TaKaRa)，16. 25 y I 雙蒸水。反應程序940C 3min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 2min，35 個循環；72で lOmin。經上述PCR反應擴增出大小約為1357bp的目的條帶(圖I)。將PCR產物回收後與pMD18-T載體(TaKaRa)連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，採用藍白斑法篩選陽性克隆，送樣測序。結果表明，該PCR產物中含有序列表中序列I所示的DNA片段，將該DNA片段所在基因命名為GhWRIl基因。整個序列I即為GhWRIl基因的編碼區序列，編碼序列表中序列2所不的蛋白質，命名為GhWRIl蛋白。4、RACE 擴增獲得 GhWRIl 基因 cDNA 的 3』 端序列按照 Invitrogen GeneRacer Kit說明進行3 ' RACE。用設計的GhWRIl基因3』 RACE特異引物Wri3GSPl 5』 -CTGCATGGAITCCGGAITGACATC-3』(序列 I 的第 1014-1037 位，序列 3 的第 1038-1061 位)與 Wri3NGSPl :5』 -GCGTGATGGATGATGATGTGAITGG-3』(序列 I 的第 1175-1199 位，序列 3 的第1199-1223位)和試劑盒對應的引物進行如下兩次PCR 第一次PCR反應(Wri3GSPl和試劑盒所提供的引物序列GeneRacer 3』primer :3』-GCAATGCATCGCATAGCAACTGTCG-5』)94°C 3min ；94°C 30s, 70°C "60°C (Touch Down，前 10個循環退火溫度每個循環下降1°C，後25個循環退火溫度均為60°C) 30s，72°C lmin，35個循環；72°C IOmin0第二次巢式PCR反應(Wri3NGSPl和試劑盒所提供的引物序列GeneRacer3』nested primer :3』 -GTGACAGTACGGCAATGCATCGC-5』)94°C 3min ；94°C 30s,60°C 30s,72°C lmin，35個循環；72°C IOmin0通過上述兩次PCR擴增得到cDNA的3』端序列，並送樣測序，測序結果顯示所得3』端序列為序列表中序列3的第1038-1539位。5、GhffRIl基因全長獲得與分析經在線Cap3拼接軟體(http://pbil.univ-lyonl. fr/cap3. php)將步驟3獲得的GhWRIl基因的編碼區序列(序列I)與步驟4獲得的GhWRIl基因cDNA的3』端序列拼接，再將拼接序列與NCBI上EST資料庫比對，經電子拼接獲得該基因的全長獲得該基因的全長，該基因全長序列為1539bp (序列3)，其中第25-1341位為GhWRII基因的編碼序列(序列I),序列3也編碼 序列表中序列2所示的GhWRII蛋白。以 ProtParam tool (http://web. expasy. org/protparam/)分析該蛋白的理化性質，發現該蛋白的分子量為49. 429KD，蛋白理論等電點為5. 55。應用SMART軟體(http://smart, embl-heidelberg. de/)分析GhWRIl胺基酸序列的保守功能域，發現GhWRIl蛋白N端的第78-150位和第180-244位含有2個AP2保守結構功能域。應用在線軟體預測(www.bioinfo, tsinghua. edu. cn/SubLoc/)預測其亞細胞定位方式,發現GhWRIl蛋白定位於細胞核。實施例2、GhffRIl轉錄因子的轉錄激活功能分析本實施例以pGBT9 (孟紅巖，杜雄明，張春義等.棉花轉錄因子基因GhMS3的克隆及其啟動子功能的鑑定.中國農業科學，2010，43 (17))為原始載體，構建如下三種表達載體(圖2中A) :(1)含有GhWRIl基因的⑶S全長(序列I，簡稱GhWRIKDS)的重組表達載體pGBT-GhWRIl ; (2)含有GhWRIl基因的N端(序列I的第1-654位核苷酸，簡稱GhWRIl-N)的重組表達載體pGBT-GhWRIl-N ；(3)含有GhWRIl基因的C端(序列I的第661-1317位核苷酸，簡稱GhWRIl-C)的重組表達載體pGBT-GhWRIl-C。從而對GhWRIl轉錄因子的轉錄激活功能進行分析。—、重組表達載體的構建以實施例I獲得的GhWRIl基因的編碼區序列(序列I)為模板，用如下引物擴增得到含有相應酶切位點的GhWRIl-CDS、GhffRIl-N和GhWRIl-C片段；用相應的限制性內切酶雙酶切對應的PCR產物，將酶切後的產物與經過同樣雙酶切的pGBT9載體的骨架片段連接。對連接產物進行轉化、搖菌、挑取質粒，送樣測序。經測序表明含有GhWRIl-⑶S、GhffRIl-N和GhWRI I-C片段的重組質粒即分別為重組表達載體pGBT-GhWRI I、pGBT-GhffRI I-N和pGBT-GhWRn-C。擴增GhWRIl-⑶S的引物序列如下CDS-up GGAATTCATGAAGAGGTCACCGAGTTGT (下劃線部分為 EcoRI 的識別序列，其後的序列為序列I的第1-21位)CDS-down CGGGATCCAACAGAGTAGTTACAAGAAACC (下劃線部分為 BamHI 的識別序列，其後的序列為序列I的第1293-1314位)擴增GhWRIl-N的引物序列如下N-up GGAATTCATGAAGAGGTCACCGAGTTGT (下劃線部分為 EcoRI 的識別序列，其後的序列為序列I的第1-21位)N-down CGGGATCCTGCTGCTTCCTCTTGTGTAT (下劃線部分為 BamHI 的識別序列，其後的序列為序列I的第635-654位的反向互補序列)擴增GhWRIl-C的引物序列如下C-up GGAATTCTATGATATGGCAGCTTTGGA (下劃線部分為 EcoR I 的識別序列，其後的序列為序列I的第661-680位)
·
C-down CGGGATCCAACAGAGTAGTTACAAGAAACC (下劃線部分為 BamHI 的識別序列，其後的序列為序列I的第1293-1314位)ニ、Whatman濾紙顯色檢測步驟ー各重組表達載體的轉錄激活功能採用熱激法將步驟ー構建的三個重組表達載體分別轉化到酵母菌株Y187 (孟紅巖，杜雄明，張春義等.棉花轉錄因子基因GhMS3的克隆及其啟動子功能的鑑定.中國農業科學，2010，43 (17))的感受態細胞，將轉化後的酵母菌株分為兩組，分別於SD/-Trp培養基(北京泛基諾(FunGenome)科技有限公司，產品目錄號YGM003A_2)和SD/-Trp/_His培養基(北京泛基諾(FunGenome)科技有限公司，產品目錄號YGM003A_17) 28°C培養2_3天。由於Y187為Trp和His雙缺陷型菌株，而pGBT9載體含有Trp編碼基因，所以轉化以上載體的酵母菌能夠在SD/-Trp培養基上生長，但不能在SD/-Trp/-His培養基上正常生長。各挑取3個在SD/-Trp培養基上生長的酵母單菌落，按Clontech系統操作流程在Whatman濾紙上進行P -半乳糖苷酶活性的定性檢測(參考文獻孟紅巖.棉花MYB轉錄因子GhMS3生物學功能的初步研究.北京，中國農業科學院，碩士學位論文，PP: 16)。然後，以0NPG(onitrophenyl-^ -D-galactopyranoside)為底物,進行0 _半乳糖苷酶活性的定量檢測(參考文獻孟紅巖.棉花MYB轉錄因子GhMS3生物學功能的初步研究.北京，中國農業科學院，碩士學位論文，pp: 16-17)。同時設置pGBT9載體作為陰性對照；設置pGBT9-WER載體(孟紅巖，杜雄明，張春義等.棉花轉錄因子基因GhMS3的克隆及其啟動子功能的鑑定.中國農業科學，2010，43 (17))作為陽性對照。用Whatman濾紙進行P -半乳糖苷酶活性的定性檢測的結果如圖2所示，pGBT-GhWRI I-N和作為陰性對照的pGBT9載體一祥，不能顯色；而pGBT_GhWRIl_C、pGBT-GhffRIl和作為陽性対照的pGBT9-WER載體一祥，都能使濾紙顯色。以ONPG (onitrophenyl-0-D-galactopyranoside)為底物進行 P -半乳糖昔酶活性的定量檢測的結果如圖3所示，pGBT-GhWRIl-N幾乎檢測不到P -半乳糖苷酶活性，而pGBT-GhWRI I-C的￠-半乳糖苷酶活性遠高於pGBT-GhWRI I。這ー結果說明轉錄激活區域位於GhWRIl蛋白的C端。實施例3、GhffRI I基因的表達分析提取不同含油量的陸地棉(Gossypium hirsutum L.)品種09F9083, 09F9077, 09F9077, 09E1021和09E1022 (各品種均從河北冀豐種業有限公司購得；種仁含油量以公眾已知的索氏提取法測定，測定結果如表I)開花後20天幼胚的RNA，經Promaga的RT-PCR反應體系反轉錄合成cDNA，針對GhWRII基因設計引物5』 -GGCATAGATGGACTGGGAGAT-3』(序列 I 的第 251-271 位)和 5』 -GCTGCTGCTTCCTCTTGTGT-3』(序列I的第637-656位的反向互補序列)，以Ghactin為內參基因，設計引物5』 -ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3』 和 5』 -TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3』，採用半定量 RT-PCR 分析GhffRIl基因在含油量材料中的表達。結果如圖4所示，GhWRIl基因的表達量與棉花品種的含油量成正比。這在一定程度上表明可以通過過量表達GhWRIl基因來調控植物中的含油量。實施例4、轉GhWRIl基因擬南芥的獲得及其功能驗證MS篩選培養基在基本MS培養液中加入終濃度為10g/L的蔗糖，終濃度為7. 6g/L的瓊脂粉，終濃度為50mg/L的卡那黴素。其中，MS培養液的溶劑是水、溶質如表I所示。表I MS基本培養液的溶質
權利要求
1.蛋白質，是如下(a)或(b) Ca)羧基端至少含有序列表中序列2的第221-438位胺基酸序列，並且從序列2的第221位開始，按照序列2的胺基酸序列方向序列2的氨基端延長，得到長度為218至438個胺基酸的任意一個蛋白片段；所述蛋白片段具有轉錄活性； (b)將(a)所限定的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且具有轉錄活性或與提高植物種子脂肪酸含量相關的由(a)所限定的胺基酸序列衍生的蛋白質。
2.根據權利要求I所述的蛋白質，其特徵在於所述蛋白質為如下(C)或(d) (C)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質； Cd)由序列表中序列2的第221-438位胺基酸序列組成的蛋白質。
3.編碼權利要求I或2所述蛋白質的核酸分子。
4.根據權利要求3所述的核酸分子，其特徵在於所述核酸分子是編碼權利要求I或2所述蛋白質的基因；所述基因是如下I)或2)或3) 1)3'端至少含有序列表中序列3的第685-1341位的核苷酸序列，並且從序列3的第685位開始，按照序列3的核苷酸序列向序列3的5'端延長，和/或從序列3的第685位開始，按照序列3的核苷酸序列向序列3的3'端延長，得到長度為657至1341bp的任意一個DNA片段； 2)3'端至少含有序列表中序列I的第661-1317位核苷酸序列，並且從序列I的第661位開始，按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為657至1317bp的任意一個DNA片段； 3)與I)或2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且與提高植物種子脂肪酸含量相關的DNA片段。
5.根據權利要求4所述的核酸分子，其特徵在於所述基因是如下4)-8)中的任一種 4)編碼序列為序列表中序列I所示的DNA分子； 5)序列表中序列I所不的DNA分子； 6)序列表中序列I的第661-1317位所不的DNA分子； 7)序列表中序列3所示的DNA分子； 8)序列表中序列3的第25-1383位所示的DNA分子。
6.含有權利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
7.權利要求I或2所述的蛋白質，或權利要求3-5中任一所述的核酸分子，或權利要求6所述的重組表達載體、表達盒或重組菌在如下al) _a6)中任一的應用 al)調控植物種子脂肪酸含量； a2)調控植物種子千粒重； a3)調控植物種子細胞大小； a4)選育種子脂肪酸含量高的植物品種； a5)選育種子千粒重增加的植物品種； a6)選育種子細胞大小增大的植物品種。
8.一種培育轉基因植物的方法，包括將編碼權利要求I或2所述蛋白質的基因導入目的植物中的步驟；所述轉基因植物與所述目的植物相比，滿足如下bl)-b3)中的至少一種bl)種子脂肪酸含量提高； b2)種子千粒重增加； b3)種子細胞大小增大。
9.根據權利要求7所述的應用，或權利要求8所述的方法，其特徵在於所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
10.權利要求I或2所述蛋白質在作為轉錄因子中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種與提高植物種子脂肪酸含量相關的轉錄因子及其編碼基因與應用。本發明所提供的轉錄因子是如下(a)或(b)(a)羧基端至少含有序列表中序列2的第221-438位胺基酸序列，並且從序列2的第221位開始，按照序列2的胺基酸序列方向序列2的氨基端延長，得到長度為218至438個胺基酸的任意一個蛋白片段；所述蛋白片段具有轉錄活性；(b)將(a)所限定的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且具有轉錄活性或與提高植物種子脂肪酸含量相關的由(a)所限定的胺基酸序列衍生的蛋白質。本發明所提供的轉錄因子GhWRI 1能夠顯著提高植物種子的脂肪酸含量，增加種子的千粒重，增大種子細胞大小，具備良好的應用前景。
文檔編號C07K14/415GK102786587SQ201210206588
公開日2012年11月21日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者劉正杰, 華金平, 張園, 李玉華, 王玉美, 趙清翠, 趙鵬 申請人:中國農業大學