用於串聯質譜從頭測序的肽的連續衍生化的製作方法

2023-09-22 20:04:40 2

專利名稱：用於串聯質譜從頭測序的肽的連續衍生化的製作方法
技術領域：
本發明涉及使用質譜對蛋白質或多肽進行測序的方法。
背景技術：
蛋白質是細胞結構的基本生物單位，其由通過肽鍵連接在一起的胺基酸的線性序列形成。該一級胺基酸序列確定了蛋白質的三維特徵和功能。普通胺基酸有二十種，每種都具有氨基、帶有獨特側鏈的碳原子和羧基。mRNA在核糖體上進行翻譯的期間，蛋白質的肽鍵主鏈通過連接一個胺基酸的羧基與隨後的胺基酸的N-末端氨基的鍵來有序形成。所得到的若干胺基酸的線性鏈包括第一個胺基酸(帶有氨基的N-末端胺基酸)和最後一個胺基酸(帶有羧基的C-末端胺基酸)。雖然蛋白質的長度在幾個肽的肽激素到超過1500個胺基酸的範圍內變動，但是大多數蛋白質通常為100至300個胺基酸那麼長。
因為蛋白質的結構與最終的生理功能直接相關，測定蛋白質的胺基酸序列是生物醫學研究和醫藥學上長期以來的基本課題。傳統地，胺基酸分析包括用實驗化學技術測定經純化的蛋白質消化物中每種胺基酸的相對百分比，以及識別各個肽殘基。蛋白質測序是艱苦的工作，其包括用酶將很大量的經過純化的蛋白質消化成肽片段，接著是Edman降解和對重疊序列的對齊。目前，由於對用於蛋白質測序的更加精確的方法的需求的增長，使用質譜分析(MS)對蛋白質測序已獲得了巨大的進步。DNA基因組測序、計算機信息學和使用質譜分析的靈敏的蛋白質分析方法正聯合傳統的蛋白質化學，極大地推動了被稱為「蛋白質組學」的科學研究的新興領域的出現。
蛋白質組學是蛋白質研究的領域之一，其研究對生物的蛋白質補足組(complement)進行的大規模或總體分析(Aebersold and Mann，2003，Nature 422198)。蛋白質組學在研究、診斷以及臨床應用中有著不可替代的重要性，因為其將來自若干技術學科的信息與細胞功能及生理聯繫了起來，所述技術學科包括化學、遺傳學、細胞成像和基於晶片或微陣列的蛋白質分析或DNA分析。實踐中，蛋白質組學要求在短時間內對大量蛋白質的複雜數據進行詳細分析。蛋白質分析的參數包括一級胺基酸序列，以及缺失，剪切重排(splice rearrangement)，多態性，突變，取代以及其它翻譯後修飾(post-translational modifications，PTMs)，例如磷酸化、乙醯化、硝化、磺化、氧化、甲基化、糖基化、交聯。對蛋白質及其相關形式的高通量分析對生物學、生理學和醫藥學研究都極其重要，其可被用於臨床診斷應用。
質譜分析(MS)在蛋白質組學中是潛在的有用工具，因為其對質量高度靈敏的測量可以通過胺基酸序列來鑑別出一些蛋白質(Aebersold andGoodlett，Chem.Rev.101269-295，2001；reviewed in Mann，et al.，2001，Ann.Rev.Biochemistry 70437；Kinter and Sherman，Protein sequencing andIdentification Using Tandem Mass Spectrometry，Wiley，NY，2000)。因為每種胺基酸或胺基酸殘基的鏈理論上可以通過對其質量進行的精確測量來檢測出來，因此對質量的足夠精確的測量使得可對各種胺基酸進行鑑別。當樣品處理和MS技術都高度精確時，就可以確定形成多肽分子的胺基酸的實際序列。此外，如果用高度精確且可信賴的方法檢測到了與一種胺基酸的已知質量的偏差，這就表示該胺基酸已被修飾，因此使得對上述蛋白質結構的所述修飾(例如缺失、剪切重排、多態性、突變、取代以及翻譯後修飾)能被檢測到，在蛋白質組學研究中所述修飾通常非常重要。
質譜分析涉及在氣相中對經過電離的待分析物進行的分析，其中使用對待分析物進行電離的離子源，測量經過電離的待分析物的質荷比(M/Z)的質量分析儀，以及記錄每個m/z值處離子數目的檢測器。MS裝置還可以與分離技術聯合，以改進分析複雜混合物的能力。此外，可以將MS儀器進行組合來提高靈敏度和選擇性。很多種不同的MS儀器都可用於蛋白質測序。關於離子源的方面，電噴霧電離化(electrosprayionization，ESI)和基質輔助雷射解吸附/電離化(matrix-assisted laserdesorption/ionization，MALDI)是對蛋白質或肽電離化以進行分析的兩種常用技術。ESI對來自溶液的待分析物進行電離化，MALDI中使用當暴露於光能時能促進解吸附和電離化的「基質」(matrix)，對樣品進行解吸附並電離化。MALDI產生出來的主要是來自肽的帶單一電荷的離子。如下文中更為詳細的描述所述，串聯(tandem)MS/MS是使用至少兩種MS部件的技術，其是用於對多肽進行MS分析的常用方法。
質量分析儀有若干種，包括離子阱分析儀、飛行時間(TOF)分析儀、四極分析儀、扇形磁場分析儀以及傅立葉變換離子迴旋(FT-MS)分析儀，每種都有著不同的分析特性。上述分析儀可以單獨使用，或者可以串聯組合，以使MS分析的靈敏度和效用最大化。例如，MALDI離子源通常與TOF分析儀耦合，但也可以與四極離子阱耦合，以及與組合式TOF儀器或FT-MS耦合。例如，在TOF-TOF中，兩個TOF部件被碰撞室分開。在混合型的四極TOF裝置中，碰撞室被置於四極濾質器和TOF分析儀之間。上述例子闡明了從完整的MS裝置或從選自上述儀器的部件組合成「串聯」質譜裝置的方式。串聯MS的基本特徵是從離子的片段化(fragmentation)模式中獲得的結構信息。對串聯MS/MS儀器的設計使其可以具有多功能性以及增強的靈敏度，這取決於分析的目標和待分析物的化學組成。在可獲得的MS設備中，MALDI-MS/MS是優選用於肽分析的方法，雖然其它也可以使用。Aebersold and Goodlett，2001；Cramer andCorless，Rapid Comm.in Mass Spectrom.152058-2066，2001；其它MS儀器組合見Aebersold and Mann，2003。
對通過片段化從蛋白質獲得的一組肽而言，獲得對其精確的質量測量的能力使得通過質譜進行的多肽分析容易起來，所述片段化是在使用用於蛋白水解的特異性切割酶之後發生於特定的胺基酸序列上的。對蛋白質進行鑑別的原理假設用規定的蛋白酶水解之後，不同胺基酸序列的蛋白質產生的一組肽構成對特定的蛋白質來說獨一無二的蛋白質質量指紋(fingerprint)。如果用基於實驗中精確觀察到的肽的質量指紋而選定的質量來搜索含有該特定蛋白質序列的序列資料庫，將該資料庫與蛋白酶的片段化規則聯合起來，就可以期待能夠在該資料庫中正確地鑑別出所述蛋白質來。如下文更詳細的描述所示，存在有若干種情況，其中，實驗中觀察到的質譜不能轉化為對實際蛋白質組成或序列的正確預測。
通過上述方法進行的蛋白質鑑別涉及一些基本步驟(i)通過使用對胺基酸序列有特異性的切割試劑來對樣品蛋白質進行消化，以產生肽，使得羧基-或氨基-末端的殘基以合理的確定度被已知。例如，胰蛋白酶在消化片段的羧基末端產生精氨酸(R)或賴氨酸(K)。因此，經胰蛋白酶消化的肽的N-末端(除了N-最末端的一個)可被鑑別為在蛋白質序列中緊接著K或R殘基的胺基酸。(ii)消化之後，在質譜儀中對肽或多肽的質量進行儘可能精確的測量。(iii)在計算機中對實驗蛋白質片段的質量數據進行處理，將其與計算機資料庫中的數據進行比較，並且使用用於實驗中所用的蛋白水解方法的規則，以產生一系列理論質量，與測量出的一系列質量進行比較。(iv)用算法來對測量出的一系列肽質量與上述對資料庫中每個蛋白質預測的一系列質量進行比較，以及對每一匹配給出一個分數值，該分數值表示了匹配程度的排名。該方法通常被稱為「計算機」消化(″in silico″digestion)，通過質量分析對蛋白質進行正確的鑑別取決於測量出的質量與資料庫中含有的相應數據之間的關係。然而，該方法中存在有很多困難。顯然，對待鑑別的蛋白質而言，其序列必須要存在於用於比較的序列資料庫中。另外，蛋白質混合物的消化物對質量分析來說存在一個問題，因為不易明確複雜的肽混合物中哪個肽來自於特定的蛋白質。測量精確度的提高將降低實驗獲得的質量與序列資料庫中相應質量匹配的潛在錯誤，因此將增加資料庫搜索的嚴謹度。
如果對純粹的蛋白質進行消化，將得到的肽的質量與為該蛋白質預測出的一系列肽質量進行比較，典型地，將產生兩種觀察結果。第一種是並非所有預測出的肽都被檢測到。第二種是一些測量出的肽質量並不在從該蛋白質預測出的一系列質量之中。第一個問題，遺漏的質量，通常是由於可能發生於質譜分析之前或期間的很多問題所導致的，例如低溶解度、選擇性吸收、離子抑制、選擇性電離、很短或很長的肽長度、遺漏的或不恰當的蛋白水解切割或其它導致樣品丟失或使特定的肽很少或無法被MS檢測到的人為因素。這是很關鍵的缺陷，因為遺漏的肽質量可能含有很有意義的生物信息。因此，未被檢出的肽質量是通過質譜進行的蛋白質鑑別的一個重大問題，並且，其可能是錯誤鑑別或遺漏鑑別的唯一的主要來源。
片段離子譜是通過被稱為碰撞誘導裂解(CID)的方法來產生的，所述方法中，肽的醯胺鍵被破壞，之後是對片段離子譜的記錄。對醯胺鍵的切割導致b-離子(含有N-末端)和y-離子(含有C-末端)的產生。經胰蛋白酶水解的肽的高品質的MS/MS譜典型地會顯示顯著的b和y-離子系列。如果對10殘基肽的每個醯胺鍵而言，僅有上述兩種離子產生的話，所述的片段離子譜將含有18個峰。理想地，b或y型佔主導地位的長的穩定離子系列將被回收。實際中，肽的片段化是不定的，且取決於基團部分(moiety)，這在分析中導致缺口及困難。產生片段離子的多樣性和不定性使得從肽的MS/MS譜來鑑別肽和測序變得複雜。使對MS/MS譜的解讀變複雜的因素是遺漏的離子集合、內部重排、後續片段化以及多電荷狀況。還需要考慮的是片段離子峰強度與離子系列來源和片段質量之間的關係、胺基酸殘基及其衍生物對相鄰醯胺鍵切割的影響、以及胺基酸組成和中性片段化丟失之間的聯繫。
現有若干種方法用於MS蛋白質從頭測序(de novo sequencing)，其隨著待分析蛋白質的大小和純度而變動。雖然已有一些數據被發表出來，但是對經過部分純化且未被消化的蛋白質進行的MS序列分析(術語為從上至下的測序)或者對來自整個細胞的蛋白質的表達分析，在技術上仍然是困難的，其部分因為樣品的複雜性(Zabrouskov et al.，Mol.Cell.Proteomics 21253，2003；Sze et al.，PNAS 991774-1779，2002)。
先進行肽的串聯MS分析、然後進行計算機化資料庫搜索在高通量蛋白質組學研究中也很常用。近來在多維分離技術和自動數據採集及分析領域取得的進展已進一步增加了用該方法分析生物樣品中多肽的通量。然而，該方法的主要缺陷是對高品質的實驗MS譜依然有嚴格的依賴性，因為理論上的肽序列是通過用實驗譜與計算機產生的理論譜進行匹配來確定的。雖然越來越多不同生物的基因組都已被測序，但目前資料庫仍然無法覆蓋當今生物學研究中所用到的模式生物的整個集合。此外，由於資料庫的錯誤、不完全的轉錄剪切信息(通常出現於真核細胞中)以及多肽的翻譯後修飾，來源於基因組的預測得到的多肽序列信息通常無法可靠地預測實際的多肽信息。已知的對蛋白質和肽的翻譯後化學修飾及翻譯後酶學修飾的數量在持續增加。目前已知有超過200種的對蛋白質的翻譯後修飾。隨著此類修飾的多樣性、幅度和頻率被意識到，對資料庫產生的MS譜的完美質譜匹配的可能性應會降低。因此，上述生物過程可能會顯著地妨礙資料庫搜索以及對生物樣品中蛋白質精確的序列測定。
近來的文章表明，改進的MS分析方法可以鑑別來自其它mRNA剪切、單點突變以及共翻譯修飾和翻譯後修飾的蛋白質異構體(Mann andJensen，Nat.Biotech.21255-261，2003評論)。化學衍生化法可與親和色譜聯合起來，鑑別特定的胺基酸修飾。在固定金屬親和柱色譜前對帶負電荷的胺基酸殘基進行酯化，接著是MS/MS分析，會改進對磷酸化肽的鑑別(Ficarro，Nat.Biotechnol.20301-305，2002)。MacCoss用毛細多維液相色譜，接著使用MS/MS分析，來分析用三種不同的蛋白水解酶消化過的蛋白質，並獲得了對於重疊的肽的序列結果，其減少了作圖修飾(mapping modification)的不確定性，並檢測出了磷酸化位點(MacCosset al.，PNAS 997900-7905，2002)。Claverol et al.使用將凝膠分離的蛋白質和ESI-MS/MS結合起來的策略，以測定酪蛋白的磷酸化和糖基基元(Claverol，et al.，Mol.Cell.Proteomics 2483-493，2003)。用MALDI-TOF和目標LC-MS/MS的組合鑑別出了暴露於毒素導致的化學誘導蛋白質修飾(Person，et al.Chem.Res.Toxicol 16598-608，2003)。
Cagney注意到，他們的實驗結果是典型的肽MS/MS實驗，因為其中觀察到了較長卻不完全的y-離子系列(Cagney and Emili，2002)。大多數從頭進行的肽MS/MS譜或者是不完全的，或者是太複雜的，以至於不能被精確地轉化為對肽的測序。這主要是由於方向性導致的困難(N-末端離子與C-末端離子的區別)、片段化的低效率、內部片段化、片段化期間產生的不同類型離子(即b、y、a、c、x和z型)的存在、不完全的b和y系列的離子組的存在以及它們丟失NH3和H2O基團的傾向。上述各種不同的片段化離子可以以非常不同的量被產生，其中每種都有特徵性的在質譜儀中被檢測到的能力。因此，多肽的MS/MS譜可表現為強度差別極大的高度複雜的表觀質量系列。由於MS/MS譜外觀所固有的複雜性，從頭進行的對肽的測序並不完全具有對多肽進行序列測定的能力。序列錯誤和複合因素，例如多態性、差異性剪切或蛋白質的翻譯後修飾的存在，導致了對有效的從頭測序策略的需求(Cagney，2002)。如果可通過對MS/MS譜的分析來直接對肽的序列進行有序的確定，那就將給蛋白質組學帶來很大的好處。
人們對於從頭測序的嘗試關注於針對方向性和易變化的肽鍵的技術困難，以在保持確定胺基酸精確度的同時簡化或增強對譜的解讀。此外，並非所有的肽都可被溶解，這是由肽的內在化學結構以及MS分析期間其對片段化的多種傾嚮導致的。若干種胺基酸顯示出特定的困難，例如，異亮氨酸和亮氨酸具有相同的質量(異構體)；賴氨酸和穀氨醯胺的質量相近(同量異位，isobaric)，且難於分辨；將酸性胺基酸，天冬氨酸和穀氨酸與其它胺基酸連接起來的醯胺鍵較之其它醯胺鍵更易發生變化，導致了肽在此類位點的脆弱性；位置緊接著N-末端胺基酸的胺基酸容易對片段化產生抗性；以及，組氨酸和脯氨酸非常難於被分析，尤其是鄰近天冬氨酸的脯氨酸。考慮到上述的技術困難存在並需要複雜的數據分析，錯誤或不完全的質譜分析導致從頭蛋白質測序中蛋白質序列的錯誤就很有可能了。
近來，包括同位素標記和化學衍生化的基於MS/MS的方法，已經改善了MS譜的解讀(Cagney and Emili，2002評論)。使用16O/18O標記，改進了對y-離子的鑑別，但還降低了信號強度(Munchbach et al.，Anal.Chem.724047-4057，2000；Uttenweiler-Joseph et al.，Proteomics 1668，2001)。另一種方法涉及到對肽中羧基的甲酯化(Hunt，et al.，PNAS 836233，1986；Goodlett，et al.，Rapid Commun.Mass Spectrom.151214，2001)。該反應增加了天冬氨酸和穀氨酸羧基側鏈的質量，還修飾了C-末端的羧基。然而，對同位素標記和甲基化而言，經修飾的譜都應仍與原始的未被衍生的肽的譜進行比較。因此，對肽進行的化學標記可能需要額外的會使高通量測序變慢的實驗及計算機步驟。質譜分析(MS)涉及在氣相中對經過電離的待分析物進行的分析，其中使用對待分析物進行電離的離子源，測量經過電離的待分析物的質荷比(M/Z)的質量分析儀，以及記錄每個m/z值處離子數目的檢測器。MS裝置還可以與分離技術聯合，以改進分析複雜混合物的能力。此外，可以將MS儀器進行組合來提高靈敏度和選擇性。很多種不同的MS儀器都可用於蛋白質測序。關於離子源的方面，電噴霧電離化(ESI)和基質輔助雷射解吸附/電離化(MALDI)是對蛋白質或肽電離化以進行分析的兩種常用技術。ESI對來自溶液的待分析物進行電離化，MALDI中使用當暴露於光能時能促進解吸附和電離化的「基質」，對樣品進行解吸附並電離化。MALDI產生出來的主要是來自肽的帶單一電荷的離子。如下文中更為詳細的描述所述，串聯MS/MS是使用至少兩種MS部件的技術，其是用於對多肽進行MS分析的常用方法。
質譜分析(MS)涉及在氣相中對經過電離的待分析物進行的分析，其中使用對待分析物進行電離的離子源，測量經過電離的待分析物的質荷比(M/Z)的質量分析儀，以及記錄每個m/z值處離子數目的檢測器。MS裝置還可以與分離技術聯合，以改進分析複雜混合物的能力。此外，可以將MS儀器進行組合來提高靈敏度和選擇性。很多種不同的MS儀器都可用於蛋白質測序。關於離子源的方面，電噴霧電離化(ESI)和基質輔助雷射解吸附/電離化(MALDI)是對蛋白質或肽電離化以進行分析的兩種常用技術。ESI對來自溶液的待分析物進行電離化，MALDI中使用當暴露於光能時能促進解吸附和電離化的「基質」，對樣品進行解吸附並電離化。MALDI產生出來的主要是來自肽的帶單一電荷的離子。如下文中更為詳細的描述所述，串聯MS/MS是使用至少兩種MS部件的技術，其是用於對多肽進行MS分析的常用方法。
在MS分析之前對肽的N-末端進行化學修飾已被發現能改進MS分析。用活性N-羥基琥珀醯亞胺酯在N-末端引入季銨基團，增加了MALDIMS的靈敏度(Bartlet-Jones，et al.，Rapid Comm.Mass Spectrom.8737，1994)。Cardenas，et al用N-琥珀醯亞胺-2-(3-吡啶基)乙酸酯與肽進行反應，接著進行液相色譜分離及ESI-MS/MS分析(Cardenas，et al.，RapidComm.Mass Spectrum.111271-1278，1997)。該反應修飾了N-末端的胺基酸以及賴氨酸的氨基。Keough et al.報導將磺酸基添加到經胰蛋白酶水解的肽的N末端，會增加片段化的靈敏度，較之天然的肽會產生更高產量的片段離子。(WO 02/08767；2003/0032056；WO 02/095419；PNAS 967131-7134，1999；Rapid Commun.Mass Spectrom 152227-2239，2001)。通過對醯胺氮的質子化對醯胺鍵進行去穩定，在MALDI和ESI(AP MALDI與離子阱MS組合)電離化條件下會產生廣泛的片段化。經磺酸化的含有天冬氨酸、穀氨酸和被氧化的甲硫氨酸的肽的MS/MS譜顯示，肽主鏈上的片段化更加一致。此外，Keogh et al.觀察到了脯氨酸殘基上N-末端一側的優先片段化，這增強了對脯氨酸的識別。
人們已發現，在分析之前對肽的C-末端胺基酸進行化學修飾能形成更長且更穩定的y-離子系列。已有若干種對C-末端進行化學修飾的方法被報導用於賴氨酸。如上所述，通常在通過MS進行的多肽分析中使用胰蛋白酶消化來進行片段化，因為得到的片段會可靠地以精氨酸(R)或賴氨酸(K)結尾，因此建立起C-末端的部分。雖然已知精氨酸會產生異常強的MS信號，但賴氨酸卻難於被檢測到。然而，可對賴氨酸進行化學修飾以增強其信號(見Peters，WO 03/056299)。這種修飾可使賴氨酸的質量與穀氨醯胺的質量區別開。Cagney和Emili(2002)使用了一種相似的手段，其中對C末端賴氨酸進行差別胍酯化(guanidination)，接著進行LC-ESI-MS/MS分析(Cagney，Emili，Nat.Biotech.20163-170，2002)。Guet al(Gu et al.，J.Am.Soc.Mass Spectrom.141-7，2003)利用了加入氘標記的(重)賴氨酸。
Peters et al.(Peters，et al.，WO 03/056299)描述了一種不同的用於C-末端賴氨酸的化學衍生化方法，其指出，當用一組特別的試劑，例如2-甲氧基-4，5-二氫-1-H-咪唑(稱為「咪唑」)來修飾多肽C-末端的賴氨酸時，得到的MS/MS譜的複雜度將被很大地降低。Peters et al.注意到，對y-離子系列的鑑別會被改進，因此使得對胺基酸序列的檢測更為精確。
通過對肽進行化學衍生化獲得的對MS/MS譜的簡化，以及隨之改善的對胺基酸序列數據進行鑑別的能力，顯示了發展高品質的片段化譜以及獲得完整的b-離子以及尤其是y-離子序列的長系列的潛力，並提供了用於從頭測序的實用手段。改進的從頭質量測量的解析度增加了序列測定的精確度，也減少了對計算機預測性的蛋白質序列分析的依賴。然而，雖然化學修飾能增加MS分析的可靠性和實用性，增強從頭測序的能力，但仍有若干疑難問題的技術挑戰還未得到解決，大量在生物學上很重要的肽的特徵通過現有的MS技術目前還不能被闡明。此外，肽測序和蛋白質鑑別對計算機資料庫的依賴，總是涉及預測和近似，而非實驗數據，因此，增加了無法從所述數據中檢測出來的錯誤的可能性。因此，理想地，對多肽的質量分析將允許產生精確可靠的多肽序列，所述多肽序列利用了對所述肽中每個胺基酸的從頭鑑別。
考慮到肽的片段化所固有的複雜性和對MS譜的分析的困難，用於對肽進行化學衍生化的不同方法的組合還未完全發展起來。對蛋白質組學以及對肽的複雜混合物的分析而言，一般公認僅有非常簡單並且極端有效的化學衍生化步驟能與蛋白質組學兼容。如果化學反應引入了任何雜質，那麼肽的樣品將變得甚至更為複雜，因此使得MS分析及其後的數據處理複雜化。(Mann and Jensen，Nat.Biotech.21255-261，2003)。因此，雖然化學衍生化法是用於質譜分析的已知工序，但是使用多種不相關的衍生化技術被認為將會向肽的質量分析引入顯著的複雜度和複雜性，使用從頭測序來對肽的線性胺基酸序列進行完全的測定仍然是很困難的。

發明內容
本發明是對用於質譜分析的多肽進行化學衍生化的新穎的手段。本發明既包括方法，又包括物質的組合物；特別而言，本發明包括化學衍生物，所述衍生物的與MS儀器相關的系列用途，改進的數據分析技術，所述技術應用於連續衍生化的多肽的方法，用於測定經過特定修飾的肽的胺基酸序列，本發明還包括用於質量分析中上述所有用途的方法和裝置。在某些實施方式中，本發明還包括用於MS數據分析的新技術，其中使用了譜的數據，計算資料庫以及使用實驗獲得的MS數據以鑑別蛋白質、鑑別肽或肽的序列的軟體和算法，以及對多肽進行從頭測序的軟體和算法。
本發明的優點源自對肽進行測序的數據品質的提高，所述提高基於質量測量的品質的改進，以及通過胺基酸的質量來鑑別胺基酸的譜數據的強度和品質的改進。根據本發明所獲得的上述數據展示了關於肽的質量的關鍵信息，提供了定性和定量的關於MS譜信息的改進，使得在定性和定量方面都優於現有技術並能進行從頭測序的分析得以開展。
本發明的改進和優點來自用化學功能基團和經過特別選擇和設計的反應技術對多肽進行的連續(serial)衍生化，所述反應技術用於用串聯MS產生出有改進的譜數據。所述的連續衍生化促進了通過串聯MS進行從頭測序的最終目標——偏向一種類型的離子片段系列，使得每個胺基酸殘基產生可被測量的離子的可能性近似相等。當開展對下述多肽的質量分析時，對數據品質的所述改進是特別重要的，所述多肽是已知在基於其胺基酸組成、序列或翻譯後修飾的情況下對質量測量和測序來說都存在問題的。存在獨特問題的多肽通常是酸性胺基酸，天冬氨酸和穀氨酸殘基，因為多肽中上述殘基及其相鄰殘基之間的醯胺鍵具有更易成片段的固有屬性。因此，對上述序列和其它存在問題的序列而言，含有上述種類的肽被電離化時會產生不可預料的片段化模式。另一個內在問題是脯氨酸這種胺基酸，因為其殘基具有獨特的構型結構，所述結構易於成片段，這使得對鄰近脯氨酸的序列數據的獲取複雜化了。
上述存在問題的例子對基於MS的多肽測序造成了顯著的障礙，因為在給胺基酸殘基指明身份的過程中的每一個不確定性的實例都會向任何後續的樣品分析(例如蛋白質的鑑別或實驗數據與蛋白質組資料庫的比較)引入不確定性。因為上述原因，本發明提供的對譜的數據的品質的改進就轉化為蛋白質研究領域中的切實可行的改進。
因為本發明的連續衍生化在經過連續衍生化的多肽的片段化特性方面提供了優點，所以在質譜上獲得了定性和定量的明顯改進。對質譜特徵的改進，特別是對MS/MS圖案外觀的簡化，以若干條途徑被實現。因為醯胺鍵片段化的可預測性增加，就更容易檢測到單個的胺基酸殘基，也可以以更高的精確度和確定度來確定質量的值。此外，對更多的殘基的質量值的檢測能力提高，增加了所述譜的總的品質，因為該改進使得更大片段的多肽序列的單個殘基可被確定。
MS譜品質提高的另一方面在於信噪比的增加該比率在定量基礎上增加，簡單地，是由於對單個的殘基產生了更強的信號。定性地，本發明產生了更多的峰，從中可以讀出質量測量數據，其中，測序離子的絕對數量較之非測序離子有所增加。實踐中，從側鏈片段化獲得的離子、水離子和其它噪音信號都減少了。非測序離子的減少在譜的質量方面提供了顯著的優點，因為很多非測序離子與正常的測序離子具有相近的質量值，前者的出現向多肽序列測定引入了不確定性和潛在的錯誤。總而言之，上述所有方面有利於減少通常出現於譜的數據中的缺口。
在所述譜表觀品質的方面，更多的中等強度的峰被觀察到，對於鑑別那些用以鑑別特定的肽或可被識別的肽的組合的y離子的峰的序列的能力也增加了。由經過改進的譜提供的另一項優點是可以減少的片段化能量來進行質量分析的能力。因此，本發明中提高的片段化過程的可靠性、離子的可檢測性和信噪比可以依次有利地改變用於MS分析中的儀器的分析參數。降低片段化能量的能力本身或其中，也通過減少非生產性的(non-productive)離子片段化而改進了所述的譜。
在優選的實施方式中，本發明包括至少兩個化學反應步驟，其中，每一個都是對多肽中存在的獨特的部分(moiety)的衍生化。該方法被稱為連續衍生化，因為使用了兩種截然不同的標記方法。實驗室中進行的化學反應步驟可依次或平行地於下述環境中進行，其中，所述的化學反應不幹擾對所述肽的修飾，或者不幹擾試劑之間的交叉反應，以這樣的方式使得待分析的肽的所述反應和衍生化得到折衷。典型地，連續衍生化在已經或將要被消化以產生多肽片段的樣品上進行，典型地，其具有至少兩個不相關聯的化學標記步驟在第一個步驟，消化之後對多肽進行衍生化，以建立活性末端及獲得第一種衍生物，以協助對單個殘基的鑑別。第一個衍生化步驟的例子是賴氨酸衍生化，例如Peters，et al.(WO 03/056299)所描述的方法。在第二個衍生化步驟中，已經過第一個衍生化步驟衍生化的多肽，例如賴氨酸(特別是C-末端的賴氨酸)被衍生化的那些，被用於進行第二次化學衍生化，其中會獨特地修飾與第一次衍生化不同的部分。第二次衍生化的一個例子是對羧基的烷基化，例如，對天冬氨酸殘基的羧基進行甲基化。所述開展兩種獨特的對肽的部分進行衍生化的方法區別於使用核同位素作為質量標籤或使用兩步化學反應，所述化學反應利用了保護基團在單次化學衍生化中保護特定的肽的部分。
對連續衍生化的描述在此被描述為兩個步驟的方法，因為進行了兩次獨特的衍生化。本文中描述的單個衍生化的步驟可按照任何順序展開，也可同時進行。因為對賴氨酸的衍生化可以在用酶進行消化或對多肽進行化學片段化之後發生，該衍生化步驟在順序上可作為第一個或第二個步驟被有利地進行，這取決於待分析物或其它實驗參數。
在一種優選的實施方式中，多肽或蛋白質樣品在經胰蛋白酶消化之後進行第一次衍生化，其優選標記胰蛋白酶水解片段的C-末端殘基，典型地，產生C-末端賴氨酸的咪唑衍生物。第一或單一的經衍生化的多肽與第二衍生化試劑反應，以在羧基處對多肽的酸性殘基側鏈產生額外的衍生化。如上所示，本發明的一種優選實施方式包含基於Peter，et al.(WO03/056299)的第一衍生化技術及隨後的第二次衍生化的組合，所述第二次衍生化包含對酸性殘基上羧基的甲基化。因為Peters et al.的技術趨向於關注多肽待分析物在酸性殘基周圍的片段化，因而第二次衍生化就協助解決用於酸性殘基的譜的數據，並且其對於提高所述譜的整體品質具有協同效應。
當使用假定的或實際的蛋白質序列資料庫和蛋白質本體資料庫(protein identity database)時，本發明提供的優點就轉化為MS數據的實用性增加。可被鑑別出來的每種額外的可靠的胺基酸殘基都增加了蛋白質測序和蛋白質鑑別的精確度，並改進了將實驗確定的序列與基因組或蛋白質組資料庫的成員進行比較的能力。
本發明導致的改進的譜的數據的另一應用是鑑別出樣品中蛋白質或多肽待分析物的變異體或修飾。很多重要的生理條件是由對蛋白質或多肽的修飾導致的或伴隨的，所述修飾可於含有來自病人的多肽的生物樣品中檢測到，所述生物樣品例如血液、尿、唾液、腦脊髓、體液、腹水、血漿、細胞或組織樣品或提取物或常用於分析方法的其它物質。採用上述樣品，對蛋白質或多肽待分析物的精確實驗測量允許基於對多肽的測量出的質譜圖案與假定或標準質譜圖案的比較的分析和診斷。所述標準質譜圖案可以代表正常的待分析物，或者代表已知表示疾病狀態或已知的生理條件、或特定的目標基因型的待分析物。在該種實施方式中，實驗獲得的序列被與標準或參照進行比較，其差異與標準物或參照物和病人的待分析物之間存在的特定修飾或改變相關。該測量出的差異因此能鑑別出突變，多態性，剪切重排，缺失，取代或其它翻譯後修飾，例如磷酸化、乙醯化、氧化、甲基化、凝膠化、糖基化等。
本發明適用於很多類型的質量分析裝置。


圖1A和圖1B是咪唑標記的肽(SEQ ID NO1)GLQYLLEK的MS/MS譜(MALDI/Q-TOF)，已用Peters et al.(WO 03/056299)的技術對所述的在肽賴氨酸殘基處進行了衍生化，並對羧酸酯(carboxylate)基團進行了甲基化。肽(SEQ ID NO1)GLQYLLEK產生自β晶狀體球蛋白(牛眼晶狀體)的胰蛋白酶消化產物。y1離子及其片段，即215.1、170.1和152.1a.m.u.在所述的譜中佔優勢，因此抑制了其它的y-離子，尤其是質量較高的那些。這可能導致對所述的肽氨基末端殘基鑑別的遺漏。在圖1B中，經過連續衍生化的肽的譜具有較好的y-離子強度分布，因此有助於對序列中每個胺基酸的鑑別。
圖2A和2B是咪唑標記的肽(SEQ ID NO2)CDENILWLDYK的MS/MS譜(MALDI/Q-TOF)，所述的肽產生自丙酮酸激酶(兔肌肉)的胰蛋白酶消化產物。對多肽進行分析的一個額外問題是，羧基末端到酸性殘基即穀氨酸和天冬氨酸的肽鍵，在某些序列情況下易於被破壞，導致MS/MS譜僅有一些佔據優勢的峰，不足以確定所述的肽的全長序列。如圖2A中所示的那些，對肽的分析產生的MS/MS譜數據對這種情況進行了例證。與相應的未經過衍生化的肽相比較，經過連續衍生化的肽對譜品質的改進(圖2B)是非常顯著的，而且從這樣的譜中可以容易地確定出肽的序列。
圖3A和圖3B是咪唑標記的肽(SEQ ID NO1)GLQYLLEK的MS/MS譜，已用Peters et al.(WO 03/056299)的技術用咪唑對所述的肽的羧基末端的賴氨酸和氨基末端的賴氨酸進行了衍生化，所述的肽產生自β-晶狀體球蛋白(牛眼晶狀體)的胰蛋白酶消化產物。雖然在肽的氨基末端的伯胺通常不與咪唑試劑反應，但是當肽的氨基末端的胺基酸殘基是甘氨酸的時候，該N-末端會以較慢的速率被衍生化。由於y-離子系列不完全以及y、a、b和一些c離子的存在，來自此類雙標記肽的MS/MS譜難於被從頭解讀。當同樣的肽被連續衍生化後，y-離子系列變成了所述譜中佔據優勢的特徵，從頭解讀變得更為容易更為精確，如圖3B所示。
圖4A和圖4B。Lys-C可被用於消化蛋白質，以增加羧基末端賴氨酸的出現，這可能會增加用於鑑別的蛋白質序列的覆蓋範圍。然而，Lys-C消化之後得到的肽通常具有內部的精氨酸，這使得它們的MS/MS譜難於被解讀，即使是在咪唑衍生化之後，如圖4A所示。對來自細胞色素C(牛心臟)的同樣的肽(SEQ ID NO3)(圖4B)進行連續衍生化之後的MS/MS譜顯示了直到內部精氨酸的長且佔據優勢的y-離子系列，使得該肽序列的長段可被讀出。
圖5是本發明的方法的一種實施方式，其中除了必要的連續衍生化之外還包括若干可選的步驟。所述方法的組成包括對改進的質譜數據的分析，以進行從頭的肽序列分析、在後續分析中使用序列數據、以及開展大量需要精確序列信息的肽分析步驟中的任何一種。
具體實施例方式
定義本文中使用的術語「烷基化試劑」指如本文中所述的能與胺基酸的羧酸酯基團反應以產生烷基衍生物的化合物。
術語「質量分析」指一種方法，其中，對胺基酸殘基的鑑別是通過對質荷比(M/Z)的測量來確定的。
「多肽」指包含通過肽鍵相連的胺基酸殘基、相關的天然形成的結構變異體、以及合成的非天然形成的其類似物的聚合物，相關的天然形成的其結構變異體，以及合成的非天然形成的其類似物。術語「多肽」還包括作為較大多肽的切割、消化或片段化產物存在的多個胺基酸，其中，切割、消化或片段化是通過化學、生化、電離、機械或其它反應發生的。術語「蛋白質」典型地指較大的多肽。術語「肽」典型地指短的多肽。
本發明涉及改善肽的MS/MS譜品質的方法，因此肽序列(以及，可能地，某些翻譯後修飾)可直接被確定，而不需要基因組信息的在先知識。如上所述，用於蛋白質鑑別和測序的質譜分析方法被廣泛應用於蛋白質組學的領域。質譜分析可以定義出多肽序列的特徵，或者確定蛋白質或多肽序列的兩種形式之間的不同之處。對來自兩種生物學條件，例如來自癌症與正常細胞，的蛋白質表達的比較，可揭示出對應於癌症狀態的獨一無二的蛋白質或一組蛋白質。在蛋白質組學中用質譜分析來從頭獲得序列信息的能力要求高度精確的MS技術、MS/MS譜的可靠產生、以及解釋肽片段化由此鑑別出大量的特定殘基從而產生真實可靠的序列信息的能力。為達到此目的，必須克服使用MS數據來確定肽的序列的過程中的若干已知的問題。根據本發明，肽被連續衍生化，以對片段化特徵進行控制，使得得到的MS/MS譜中的y-離子展現出更加近似相等的強度，且使缺口和非測序數據點最少化。
從頭測序中的重要參數包括多肽片段的片段離子方向性(directionality)氨基(b-離子)或羧基(y-離子)末端上離子電荷保持性。一旦片段離子定向的方向性已被指定，就可以通過確定特定胺基酸殘基的質量來從頭獲得肽序列。從頭序列信息能產生對應於整個肽的較大部分的各單個殘基的延長且可靠的鑑別，並在從頭數據用於資料庫搜索時增強分析能力。但是，對從頭獲得的序列與通過資料庫搜索發現的序列的比較，也可用於分析實驗和理論數據之間的差異本身。當從頭序列與從資料庫搜索獲得的序列不同時，該差異可以被歸因於一種生物學現象，所述現象可在含有其序列被實驗性測定的多肽的樣品即生物樣品中被鑑別出。該特定的基於肽的分析可以通過任何已知的下述技術來開展，所述技術中，可基於質量來確定特定的分子形式。它們包括磷酸化、乙醯化、氧化、硝化、甲基化、矽化(silation)、糖基化、交聯等。雖然示出了利用MALDI/Q-TOF的具體例子，但本領域的技術人員可以認識到，該方法可被延伸到其它的MS接口(舉例而言，電噴霧電離化MS)、另外的MS電離化體系、片段化手段以及質譜儀。如例子所示，甲基化導致C末端賴氨酸被咪唑衍生化的肽中胺基酸側鏈羧基的轉化。去除羧酸酯基團離子化的電荷可能增加在片段化期間破壞鄰近的肽鍵所需要的能量，因此，產生具有改進的y-離子強度分布的MS/MS譜。對樣品進行處理以促進特定的片段化特徵的能力極大地簡化了對序列的從頭鑑別(即，對線型胺基酸序列的「召喚(calling)」)。
本發明改進了對來自本文公開的經過連續衍生化的多肽的肽數據進行的測序後分析。在一些情況下，本發明改進了可被開展的測序後數據分析的品質。在另一些情況下，對譜數據品質的改進使得目前由於肽序列質量分析的開展中所固有的困難而無法實現的新技術變得可行。
本發明可以使序列解讀足夠簡化，以允許自動分析的進行，例如，通過開發及使用計算機算法，所述算法用於對肽進行自動從頭序列召喚，以及對翻譯後修飾的確定，以及將上述方法用於高通量蛋白質組學分析。
本發明展示了對酸性殘基的甲基化與C-末端賴氨酸衍生化的組合，以及後續的質譜分析。本領域的技術人員可以想到在酸性殘基側鏈上，或多肽鏈的其它位置上，或若干功能性基團上進行額外的化學修飾，以便對從頭的序列召喚精確度做出改進。類似地，本發明不限於其所要求的通過使用特定的連續化學衍生化方法，其還包括設計質譜儀器以利用該化學衍生化體系的潛力，例如通過對來自連續衍生化的特定片段化體系進行最優化來設計質譜儀器。
雖然連續衍生化種類和技術被特異性地設計來協助使用串聯MS/MS的從頭多肽測序，但其應用還可延伸至其中從多肽的質量所獲得的信息被下述的連續衍生化所改進的任何質譜分析。此外，雖然某些技術被描述為優選的，例如對賴氨酸的衍生化以及對酸性殘基羧基的烷基化，但大量的其它衍生化是可以考慮的。當然，將一種特定的衍生化的順序指定為「第一」或「第二」可以是完全任意的，術語「連續」不應被解釋為排除了在反應條件允許的情況下對多肽的兩個不相關的化學部分的同時標記。
用同位素標籤來產生同位素類似物不被認為是本發明的衍生化步驟。連續衍生化還排除了對帶有保護基團的單一標記種類的使用。在此類情況下，多肽上僅有單一的目標部分被標記，但是保護基團使某些允許基於單一標記的存在而產生定量差異的化學環境被區別開。
相反地，在連續衍生化中，兩種不相關的標記策略被用於對目標多肽的兩個部分的獨立衍生化，優選地，在對兩種或多種標記來說實質上全部可用的位點進行。第一次衍生化的優選實施例由Peters et al.PCT/US02/35581，WO 03/056299提供，其全文通過引用的方式被特別地包括在本文中。典型地，用能破壞多肽醯胺鍵的化學反應來切割含有完整蛋白質、蛋白質片段或多肽片段或其它多肽待分析物的樣品。
雖然本說明書中為了闡釋的目的使用了胰蛋白酶的消化，但是其它特定的消化也是可能的，其包括但不限於胰凝乳蛋白酶、內蛋白酶、Arg C或Lys C，化學片段化方法，例如溴化氰切割、羥胺切割、BNPS-Skatole等。然而，胰蛋白酶(或內蛋白酶)切割是優選的，因為得到的多肽具有C-末端賴氨酸或精氨酸殘基的特徵。USP 5,821,063提供了用於多肽的通用消化方法。當然，賴氨酸殘基的衍生化發生於末端賴氨酸和內部賴氨酸，雖然對末端賴氨酸的標記對於測序的目的來說是特別有用的。
Peters et al.通過連接具有任何如下結構式的咪唑衍生物來對賴氨酸殘基進行衍生化 其中，每個R都是可從下述基團中獨立選擇出的功能基團，所述基團是氫、氘、滷素、羥基、氰基、可選的被取代的烷基、可選的被取代的烷基氨基甲醯基、可選的被取代的烷氧基、可選的被取代的烷氧基羰基、可選的被取代的芳基、可選的被取代的芳氧基、可選的被取代的芳氧基羰基、可選的被取代的芳基氨基甲醯基、可選的被取代的矽氧烷基(siloxanly)以及親和標籤。
下標「m」是從0-7的整數，其中，連接兩個氮的環表示具有2至12個額外環原子的可選被取代的單環或雙環系統，其中，環原子選自碳、氧、氮、硫和矽，其中，前述的環原子可選地可被取代。
在Peters et al.的一種優選實施方式中，所述標記具有如下結構式 其中，R1、R2、R3和R4都是可從下述基團中獨立選擇出的功能基團，所述基團是氫、氘、滷素、羥基、氰基、可選的被取代的烷基、可選的被取代的烷基氨基甲醯基、可選的被取代的烷氧基、可選的被取代的烷氧基羰基、可選的被取代的芳基、可選的被取代的芳氧基、可選的被取代的芳氧基羰基、可選的被取代的芳基氨基甲醯基以及親和標籤；或在另一種實施方式中，R2、R3和其與之相連的碳，聯合形成了n元碳環、雜環、芳環或芳基雜環，其中n是從大約4至大約8之間的整數。優選地，形成5元或6元環。然而，在某些實施方式中，y是0，其鄰接的碳原子和R1與R2都不存在，以形成4元環。
R5選自氫、滷素、羥基、可選的被取代的烷基、可選的被取代的烷氧基、可選的被取代的芳基和親和標籤。在結構式I中，下標「y」是0、1或2。
在另一種實施方式中，Peters et al.描述了如下結構式的化合物
其中，每個R都各自獨立地選自氫、氘、滷素、羥基、氰基、可選的被取代的烷基、可選的被取代的烷基氨基甲醯基、可選的被取代的烷氧基、可選的被取代的烷氧基羰基、可選的被取代的芳基、可選的被取代的芳氧基、可選的被取代的芳氧基羰基、可選的被取代的芳基氨基甲醯基、可選的被取代的矽氧烷基以及親和標籤。
下標「m」是從0-7的整數，其中，連接兩個氮的環表示具有2至12個額外環原子的可選被取代的單環或雙環系統，其中，環原子選自碳、氧、氮、硫和矽。結構式II中，LG是離去基團。
在一種優選的實施方式中，所述標記具有如下結構式 其中，R1、R2、R3和R4都是可從下述基團中獨立選擇出的功能基團，所述基團是氫、氘、滷素、羥基、氰基、可選的被取代的烷基、可選的被取代的烷基氨基甲醯基、可選的被取代的烷氧基、可選的被取代的烷氧基羰基、可選的被取代的芳基、可選的被取代的芳氧基、可選的被取代的芳氧基羰基、可選的被取代的芳基氨基甲醯基以及親和標籤；或在另一種實施方式中，R2、R3和其與之相連的碳，聯合形成了n元碳環、雜環、芳環或芳基雜環，其中n是從大約4至大約8之間的整數。優選地，形成5元或6元環。然而，在某些實施方式中，y是0，其鄰接的碳原子和R1與R2都不存在，以形成4元環。
R5選自氫、滷素、羥基、可選的被取代的烷基、可選的被取代的烷氧基、可選的被取代的芳基和親和標籤。LG是X-CH3，其中X是雜原子例如O和S。下標「y」是0、1或2。
上述結構式的一種特別優選的實施方式是2-甲氧基-4，5-二氫-1H-咪唑，上述衍生化的一種優選的實施例會在經胰蛋白酶消化的多肽的C末端賴氨酸殘基處產生咪唑衍生物。
除Peters et al.公開的種類之外，很多其它的對多肽的衍生化也是已知的，其可作為本發明的要素付諸於實踐。上述技術中的很多都已知具有選擇性的反應特徵，以產生在MS/MS譜中可觀察到的特徵特性。如上所述，用於測定某些多肽的肽序列的獨特的困難是由存在於該多肽中的特定的功能基團以及其獨特的化學性質帶來的。這些單個問題中的若干種可用本發明的範圍內包含的各種不同的單一衍生化技術來逐一解決。另一個例子是由Caguex et al.提出的，其中使用了O-甲基異脲來對多肽序列進行處理，Nature Biotechnology 20163-170(2002)。然而，從頭測序增加的實用性是基於對譜的品質做出的定性或定量的改進的。該方法展示了一個例子對賴氨酸進行單一衍生化，以此試圖改進片段化特徵以及對測序數據品質有用的質量數據。
第一次衍生化不僅僅限於那些關於對C-末端殘基進行標記以改進佔優勢的y-離子譜的方法。Carderas et al.Rapid Comm.Mass Spectrum.Vol.II，1271-1278(1997)先對肽進行了標記，再經過LC柱及後續的ESI MS/MS分析。衍生化反應在傳統的LC裝置中進行，其中，用經過修飾的胰蛋白酶對蛋白質樣品進行消化，再用N-琥珀醯亞胺-2(3-吡啶基)乙酸酯(SPA)進行嵌入式衍生化。得到的N-末端吡啶乙醯基衍生物和賴氨酸側鏈氨基與胰蛋白酶-OH基團的部分標記共同存在。該技術能幫助區分同量異位的殘基和偏向於形成b-離子的CID片段化途徑的改變。
在Bhikhabbai et al.PCT/US02/16247中描述了對肽的N-末端殘基進行額外的功能衍生化，其中，用帶有磺醯部分和經活化的酸部分的酸性試劑進行了水相衍生化。該反應的特徵在於由於其趨向於降低MS檢測的靈敏度，因而其需要較大的樣品。在對衍生化反應的選擇方面，從多肽片段的C-末端導致片段化反應以產生能在測序分析中對殘基進行鑑別的y-離子的能力應與此類衍生化會極顯著地降低獲得的質譜的靈敏度這一趨勢相平衡。Bhikhabbai et al.的衍生化可通過與下述步驟組合來實現，所述步驟保護某些特定官能團的反應，否則這些官能團將被衍生化。磺醯部分和經活化的酸的部分的組合將在每個賴氨酸殘基處導致磺化反應。為了保護賴氨酸殘基免受該反應，使用鳥嘌呤化(guanination)反應的保護手段被用於對賴氨酸側鏈進行特別保護，以防止其在衍生化步驟中發生反應。此種保護的基團反應對該種衍生化來說是必要的，特別是使用胰蛋白酶消化因此在肽片段的C-末端產生了多個賴氨酸或精氨酸殘基的時候。將保護基團與經活化的酸的部分和磺醯部分聯合使用，是本文描述的連續衍生化範疇內的單一衍生化步驟。
Keough et al.(WO 00/43792)描述了另一種單一衍生化，其中用，例如磺基或雙磺基衍生物，來獲得用一個或多個pKa值小於2的酸的部分對多肽的N-末端進行的衍生化。該衍生化試圖以電荷位點特異性的方式在多肽的醯胺鍵產生選擇性切割，以使單一系列中僅有y-離子的選擇性檢測可以實現。
如上所述，第二個衍生化步驟幫助解決了存在獨特問題的質量測量問題，並檢測到了在單一衍生化的多肽中的問題。對酸性側鏈中羧基進行烷基化的實施例是一個優選的實施例，其與本發明的原理一致，所述原理是改變被衍生化的肽的片段化特徵，以給出具有近似等同的強度的佔優勢的y-離子系列。
對穀氨酸和天冬氨酸及其衍生物、等同物的酸性胺基酸側鏈的羧基的烷基化是如下面的實施例1中所述來獲得的。對肽中羧基的烷基化幫助區分y離子與存在的其它任何離子(包括化學噪音)。在一個優選的甲基化的實施例中，該反應還增加了多肽片段的質量，每個羧基增加了14個質量單位。天冬氨酸和穀氨酸的酸性側鏈不存在的時候，僅有C-末端的羧基能被觀察到了進行了反應，以及顯示出所述的14個質量單位的變化。
通常，烷基化對羧基進行了標記，以形成帶有直鏈、分支或叔烷基的酯，如下述結構式所示CH3(-CH2)n其中，n＝0-3，所述的烷基種類可以是甲基、乙基、丙基、正丙基、異丙基、丁基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基等種類，其中，甲基是優選的。
烷基化反應向蛋白質酸性側鏈的羧基加上了烷基基團，對甲基化而言是加上了14個am。特別地，該反應發生於天冬氨酸、穀氨酸和S-羧甲基化的半胱氨酸。該反應導致了與酸性側鏈數目及被選用的烷基種類相關的質量變化，還對本文所述的MS/MS譜產生了改進。消化或其它片段化可發生於被衍生化或未被衍生化的多肽上，以定位酸性殘基。因此，如上所述，典型地，術語「烷基化」或「甲基化」表示形成羧基的烷基酯或甲基酯，然而，該反應可能並不總是導致酯化，所述的烷基化還可以引起羧基周圍電荷分布的改變，這仍然提供了本發明的優點，而不是嚴格地限於形成烷基酯。
如前所述，本發明還包括用於下列過程的方法對肽進行的衍生化、對經過衍生化的肽的質量分析、測定經過衍生化的肽的胺基酸序列、序列分析以及其它若干基於使用來自經連續衍生化的肽的數據的特定方法。上述方法中的初始化步驟可以包括為了質量分析來分離和製備待分析物。典型地，該步驟包括獲得含有多肽的樣品，從樣品中分離出所述的多肽(雖然對某些樣品而言，該步可以忽略)，以及通過純化、消化或其它方式製備用於衍生化步驟的多肽。然後如上所述對待分析物進行第一次和第二次化學衍生化。如果所述反應不包括競爭，或不妨礙對肽的標記，或不包含待分析物的結構或化學組成，所述步驟可以同時進行。一旦樣品/待分析物已製備好，就可以進行質量分析並獲得譜，其中，用MS/MS來測量多肽片段，並獲得經衍生化的多肽的質量/電荷數據。該質譜包括將肽片段的質量/電荷比與胺基酸序列相關聯的數據，並可以包括以任何形式存在的下述定性或定量的數據，所述數據可用於判斷出關於包括有胺基酸序列的所述待分析物的信息。
除原本的序列數據外，所述的譜還可以含有反映關於基礎(underlying)肽的非序列信息的數據，包括該肽的化學信息，包括糖基化、水合或其它化學修飾。對第一個待分析物的非序列信息可被用於直接確定關於第一個待分析物的信息，或可被用來與第二個待分析物的序列信息或非序列信息、或從中獲得第一個或第二個待分析物的樣品的序列信息或非序列信息進行比較。在蛋白質組學分析中，比較兩種待分析的肽的形式時，該種類型的數據分析是特別有用的。
所述的特定技術包括測量待分析物的實驗或實際質量、測定待分析物的胺基酸序列、測量實驗或實際質量與基於組成原子的分子量的理論值之間的差異、以及確定對任何多肽種類而言，獲得的實驗值與理論值或已知的質量數據之間的差異的來源。
質量分析數據或譜可與已知的測序算法一起使用，以產生所述肽待分析物的胺基酸序列(Taylor and Johnson，Rapid Communications in MassSpectrometry，11，1067-1075m 1997；Chen，et al.，Journal of ComputationalBiology，8(6)，571-583，2001；Dancik，et al.，Journal of Computational Biology，6，327-342，1999；Eng，et al.，J.Am.Soc.Spectrom.，5976-989，1994；Mann Wilm，Anal.Chem.，664390-4399，1994)。上述算法是公知的，並且不考慮質量分析數據的精確度和精確性，其具有一定程度的實用性。由本發明提供的對數據獲取和質譜品質的改進增加了測序算法的實用性，並增加了可被精確測定的序列長度和序列信息的精確度。本發明的方法包括將可獲得的測序算法應用到從經過連續衍生化的多肽的質量分析獲得的序列信息上，以及獲得經過獨特衍生化的多肽或片段的序列信息。
使用用本發明測定出來的精確的胺基酸序列數據，可僅從對部分胺基酸序列的精確測定和對蛋白質資料庫的搜索來進行對部分或全長蛋白質的鑑別。在很多蛋白質組學的研究和基本的生物試驗中，關鍵的測定是對有時存在於生物樣品中的待分析物蛋白質的鑑別。典型地，通過對實驗測定的胺基酸序列與全長蛋白質及被鑑別出的蛋白質片段的資料庫中的大量參照胺基酸序列進行比對，上述蛋白質組學資料庫得以被執行。很容易認識到，序列信息精確度和多肽待分析物中鑑別出來的序列數量的增加，將改進用對照測序對實驗測定出的多肽片段進行的比較和鑑別的實用性。因此，本發明的一個方面是利用從經過本文所述的連續衍生化的多肽的質量分析所獲得的序列數據來鑑別蛋白質，所述鑑別是通過如下方式實現的向蛋白質資料庫提交從MS實驗數據測定的胺基酸序列，以鑑別待分析物和/或鑑別作為樣品組分的待分析物。
已經表明，連續的(沒有缺口的連續序列)五個或更多胺基酸的序列可被用於搜索資料庫從而以高度的置信度來鑑別蛋白質(Mann Wilm，Anal.Chem.，664390-4399，1994)。胺基酸序列的上述長度已被稱為關鍵長度序列標籤。更長的胺基酸序列標籤可以顯著地提高鑑別的精確性，當資料庫中的很多蛋白質共享一定量的進化保守序列時，這是非常有用的。更長的胺基酸序列標籤還可以增加對沒有完全或足夠測序的基因組的生物的蛋白質鑑別的置信度。然而，當在序列標籤中發現缺口時(例如，用三胺基酸標籤加上不定長度的缺口接著是二胺基酸的標籤，來代替五個連續胺基酸的標籤)，蛋白質鑑別就變得非常困難。更多的蛋白質可與更小的序列標籤相匹配，而且因為兩個小標籤的方向性也是未知的，所述的蛋白質鑑別就非常不可靠了。Mann和Wilm已經提出對85％置信度的蛋白質鑑別而言，最小的序列標籤應當有至少三個至四個連續的殘基，但是明顯地，更長的序列標籤是有好處的。
如上所述，本發明的技術對蛋白質中的翻譯後修飾進行MS/MS分析是特別有用的。上述修飾被廣義定義為在信使RNA已翻譯成胺基酸序列之後發生的多肽序列或化學上的任何改變。翻譯後修飾在蛋白質組學分析和對與疾病相關的臨床樣品裡蛋白質的分析中特別重要。很多類型的翻譯後修飾，例如糖基化以及本文中描述的其它修飾，是已知與特定的疾病狀態一致的，或者其可以表明在對病人的診斷中有臨床上的重要意義的生理條件。在某些情況下，用本發明所述的連續衍生化方法來改進多肽片段的質譜的能力，還使通過對多肽待分析物的質量的直接測量和與參照值的比較來對特定的翻譯後修飾進行的檢測和鑑別變得可行。在上述情況下，實驗性地開展質量分析，以測量多肽片段的質量，將該質量與所述多肽片段的期待質量進行比較，所述多肽片段是經過或未經過翻譯後修飾的。例如，加入水分子，作為對多肽片段的翻譯後水合，將增加18的質量，即加入的水分子的質量。當對多肽片段的質量分析產生了與天然多肽相差18個單位的數字時，就鑑別出了翻譯後修飾。可對下述所有類型的翻譯後修飾進行類似的分析，所述翻譯後修飾中可製造出天然多肽較之被修飾的多肽在質量測量上的差異，並且參照質量是已知的。
類似地，這對於對給定的經歷過翻譯後修飾的肽序列中的特定殘基進行的鑑別也有著相當重要的意義。例如，在擁有超過一個潛在修飾位點的肽中。其中一個例子是具有兩個磷酸化潛在位點的肽序列。為了鑑別出獨特的修飾位點，通過MS/MS片段化進行的從頭序列分析可以區分兩個潛在的修飾位點，因為MS/MS片段化圖案應當顯示出漂移了磷醯基團的額外質量(80amu)的恰當質量的y-離子，所述額外質量被添加到連接有磷醯基團的胺基酸殘基的質量上。因此，除任何附屬修飾的質量之外，MS/MS譜信息還包括取決於氨基芳基質量的漂移。以下是明顯的與已知胺基酸質量不一致的相鄰的y-離子之間的質量漂移可作為修飾(包括已知的和有待被了解的翻譯後修飾)存在情況的判斷據。
當質量分析中的任何差異都可被歸因於疾病或有臨床意義的任何生理條件時，類似的能力是存在的。例如，當蛋白質突變已知是針對特定疾病狀態的，並且當該突變是已知的及能導致與天然多肽或代表正常或非疾病狀態的多肽的質量差異，通過比較病人樣品中多肽待分析物的質量與天然或非疾病狀態的已知質量，就可以從質量分析來做出臨床診斷。對此種應用而言，僅需要對本發明的方法加以調整，以包括如下步驟在上述連續衍生化之前將所述的多肽待分析物從病人樣品中分離出來。此外，對質量數據或譜的數據處理包括如下步驟確定至少一個包含有病人樣品的一部分的多肽片段的質量，將該結果與非疾病狀態的已知質量相比較。對病人樣品和正常樣品的比較能顯示出疾病狀態是否存在。因為本發明的連續衍生化增強了串聯MS/MS以高通量模式進行從頭肽測序的能力，本發明還增加了用MS/MS技術來進行用於對多肽序列的任何檢測的大規模篩選和臨床診斷的實用性。
本領域的技術人員明顯知道，本發明增加的對多肽測序的實用性還可以轉化為增加的對多肽資料庫使用中的基因組分析的實用性。任何時候，只要多肽序列已知，就可以確定出理論多核苷酸序列，可以在已知的資料庫中針對與已知序列的相似性進行搜索，即，通過BLAST或其它已知的技術。在本發明方法的範疇內，在開展基因組分析中對多核苷酸序列進行確定的實用性增加，僅僅需要從對經過連續衍生化的多肽的質量分析進行到對多肽序列的測定，通過已知技術對理論的多核苷酸序列進行確定，以及使用現有的多核苷酸資料庫來使多肽待分析物的序列與編碼所述多肽片段或含有所述片段的全長多肽的基礎的多核苷酸序列關聯起來。
如上述關於蛋白質組學研究的例子所述，在蛋白質樣品中檢測改變(例如突變或翻譯後修飾)的能力可與編碼所述蛋白質的基礎的多核苷酸序列聯合起來，以進行基於所述經過連續衍生化的多肽序列的基因組學研究。在蛋白質組學應用中，來自實驗獲得的多核苷酸序列的數據可被用以分析實驗確定的多核苷酸序列和參照序列之間的差異，所述差異可被鑑別出，並與疾病或其它生理條件相關聯。在每種此類應用中，本發明提供的基本的優點是對經過連續衍生化的多肽的質量分析產生的譜或質量數據與參照值之間的比較，所述參照值或者是關於已知多肽的質量的，或者是關於已知多肽的序列的。因此，對本發明產生的數據的比較可以包含對實驗獲得的質量數據與含有參照質量數據的資料庫之間的比較，或者對實驗獲得的序列數據與含有參照序列數據的資料庫之間的比較，或者是上述二者的組合。
實施例1衍生化及咪唑肽及對羧基的甲基化八個蛋白質，β-酪蛋白(牛奶)、肌紅蛋白(馬心臟)、細胞色素c(牛心臟)、β-晶狀體球蛋白(牛眼晶狀體)、鈣調蛋白(牛腦)、人血清蛋白、丙酮酸激酶(兔肌肉)和人轉鐵蛋白被單獨溶解於含有8M尿素、100mM NH4HCO3、pH為8.5、終濃度為大約2mg/ml的緩衝液中。每種蛋白質取大約200μg，先用三(2-羧乙基)-鹽酸磷化氫在37℃進行30分鐘的還原，再在室溫用碘代乙醯胺與其進行反應30分鐘。得到的蛋白質溶液被稀釋四倍，至最終的尿素濃度為2M，以40∶1加入胰蛋白酶，在37℃培養過夜。通過加入少量乙酸來終止消化反應。細胞色素c和轉鐵蛋白按照上面描述的那樣被還原和烷基化。不經稀釋就將Lys-C以100∶1加入到蛋白質溶液中，並在37℃培養過夜，再用乙酸來終止反應。
為了用咪唑來修飾肽羧基末端的賴氨酸，將30μl(-10μg)蛋白質的胰蛋白酶消化產物與20μl 1M的咪唑貯藏液(例如，終濃度為400mM的2-甲氧基-4，5-二氫-1-H-咪唑)混合。在60℃對該反應混合物進行3小時的培養，用5μl的冰醋酸來終止反應。在C18旋轉柱(Pierce)上對肽進行純化，分為兩半並凍幹。其中一半被溶於50∶50v/v的甲醇水中，用MALDI-MS/MS加以分析。為衍生化羧酸酯基團，將另一半溶於100μl作為烷基化試劑的2M甲醇HCl中，在室溫培養2小時(Ficarro et al.，Nature Biotechnology，2002，20301-305)。通過凍幹來終止該反應。被凍幹的肽混合物被重新溶解於50∶50v/v的甲醇∶水中，用MALDI-MS/MS加以分析。用此方法對八種不同的蛋白質分別進行試驗。如本領域的技術人員所知，為增加單個蛋白質的蛋白質序列覆蓋度，或為了分析更為複雜的蛋白質混合物，例如蛋白質複合物，或者甚至是細胞的全部溶解產物，還可通過單獨的或多維的分離技術(例如液相色譜)來對經過衍生化的肽進行分離，然後用合適的質譜方法對其進行分析，例如通過MALDI-MS/MS或在線的電噴霧電離化MS/MS。來自細胞色素、丙酮酸激酶和β-晶狀體球蛋白的有代表性的MS/MS譜被展示出來。
與相應的未經過衍生化的肽(圖1、2、3和4的A圖)相比，經連續衍生化的肽(圖1、2、3和4的B圖)在譜的品質方面取得的改進是很顯著的，從上述的譜中可以容易地確定肽的序列。在所有情況下，較之未經過衍生化的肽，對經過羧酸酯衍生化的肽進行肽片段化需要更高的碰撞能量，這代表著經過穩定化的肽鍵。通過破壞酸性殘基的羧酸酯側鏈產生的y離子不再佔據優勢地位，例如圖2中A部分的y2離子所示。並且，通常地，y1離子及其片段不再是MS/MS譜中的優勢特徵了。這兩項改進使得更高質量的y離子能被檢測到。總體而言，經過羧酸酯衍生化的肽在MS/MS譜上產生了具有更加完全的y-離子系列和均勻分布的峰強度的片段，這是從頭測序中所期待的特徵。
參考圖1A和圖1B，圖1A是從對肽(SEQ ID No1)進行的MALDI/Q-TOF MS分析中獲得的MS/MS數據，所述的肽已用Peters et al(WO 03/056299)描述的技術在賴氨酸殘基處進行了衍生化。如圖1A所示，某些特徵在對被測序的胺基酸進行直接解碼時可能存在問題。所述y離子及其片段，即215.1、170.1和152.1a.m.u.在所述的譜中佔據優勢地位，並抑制了其它的y離子，特別是具有較高質量的那些。對系列中其它y離子的抑制增加了對肽中氨基末端殘基錯誤鑑別的可能性。與之相比，圖1B展示了已經過實質性改進的y-離子強度分布和經過改進的鑑別組成序列的能力。
對下述多肽的分析可能導致另外的問題，所述多肽中聯繫羧基末端和酸性殘基(例如穀氨酸和天冬氨酸)的肽鍵，在某些序列情況下易於被破壞，導致MS/MS譜僅有少數佔據優勢的峰，不足以確定所述肽的全長序列。這可能導致對所述肽中殘基的鑑別被遺漏。圖2A中顯示的對肽(SEQ ID No2)的分析產生的MS/MS譜的數據示例性地說明了這一情況。圖2B顯示了對多肽片段進行甲基化之後譜的品質的改進。
參考圖3A，從其中羧基末端的賴氨酸和氨基末端的甘氨酸都被咪唑衍生化了的肽(SEQ ID No1)獲得的MS/MS譜顯示雖然在肽的氨基末端的一級胺通常不與咪唑試劑反應，但是當肽的氨基末端的胺基酸是甘氨酸時，N末端就會以較慢的速率被衍生化。由於y-離子系列不完全以及y、a、b和一些c離子的存在，來自此類雙標記肽的MS/MS譜難於從頭被解讀。當根據本發明對同樣的肽進行連續標記後，y-離子系列變成了所述譜中佔據優勢的特徵，從頭解讀變得更為容易更為精確，如圖3B所示。
參考圖4，從具有內部精氨酸的肽(SEQ ID No3)獲得的MS/MS譜。Lys-C通常被用於消化蛋白質，以增加羧基末端賴氨酸殘基的出現，這增加了將實驗確定的序列用於蛋白質鑑別的能力。然而，內部的精氨酸殘基使得所述的MS/MS譜難於被解讀，即使是在咪唑衍生化之後，如圖4A所示。圖4B顯示了有所改進的MS/MS譜，其來自對同樣的肽的酸性殘基的羧基進行的烷基化，其顯示了直到內部精氨酸的胺基酸殘基系列，因此允許對長序列標籤的測定。
本發明包括含有用於進行上述連續衍生化的試劑和說明書的工具包。對每個工具包而言，所述試劑包括但不限於烷基化試劑、特異性甲基化試劑例如甲醇氯化氫、經活化的咪唑化合物例如2-甲氧基-4，5-二氫-1-H-咪唑、緩衝液、溶劑和容器。所述工具包還可以包括反應管、混合管和顯示化學反應完成程度的指示劑。該工具包包括進行上述連續衍生化反應的書面的說明書，其還可以包括用於分析從本發明的實踐中獲得的質量數據或質量譜的說明書。該工具包還包括用於在質譜分析之前色譜清除反應產物的固相設備。
實踐中，用標準的MS/MS設備和系統來分析所述的多肽待分析物，所述設備和系統典型地包括電離化腔、質量檢測器的接口、質量檢測器和數據分析系統。所述數據分析系統包括用於對質量分析數據進行分析及報告的計算機或數據處理器，顯示質譜的顯示單元(例如視頻監視器)和/或印表機。對序列分析而言，計算機/數據處理器包括用於開展序列計算和顯示或列印胺基酸序列的軟體。可用相同的或單獨的計算機/數據處理器來提交序列數據，以進行資料庫分析、蛋白質鑑別或上述的蛋白質組學或基因組學分析。
只要不與本公開矛盾，本說明書中引用的所有文獻和專利申請文件都以參考文獻的方式被包括進本文中，就像每件單獨的文獻或專利申請文件被特別且單獨地指出以參考文獻的方式被包括進來一樣。
雖然為了清楚理解的目的，前述的發明某些細節是通過詳細闡述和實施例的方式來描述的，但是根據本發明的教導，可在不超過所附的權利要求的精神或範圍的情況下，做出某些改變和修改，這對本領域技術人員來說是很明顯的。
序列表110安捷倫科技有限公司巴裡·E·博伊斯戈登·R·尼古拉劉宏斌120用於串聯質譜從頭測序的肽的連續衍生化13010040405KTM7374140還未轉讓1412004-07-161603170PatentIn version 3.221012118212PRT213牛220
221MISC_FEATURE223來自β-晶狀體球蛋白(牛眼晶狀體)的肽4001Gly Leu Gln Tyr Leu Leu Glu Lys1 5210221111212PRT213兔220
221MISC_FEATURE223來自丙酮酸激酶(兔肌肉)的肽4002Cys Asp Glu Asn Ile Leu Trp Leu Asp Tyr Lys1 5 10210321111212PRT213牛220
221MISC_FEATURE223來自細胞色素c(牛心臟)的肽4003Gly Glu Arg Glu Asp Leu Ile Ala Try Leu Lys1 5 10
權利要求
1.一種多肽，具有包含賴氨酸和穀氨酸或天冬氨酸的胺基酸序列，並具有至少兩種化學衍生物，所述多肽包括所述賴氨酸的咪唑衍生物；以及所述穀氨酸或天冬氨酸的羧基的烷基衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其中所述的咪唑是2-甲氧基-4，5-二氫-1H-咪唑。
3.如權利要求1所述的多肽，其中所述的烷基衍生物是甲基。
4.如權利要求1所述的多肽，其中所述的烷基衍生物選自乙基、丙基、正丙基、異丙基、丁基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基或其組合。
5.如權利要求1所述的多肽，其中所述的賴氨酸是C末端的賴氨酸。
6.如權利要求1所述的多肽，其中所述的賴氨酸是內部的賴氨酸。
7.一種對多肽進行質量分析的方法，其包括通過用咪唑與所述多肽反應來對多肽進行衍生化，以產生具有賴氨酸的咪唑衍生物的經衍生化的多肽；通過用烷基化試劑與所述多肽反應來對多肽進行衍生化，以產生經過衍生化的多肽片段，所述多肽片段具有穀氨酸或天冬氨酸的酸性側鏈羧基的烷基衍生物，其中，上述這些衍生化步驟產生經過連續衍生化的、同時具有賴氨酸的咪唑衍生物和被烷基化的羧基的多肽；以及獲得對所述經過連續衍生化的多肽的質量分析。
8.如權利要求7所述的方法，還包括在用咪唑與所述多肽反應之前對所述多肽進行消化的步驟。
9.如權利要求7所述的方法，還包括從所述質量分析來確定所述經過了連續衍生化的多肽的胺基酸序列。
10.如權利要求7所述的方法，其中所述的用咪唑與所述多肽反應的步驟是利用2-甲氧基-4，5-二氫-1H-咪唑來進行的。
11.如權利要求7所述的方法，其中所述的用烷基化試劑與所述多肽反應的步驟包括對所述的羧基進行甲基化。
12.如權利要求7所述的方法，其中所述的用烷基化試劑與所述多肽反應的步驟產生羧基的烷基衍生物，所述烷基選自乙基、丙基、正丙基、異丙基、丁基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基以及其組合所構成的組。
13.一種檢測多肽待分析物序列的方法，所述方法包括用咪唑與所述多肽待分析物反應，以產生具有經咪唑衍生化的賴氨酸的經衍生化的多肽待分析物；用烷基化試劑與所述多肽待分析物反應，以產生經過衍生化的多肽待分析物，所述經過衍生化的多肽待分析物在穀氨酸或天冬氨酸的酸性側鏈處具有經過烷基化的羧基，其中，這些反應步驟產生了經過連續衍生化的多肽；對所述經過連續衍生化的多肽待分析物進行質量分析；以及從所述的質量分析來確定所述經過連續衍生化的多肽待分析物的胺基酸序列。
14.如權利要求13所述的方法，還包括將所述胺基酸序列與參照序列進行比較。
15.如權利要求14所述的方法，還包括確定所述胺基酸序列質量與所述參照序列質量之間的差異。
16.如權利要求14所述的方法，還包括將所述比較與所述胺基酸序列的翻譯後修飾聯繫起來。
17.如權利要求13所述的方法，還包括從病人樣品中分離多肽待分析物的步驟，其中，所述的多肽待分析物是指示疾病是否存在的蛋白質。
18.如權利要求14所述的方法，還包括在用咪唑與所述多肽待分析物反應之前對所述多肽進行消化。
全文摘要
本發明公開了通過化學反應對用於質譜分析的待分析物進行的連續衍生化。所述衍生化增強了MS技術對於分析蛋白質樣品的用途，特別是通過串聯MS/MS來確定多肽的序列時。本發明描述了用於對多肽進行測序以及在蛋白質分析中使用測序數據的精確質量分析技術。
文檔編號G01N30/00GK1749269SQ20051008451
公開日2006年3月22日 申請日期2005年7月18日 優先權日2004年7月16日
發明者巴裡·E·博伊斯, 戈登·R·尼古拉, 劉宏斌 申請人:安捷倫科技有限公司