基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢的方法和試劑盒的製作方法

2023-09-22 02:14:15 2

基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢的方法和試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢的方法和試劑盒，該試劑盒由具有富集抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體功能的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠、多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG抗體納米探針、質控品以及PBST緩衝液所組成；質控品包括陽性質控品以及陰性質控品；陽性質控品為人肺炎衣原體感染者的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體分別為陽性的血清；陰性質控品是抗人肺炎衣原體IgM、IgG均為陰性的人血清。本發明具有簡便、快速、高靈敏度的優點，可實現對抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體的同步檢測。
【專利說明】基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢的方法和試劑盒

【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學檢測【技術領域】，具體為一種基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢的檢測方法及檢測試劑盒，以及該檢測試劑盒的製備及使用方法。

【背景技術】
[0002]肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae, Cpn)作為衣原體屬的一種重要的呼吸道病原微生物，自從上個世紀80年代中期由Grayston等人正式命名，在隨後的時間裡被研究者們廣泛研究。現僅知人是該病原體的宿主，感染方式可能為人與人之間通過呼吸道分泌物傳播。5歲以下兒童極少受染，8歲以上兒童及青年易被感染，尤其是人群聚集處，如家庭、學校、兵營中易流行，經血清流行病學調查，證實成人中至少有40%已受到該衣原體感染，大部分為亞臨床型。肺炎衣原體是專性細胞內寄生的微生物，寄居於人呼吸道和咽喉等處，在兒童和成人中產生上呼吸道和呼吸道感染，常引起肺炎和支氣管炎等呼吸道疾病。目前研究表明，其還與動脈粥樣硬化綜合症、老年痴呆症、心肌炎、哮喘等疾病有關。臨床上由於其與其他呼吸道病原體引起的感染症狀類似，因此常難以根據臨床表現、X-射線檢查等得出結論，確診往往依賴於實驗室診斷。快速有效的診斷方法應該是在疾病的發病初期就可以得到明確的診斷，便於實施針對性的治療，阻止病情的發展遷延。
[0003]在人肺炎衣原體感染的實驗室診斷上，被檢者血清中抗人肺炎衣原體抗體指標則是診斷結果的重要依據之一。
[0004]免疫球蛋白M(Immunoglobulin M, IgM)和免疫球蛋白 G(Immunoglobulin G, IgG)是人體內最重要的兩種抗體。當人肺炎衣原體進入機體後，最早出現的免疫球蛋白是IgM抗體，之後出現IgG，通過檢測體內特異性IgM、IgG抗體的存在，可診斷人體對人肺炎衣原體的免疫反應狀態。若檢測出特異性IgM抗體，表明有近期感染的發生，但IgM抗體半衰期較短，IgM的檢測陰性並不能證明機體未受感染，還需要檢測半衰期較長，含量最高的IgG抗體，以明確診斷。
[0005]目前，血清中特異性IgM及IgG抗體的檢測方法主要有冷凝集實驗、明膠顆粒凝集實驗、酶聯免疫吸附實驗、金標免疫斑點法及金標免疫層析法。冷凝集實驗的特異度和敏感度均為最低，因此其臨床診斷價值不大；金標免疫斑點法及金標免疫層析法雖操作簡便快捷，但敏感度略低，對抗體水平較低的患者有漏診的可能；明膠凝集實驗試劑準備與操作過程較為繁瑣，且需要專業操作人員。酶聯免疫吸附法具有特異、敏感等優點，已用於檢查各種抗體或抗原，但此方法存在以下問題:(I)每一批試驗從加樣、溫浴、洗版等步驟較多，操作繁瑣，時間較長(總共需要2-4小時)；(2)檢測中需分別加入顯色成分A液與B液，且還要在規定時間內完成讀數，一定程度上增加了勞動強度和操作失誤的可能性；(3)該法無法做到對IgM及IgG兩種抗體的同時檢測。雖然單獨檢測IgM和IgG抗體後，再綜合分析檢測結果對疾病的診斷並無影響，但操作過程繁瑣，檢測不夠方便快捷，檢測成本較共檢亦會增加。
[0006]因此，建立具備高靈敏度的能對抗人肺炎衣原體的特異性IgM、IgG抗體進行快速同步共檢的檢測方法顯得十分必要。


【發明內容】

[0007]針對【背景技術】中存在的這些技術問題，本發明提供了一種基於磁性分離和多色量子點標記的能簡便、快速、高靈敏度的同步共檢抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體的檢測方法和試劑盒，以及該試劑盒的製備及使用方法。
[0008]本發明是通過以下技術方案來實現的:
[0009]一種基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢的方法，其特徵在於:所述方法包括以下步驟:
[0010]I)重組人肺炎衣原體98KD膜蛋白抗原的製備；
[0011]2)將步驟I)製備得到的重組人肺炎衣原體98KD膜蛋白抗原與納米磁珠通過共價偶聯，製得抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠；
[0012]3)將鼠抗人IgM單克隆抗體與發射波長為520nm的納米量子點通過共價偶聯，製備量子點標記的抗人IgM納米探針；將鼠抗人IgG單克隆抗體與發射波長為600nm的納米量子點通過共價偶聯，製備量子點標記的抗人IgG納米探針；將量子點標記的抗人IgM納米探針與量子點標記的抗人IgG納米探針等量混合即製得多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針；
[0013]4)取人血清樣本，用PBSA緩衝液適當稀釋後，分別向血清稀釋液中加入步驟2)製備得到的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠以及步驟3)製備得到的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針，充分混合，反應5-45min後進行磁分離，以PBST緩衝液洗滌2遍後，使用螢光酶標儀，在發射波長(Em)分別為520nm及600nm下分別讀取螢光值；所述PBSA緩衝液中各組分含量分別為 8g/L NaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA (牛血清白蛋白)，所述PBSA緩衝液的pH = 7.4 ;所述PBST緩衝液中各組分含量分別為 8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA(牛血清白蛋白)，0.3g/L NaN3,0.5ml/L Tween-20，所述 PBST 緩衝液的 pH = 7.4 ；
[0014]5)根據步驟4)的方法檢測至少30份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本,分別讀取發射波長(Em)分別為520nm及600nm下的螢光值；所述抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本簡稱人肺炎衣原體抗體陰性對照樣品；所述人肺炎衣原體抗體陰性對照樣品在發射波長(Em)為520nm的螢光值的平均值與3倍標準差之和記為CUT-OFFl值；所述人肺炎衣原體抗體陰性對照樣品在發射波長(Em)為600nm的螢光值的平均值與3倍標準差之和記為⑶T-0FF2值；若步驟4)中人血清樣本在發射波長(Em)為520nm的檢測螢光值大於CUT-OFFl值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎衣原體IgM抗體為陽性；若步驟4)中人血清樣本在發射波長(Em)為520nm的檢測螢光值小於CUT-OFFl值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎衣原體IgM抗體為陰性；若步驟4)中人血清樣本在發射波長(Em)為600nm的檢測螢光值大於CUT-0FF2值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽性；若步驟4)中人血清樣本在發射波長(Em)為600nm的檢測螢光值小於CUT-0FF2值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎衣原體IgG抗體為陰性。
[0015]一種基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒，其特徵在於:所述基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒由具有富集抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體功能的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠、多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG抗體納米探針、質控品以及PBST緩衝液所組成；所述質控品包括陽性質控品以及陰性質控品；所述陽性質控品由兩份人肺炎衣原體感染者的抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性的血清及兩份抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽性的血清組成；所述陰性質控品是四份抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清。
[0016]—種用於製備基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒的方法，其特徵在於:所述方法包括以下步驟:
[0017]I)抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠的製備:
[0018]1.1)重組M98_His融合蛋白的製備、純化:
[0019]1.1.1)對人肺炎衣原體98KD外膜蛋白進行生物信息學分析，獲取人肺炎衣原體98KD膜蛋白胞外結構域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對應的基因序列；
[0020]1.1.2)在步驟1.1.1)中所得到的基因序列的5』端及3』端分別引入酶切位點並化學合成全基因序列，同時標記記為M98 ;其序列參見序列表；
[0021]1.1.3)將步驟1.1.2)中所得到的M98按分子生物學方法克隆入表達載體pET-28a(+)後轉入大腸桿菌中表達重組M98-His融合蛋白；所述重組M98_His融合蛋白以包涵體表達形式存在於基因工程菌體中；
[0022]1.1.4)用鎳柱純化步驟1.1.3)所得到的重組M98_His融合蛋白，SDS-PAGE檢測其純度後，再對重組M98-His融合蛋白進行復性,經bradford試劑盒進行蛋白質濃度測定後，用PBS緩衝液調整濃度為0.2mg/mL ;所述PBS緩衝液中各成分含量如下:8g/L NaCL,0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,所述 PBS 緩衝液的 pH = 7.4 ；
[0023]1.2)納米磁珠的包被:
[0024]1.2.1)取5mg磁珠，用Iml MES緩衝液洗滌三次，置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內核、粒徑為1150nm的羧基磁珠；所述MES緩衝液是質量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代)乙磺酸；所述MES緩衝液的pH = 6.0 ;所述納米磁分離器的磁性強度是0.4T；
[0025]1.2.2)依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩衝液配製的濃度是8_12mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩衝液配製的濃度是6-10mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以10-40rpm/min於旋轉混合儀中活化Ihr,置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清，用Iml步驟1.2.1)中的MES緩衝液重懸，得到活化後的磁珠；
[0026]1.2.3)取5個離心管，在每個離心管中加入200 μ L步驟1.2.2)所得到的活化後的磁珠，置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清，向各離心管中加入用PBS緩衝液稀釋的濃度為50-200 μ g/ml的由步驟1.1.4)所製備的重組M98_His融合蛋白溶液各1ml，室溫下以15rpm/min於旋轉混合儀中反應2_6h，置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清後，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩衝液,室溫下以15rpm/min於旋轉混合儀中反應2h以封閉磁珠上未與抗體反應的羧基；所述PBS緩衝液中各成分含量如下:8g/L NaCL,0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,所述 PBS 緩衝液的 pH = 7.4 ；
[0027]1.2.4)封閉反應完成後，將該5個離心管置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清，各用Iml洗滌緩衝液洗滌三遍；所述洗滌緩衝液中各成分含量如下:8g/L NaCL,
0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.5ml/L Tween-20，所述洗滌緩衝液的pH =7.4 ；
[0028]1.2.5)向各個離心管中分別加入Iml保存緩衝液重懸磁珠，置於4°C保存備用；至此製得抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠；所述保存緩衝液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.3g/L NaN3, 5g/L 牛血清白蛋白(BSA)，所述保存緩衝液的pH = 7.4 ;
[0029]2)多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針的製備:
[0030]其具體製備方法包括:
[0031]2.1)向微量離心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子點、300nmol N-羥基琥珀醯亞胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩衝液定容為5ml，混合溶液，37°C反應30min後,透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS及EDC,得到活化後的量子點；所述羧基水溶性量子點的發射波長是520nm ;所述磷酸鹽緩衝液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉；所述磷酸鹽緩衝液的pH = 7.4 ;
[0032]2.2)在步驟2.1)所得到的活化的量子點中，加入2-12nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應2h，加入單端氨基化聚乙二醇PEG2000-NH2至終濃度為1%，封閉未反應的活化羧基位點，繼續避光反應Ih ；
[0033]2.3)用0.2 μ m PES濾器過濾除去步驟2.2)中的抗體聚集物，然後將濾液轉移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發生偶聯反應的抗體和反應中的副產物；
[0034]2.4)收集步驟2.3)中超濾離心管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶於2ml磷酸鹽洗滌液中，再將此溶液轉移到一個新的50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，收集超濾離心管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶於Iml磷酸鹽保存液中，置於4°C保存備用，至此製得量子點標記的抗人IgM納米探針；所述磷酸鹽洗滌液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，
0.3g/L疊氮鈉，所述磷酸鹽洗滌液的pH = 7.4 ;所述磷酸鹽保存液中各成分含量如下:
2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L牛血清白蛋白，0.3g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽保存液的pH = 7.4 ;
[0035]2.5)按與步驟2.1)-2.4)相同的方法利用鼠抗人IgG單克隆抗體與發射波長為600nm的羧基水溶性量子點製得量子點標記的抗人IgG納米探針；將上述兩種量子點標記的納米探針溶液按體積比1:1混合，即製得多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針；
[0036]3) PBST緩衝液的配製:
[0037]其具體配製方法包括:
[0038]取8g NaCL, 0.2g KCl，0.24KH2P04，1.44g Na2HPO4, 5g BSA，0.3g NaN3, 0.5mlTween-20溶解於900ml蒸餾水中，用5M NaOH調整pH至7.4，再定容至100ml ；
[0039]4)質控品的製備:
[0040]4.1)陽性質控品:
[0041]4.1.1)抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性質控品:由0.5ml人肺炎衣原體感染者的已確定抗人肺炎衣原體IgM抗體為陽性的血清構成；
[0042]4.1.2)抗人肺炎衣原體IgG抗體陽性質控品:由0.5ml人肺炎衣原體感染者的已確定抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽性的血清構成；
[0043]4.2)陰性質控品:由0.5ml抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清構成。
[0044]作為優選，本發明在步驟1.2.2)中，依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩衝液配製的濃度是10mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩衝液配製的濃度是8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以15rpm/min於旋轉混合儀中活化Ihr,置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清，用Iml步驟1.2.1)中的MES緩衝液重懸，得到活化後的磁珠；
[0045]所述步驟1.2.3)中，向各離心管中加入用PBS緩衝液稀釋的濃度為150 μ g/ml的由步驟1.1.4)所製備的重組M98-His融合蛋白溶液各Iml,室溫下以15rpm/min於旋轉混合儀中反應3h，置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清後，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩衝液；
[0046]所述步驟2.2)中，在步驟2.1)所得到的活化的量子點中，加入6nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應2h。
[0047]作為優選，本發明所採用的量子點是羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點。
[0048]作為優選，本發明所採用的磁珠是以超順磁性Fe3O4為內核、殼材料為聚苯乙烯、表面官能團為羧基、粒徑為1150nm的羧基磁珠。
[0049]一種基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒的使用方法，其特徵在於:所述使用方法包括以下步驟:
[0050]I)取待檢血清樣本5 μ I用995 μ I PBSA緩衝液稀釋後將稀釋液轉入1.5ml普通離心管中；所述PBSA緩衝液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,
1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA ;所述 PBSA 緩衝液的 pH = 7.4 ；
[0051]2)向步驟I)中的離心管中依次加入基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠10-100 μ I及基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ I,室溫下以10rpm/min於旋轉混合儀上反應5-25min後取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清；
[0052]3)添加基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的PBST緩衝液Iml洗滌兩遍，採用納米磁分離器磁分離後吸出洗滌液，最後用
0.2ml PBS緩衝液重懸磁珠，製得納米磁珠-人肺炎衣原體抗體-量子點「三明治」複合物；所述 PBS 緩衝液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/LNa2HPO4 ;所述PBS緩衝液的pH = 7.4 ；
[0053]4)將步驟3)得到的納米磁珠-人肺炎衣原體抗體-量子點複合物載於酶標板中，使用螢光酶標儀在激發波長(Ex)同為365nm，發射波長(Em)分別為520nm及600nm的參數下分別對其螢光值進行分別讀數；
[0054]5)按上述同樣的方法檢測至少30份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本,分別讀取發射波長(Em)分別為520nm及600nm下的螢光值；所述經臨床各種方法均確定為抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發射波長(Em)為520nm的螢光值的平均值與3倍標準差之和記為⑶T-OFFl值；所述經臨床各種方法均確定為抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發射波長(Em)為600nm的螢光值的平均值與3倍標準差之和記為CUT-0FF2值；同時檢測試劑盒中提供的四份陰性質控品樣品及四份陽性質控品樣品，分別讀取發射波長(Em)分別為520nm及600nm下的螢光值；四份陰性質控品樣品在發射波長(Em)為520nm的螢光值的平均值記為NCXl ;四份陰性質控品樣品在發射波長(Em)為600nm的螢光值的平均值記為NCX2值；兩份抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性質控品樣品在發射波長(Em)為520nm的螢光平均值為PCXl ;兩份抗人肺炎衣原體IgG抗體陽性質控品樣品在發射波長(Em)為及600nm下的突光值記為PCX2 ;若步驟4)中待檢血清樣本樣本在發射波長(Em)為520nm的檢測螢光值大於⑶T-OFFl值且PCX1/NCX1彡2.1,則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎衣原體IgM抗體為陽性；若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為520nm的檢測螢光值小於CUT-OFFl值且PCX1/NCX1 ^ 2.1，則判斷為人待檢血清樣本中抗人肺炎衣原體IgM抗體為陰性；若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為600nm的檢測螢光值大於CUT-0FF2值且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽性；若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為600nm的檢測螢光值小於⑶T-0FF2值且PCX2/NCX2彡2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎衣原體IgG抗體為陰性；gPCXl/NCXl < 2.1或PCX2/NCX2 < 2.1，均表明試劑盒失效。
[0055]作為優選，本發明所提出的步驟2)中，向步驟I)中的離心管中依次加入基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠20 μ I及基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ I,室溫下以10rpm/min於旋轉混合儀上反應15min後取下,將離心管插入納米磁分離器磁分離3min,用移液器吸出上清。
[0056]本發明所需的羧基水溶性納米量子點、1150nm羧基磁珠，鼠抗人IgM單克隆抗體、鼠抗人IgG單克隆抗體等可到相關專業的研究單位、公司購買或定製；所需的儀器、設備、藥品均有市售。
[0057]本發明相比現有技術具有如下優點:
[0058]1、本發明利用了納米磁珠對樣品的可富集性、分離的速度快、效率高等優點，同時結合量子點光化學穩定性高、螢光強度高等特性，使得檢測體系具備多重信號協同放大的效果，從而具有超高的檢測靈敏度與準確度。
[0059]2、本發明所用的捕獲抗原是包含有人肺炎衣原體特異性98KD膜蛋白抗原胞外區富含抗原表位的重組抗原，病人血清中針對其產生的抗體水平高，因此捕獲效果好。
[0060]3、本發明所用的捕獲抗原為人肺炎衣原體所特有的表面抗原，其特異性高，與其他常見的呼吸道病原體(如鸚鵡熱衣原體、沙眼衣原體、甲、乙型人流感病毒、人流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、人肺炎支原體、人流感嗜血桿菌等)的抗體之間無抗原抗體交叉反應。
[0061]4、本發明所用抗原為基因工程重組抗原，蛋白質表達量高，蛋白復性方法簡單，故較為廉價易得。
[0062]5、本發明檢測方法簡單，檢測快速(30min之內)，易於判定，檢測成本低廉，克服了現有技術檢測陽性率低、成本高、操作複雜繁瑣、耗時長、臨床應用不便的不足。
[0063]6、本發明可實現抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體的同步檢測，解決了分項檢測所帶來的操作過程繁瑣，檢測不夠方便快捷，檢測成本較高等問題，而目前市面上還未曾見到抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體同步共檢測的產品或者相關科學報導的出現。

【具體實施方式】
[0064]本發明是根據免疫學中的抗體抗原反應原理，利用納米磁珠對樣品的可富集性、分離的速度快、效率高等優點，結合量子點光化學穩定性高、螢光強度高等特性，建立的一套具備多重信號協同放大、具有超高靈敏度及高度特異性的快速同步檢測抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體的新方法，具有廣闊的市場應用前景。
[0065]本發明通過以下實施例作進一步具體描述。
[0066]各種試劑的配製及所需材料的說明
[0067]1.PBSA緩衝液:稱取1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，8g氯化鈉，0.2g氯化鉀，5g牛血清白蛋白溶解於900ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調pH至7.4後用去離子水定容至1000ml。
[0068]2.PBS緩衝液:稱取1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，8g氯化鈉，0.2g氯化鉀溶解於900ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調pH至7.4後用去離子水定容至1000ml。
[0069]3.重組M98_His融合蛋白:為本發明自製，用PBS緩衝液稀釋，搖勻，使溶液中重組蛋白的重量百分比濃度為0.2mg/ml。
[0070]4.鼠抗人IgM單克隆抗體:為Abcam公司產品，貨號ab99741，用PBS緩衝液稀釋，搖勻，使溶液中單克隆抗體重量百分比濃度為lmg/ml。
[0071]5.鼠抗人IgG單克隆抗體:為Abcam公司產品，貨號ab99757，用PBS緩衝液稀釋，搖勻，使溶液中單克隆抗體重量百分比濃度為lmg/ml。
[0072]6.量子點:本發明中所用的兩種量子點均為羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點，其發射波長分別為520nm及600nm，自武漢珈源量子點技術開發有限公司購買，產品名稱為羧基水溶性量子點-520及羧基水溶性量子點-600。
[0073]7.磁珠:本發明中所用磁珠是以超順磁性Fe3O4為內核、殼材料為聚苯乙烯、表面官能團為羧基、粒徑為分別為50nm、180nm、350nm、1150nm、3 μ m的羧基磁珠,可從陝西北美基因股份有限公司、上海奧潤微納新材料科技有限公司購買。
[0074]實施例1重組M98_His融合蛋白的表達、純化與復性
[0075]1.相關基因的克隆
[0076]對人肺炎衣原體98KD膜蛋白(其NCBI蛋白質資料庫中的access1n number為CAA04672)進行生物信息學分析，獲取其胞外保守結構域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對應的DNA編碼序列，同時在序列5』引入酶切位點Ndel、3』端引入終止信號TAA和酶切位點XhoI後化學合成全基因序列(全序列合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交貨時人工合成的基因片段連於載體PUC57上)，記為M98。其基因全序列如序列表所示。具體的說，M98基因編碼的蛋白質序列為天然人肺炎衣原體98KD膜蛋白(access1nnumber:CAA04672)的130_305aa。將含有該段人工合成的DNA片段的載體pUC57用NdeI及XhoI進行雙酶切後按常規方法回收目的片段，備用。同時採用NdeI及XhoI對載體pET-28a(+)進行雙酶切，並按常規方法將經雙酶切後獲得的m98基因連入pET-28a(+)載體中，並轉化大腸桿菌T0P10，構建pET-M98表達載體。經酶切和序列測定證實表達載體構建無誤。該載體表達重組M98-His融合蛋白。
[0077]2.重組M98_His融合蛋白的表達與純化
[0078]將鑑定正確的陽性克隆菌培養後提取質粒，按常規技術轉入感受態E.coliBL21 (DE3)中，轉化完成後將菌液塗布於含50 μ g/mL卡那黴素的LB平板上，按常規方法篩選表達菌株。挑取PET-M98轉化的具有外源蛋白表達能力的單個菌落並接種入10mL LB培養基中，於37°C培養過夜。取出菌液後，按1:100接種於10mL含有50 μ g/mL卡那黴素的LB培養基中，於37°C培養至OD6tltl = 0.6時，加入lmol/L IPTG至終濃度為lmmol/L，於37°C搖菌培養,誘導融合蛋白表達。誘導4h後於8000r/min下離心1min收集菌體。將此菌體用 20mL磷酸鹽緩衝液(8g/L NaCL, 0.2g/L KC1,0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HP04pH =7.4)洗滌3次並用1mL上樣緩衝液(20mM Na3PO4,0.5M NaCl ；30mM咪唑，pH7.4)重懸後進行超聲破碎，操作條件為:50HZ，200W，超聲3S，間歇5S，工作100次。超聲完成後，12000g離心15min分別收集沉澱和上清後進行電泳檢測。發現重組M98-His融合蛋白以包涵體方式存在於菌體中。
[0079]重組M98_His融合蛋白的純化步驟如下:
[0080]將上述沉澱組分用洗滌緩衝液(20mM Na3PO470.5M NaCl ;3M尿素，30mM咪唑，pH7.4)洗漆兩次後，12000g離心15min收集沉澱。將沉澱用Binding buffer (20mMNa3PO470.5M NaCl ;8M 尿素，30mM 咪唑，ρΗ7.4)於室溫下溶解後，12000g 離心 15min，上清用0.45 μ m的濾膜進行過濾。溶解液中的重組蛋白用His Trap affinity columns (GEhealthcare公司產品)，按照說明書用同樣的方法進行純化。具體方法如下:
[0081]I)用5mL注射器吸滿蒸餾水，擰開柱的塞子，用提供的接頭將柱和注射器連接上，以lmL/min流速洗柱。
[0082]2)用 10mT, Binding buffer 平衡，lmL/min 流速。
[0083]3)將融合蛋白上樣，lmL/min流速。
[0084]4)用 10mT, Binding buffer,以 lmL/min 流速洗柱。
[0085]5)用 1mL Elut1n buffer (20mM Na3PO4,0.5M NaCl ;8M 尿素，500mM 咪唑，PH7.4)，以lmL/min流速洗脫，分管收集，每管1ml，12% SDS-PAGE檢測，合併洗脫組分中含有目的蛋白的樣品。經bradford試劑盒進行蛋白質濃度測定後,調整濃度為0.5mg/mL。
[0086]3.重組M98_His融合蛋白的復性
[0087]將上述經His Trap affinity columns純化的重組M98_His融合蛋白，先用含4mol/L尿素的PBS緩衝液透析過夜，然後再各分別用含2、1、0.6、0.2mol/L尿素的PBS緩衝液梯度透析各4h，最後用PBS緩衝液透析4h。將透析液各用12000rpm離心15min，上清即為復性的重組M98-His融合蛋白。經bradford試劑盒進行蛋白質濃度測定後，用PBS緩衝液調整其濃度均為0.2mg/mL，供納米磁珠的包被用。
[0088]實施例2抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠的製備
[0089]1.重組M98_His融合蛋白偶聯磁珠反應條件的優化:
[0090]以偶聯了重組M98_His融合蛋白的磁珠作為固相載體，量子點標記的鼠抗人IgM單克隆抗體作為檢測抗體，檢測抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性血清，觀察磁珠與重組蛋白的偶聯情況。分別對磁珠的粒徑，以及EDC/NHS活化劑濃度、偶聯抗體濃度、偶聯時間、封閉劑種類等偶聯條件進行了一系列的優化選擇。
[0091]1.1磁珠粒徑的選擇
[0092]選擇粒徑為50nm、180nm、350nm、1150nm、3 μ m的羧基納米磁珠，均加入含4mg/mlEDC及4mg/ml NHS的PBS緩衝液進行活化反應後，分別與重組M98_His融合蛋白偶聯反應。分別將製備好的羧基納米磁珠檢測抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性血清，螢光顯微鏡下觀察結果，選擇螢光強度大，背景螢光幹擾少，以及在磁場作用下分離速度較快者為最適磁珠粒徑。結果表明粒徑1150nm的磁珠最符合本發明的要求,確定最適羧基磁珠粒徑為1150nm。
[0093]1.2EDC/NHS活化劑濃度的選擇
[0094]將反應體系中EDC和NHS濃度各自設為I?10mg/ml後進行濃度梯度組合，分別活化粒徑1150nm的羧基納米磁珠。將製備好的羧基納米磁珠檢測抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性血清，選擇螢光最強者為EDC和NHS溶液的最適活化濃度。結果表明當EDC濃度為5mg/ml、NHS濃度為4mg/ml時偶聯效果最好。
[0095]1.3偶聯抗原濃度的選擇
[0096]將10 μ g、50 μ g、100 μ g、120 μ g、150 μ g、200 μ g、250 μ g、300 μ g 的重組 M98_His融合蛋白分別與Img按上述最優方法活化的粒徑為1150nm的磁珠進行偶聯。將製備好的羧基納米磁珠分別檢測抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性血清，結果發現，當重組蛋白的投放量小於150 μ g/mg時，螢光強度隨著抗體的濃度增加而增加，而當重組蛋白的投放量大於150 μ g/mg時，螢光強度基本不變甚至略有減小，因此本實施例選擇重組M98-His重組蛋白的偶聯量為150 μ g/mg。
[0097]1.4偶聯時間的選擇
[0098]確定磁珠的粒徑、EDC/NHS活化劑濃度及抗體偶聯量後，將重組M98_His融合蛋白與磁珠的偶聯反應時間分別設為0.5h、lh、2h、3h、4h、5h。將製備好的羧基納米磁珠分別檢測抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性血清，結果發現，當偶聯時間>3h時，螢光強度趨於穩定，此後再延長偶聯時間，螢光不再增強。因此，確定重組M98-His融合蛋白與磁珠的最適偶聯反應時間為3h。偶聯時間遠少於傳統ELISA法的24h。
[0099]1.5封閉劑的選擇
[0100]按照上述確定的最優條件選擇磁珠的粒徑、EDC/NHS活化劑濃度、抗體偶聯量及偶聯時間後進行偶聯反應。偶聯結束後，選擇BSA，乙醇胺，Tris和D-氨基葡萄糖鹽酸鹽作為納米磁珠封閉劑，製得成品羧基納米磁珠。將製備好的納米磁珠分別檢測抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性血清，結果發現，採用乙醇胺作為封閉劑的納米磁珠的檢測螢光值最高。推測由於乙醇胺的分子較小，可以較好的消耗由於空間位阻未與抗體結合的表面羧基，使封閉更為完全，並且有效減少空間位阻效應對已連接抗體的結構影響。
[0101]同時，以偶聯了重組M98-His融合蛋白的羧基納米磁珠作為固相載體，對應的量子點標記的鼠抗人IgG單克隆抗體作為檢測抗體，建立抗人肺炎衣原體IgG抗體的檢測體系，對相應的檢測體系中的重組蛋白偶聯磁珠的反應條件進行優化。結果發現，該檢測體系中的最佳偶聯條件均與上述步驟1.1-1.5所給出的結果完全一致。
[0102]2.偶聯過程:
[0103]取5mg磁珠(以超順磁性Fe3O4為內核、粒徑為1150nm的羧基磁珠)於1.5ml普通離心管中，用Iml MES緩衝液(2g/L MES, pH6.0)洗滌三次，置於納米磁分離器中進行磁分離(0.4T)後移除上清，依次加入用上述MES緩衝液配製的濃度為10mg/ml的EDC溶液及用上述MES緩衝液配製的濃度為8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以15rpm/min於旋轉混合儀中活化lhr，磁分離後移除上清，用Iml上述的MES緩衝液重懸；取5個離心管，每個離心管中加入200 μ L上述活化的磁珠，磁分離後吸出上清，向各管中加入用PBS緩衝液(8g/L NaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, pH7.4)稀釋的濃度為 150 μ g/ml的實施例1所製備的重組M98-His融合蛋白溶液各Iml,室溫下以15rpm/min於旋轉混合儀中反應3h，磁分離移除上清後，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩衝液，室溫下以15rpm/min於旋轉混合儀中反應2h以封閉磁珠上未與抗體反應的羧基。磁分離後移除各管上清，各用 Iml 洗滌緩衝液(8g/L NaCL, 0.2g/L KC1,0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,
0.5ml/L Tween-20,pH7.4)洗滌三遍，最後各用 Iml 保存緩衝液(8g/L NaCL, 0.2g/L KCl,
0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.3g/L NaN3, 5g/L BSA, pH7.4)重懸磁珠，置於 4°C保存備用，至此製得抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠。
[0104]實施例3多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針的製備
[0105]1.納米羧基量子點標記鼠抗人IgM單克隆抗體反應條件的優化:
[0106]1.1、羧基量子點標記抗體探針最佳標記pH的確定
[0107]將標記反應中磷酸鹽緩衝液pH分別設為5，6，7，8，9，對標記產物利用全光譜儀進行螢光強度測定，觀察不同PH值對偶聯反應的影響，確定了量子點標記單抗反應的最佳pH為7.0-8.0。本實驗選擇pH7.4。
[0108]1.2、羧基量子點標記抗體探針最佳標記量的確定
[0109]將量子點摩爾濃度與單抗濃度之比分別設置為1:1，1:2，1:3及1:4，進行標記反應後，對標記產物利用全光譜儀進行螢光強度測定，觀察二者不同濃度比對偶聯反應的影響，確定量子點標記鼠抗人IgM單克隆抗體反應的最佳摩爾濃度比為量子點與抗體摩爾比為1:3。本實驗選擇該最優濃度比來確定標記量。
[0110]1.3、羧基量子點標記抗體探針最佳封閉劑種類的確定
[0111]以乙醇胺、Tris, PEG2000-NH2或者BSA作為封閉劑，按步驟1.1及1.2確定的條件進行標記反應後，對標記產物利用全光譜儀進行螢光強度測定，觀察不同的封閉劑對於標記反應的影響，結果發現，PEG2000-NH2為最佳封閉劑，其可顯著提高標記複合物的膠體穩定性及免疫活性。
[0112]納米羧基量子點標記鼠抗人IgG單克隆抗體反應的條件優化結果與步驟1.1-1.3描述的納米羧基量子點標記鼠抗人IgM單克隆抗體反應相關條件的優化結果均完全一致。
[0113]2.標記過程:
[0114]向微量離心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子點(發射波長520nm)、300nmolN-羥基琥珀醯亞胺(sulfo-NHS)和300nmol碳二亞胺(EDC)，以磷酸鹽緩衝液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，pH 7.4)定容為2ml，不停地混合溶液，37°C反應30min後,透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS與EDC。在活化的量子點中，加入6nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應2h，加入單端氨基化聚乙二醇(PEG2000_NH2)至終濃度為I %，封閉未反應的活化羧基位點，繼續避光反應lh。用0.2 μ m PES濾器過濾除去抗體聚集物，然後將濾液轉移到50000麗超濾離心管中，以SOOOg離心力在4°C下離心15min，除去未發生偶聯反應的抗體和反應中的副產物。收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶於2ml磷酸鹽洗滌液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，0.3g/L疊氮鈉，pH 7.4)中，再將此溶液轉移到50000MW超濾離心管中，以SOOOg離心力在4°C下離心15min，收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶於Iml磷酸鹽保存液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L BSA,
0.3g/L疊氮鈉，pH 7.4)中，至此製得量子點標記的抗人IgM納米探針，置於4°C保存備用。
[0115]按上述相同方法利用鼠抗人IgG單克隆抗體與發射波長為600nm的羧基水溶性量子點製得量子點標記的抗人IgG納米探針。將上述兩種量子點標記的納米探針溶液按體積比1:1混合，即製得多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針；
[0116]實施例4羧基納米磁珠對人肺炎衣原體抗原進行免疫捕獲條件的優化
[0117]以偶聯了重組M98_His融合蛋白的磁珠作為固相載體，多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針作為檢測抗體，建立人肺炎衣原體抗體的檢測體系。分別對檢測體系中羧基納米磁珠的用量，捕獲時間等條件進行了一系列的優化選擇。
[0118]實驗1.羧基納米磁珠加入量的選擇
[0119]將5μ 1、10μ 1、15μ 1、20μ 1、30μ 1、50μ 1、70μ I 的由實施例 2 所製備好的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠分別加入到0.5ml含抗人肺炎衣原體IgG抗體的人血清稀釋液中，進行免疫捕獲，再由實施例3所描述的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針進行檢測，記錄螢光值。結果發現，隨著羧基納米磁珠加入量的增加，螢光值逐漸增大，當羧基納米磁珠加入量達到20 μ I時，螢光值達到最大。再繼續增加羧基納米磁珠的量，螢光值反而降低。故本實驗選擇20 μ I作為納米磁珠的最佳加入量。
[0120]實驗2.免疫捕獲時間的選擇
[0121]確定磁珠的加入量後，取四份實施例2所製備好的納米磁珠，在室溫下以1r/min,對抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性血清進行5min、lOmin、15min、20min、30min及40min的免疫捕獲，再由實施例3所描述的量子點標記探針進行檢測，記錄螢光值。結果發現，螢光值在免疫捕獲15min時表現出最大值，隨著時間的延長，數值基本不變。故本實驗選擇15min作為免疫捕獲的最佳時間。
[0122]同時，以偶聯了重組M98_His融合蛋白的羧基納米磁珠作為固相載體，對應的量子點標記的鼠抗人IgG單克隆抗體作為檢測抗體，建立抗人肺炎衣原體IgG抗體的檢測體系，對相應的檢測體系中的捕獲條件進行優化。結果發現，上述檢測體系中的最佳捕獲條件均與上述實驗I及實驗2所給出的結果完全一致。
[0123]實施例5PBST緩衝液的配製
[0124]取8g NaCL, 0.2g KCl，0.24KH2P04，1.44g Na2HPO4, 5g BSA，0.3g NaN3, 0.5mlTween-20溶解於900ml蒸餾水中，用5M NaOH調整pH至7.4，再定容至1000ml。
[0125]實施例6質控品的製備
[0126]6.1)陽性質控品:
[0127]6.1.1)抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性質控品:由0.5ml人肺炎衣原體感染者的已確定抗人肺炎衣原體IgM抗體為陽性的血清構成；
[0128]6.1.2)抗人肺炎衣原體IgG抗體陽性質控品:由0.5ml人肺炎衣原體感染者的已確定抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽性的血清構成；
[0129]6.2)陰性質控品:由0.5ml抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清構成。
[0130]實施例7試劑盒的製備
[0131 ]由實施例2所描述的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠2ml、實施例3所描述的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針5ml、實施例5所描述的PBST緩衝液200ml、實施例6所描述的質控品一套共同組成基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒。
[0132]實施例8待檢血清稀釋度的確定
[0133]用臨床各種方法均確定為抗人肺炎衣原體IgM抗體分別為陰性及陽性的人血清樣本各20份，用PBSA緩衝液分別進行1:50、1:100、1:200、1:400、1:800，1:1600倍稀釋，
選擇陽性血清與陰性血清的檢測螢光數值之比>3的最高稀釋度作為待檢血清的最適工作濃度。結果發現，200倍稀釋的效果最佳。
[0134]同樣，用臨床各種方法均確定為抗人肺炎衣原體IgG抗體分別為陰性及陽性的人血清樣本各20份，用PBSA緩衝液分別進行1:50、1:100、1:200、1:400、1:800，1:1600倍稀釋，選擇陽性血清與陰性血清的檢測螢光數值之比>3的最高稀釋度作為待檢血清的最適工作濃度。結果亦發現，200倍稀釋的效果最佳。
[0135]實施例9試劑盒的使用方法
[0136]I)取待檢血清樣本5 μ I用995 μ I PBSA緩衝液稀釋(200倍稀釋)後將稀釋液轉入1.5ml普通離心管中；
[0137]2)向步驟I)中的離心管中依次加入基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠20 μ I及基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ I,室溫下以15rpm/min於旋轉混合儀上反應15min後取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清；
[0138]3)添加基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的PBST緩衝液Iml洗滌兩遍，採用納米磁分離器磁分離後吸出洗滌液，最後用
0.2ml PBS緩衝液重懸磁珠，製得納米磁珠-人肺炎衣原體抗體-量子點「三明治」複合物；
[0139]4)將步驟3)得到的0.2ml納米磁珠_人肺炎衣原體抗體_量子點複合物載於酶標板中，使用突光酶標儀在激發波長(Ex)同為365nm,發射波長(Em)分別為520nm及600nm的參數下分別對其螢光值進行分別讀數；
[0140]5)⑶T-OFF值的確定:按與上述步驟I)-4)同樣的方法檢測100份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本，分別讀取發射波長(Em)分別為520nm及600nm下的突光值；所述100份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發射波長(Em)為520nm的螢光值的平均值(42.5)與3倍標準差(9.76)之和記為⑶T-OFFl值(71.78);所述100份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發射波長(Em)為600nm的螢光值的平均值(57.3)與3倍標準差(13.54)之和記為⑶T-0FF2值(97.92)；
[0141]6)按與上述步驟1)-4)相同的方法同時檢測試劑盒中提供的四份陰性質控品樣品及四份陽性質控品樣品，分別讀取發射波長(Em)分別為520nm及600nm下的螢光值；四份陰性質控品樣品在發射波長(Em)為520nm的螢光值的平均值記為NCXl ;四份陰性質控品樣品在發射波長(Em)為600nm的螢光值的平均值記為NCX2值；兩份抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性質控品樣品在發射波長(Em)為520nm的螢光平均值為PCXl ;兩份抗人肺炎衣原體IgG抗體陽性質控品樣品在發射波長(Em)為及600nm下的螢光值記為PCX2 ;若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為520nm的檢測螢光值大於⑶T-OFFl值(71.78)且PCX1/NCX1 ^ 2.1,則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎衣原體IgM抗體為陽性；若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為520nm的檢測螢光值小於⑶T-OFFl值(71.78)且PCX1/NCX1 ^ 2.1，則判斷為人待檢血清樣本中抗人肺炎衣原體IgM抗體為陰性；若步驟
4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為600nm的檢測螢光值大於CUT-0FF2值(97.92)且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽性；若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為600nm的檢測螢光值小於⑶T-0FF2值(97.92)且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎衣原體IgG抗體為陰性；gPCXl/NCXl< 2.1或PCX2/NCX2 < 2.1，均表明試劑盒失效。
[0142]實施例10試劑盒的特異性試驗
[0143]用呼吸道常見病原體如人呼吸道合胞病毒、人肺炎支原體、鸚鵡熱衣原體、沙眼衣原體、人腺病毒3型、人腺病毒7型、人甲型流感病毒、人乙型流感病毒、人流感嗜血桿菌、人肺炎鏈球菌感染者的相應病原體抗體呈陽性的血清來代替人肺炎衣原體抗體陽性血清用實施例7所述的試劑盒按實施例9所述的方法進行檢測，發現檢測結果均為陰性。
[0144]實施例11臨床測試例
[0145]應用本發明製備的基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒對臨床診斷明確的抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性血清樣本120份和陰性血清樣本70份進行了檢測，檢測結果如表I。
[0146]表I抗人肺炎衣原體IgM抗體臨床血清檢驗結果
[0147]
__檢測結果陽性病例陰性病例
+119O
本試劑盒
_I —I I I 70
[0148]應用本發明製備的基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒對臨床診斷明確的抗人肺炎衣原體IgG抗體陽性血清樣本70份和陰性血清樣本50份進行了檢測，檢測結果如表2。
[0149]表2抗人肺炎衣原體IgG抗體臨床血清檢驗結果
[0150]
__檢測結果陽性病例陰性病例
+69O
本試劑盒
_I —I I 50
[0151]需要指出的是，以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明精神和原則之內所做的任何修改、等同替換等均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢的方法，其特徵在於:所述方法包括以下步驟: 1)重組人肺炎衣原體98KD膜蛋白抗原的製備； 2)將步驟I)製備得到的重組人肺炎衣原體98KD膜蛋白抗原與納米磁珠通過共價偶聯，製得抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠； 3)將鼠抗人IgM單克隆抗體與發射波長為520nm的納米量子點通過共價偶聯，製備量子點標記的抗人IgM納米探針；將鼠抗人IgG單克隆抗體與發射波長為600nm的納米量子點通過共價偶聯，製備量子點標記的抗人IgG納米探針；將量子點標記的抗人IgM納米探針與量子點標記的抗人IgG納米探針等量混合即製得多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針； 4)取人血清樣本，用PBSA緩衝液適當稀釋後，分別向血清稀釋液中加入步驟2)製備得到的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠以及步驟3)製備得到的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針，充分混合，反應5-45min後進行磁分離，以PBST緩衝液洗滌2遍後，使用螢光酶標儀，在發射波長分別為520nm及600nm下分別讀取螢光值；所述PBSA緩衝液中各組分含量分別為 8g/L NaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA，所述PBSA緩衝液的pH = 7.4 ;所述PBST緩衝液中各組分含量分別為8g/L NaCL, 0.2g/L KCl,0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA，0.3g/L NaN3,0.5ml/L Tween-20，所述PBST 緩衝液的pH = 7.4 ； 5)根據步驟4)的方法檢測至少30份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本，分別讀取發射波長分別為520nm及600nm下的螢光值；所述抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本簡稱人肺炎衣原體抗體陰性對照樣品；所述人肺炎衣原體抗體陰性對照樣品在發射波長為520nm的螢光值的平均值與3倍標準差之和記為CUT-OFFl值；所述人肺炎衣原體抗體陰性對照樣品在發射波長為600nm的螢光值的平均值與3倍標準差之和記為⑶T-0FF2值； 若步驟4)中人血清樣本在發射波長為520nm的檢測螢光值大於CUT-OFFl值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎衣原體IgM抗體為陽性； 若步驟4)中人血清樣本在發射波長為520nm的檢測螢光值小於CUT-OFFl值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎衣原體IgM抗體為陰性； 若步驟4)中人血清樣本在發射波長為600nm的檢測螢光值大於CUT-0FF2值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽性； 若步驟4)中人血清樣本在發射波長為600nm的檢測螢光值小於CUT-0FF2值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎衣原體IgG抗體為陰性。
2.一種基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒，其特徵在於:所述基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒由具有富集抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體功能的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠、多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG抗體納米探針、質控品以及PBST緩衝液所組成；所述質控品包括陽性質控品以及陰性質控品；所述陽性質控品由兩份人肺炎衣原體感染者的抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性的血清及兩份抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽性的血清組成；所述陰性質控品是四份抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清。
3.一種用於製備如權利要求2所述的基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒的方法，其特徵在於:所述方法包括以下步驟: 1)抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠的製備: 1.1)重組M98-His融合蛋白的製備、純化: 1.1.1)對人肺炎衣原體98KD外膜蛋白進行生物信息學分析，獲取人肺炎衣原體98KD膜蛋白胞外結構域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對應的基因序列； 1.1.2)在步驟1.1.1)中所得到的基因序列的5』端及3』端分別引入酶切位點並化學合成全基因序列，同時標記記為M98 ； 1.1.3)將步驟1.1.2)中所得到的M98按分子生物學方法克隆入表達載體pET_28a (+)後轉入大腸桿菌中表達重組M98-His融合蛋白；所述重組M98-His融合蛋白以包涵體表達形式存在於基因工程菌體中； 1.1.4)用鎳柱純化步驟1.1.3)所得到的重組M98-His融合蛋白，SDS-PAGE檢測其純度後，再對重組M98-His融合蛋白進行復性，經bradford試劑盒進行蛋白質濃度測定後，用PBS緩衝液調整濃度為0.2mg/mL ;所述PBS緩衝液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/LKC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,所述 PBS 緩衝液的 pH = 7.4 ； 1.2)納米磁珠的包被: 1.2.1)取5mg磁珠，用Iml MES緩衝液洗滌三次，置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內核、粒徑為1150nm的羧基磁珠；所述MES緩衝液是質量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代)乙磺酸；所述MES緩衝液的pH = 6.0 ;所述納米磁分離器的磁性強度是0.4T ； 1.2.2)依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩衝液配製的濃度是8_12mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩衝液配製的濃度是6-10mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以10-40rpm/min於旋轉混合儀中活化lhr，置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清，用Iml步驟1.2.1)中的MES緩衝液重懸，得到活化後的磁珠； 1.2.3)取5個離心管，在每個離心管中加入200 μ L步驟1.2.2)所得到的活化後的磁珠，置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清，向各離心管中加入用PBS緩衝液稀釋的濃度為50-200 μ g/ml的由步驟1.1.4)所製備的重組M98_His融合蛋白溶液各1ml，室溫下以15rpm/min於旋轉混合儀中反應2_6h，置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清後，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩衝液,室溫下以15rpm/min於旋轉混合儀中反應2h以封閉磁珠上未與抗體反應的羧基；所述PBS緩衝液中各成分含量如下:8g/L NaCL,0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,所述 PBS 緩衝液的 pH = 7.4 ； 1.2.4)封閉反應完成後，將該5個離心管置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清，各用Iml洗滌緩衝液洗滌三遍；所述洗滌緩衝液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/LKC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.5ml/L Tween-20，所述洗滌緩衝液的 pH = 7.4 ； 1.2.5)向各個離心管中分別加入Iml保存緩衝液重懸磁珠，置於4°C保存備用；至此製得抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠；所述保存緩衝液中各成分含量如下:8g/L NaCL,0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.3g/L NaN3, 5g/L BSA，所述保存緩衝液的pH = 7.4 ； 2)多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針的製備: 其具體製備方法包括: 2.1)向微量離心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子點、300nmol N-羥基琥珀醯亞胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩衝液定容為5ml，混合溶液，37°C反應30min後,透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS及E:DC,得到活化後的量子點；所述羧基水溶性量子點的發射波長是520nm ;所述磷酸鹽緩衝液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉；所述磷酸鹽緩衝液的pH = 7.4 ; 2.2)在步驟2.1)所得到的活化的量子點中，加入2-12nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應2h，加入單端氨基化聚乙二醇PEG2000-NH2至終濃度為I %，封閉未反應的活化羧基位點，繼續避光反應Ih ； 2.3)用0.2μπι PES濾器過濾除去步驟2.2)中的抗體聚集物，然後將濾液轉移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發生偶聯反應的抗體和反應中的副產物； 2.4)收集步驟2.3)中超濾離心管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶於2ml磷酸鹽洗滌液中，再將此溶液轉移到一個新的50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，收集超濾離心管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶於Iml磷酸鹽保存液中，置於4°C保存備用，至此製得量子點標記的抗人IgM納米探針；所述磷酸鹽洗滌液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，0.3g/L疊氮鈉，所述磷酸鹽洗滌液的pH = 7.4 ;所述磷酸鹽保存液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L牛血清白蛋白，0.3g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽保存液的pH = 7.4 ; 2.5)按與步驟2.1)-2.4)相同的方法利用鼠抗人IgG單克隆抗體與發射波長為600nm的羧基水溶性量子點製得量子點標記的抗人IgG納米探針；將上述兩種量子點標記的納米探針溶液按體積比1:1混合，即製得多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針； 3)PBST緩衝液的配製: 其具體配製方法包括:
取 8g NaCL, 0.2g KC1，0.24KH2P04，1.44g Na2HPO4, 5g BSA，0.3g NaN3,0.5ml Tween-20溶解於900ml蒸餾水中，用5M NaOH調整pH至7.4，再定容至100ml ； 4)質控品的製備: 4.1)陽性質控品: 4.1.1)抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性質控品:由0.5ml人肺炎衣原體感染者的已確定抗人肺炎衣原體IgM抗體為陽性的血清構成； 4.1.2)抗人肺炎衣原體IgG抗體陽性質控品:由0.5ml人肺炎衣原體感染者的已確定抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽性的血清構成； 4.2)陰性質控品:由0.5ml抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清構成。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於:所述步驟1.2.2)中，依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩衝液配製的濃度是10mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩衝液配製的濃度是8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以15rpm/min於旋轉混合儀中活化Ihr,置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清，用Iml步驟1.2.1)中的MES緩衝液重懸，得到活化後的磁珠； 所述步驟1.2.3)中，向各離心管中加入用PBS緩衝液稀釋的濃度為150 μ g/ml的由步驟1.1.4)所製備的重組M98-His融合蛋白溶液各Iml,室溫下以15rpm/min於旋轉混合儀中反應3h，置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清後，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩衝液； 所述步驟2.2)中，在步驟2.1)所得到的活化的量子點中，加入6nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應2h。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於:所述量子點是羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於:所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內核、殼材料為聚苯乙烯、表面官能團為羧基、粒徑為1150nm的羧基磁珠。
7.一種基於如權利要求2所述的基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒的使用方法，其特徵在於:所述使用方法包括以下步驟: 1)取待檢血清樣本5μ I用995 μ I PBSA緩衝液稀釋後將稀釋液轉入1.5ml普通離心管中；所述PBSA緩衝液中各成分含量如下:8g/L NaCL,0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA ;所述 PBSA 緩衝液的 pH = 7.4 ； 2)向步驟I)中的離心管中依次加入基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠10-100 μ I及基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ I,室溫下以10rpm/min於旋轉混合儀上反應5-25min後取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清； 3)添加基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的PBST緩衝液Iml洗滌兩遍，採用納米磁分離器磁分離後吸出洗滌液，最後用0.2mlPBS緩衝液重懸磁珠，製得納米磁珠-人肺炎衣原體抗體-量子點「三明治」複合物；所述PBS 緩衝液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4 ；所述PBS緩衝液的pH = 7.4 ; 4)將步驟3)得到的納米磁珠-人肺炎衣原體抗體-量子點複合物載於酶標板中，使用突光酶標儀在激發波長同為365nm,發射波長分別為520nm及600nm的參數下分別對其突光值進行分別讀數； 5)按上述同樣的方法檢測至少30份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本，分別讀取發射波長分別為520nm及600nm下的螢光值； 所述經臨床各種方法均確定為抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發射波長為520nm的螢光值的平均值與3倍標準差之和記為CUT-OFFl值；所述經臨床各種方法均確定為抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發射波長為600nm的螢光值的平均值與3倍標準差之和記為CUT-0FF2值；同時檢測試劑盒中提供的四份陰性質控品樣品及四份陽性質控品樣品，分別讀取發射波長分別為520nm及600nm下的螢光值；四份陰性質控品樣品在發射波長為520nm的螢光值的平均值記為NCXl ;四份陰性質控品樣品在發射波長為600nm的螢光值的平均值記為NCX2值；兩份抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性質控品樣品在發射波長為520nm的螢光平均值為PCXl ;兩份抗人肺炎衣原體IgG抗體陽性質控品樣品在發射波長為及600nm下的螢光值記為PCX2 ； 若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長為520nm的檢測螢光值大於CUT-OFFl值且PCX I/NCXI ^ 2.1,則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎衣原體IgM抗體為陽性； 若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長為520nm的檢測螢光值小於CUT-OFFl值且PCX1/NCX1 ^ 2.1，則判斷為人待檢血清樣本中抗人肺炎衣原體IgM抗體為陰性； 若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長為600nm的檢測螢光值大於CUT-0FF2值且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽性； 若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長為600nm的檢測螢光值小於CUT-0FF2值且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎衣原體IgG抗體為陰性； 若PCX1/NCX1 < 2.1或PCX2/NCX2 < 2.1，均表明試劑盒失效。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於:所述步驟2)中，向步驟I)中的離心管中依次加入基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠20 μ I及基於磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ 1，室溫下以10rpm/min於旋轉混合儀上反應15min後取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清。
【文檔編號】G01N33/577GK104198710SQ201410405739
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月18日 優先權日:2014年8月18日
【發明者】楊波, 胡徵 申請人:湖北工業大學