與人ζ鏈胞外域特異性相互作用的免疫製劑的製作方法

2023-09-22 03:25:45 2

專利名稱：與人ζ鏈胞外域特異性相互作用的免疫製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種核酸分子，它含有編碼一種抗體的可變區的至少一個互補決定區(CDR)的核酸序列，該抗體特異性地與完整細胞表面的人ζ(zeta)鏈的胞外域相互作用，該抗體可以通過先用Jurkat細胞，接著用載體分子與含有大鼠ζ鏈N末端11個胺基酸的肽構成的偶聯物免疫大鼠來製取。較好的是，本發明核酸分子所編碼的肽或多肽是一種單特異性或雙特異性抗體。本發明還涉及含有本發明核酸分子或抗體的藥物組合物，還涉及含上述化合物的試劑盒。最後，本發明還涉及用本發明抗體測定NK細胞、T細胞或它們前體細胞上ζ鏈或η(eta)鍊表達的方法。
ζ鏈屬於一族結構功能相關的信號轉導分子，該家族還包括η鏈(ζ鏈的另一種剪接形式)和高親合性IgE-Fc-受體FcεRI的γ鏈。這一族跨膜蛋白的共同特徵是它們的長胞內域，該結構域包含一個或數個ITAM基序(免疫受體的酪氨酸活化基序；ζ3，η2，γ1)和9(ζ，η，序列相同)或4(FcεRI-γ)個胺基酸的極短的胞外域。這些蛋白的胞外域序列在小鼠、大鼠和人之間100％保守，而且可能還與其他物種之間保守。
ζ鏈僅在T淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞以及(一定程度上)在它們的前體細胞上表達為同源二聚體或與η鏈的異二聚體。在成熟T淋巴細胞表面上，ζ鏈在結構和功能上與T細胞受體(TCR)和CD3-複合物密切相關。通過TCR參與誘導的信號經CD3和ζ鏈轉導入T細胞的細胞質，其中，與構成CD3-複合物的ε、δ和γ鏈(不是FcεRI-γ)上的單個ITAM相比，ζ鏈上的三個ITAM提供了主要的信號放大作用。
在NK細胞表面，ζ鏈與IgG-Fc-受體(FcγRIIIA)表現出相似的關聯性。當抗體覆蓋的靶細胞通過FcγRIIIA被NK細胞識別時，產生的信號通過ζ鏈和/或γ鏈轉導給細胞質，於是激活NK細胞裂解被識別的靶細胞(ADCC，依賴於抗體的細胞毒性)。
因此，成熟T淋巴細胞上的TCR複合物是一種由多條鏈(TCR-α/β或TCR-γ/δ與CD3ε、CD3δ、CD3γ和ζ鏈或它的另一剪接產物η)偶聯構成的寡聚結構(Keegan，今日免疫學Immunology Today)13(1992)，63-68)。由缺乏胞質內信號轉導域的多形TCR-α/β或TCR-γ/δ異二聚體識別抗原。不變的CD3蛋白(γ/δ和δ/ε異二聚體)和ζ或η鏈(ζ同源二聚體或ζ-η異二聚體)是正確裝配、運輸和在細胞表面有效表達完整TCR複合物，以及轉導TDR信號所必需的(Clevers，免疫學評論年報(Annu.Rev.Immunol.)6(1988)629-662，Ashwell，免疫學評論年報8(1990)，139-167)。信號的傳遞必需一段保守的18胺基酸序列(Reth，自然(Nature)338(1989)383-384，Samelson，J.，生物化學(Biol.Chem.)267(1992)24913-24916)，稱為免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)，它在ζ鏈中有三份，η鏈中有兩份，各CD3亞基中(γ、δ和ε)中有一份。每個ITAM都含有一對酪氨酸-X-X-亮氨酸/異亮氨酸(Y-X-X-L/I)基序，相隔10或11個胺基酸(Cambier，今日免疫學16(1995)110)。TCR連接後，每個ITAM內的酪氨酸殘基迅速磷酸化，並起著信號蛋白停靠位點的作用，信號蛋白通過src-同源性-2(SH2)結構域與磷酸酪氨酸結合(Cooke，細胞(Cell)65(1990)281-291，Glaischenhaus，細胞64(1991)511-520，Samelson，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87(1990)，Straus，細胞70(1992)585-593，Songyan，細胞72(1993)767-778，Songyan，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)14(1994)2777-2785，Isakov，實驗醫學雜誌(J.Exp.Med.)181(1995)375-380)。對抗原特異性T細胞雜交瘤的ζ鏈缺陷突變株(該突變株不能應答抗原，對抗CD-3抗體只有弱應答)進行的研究證實ζ鏈是TCR介導的信號傳遞所必需的(Sussman，細胞52(1988)85-95)。雖然在CD-3抗體刺激應答種部分活性的保留表明TCR複合物的其他鏈能夠補償ζ的缺失，但其他研究顯示，當突變系通過轉染ζ鏈重建時，重新獲得了識別抗原或應答抗CD3抗體的功能，這清楚地表明了ζ鏈在信號轉導中的重要作用(Weissman，歐洲分子生物學雜誌(EMBOJ.)8(1989)3651-3656)。由於其單一構形，ζ鏈可能是主要的TCR信號傳遞結構，而它的一式三份ITAM主要起促進TCR信號放大的作用。
一般信號轉導和特定的ζ鏈介導的信號轉導中，TCR複合物既參與成熟T淋巴細胞的活化又參與其程序性死亡(凋亡)。有些實驗中，ζ鏈的細胞質尾部附著於不相關的受體，實驗證明，表達此類嵌合受體的細胞系能對與IL-2釋放和上調其他活化參數的交聯抗體作出應答(Irving，細胞64(1991)891-901)。而且，已證明，表達嵌合ζ鏈衍生物的細胞毒T淋巴細胞(CTL)特異性地裂解帶有嵌合ζ受體所識別表面分子的靶細胞(Romeo，細胞64(1991)1037-1046，Romeo，細胞68(1992)889-897)。然而，以上結果被發現僅限於活化的T細胞，因為其餘表達嵌合ζ鏈分子的T淋巴細胞既不是活化的，當通過嵌合受體被激活時，對靶細胞也沒有任何細胞毒性(Brocker，實驗醫學雜誌181(1995)1653-1659)，所述的嵌合受體，根據生物化學分析，不與內源性TCR亞基結合，因此是物理上獨立的信號分子(Shinkai，免疫(Immunity)2(1995)401-411)。因此，以上信息表明，嵌合ζ鏈衍生物只能取代活化的完全TCR複合物，而不能取代靜息T細胞的TCR。如果當細胞被活化或增殖時發生強烈的TCR重新接合(reengagement)，將誘導TCR介導的成熟T淋巴細胞的凋亡(Lenardo，自然353(1991)858-861，Russell，美國科學院院報88(1991)2151-2157，Critchfield，細胞免疫(Cell. Immunol.)160(1995)71-78)。成熟T細胞的死亡在外周免疫系統穩定和耐受性中起著重要作用。最近的實驗顯示，ζ鏈是通過TCR結合有效誘導T細胞凋亡所必需的，而CD3的信號結構域對TCR介導的凋亡只有微弱的作用(CD3ε)或根本沒有作用(CD3γ和δ)(Combadiere，J.Exp.Med.183(1996)2109-2117)。此外，ζ鏈的三個ITAM對誘導T細胞凋亡具有不同貢獻，最近N末端的那個起著主要作用，其次，C末端的ITAM近似於CD3ε的微弱作用，中間的一個則完全不能誘導凋亡。
T細胞主要在胸腺內發育，其中的T細胞前體來自胎兒的肝臟或成人的骨髓。剛進入胸腺時，這些早期祖先T細胞是三陰性的(TNTCR-CD4-CD8-)(Shortman，免疫學評論年報14(1996)29-47)，但已表達ζ鏈和CD3鏈(Wiest，實驗醫學雜誌180(1994)1375-1382，Wilson，國際免疫學(Int.Immunol.)7(1995)1659-1664)。在胸腺的誘導性環境中，它們經過一系列發育階段，然後分化成CD4+CD8+雙陽性(DP)胸腺細胞(Godfrey，今日免疫學14(1993)547-553)。最不成熟的CD44+CD25--TN-胸腺細胞和由它衍生的CD44+CD25+-TN-胸腺細胞仍表現出TCR基因的種系構形。然而，以表面表型CD44-/10CD25+為特徵的下一成熟階段的TN胸腺細胞開始重排TCRβ基因座。在此階段以前，ζ鏈雖被表達，但可能不是胸腺細胞成熟所必需的(Crompton，歐洲免疫學雜誌(Eur.J.Immunol.)24(1994)1903-1907)。TN胸腺細胞的下一步成熟以CD44-/10CD25+轉變為CD44-CD25+為特徵，但在缺乏ζ鏈時受到抑制(Crompton，歐洲免疫學雜誌24(1994)1903-1907)，而且必需TCRβ鏈的重排和表達(Kishi，歐洲分子生物學雜誌10(1991)93-100，Mombaerts，自然360(1992)225-231，Shinkai，科學259(1993)822-825)。TCRβ與不變鏈前Tα(pTα)結合(Groettrup，細胞75(1993)283-294)，後者取代仍未重排的TCRα鏈形成前TCR，可能與ζ鏈和CD3鏈結合(Van Oers，實驗醫學雜誌182(1995)1585-1590)。作為前TCR介導的信號的結果，發育中的胸腺細胞進化到DP期。在此階段，胸腺細胞啟動它們TCRα基因的重排，停止表達pTα，開始低水平表達TCR複合物，後者的多鏈組成與成熟T淋巴細胞上的TCR複合物相似(Von Boehmer，Ann.N.Y.Acad.Sci.766(1995)52-61，Robdy，免疫學評論年報12(1994)265-705)。
CD44-CD25--TN胸腺細胞的發育和其後DP胸腺細胞的發育在缺乏ζ鏈時受到抑制，並可通過表達無功能性ITAM的信號缺陷突變ζ鏈來恢復(Shores，免疫學雜誌(J.Immunol.)159(1997)222-230，Shores，科學266(1994)1047-1050)，因此，ζ鏈促進前TCR表面表達的重要性可能超過其信號功能的重要性。
進一步根據TCR特異性選擇DP胸腺細胞。表達對自身MHC分子(不管MHC蛋白結合的是什麼肽)幾乎沒有特異性的TCR的胸腺細胞在胸腺內死亡，可能是因為它們未能通過它們的TCR收到存活信號(Robey，免疫學評論年報12(1994)265-705，Jameson，免疫學評論年報13(1995)93-126)。相反，表達具有適當配體特異性的TCR的胸腺細胞存活下來，並成熟為CD4+或CD8+的單陽性(SP)T細胞，表現出高水平的TCR表達。然而，表達自身反應性或潛在自身反應性TCR的胸腺細胞被去除了(Robey，免疫學評論年報12(1994)265-705，Jameson，免疫學評論年報13(1995)93-126)。因此，TCR在DP胸腺細胞上的結合導致了兩種截然不同的細胞命運，或者存活並繼續成熟(陽性選擇)，或者凋亡(陰性選擇)。
雖然，ζ鏈的ITAM不是胸腺內成熟SP T細胞的發育(Shores，科學266(1994)1047-1050)和MHC-限制性選擇(Simpson，國際免疫學7(1995)287-293)所必需的，但它們似乎通過在胸腺選擇過程中放大TCR結合所產生的信號應答對T細胞群落的形成起作用。
實際上，最近的一項研究揭示，雖然不特別需要任一單獨ITAM，但TCR複合物內ζ鏈ITAM的數量與陽性和陰性選擇都直接相關(Shores，實驗醫學雜誌185(1997)893-900)。以上結果可能是預料中的，如果陽性和陰性選擇主要由TCR信號閾值決定，如果對不同親合性的配體的信號應答(在決定發育胸腺細胞命運中是致關重要的)的程度或多或少地分別受到自然ζ鏈內一式三份的ITAM或ζ鏈突變體內ITAM減少的放大。
因此預計，天然ζ鏈存在下陽性選擇的胸腺細胞群落明顯不同於信號缺陷性ζ鏈衍生物存在下所選，後一種群落含有可能陰性選擇的T細胞(Shores，當代免疫學觀點(Current Opinion in Immunology)9(1997)380-389)。
NK細胞是大型粒性淋巴細胞，佔外周血淋巴細胞(PBL)的10-15％。它們能夠以一種非主組織相容性複合體(MHC)限制性方式殺死腫瘤細胞和某些被病毒感染的細胞(Trinchieri，高級免疫學(Adv.Immunol.)47(1989)187-376，Ritz，高級免疫學(1988)181-211)。這種溶胞效應器功能不需要事先敏化或由輔佐細胞呈遞抗原。這些特性使得NK細胞能在激發抗原特異性免疫應答之前引發自發性宿主防禦。已知NK細胞有兩種形式的溶胞活性，自然細胞毒性和ADCC(抗體依賴性細胞毒性)，後者還能殺死抗自然細胞毒性的靶細胞。
T細胞的細胞毒性是通過克隆型(clonotypic)TCR結合而產生的活化信號所引發的，與之不同，NK細胞的自然細胞毒性則主要受抑制信號調節(Yokoyama，實驗醫學雜誌186(1997)1803-1808)。抑制性的NK細胞受體通過與靶細胞上MHCI類分子的特異性結合而被結合，從而抑制在缺乏靶細胞MHCI類表達時才釋放的天然細胞毒性，於是激活自然殺傷作用。NK細胞受體具有胞質內免疫受體酪氨酸抑制基序(ITM，共有序列I/V-X-Y-X-X-L)，這些基序在受體結合誘導的酪氨酸磷酸化後介導抑制性信號(Muta，自然368(1994)70-73，Thomas，實驗醫學雜誌181(1995)1953-1956)。
ADCC是由低親合性IgG Fc-受體FcγRIIIA誘導的，並可在體外通過NK細胞與抗體覆蓋的靶細胞共培養來證明。FcγRIIIA的配體結合和交聯誘導NK細胞的活化，產生溶胞活性，表面活化分子和細胞因子分泌的上調(Chehimi，實驗醫學雜誌75(1992)789，Ravetch，免疫學評論年報9(1991)457)。FcγRIIIA表達為一種複合物，包含跨膜的配體結合性受體糖蛋白CD16和γ及ζ兩條跨膜鏈，這兩鏈負責受體的裝配和信號的轉導(Anderson，美國科學院院報87(1990)2274-2278，Ravetch，免疫學評論年報9(1991)457)。起初，γ鏈曾被鑑定為IgE的高親合性受體的一個亞基，並與ζ鏈和η鏈屬於同一信號轉導分子家族。當NK細胞上的FcγRIIIA被結合後，ζ鏈和γ鏈的ITAM內發生酪氨酸磷酸化，於是誘導進一步的信號轉導，這包括含有FcγRIIIA複合物特異性Src同源性(SH)2結構域的蛋白的徵集。最近的研究證明，轉染到NK細胞內的嵌合ζ鏈受體的結合似乎與FcγRIIIA介導的NK細胞活化相似，因此方式也與T細胞內的相似(Tran，免疫學雜誌155(1995)1000-1009)。
雖然以上所述表明，與完整細胞表面上人ζ鏈胞外域特異性相互作用/識別該胞外域的抗體為多種目的所需要，例如癌症治療中，T細胞或NK細胞上的人工信號轉導，目前還沒有成功實驗的報導。未能成功產生滿足上述需要的抗體可能主要是因為參與ζ鏈結合T細胞受體和T細胞上的CD3複合物或結合NK細胞上IgG-Fc-受體的該結構域相當短(9個胺基酸)。
因此，本發明的技術課題是提供一種可成功滿足以上需要的工具。該課題是通過權利要求所述實施方式解決的。
所以，本發明涉及一種核酸分子，它含有編碼一種抗體的可變區的至少一個互補決定區(CDR)的核酸序列，該抗體特異性地與完整細胞表面上的人ζ(zeta)鏈的胞外域相互作用，該抗體可以通過先用Jurkat細胞，接著用載體分子與含有大鼠ζ鏈N末端11個胺基酸的肽構成的偶聯物免疫大鼠來製取。
所述的完整細胞最好是T細胞或NK細胞，或他們的前體細胞，但也包括人工轉染的細胞。
根據本發明，用Jurkat細胞(ATCC TIB-152)免疫原初大鼠，然後用含有載體分子和上述肽的偶聯物加強免疫，由此獲得具有所述CDR的抗體。而且估計，其他免疫策略可能也行，例如給大鼠注射一次或多次偶聯物。雖然在產生抗體時用KLH作為載體，但其他載體也可以。其他載體的例子如BSA。
由於T細胞和NK細胞表面的ζ鏈分子或與TCR和CD3結合，或與FcγRIIIA結合，或呈自由漂浮的同源或異二聚體，所以，所述的相互作用可能是與以上ζ鏈形式之一，或與其全部。同樣，抗體可能與單ζ鏈相互作用，也可能特異性地與二聚體結構相互作用。因為人的η鏈具有與ζ鏈相同的胞外域，本發明的抗體也識別與ζ鏈相同構像和/或結合形式的η鏈。而且，抗體還特異性地與大鼠和小鼠的ζ/η鏈胞外域相互作用。
本發明抗體的一個獨特優良特性是，它識別T細胞和NK細胞兩種細胞以及他們前體細胞上的ζ/η鏈。根據對ζ鏈結構和結合形式的了解來看，開發出這樣的抗體可以認為是出人意料的。這極短的9胺基酸肽上的表位必定十分靠近細胞膜。這樣緊密的結構以及因而與細胞表面上多分子蛋白複合物的空間結合，使得象抗體這樣的大結構，在空間上似乎不可能接觸到這些表位。而且，因為ζ鏈在T淋巴細胞和NK細胞上與不同多分子蛋白複合物結合，估計不可能被抗體接觸到的T細胞上的ζ鏈胞外表位不可能與NK細胞上的完全相同。此外，因為人、大鼠和小鼠間的序列一致性，ζ鏈胞外域代表著上述三物種內的一種自身抗原，因此不可能通過免疫小鼠和大鼠來獲得它的特異性抗體。
本發明抗體的開發必然被認為是出人意料的理由，除以上所述之外，還因為最可能獲得此類抗體的方法沒有成功。即，用肽-KLH偶聯物免疫小鼠，從它的脾細胞RNA克隆一個組合抗體文庫，展示在絲狀噬菌體上，交替地在肽-BSA偶聯物、純化的CD8+-T-淋巴細胞和純化的NK細胞上進行體外選擇。雖然最後在CD8+-T-淋巴細胞上篩選時富集了展示與肽-BSA偶聯物反應的Fab抗體片段的噬菌體克隆，但其中大多數在下一步純化NK細胞上篩選時丟失了，說明該克隆集中沒有識別T淋巴細胞和NK細胞上共同的ζ鏈胞外表位的抗體。測試大量與肽-BSA偶聯物反應的克隆，證實都沒有與T淋巴細胞和NK細胞的交叉結合活性。
只有當本發明用一種過時的，而且相當煩瑣的方法來生產這樣的抗體時，才獲得了成功。這一方法包括合成含ζ鏈N末端前11個胺基酸的肽，通過半胱氨酸11上的SH基團將它與KLH偶聯。分別用Jurkat細胞初免疫大鼠，用上述偶聯物免疫小鼠，獲得的雜交瘤細胞系用11胺基酸肽與BSA的偶聯物篩選。獲得了150個小鼠雜交瘤細胞系和45個大鼠雜交瘤細胞系，它們識別肽-BSA偶聯物，但通過流式細胞計數，只鑑定到一種與T淋巴細胞和NK細胞都結合的大鼠IgM抗體。
本發明的抗體或其相應的免疫球蛋白鏈還可以用本領域已知的技術進一步修飾，例如胺基酸缺失、插入、取代、增加和/或重組和/或其他修飾，可以單獨進行，也可以聯合進行。將上述修飾導入免疫球蛋白胺基酸序列的DNA序列內的方法是本領域眾所周知的，可參見，例如Sambrook的分子克隆實驗室手冊，ColdSpring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所述抗體也可以是嵌合抗體。
本領域眾所周知的是，通常一個CDR，特別是重鏈上的CDR，就能識別一個表位，所以推測，上述方法所得抗體的一個CDR就足以造成至少微弱但明顯的結合。用以上策略產生的抗體證實，該推測完全正確。然而，較好的是，所述核酸分子含有編碼所述可變區至少兩個CDR的核酸序列。
本發明核酸分子的另一優選實施例中，所述核酸分子含有編碼所述可變區三個CDR的核酸序列。
本發明核酸分子另一優選實施例的特徵在於所述核酸序列編碼VH鏈。
本發明核酸分子的另一優選實施例中，所述核酸序列編碼VL鏈。
本發明的核酸分子可以是例如RNA分子或DNA分子。另一優選實施例中，本發明的核酸分子是DNA分子。特別好的是合成或半合成的DNA分子。
本發明核酸分子的另一優選實施例中，所述CDR具有以下核苷酸序列之一(a)SEQ ID No.1；(b)SEQ ID No.3；(c)SEQ ID No.5；(d)SEQ ID No.7；(e)SEQ ID No.9；(f)SEQ ID No.11。
本發明核酸分子的一個特別優選的實施例中，所述VH鏈具有核苷酸序列SEQID No.13，或編碼胺基酸序列SEQ ID No.14。
本發明核酸分子另一優選的實施例中，所述VL鏈具有核苷酸序列SEQ IDNo.15，或編碼胺基酸序列SEQ ID No.16。
本發明還涉及權利要求1-6中任一項所述的核酸分子，其中的CDR編碼胺基酸序列SEQ ID No.2、4、6、8、10或12之一。
本發明還涉及一種載體，它包含本發明的核酸分子。
本發明的載體可含有其他基因，例如標記基因，它們可在合適的條件下在合適的宿主細胞內對所述載體進行選擇。較好的是，本發明的聚核苷酸與允許在原核或真核細胞內表達的表達調控序列操作性連接。所述聚核苷酸的表達包括該聚核苷酸轉錄成可翻譯的mRNA。確保在真核細胞(以哺乳動物細胞為佳)內表達的調控元件已為本領域所熟知。通常包括確保轉錄起始的調控序列，可能還包括確保轉錄終止並穩定轉錄產物的聚A信號。其他調控元件可能還包括轉錄和翻譯的增強子，和/或天然結合的或異源的啟動子區域。在這方面，本領域熟練技術人員很容易理解，編碼至少輕鏈和/或重鏈可變區的聚核苷酸可能編碼這兩種免疫球蛋白鏈的可變區，也可能只編碼其中一種的可變區。類似的，所述聚核苷酸的表達可能受同一啟動子的調控，也可能受分別調控。允許在原核宿主細胞內表達的調控元件可能包括，例如，用於大腸桿菌的PL、lac、trp或tac啟動子，允許在真核宿主細胞內表達的調控元件的例子是用於酵母的AOX1或GAL1啟動子，或用於哺乳動物或其他動物細胞的CMV-、SV40-、RSV-啟動子(Rous肉瘤病毒，CMV增強子，SV40增強子或球蛋白內含子)。除了負責啟動轉錄的元件之外，所述調控元件還可能包括轉錄終止信號，例如聚核苷酸下遊的SV40-聚A位點或tk-聚A位點。而且，根據所用的表達系統，還可以給本發明聚核苷酸編碼序列加上前導序列，用於將多肽導入某細胞區室或分泌到培養基中，這些前導序列是本領域所熟知的。前導序列的裝配與翻譯、起始和終止序列成正確的相位關係，較好的是，前導序列能夠引導所翻譯的蛋白或其一部分進入周質間隙或胞外培養基。或選的是，異源序列可編碼一個融合蛋白，該蛋白包括C末端或N末端標誌肽以賦予所需特徵，例如簡化所表達重組產物的純化或穩定化。本文中，合適的表達載體是本領域所熟知的，例如Okayama-Berg cDNA表達載體pcDV1(Pharmacia)，pCDM8，pRc/CMV，pcDNA1，pcDNA3(In-vitrogen)或pSPORT1(GIBCO BRL)。
較好的是，表達調控序列是能夠轉化或轉染真核宿主細胞的載體內的真核啟動子系統，但也可使用針對原核宿主的調控序列。載體進入合適的宿主後，將宿主維持在適合高表達核苷酸序列的條件下，根據需要收集並純化免疫球蛋白輕鏈、重鏈、輕/重鏈二聚體或完整抗體，然後可收集並純化結合片段或其他免疫球蛋白形式；參見，Beychok，免疫球蛋白合成細胞，Academic Press，N.Y.(1979)。
本發明的載體可以是例如質粒、粘粒、病毒或噬菌體，它們最好是表達載體。可用來自逆病毒、牛痘病毒、腺相關病毒、皰疹病毒或牛乳頭瘤病毒的病毒表達載體將本發明的聚核苷酸或載體送入靶細胞群。可用本領域熟練技術人員熟知的方法構建重組病毒載體；參見，例如，Sambrook的分子克隆實驗室手冊，Cold SpringHarbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，現代分子生物學方法，Green PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)。或者，可將本發明的聚核苷酸和載體重構成脂質體送入靶細胞。可根據細胞宿主的類型，用熟知的方法，將含本發明聚核苷酸(例如免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈可變區的編碼序列以及表達調空序列)的載體導入宿主細胞。例如，常用氯化鈣轉染原核細胞，對其他細胞宿主則採用磷酸鈣處理或電穿孔；參見，Sambrook，同上。
本發明還涉及用本發明載體轉化或轉染的宿主。
所述宿主可以是原核或真核細胞。本發明的聚核苷酸或載體在宿主細胞內可能整合到宿主細胞的基因組內，也可能仍在染色體外。
宿主細胞可以是原核或真核細胞，例如細菌、昆蟲、真菌、植物、動物或人的細胞。較好的真菌細胞例如酵母屬細胞，具體的如釀酒酵母。「原核」包括所有可用DNA或RNA分子轉化或轉染，從而表達本發明抗體或相應免疫球蛋白鏈的細菌。原核宿主可包括革蘭氏陰性和陽性菌，例如大腸桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，粘質沙雷氏菌和枯草桿菌。「真核」包括酵母，高級植物，昆蟲，和較好的哺乳動物細胞。根據重組生產過程所用的宿主，本發明聚核苷酸所編碼的肽或多肽/抗體或免疫球蛋白鏈可能是糖基化的，也可能是非糖基化的。本發明的抗體或相應的免疫球蛋白鏈還可能包括起始的甲硫氨酸殘基。可用各種本領域熟知的技術，以本發明的聚核苷酸轉化或轉染宿主。而且，在哺乳動物細胞和細菌內製備並表達融合的操作性連鎖基因的方法，也是本領域所熟知的(Sambrook的分子克隆實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.)。可用其中所述的基因構建物和方法，在真核或原核宿主內表達本發明的肽或多肽/抗體或相應的免疫球蛋白鏈。通常，根據宿主選用含有促進所需聚核苷酸有效轉錄的啟動子序列的表達載體。該表達載體通常含有一個複製起始點，一個啟動子和一個終止子，以及供轉化細胞表型選擇的特殊基因。而且，可用含有本發明細胞的轉基因動物，最好是哺乳動物，進行本發明肽或多肽的大規模生產。
可將轉化後宿主培養在發酵罐中，並根據本領域的已知技術培養，以獲得最佳的細胞生長。表達後，可按照本領域的標準方法純化本發明的全肽或多肽/抗體、它們的二聚體，單獨的輕鏈和重鏈或其他免疫球蛋白形式，所述方法例如硫酸銨沉澱，親合柱層析，柱層析，凝膠電泳等；參見，Scopes，「蛋白質純化」Springer-Verlag，N.Y.(1982)。然後可從培養基、細胞裂解物或細胞膜組分中分離本發明的抗體或其相應免疫球蛋白鏈。可用各種常規方法分離和純化(例如)微生物表達的本發明抗體或免疫球蛋白鏈，所述方法例如製備性層析分離和免疫學分離法，例如用到相關(例如抗本發明抗體恆區的)單克隆或多克隆抗體的免疫學分離法。對本領域熟練技術人員來說顯而易見的是，本發明抗體還可以與其他分子偶聯，用於例如藥物定向和造影。這樣的偶聯，可以在肽或多肽/抗體或抗原表達後用化學方法將它們偶聯於結合位點，或通過基因工程在DNA水平上與本發明的肽或多肽/抗體偶聯。然後在合適的宿主系統內表達該DNA，收集表達的蛋白，並根據需要進行復性。
本發明還涉及產生本發明核酸分子所編碼肽或多肽的方法，包括，在合適的條件下培養本發明的宿主，從培養物中分離所述的肽或多肽。
前文已對所述宿主細胞的培養進行了論述，還可按照公知的方法進行。分離肽和多肽的也一樣。
此外，本發明還涉及本發明核酸分子所編碼，或用本發明方法產生的肽或多肽。
本發明還涉及抗體或其片段或衍生物，其中包含至少一種本發明的肽或多肽。
較好的是，本發明的抗體包含完整的上述VH和VL兩鏈，具有合適的恆區，例如μ、γ、α、κ或λ鏈。
本發明抗體或其片段或衍生物的具體應用包括由於抗體或抗體衍生物特異性地與ζ鏈結合，或生物活性或藥理活性的分子通過抗ζ鏈抗體或抗體片段/衍生物定向於T細胞表面，結果造成TCR的結構性或功能性抑制，從而影響成熟T淋巴細胞的功能。而且，抗體或抗體片段/衍生物特異性結合ζ鏈造成的TCR或前TCR的結構性或功能性抑制，影響到胸腺細胞的發育和選擇。
在整個T細胞發育過程中，即從最不成熟的胸腺細胞到成熟T淋巴細胞，ζ鏈一直在表達，所以，該分子可用於定向於多種T細胞性惡性腫瘤。
由於抗體或抗體衍生物特異性地與ζ鏈結合，或生物活性或藥理活性的分子通過抗ζ鏈抗體或抗體片段/衍生物定向於NK細胞表面，結果造成FcγRIIIA的結構性或功能性抑制，從而還可以影響NK細胞的功能。
所以，所述的抗體或片段或衍生物可以是但不限於合成或半合成或經典方法生成的單克隆抗體。所述片段包括Fab′或F(ab′)2片段。
本發明抗體可具有另一結構域，所述結構域通過共價或非共價鍵連接。所述連接可以基於用本領域已知的前文所述方法進行的基因融合，也可以通過化學交連，例如WO94/04686所述。在含本發明抗體的融合蛋白中，該另一結構域最好通過柔性接頭連接，以多肽接頭為佳，所述的多肽接頭含有多個親水性肽鍵胺基酸，其長度足以跨越所述另一結構域的C末端至本發明抗體N末端(或反過來)之間的距離。上述融合蛋白還可以具有一個蛋白酶的可剪切接頭或剪切位點。這些間隔部分可以是不溶性的或可溶性的(Diener等，科學，232148，1986)，並選擇能在靶位置使藥物從抗原上釋放的那些。可與本發明抗體偶聯用於免疫治療的治療性製劑是藥物，放射性同位素，凝集素和毒素。可與本發明抗體偶聯的藥物包括那些經典藥物，例如絲裂黴素C、柔毛黴素和長春鹼。
當用放射性偶聯的本發明抗體進行例如免疫治療時，根據白細胞分布以及穩定性和發射性等因素，有些同位素可能比另一些更合適。根據自身免疫應答，有些發射性物質可能比另一些好。一般說來，發射α和β粒子的放射性同位素適用於免疫治療。較好的是幅距短的高能α發射性物質，例如212Bi。可與本發明抗體、抗原或表位結合而用於治療的放射性同位素的例子是125I，131I，90Y，67Cu，212Bi，212At，211Pb，47Sc，109Pd和188Re。其他可與本發明抗體、抗原或表位結合的治療劑，以及體外和體內的治療方法，都是已知的，本領域熟練技術人員可方便的獲知。只要合適，本領域技術人員可使用編碼上述抗體、抗原或表位的本發明聚核苷酸或相應載體，而不是蛋白質物質本身。
一優選實施例中，本發明的抗體是單克隆抗體。
本發明另一優選實施例中，本發明的抗體是雙特異性抗體。
在本發明雙特異性抗體的一優選實施例中，第一特異性針對完整細胞表面上的人ζ鏈的胞外域，第二特異性針對T淋巴細胞、自然殺傷細胞或它們前體細胞的表面上可能不同的另一分子。
本發明的雙特異性抗體可與上述位於相同或不同細胞上的靶結合。所述不同細胞可以是，例如，相同種類的兩個不同T淋巴細胞，或一個T淋巴細胞和一個自然殺傷細胞，或它們的前體細胞。
在本發明雙特異性抗體的另一優選實施例中，第一特異性針對完整細胞表面上的人ζ鏈的胞外域，第二特異性針對不同細胞表面的一不同分子，該細胞最好不是T細胞、自然殺傷細胞或它們的前體細胞。較好的是，該分子是病毒編碼的抗原，腫瘤相關抗原，或抗原呈遞細胞(APC)(最好是樹狀細胞)或非APC上的表面抗原。
本發明雙特異性抗體的一種較好的應用是將T淋巴細胞再定向於靶細胞，這是通過用雙特異性抗體同時定向於ζ鏈和一種靶細胞表面抗原，而不是通過用嵌合ζ鏈受體轉染T淋巴細胞(Romeo，細胞64(1991)1037-1046)。因為雙特異性抗體結合天然ζ鏈，ζ鏈則與其他TCR亞基結合，所以可利用整個TCR複合物的信號機制。相反，嵌合ζ鏈受體不結合內源性TCR亞基，所以可能只改變ζ鏈的信號作用，就活化和凋亡來說，這似乎尚不足以活化靜息T細胞，卻可能引起T淋巴細胞功能狀態的非平衡改變。
T細胞再定向的一個較好的應用包括，將細胞毒T淋巴細胞的細胞毒性定向於靶細胞，從而將其裂解。另一個較好的應用是，通過原初T淋巴細胞的ζ鏈與已修飾抗原呈遞細胞(APC)或非APC上的表面抗原交連，提供充分的協同刺激信號，從而引發幼稚T淋巴細胞。另一方面，通過ζ鏈介導重定向於不能提供充足信號的細胞，可使原初T細胞無能應答或缺失。
T細胞再定向的另一個較好的應用是在成熟的活化T淋巴細胞內誘導凋亡，這是通過ζ鏈介導強TCR重新結合，類似於介導外周T細胞耐受性並提供外周免疫系統穩定性的機制。
可用雙特異性抗體，通過胸腺細胞上的ζ鏈與直接參與陽性或陰性選擇過程的胸腺抗原呈遞細胞上的表面分子交連，改變T細胞發育過程中對胸腺細胞的胸腺選擇。
本發明雙特異性抗體的另一種較好的應用是將NK細胞的細胞毒性再定向於靶細胞，這是通過用雙特異性抗體同時定向於ζ鏈和一種靶細胞表面抗原，而不是通過用嵌合ζ鏈受體轉染NK細胞使之定向於靶細胞(Tran，免疫學雜誌155(1995)1000-1009)。
另一優選實施例中，本發明的抗體衍生物是scFv鏈。
本發明單克隆抗體的一優選實施例中，所述抗體是IgM。
本發明還涉及一種雙特異性受體，它包含本發明的肽或多肽和與同一細胞或另一細胞上表面分子的天然受體、天然配體或其衍生物；較好的是，所述受體或配體是CD4，CTLA-4，B7-1，B7-2，LFA-3，ICAM-1、-2、-3，或MIP-1α、MIP-1β、RANTES或SDF-1等趨化因子。
據推測，本發明的雙特異性抗體也可用於本發明的雙特異性受體。
本發明還涉及一種藥物組合物，它含有本發明的核酸分子，載體，宿主，肽或多肽，抗體或其片段或衍生物和/或本發明的雙特異性受體。
本發明的藥物組合物還可含有一種藥學上認可的運載體。合適的藥學上認可的運載體的例子是本領域所熟知的，包括磷酸鹽緩衝液，水，乳液(例如油/水乳液)，各類潤溼劑，無菌溶液等。含上述運載體的組合物可用常規方法來配製。可以合適的劑量給予這些藥物組合物。給予合適的組合物可通過各種不同的途徑，例如，靜脈內、腹腔內、皮下、肌內、局部或透皮給藥。劑量決定於醫生和臨床因素。正如醫學界所熟知的，任一患者的劑量取決於許多因素，包括患者體形，身體表面積，年齡，具體使用的化合物，性別，用藥時間和途徑，總體健康狀況，和目前正在使用的其他藥物。典型劑量可以是，例如，0.001-1000μg(或是用於該水平表達或抑制該水平表達的核酸)；然而，具體考慮上述因素時，劑量也可能低於或超過該例舉的範圍。通常，所述藥物組合物的規律給藥方式是每日1μg-10mg。如果是連續輸液，也應在每分鐘每kg體重1μg-10mg的範圍內。可通過定期檢查來監測進展。劑量可以不同，但靜脈給予DNA的優選劑量約為106-1012份DNA分子拷貝。本發明的組合物可局部給予或全身給予。通常採用腸胃外給予，例如靜脈內；還可以(例如)通過生物彈射法(biolistic)遞送到一內部或外部靶部位或通過導管遞送到動脈內某部位，將DNA直接給藥到靶部位。用於腸胃外給藥的製劑包括無菌的水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油例如橄欖油，和可注射有機酯例如油酸乙酯。水性運載體包括水、醇/水溶液，乳液或懸浮液，包括生理鹽水和緩衝介質。腸胃外媒質包括氯化鈉溶液，Ringer葡萄糖，葡萄糖與氯化鈉，乳糖化的Ringer試劑，或固化油。靜脈媒質包括液態營養補充劑，電解質補充劑(例如基於Ringer葡萄糖的那些)，等等。還可以有防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物、抗氧化、螯合試劑，和惰性氣體等。而且，根據用途，本發明的藥物組合物還可以含有白介素或幹擾素等其他試劑。
本發明設想，用標準載體和/或基因遞送系統將本發明的各種聚核苷酸和載體單獨或聯合，並可以與藥學上認可的運載體或賦形劑一起進行給藥。給藥後，所述聚核苷酸或載體可能穩定地整合到受主的基因組內。另一方面，可用病毒載體，它們對特定的細胞或組織具有特異性，並能在所述細胞內存活。合適的藥物運載體和賦形劑是本領域所熟知的。
而且，還可以將本發明的藥物組合物，含本發明的聚核苷酸或載體，用在基因治療中。合適的基因遞送系統有，脂質體，受體介導的遞送系統，裸DNA和病毒載體，例如皰疹病毒、逆病毒、腺病毒和腺相關病毒等；參見前文所述的文獻。還可以用例如Williams(美國科學院院報88(1991)2726-2729)所述的生物彈射遞送系統，將核酸送到體內特定部位以進行基因治療。
本發明的藥物組合物，方法和用途可較好地適用於人類，雖然本文描述的方法和用途還包括對其他動物的治療。
本發明還涉及本發明抗體用於製備藥物組合物的用途，該抗體的第一特異性針對人ζ鏈的胞外域，第二特異性針對T淋巴細胞、自然殺傷細胞或它們前體細胞表面上的另一不同分子，所述組合物用於治療自身免疫病，免疫缺陷，T細胞性惡性腫瘤，感染性疾病，或用於抑制免疫應答，特別是為了避免器官移植後移植物排斥。
消滅靶細胞(例如腫瘤細胞或被病毒感染的細胞)之外，本發明描述了通過ζ鏈細胞外定向結合T細胞系(正常或惡性)細胞的方式，這些方式可在治療上用於增強或抑制免疫應答和/或影響與自身免疫病、免疫缺陷或T細胞性惡性腫瘤相關的T細胞性疾病。較好的是，採用基於ζ鏈(和η鏈)細胞外定向的免疫抑制來預防移植後移植物排斥。
本發明在T細胞發育和胸腺細胞選擇過程中，通過ζ鏈胞外定向改變信號的轉導，這樣的模式可在治療上用於增強有意的免疫應答，例如在感染性疾病、腫瘤和免疫缺陷中，或用於抑制不利的免疫應答，例如在自身免疫病或移植後移植物排斥中。
而且，本發明還涉及本發明抗體用於製備治療或預防惡性腫瘤、病毒感染和其他感染性疾病的藥物組合物的用途，該抗體的第一特異性針對人ζ鏈胞外域，第二特異性針對另一細胞表面上的另一不同分子。
本發明還涉及本發明肽或多體或抗體或其片段或衍生物或雙特異性受體用於製備藥物組合物的用途，即用於增強或抑制NK細胞依賴性免疫或治療NK細胞衍生的惡性腫瘤。
通過ζ鏈胞外定向促進NK細胞結合，消滅靶細胞(例如腫瘤細胞或被病毒感染的細胞)之外，該模式還可在治療上用於增強或抑制NK細胞依賴性免疫，或影響NK細胞來源的惡性腫瘤，因為ζ鏈可能在NK細胞來源的惡性腫瘤上也表達，該分子還可能被用於定向於惡性NK細胞。
此外，本發明還涉及一種測定NK細胞、T淋巴細胞或它們的前體細胞上ζ鏈或η鍊表達的方法，包括(a)使本發明的肽或多肽或抗體或其片段或衍生物與NK細胞、T淋巴細胞或它們的前體細胞接觸；(b)測定被結合的肽或多肽，抗體或其衍生物的量。
接觸的進行可以是在類似生理條件的緩衝液(例如磷酸鹽緩衝溶液，PBS)中，最好在冰上，所述肽或多肽或所述抗體或其片段或衍生物與所述NK細胞、T淋巴細胞或它們的前體細胞一起孵育20-40分鐘。用PBS洗滌兩次後，可(例如)用合適的螢光標記的第二抗體檢測被結合的肽或多肽，抗體或其片段或衍生物，並通過流式細胞計數分析來定量，如實施例4所述。
本發明還涉及含本發明核酸分子、載體、宿主、肽或多肽、抗體或其片段或衍生物和/或雙特異性受體的試劑盒。
最後，本發明還涉及一種轉基因動物，其種系含有本發明核酸分子或載體的至少一份拷貝。
可用常規發產生轉基因動物，參見，例如，Palmiter R.D.，Brinster R.L.小鼠的種系轉化(Germline transformation of mice)，遺傳學評論年報(Ann.Rev.Genet)20(1986)，465-499和Capecci M.通過同源重組改變基因組(Altering the genomeby homologous recombination)，科學244(1991)1288-1292。本發明轉基因動物的優選例是母牛，綿羊，家兔，小鼠或大鼠。
表1列舉了PCR擴增鼠Ig重鏈和輕鏈DNA片段所用的引物。
附圖顯示的是

圖1TCR的結構T細胞活化的早期活動。TCR由克隆型鏈(α+β)和恆鏈(ζ，CD3γ，CD3δ和CD3ε)構成，其亞基的組成可能是TCRα+β，CD3εδγε和ζζ。CD3和ζ鏈的胞質域內的ITAM以小的黑色橢圓表示。A)在靜息T細胞內，ITAM是非磷酸化或部分磷酸化的。蛋白酪氨酸激酶Lck與CD4或CD8的胞質域結合。B)與MHC-肽複合物相互作用時，TCR和CD4或CD8共聚集，CD3和ζ鏈內的ITAM被Src激酶Lck和/或Fyn磷酸化。ZAP-70或相關激酶Syk與其中兩個酪氨酸殘基已磷酸化的ITAM特異性結合。當ZAP-70加入到TCR-複合物中時，它被Lck激活，然後，其他分子這樣地加入TCR複合物，並使活化過程向下遊分子推進(未顯示)。圓環P表示磷酸化的酪氨酸殘基。
圖2通過噬菌體展示選擇與人ζ鏈結合所得Fab抗體片段的ELISA分析。大腸桿菌內表達的可溶性Fap片段的周質製劑與固定化的ζ肽-BSA偶聯物一起孵育。用與辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠IgG+IgM抗體的F(ab′)2片段檢測特異性結合的Fab片段。加入ABTS底物溶液進行ELISA顯色。在X軸上顯示每輪體外選擇中的8個克隆；用ELISA讀數儀在405nm處測定OD值，在Y軸上表示。作為陰性對照，測試格與PBS而不是與周質製劑一起孵育。
圖3CD8+T淋巴細胞和NK細胞表面上2-B-5抗體的ζ鏈特異性結合活性的流式細胞計數分析。來自兩位健康供者外周血的100.000個單核細胞與2-B-5雜交瘤的細胞培養上清液原液一起孵育。用與螢光素(FITC)偶聯的山羊抗大鼠Ig(IgG+IgM)抗體1∶100 PBS稀釋液檢測結合的ζ鏈特異性大鼠抗體。進行三色螢光分析，對CD8+細胞(三色(tricolor))施加一正柵極(gate)，對CD16+細胞(PE)施加一負柵極，這樣，檢測到的只有CD8+T淋巴細胞(表型CD8+，CD16+)的FITC螢光(實線)，而沒有來自CD8+NK細胞的任何幹擾信號。類似地進行三色螢光分析，對CD56+PE細胞施加一正柵極，對CD38+細胞(三色)施加一負柵極，這樣，只檢測到NK細胞(表型CD56+，CD3-)的FITC螢光(實線)，而沒有來自CD56+T淋巴細胞的任何幹擾信號。作為同型對照(虛線)，使用的是同型但特異性不相關的抗體(大鼠IgM)的培養物上清液性。用1％的聚甲醛PBS溶液固定標記細胞。在FACS掃描儀(Becton Dickinson)上通過流式細胞計數分析細胞。
圖4證明抗體2-B-5與CD8+T淋巴細胞裂解物內天然ζ鏈反應性的夾心ELISA結果。用一種ζ鏈特異性抗體覆蓋96格U形底測試板，該抗體識別人ζ鏈羧基末端的胺基酸144-163，12小時後，用PBS/3％BSA在室溫下封閉1小時。接著，加入CD8+細胞裂解物原液和數種濃度稀釋液，室溫下孵育1小時。陰性對照是與PBS而不是細胞裂解液一起孵育的格。下一步，加入1μg/ml純化抗體2-B-5，孵育1小時。先用生物素化的小鼠抗大鼠IgM抗體，然後用親合素-過氧化物酶偶聯物檢測結合的2-B-5抗體。最後，加入ABTS底物溶液進行ELISA顯色。用ELISA讀數儀在405nm處測定有色的沉澱。
圖5基於ELISA的分析大腸桿菌周質內表達的大鼠單克隆抗體2-B-5的重組Fab片段與ζ肽-KLH偶聯物的特異性結合。4℃，以ζ肽-KLH偶聯物覆蓋，12小時後，用PBS/0.05％ Tween洗滌一次。各格用PBS/3％牛血清白蛋白(BSA)封閉1小時，然後再次洗滌。然後，加入含Fab片段的周質製劑原液和數種濃度的稀釋液，孵育2小時。陰性對照是與PBS而不是周質製劑一起孵育的格。先用小鼠抗His尾抗體，接著用與過氧化物酶偶聯的多克隆山羊抗小鼠IgG抗體，檢測與ζ肽-KLH偶聯物結合的Fab片段。最後，加入ABTS底物溶液進行ELISA顯色。用ELISA讀數儀在405nm處測定底物顏色的改變。
圖6抗ζ鏈抗體2-B-5的VH區的DNA序列和蛋白質序列。數字表示核苷酸(nt)位置，胺基酸(aa)用單字母碼表示。框內顯示三個CDR。
圖7抗ζ鏈抗體2-B-5的VK區的DNA序列和蛋白質序列。數字表示核苷酸(nt)位置，胺基酸(aa)用單字母碼表示。框內顯示三個CDR。
圖8檢測細胞增殖的基於ELISA的BrdU-摻入試驗結果為了測定抗ζ鏈抗體2-B-5誘導的CD8+T淋巴細胞、NK細胞和PBMC的激活。用純化抗體2-B-5的數種濃度稀釋液覆蓋96格平底微滴板，4℃過夜。在微滴板的格中加入100.000個CD8+T淋巴細胞、NK細胞和未分離的PBMC，分別一式三格。作為2-B-5介導的激活作用特異性的對照，使用同濃度的同型(大鼠IgM)但特異性不相關的抗體。識別人CD3複合物的抗體OKT3(IgG2a同型)被用作T細胞和未分離PBMC激活的特異性陽性對照。特異性不相關的小鼠IgG2a抗體被用做OKT3的同型對照。還包括一空白對照(沒有細胞的格)和背景對照(沒有BrdU的格)。孵育3天後，加入BrdU標記溶液24小時。接著，裂解細胞並固定，然後加入抗BrdU抗體，該抗體與新合成的細胞DNA內摻入的BrdU結合。然後用底物反應檢測該與過氧化物酶偶聯的抗體。用ELISA讀數儀在450nm波長處定量測定反應產物。
圖9抗ζ鏈抗體結合所誘導的TCR/CD3複合物內化作用的流式細胞計數分析。200.000個單核細胞與1μg/ml抗ζ鏈抗體2-B-5一起在4℃或37℃孵育30或60分鐘；用大鼠抗人CD3抗體進行一平行實驗。用冷PBS洗滌兩次來終止加帽過程。為了標記細胞表面結合的抗體，細胞與螢光素(FITC)偶聯的山羊抗大鼠Ig(IgG+IgM)抗體1∶100PBS稀釋液一起孵育。陰性對照只用了第二抗體。
圖10抗ζ鏈/抗EpCAM雙特異性單鏈抗體的DNA和蛋白質序列。數字表示核苷酸(nt)的位置，核苷酸序列下是所得的胺基酸序列。DNA序列從第67位起至第1605位止編碼所述抗體。核苷酸10-66編碼一段前導肽，它在哺乳動物細胞內介導雙特異性抗體的分泌。前6個nt(第1-6位)和最後6個nt(第1632-1637位)分別含EcoRI和Sall的限制酶識別位點。
圖11因抗ζ鏈/抗EpCAM雙特異性抗體而再抗EpCAM陽性Kato細胞的PBMC和CD8+T淋巴細胞的細胞毒性。將100μl體積的200.000個非活化PBMC或CD8+T淋巴細胞加入100μl體積的10.000個鉻-51標記的Kato III細胞。加入50μl體積，濃度為40ng/ml-5μg/ml的雙特異性抗體。微滴板37℃，5％CO2孵育4小時。然後，從各格取50μl上清液，在γ計數儀中測定51Cr的釋放。
圖12通過ζ鏈/抗EpCAM雙特異性抗體將NK細胞的細胞毒性再指向EpCAM陽性細胞。將100μl體積的100.000個NK細胞加入100μl體積的10.000個鉻-51標記的Kato III細胞。加入50μl體積，濃度為1μg/ml的雙特異性抗體。微滴板37℃，5％CO2孵育4小時。然後，從各格取50μl上清液，在γ計數儀中測定51Cr的釋放。
本發明的實施例描述包涵了以上和其他實施方式。有關本發明所用的抗體、方法、用途或化合物的其他文獻，可從公共圖書館和資料庫獲取，例如用電子工具。例如，可利用網上的公共資料庫「Medline」，網址為http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。其他資料庫及其地址例如http//www.ncbi.nlm.nih.gov/，http//www.infobiogen.fr/，http/www.fmi.ch/biology/research-tools.html，http//www.tigr.org/，這些都是本領域技術人員所已知的，也可用http//www.lycos.com.獲得。有關生物技術專利信息的評論，以及用於檢索和了解當前狀況的相關專利信息來源的調查報告可參見Berk，TIBECH 12(1994)，352-364。
以上內容總體上描述了本發明。通過以下具體實施例可獲得更完全的理解，這些實施例僅以說明為目的，不限定本發明的範圍。實施例1用ζ肽-KLH偶聯物免疫小鼠，並用ζ肽-BSA偶聯物測定血清效價用ζ肽-KLH偶聯物(Jerini Bio Tools，Berlin)免疫10周齡的balb/c×C57黑鼠交配產下的F小鼠。含有ζ鏈N末端胺基酸序列(QSFGLLDPKLG)的該肽與馬來醯亞胺活化的KLH通過C末端半胱氨酸的巰基定向偶聯。將此偶聯物溶於0.9％NaCl至100μg/ml濃度。然後用完全Freund佐劑乳化，給每個小鼠腹腔內注射50μl。在4、8和12周後，除以不完全Freund佐劑替換完全Freund佐之外，以相同的方式對小鼠進行加強免疫。第一次加強免疫後10天，採集血樣，ELISA測定抗ζ肽-BSA偶聯物的抗體血清效價。免疫動物的血清效價比沒有免疫動物高1000倍。第二次加強免疫後3天，按照「現代免疫學方法」(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)中所述的標準方法，將脾細胞與P3X63Ag8.653細胞(ATCCCRL-1580)融合，生成雜交瘤細胞系。PEG融合後，按100.000個/格將細胞接種在微滴板的格內，培養在補充了10％胎牛血清、300單位/ml重組人白介素6和HAT-添加劑的200μl RPMI 1640培養基中進行選擇。緻密生長格中的培養物上清液按1∶20稀釋，用ELISA分析進行測試。用以下ELISA檢測雜交瘤上清液與ζ肽-BSA偶聯物結合的能力和ζ肽-KLH偶聯物一樣(Jerini Bio Tools，Berlin)，將100μlζ肽與牛血清白蛋白偶聯，然後以5μg/ml的濃度塗到96格U形底微滴板(Nunc，maxisorb)的格內。塗覆後在4℃過夜，用洗滌緩衝液(0.1M NaCl，0.05M Na2HPO4，pH7.3，0.05％Tween 20，0.05％NaN3)洗滌三次，然後將脫脂奶粉加入洗滌緩衝液配成200μl 2％的溶液，用該溶液在室溫下封閉1小時。下一步，純的或數種稀釋度的雜交瘤上清液在室溫下孵育2小時。檢測系統使用的是與辣根過氧化物酶偶聯的抗小鼠免疫球蛋白多克隆抗體。5次洗滌後，最後用TMB底物溶液(四甲基二氨基聯苯，Boehringer Mannheim)進行ELISA顯色。15分鐘後，有色沉澱用ELISA讀數儀在405nm處測定。
150個克隆的上清液表現出強ELISA信號，挑選它們進行流式細胞計數分析。
為了驗證雜交瘤上清液在T淋巴細胞和NK細胞上的結合活性，進行流式細胞計數分析。1×106PBMC在150個不同克隆的各50μl上清液原液中，冰上孵育30分鐘，與螢光素(FITC)偶聯的家兔抗小鼠Ig抗體F(ab)′2片段(Dako Hamburg，CodeNo.F0313)以PBS按1∶100稀釋，用該溶液檢測結合的抗體。為了避免非特異性結合，在下一步標記中，加入50μl 1∶10稀釋的小鼠血清(Sigma immunochemicals，Deisenhofen，M-5905)反應30分鐘，封閉FITC偶聯的抗體的游離價。為了區別兩個PBMC亞組，將先前標記的細胞一分為二。一半用1∶100稀釋的三色偶聯的抗CD8抗體(Caltac實驗室，Burlingame；USA，Code No.MHCD0306)染色；另一半用1∶25稀釋的藻紅蛋白(PE)偶聯的抗CD56抗體(Becton Dickinson，Heidelberg，Cat.No.347747)染色。陰性對照使用特異性不相關的鼠單克隆抗體而不是雜交瘤上清液。用特異性染色NK細胞或T淋巴細胞的非標記的抗CD16抗體和抗CD6抗體作為第一標記步驟的對照。
在FACS掃描儀(Becton Dickinson，Heidelberg)上用流式細胞計數分析細胞。按照「現代免疫學方法」(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)所述的方法進行FACS-染色和螢光強度測定。
進行雙色螢光分析，對CD8+細胞施加正柵極，對CD56+細胞施加負柵極，這樣，只分別檢測到CD8+T淋巴細胞或NK細胞上的FITC螢光。儘管各自的陽性對照抗體明顯染色CD8+T淋巴細胞和NK細胞，150份雜交瘤上清液都未顯示在CD8+T淋巴細胞和/或NK細胞上的結合活性。實施例2用噬菌體展示法在鼠組合抗體文庫中體外選擇抗ζ抗體如實施例1所述免疫10周齡的balb/c×C57黑鼠交配產下的F小鼠。第一次加強免疫後10天，採集血樣，ELISA測定抗ζ肽-BSA偶聯物抗體的血清效價(參見實施例1)。免疫動物的血清效價比未免疫動物高1000倍。第三次注射後3天，收穫小鼠的脾細胞。用Chomczynski(分析生物化學(Analytical Biochemistry)162(1987)156-159)的方法分離總RNA。通過小鼠脾細胞RNA的RT-PCR構建一個鼠免疫球蛋白(Ig)κ輕鏈和Ig重鏈Fd片段(＝VH+CH1)的DNA文庫。用標準方法合成cDNA(Sambrook，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第二版)。
選擇引物組(見表1)，使得重鏈含有5′-XhoI和3′-SpeI識別位點，輕鏈片段含5′-SacI和3′-XbaI識別位點。為了PCR擴增HC DNA片段，8種不同的5′-VH家族特異性引物各自與4種與不同IgG亞型HC-CH1結構域3′區雜交的3′引物組合；為了PCR擴增κ輕鏈片段，7種不同的5′-VK家族特異性引物各自與1種與κ恆區(CK)3′末端雜交的3′引物組合。
用以下PCR程序進行擴增94℃初變性2分鐘；擴增40輪94℃變性20秒，52℃引物退火50秒，72℃引物延伸60秒；然後72℃延長10分鐘。
將450ngκ輕鏈片段(Sacl-XbaI消化)與1400ng噬菌粒pComb3H(Sacl-XbaI消化；大片段)連接(Barbas等，美國科學院院報88，7978-82(1991))。然後將得到的輕鏈文庫通過電穿孔(2.5kV，0.2cm寬的比色杯，25FD，200Ω，Biorad基因脈衝儀)轉化到300μl電感受態的大腸桿菌XL1Blue中，得到大小為6×108個獨立克隆的文庫。1小時的表型表達後，在100ml液態SB培養物中過夜，選出載體編碼羧苄青黴素抗性的陽性轉化子。然後離心收集細胞，用市售的質粒製備試劑盒(Qiagen)製備質粒。
將2800ng含κ輕鏈文庫的該質粒DNA(Xhol-SpeI消化；大片段)與900ng HC-Fd-DNA片段(Xhol-SpeI消化)連接，並仍通過電穿孔(2.5kV，0.2cm寬的比色杯，25FD，200Ω)轉化到兩份300μl電感受態的大腸桿菌XL1Blue中，得到4×108個獨立克隆的抗體Fab片段組合文庫。
1小時的表型表達後，根據羧苄青黴素抗性選出陽性轉化子。經過如此適應後，用感染劑量1×1012個輔助噬菌體VCSM13顆粒感染這些克隆，於是產生並分泌出絲狀M13噬菌體，各噬菌體顆粒含編碼單個鼠抗體Fab片段的噬菌粒載體的單鏈拷貝，並在噬菌體表面展示相應的Fab蛋白。通過翻譯將HC-Fd片段與噬菌體包被蛋白III融合，Ig輕鏈自發地與HC片段結合，這樣將Fab片段錨著在噬菌體表面上。
用PEG8000/NaCl沉澱和離心，從培養物上清液收穫帶有克隆Fab集的噬菌體文庫，重溶於補充了10％FCS的RPMI1640培養基，隔日輪換地與固定化ζ肽-BSA偶聯物或分離的CD8+淋巴細胞或NK細胞一起培養。預先用免疫磁力分離法分離兩個人PBMC亞群。用Ficoll密度梯度離心從外周血獲得單核細胞，它們先與抗人CD8和CD56的鼠源特異性第一抗體一起孵育，然後用偶聯了綿羊抗小鼠IgG抗體的順磁性微珠(Dynal，Oslo，Norway)進行花結實驗。用一塊磁鐵貼在含細胞懸液試管的壁上，分離出CD8+T淋巴細胞和CD56+NK細胞。噬菌體文庫分別與純化的CD8+T淋巴細胞或NK細胞在4℃連續攪拌孵育2小時，然後，因為順磁性微珠仍然結合著細胞，所以可從非結合噬菌體顆粒中拯救出結合噬菌體顆粒的細胞。
所以，與磁場作用可用來取消每輪從篩選時為減弱噬菌體背景而多次使用洗滌溶液重懸細胞。最後，用HCl-甘油，pH2.2洗脫特異性結合的噬菌體顆粒，用2M Tris，pH12中和後，用洗脫物感染新的未感染的大腸桿菌XL1Blue培養物。同樣，用羧苄青黴素抗性選出編碼鼠Fab片段的pComb3H噬菌粒拷貝成功轉導的細胞，然後用VCMS13輔助噬菌體感染，開始另一輪抗體展示和體外選擇。
完整的體外選擇包括前兩輪固定化ζ肽-BSA偶聯物上的篩選，然後一輪分別在CD8+T淋巴細胞和CD56+NK細胞上的篩選。然後，又是兩輪固定化ζ肽-BSA偶聯物上的篩選，接一輪CD8+T淋巴細胞上的篩選，最後在CD56+NK細胞上篩選。為了保持對ζ鏈特異性Fab片段的選擇壓力，按(Barbas等，美國科學院院報88，7978-82(1991))所述進行固定化抗原上的篩選，否則，這些Fab片段可能因非特異性噬菌體洗脫而從含有除ζ鏈之外大量其他抗原的細胞表面丟失。每輪篩選後，從得到的大腸桿菌培養物製備質粒DNA。
為了生產可溶性Fab蛋白，從製備的質粒DNA中切下基因III DNA片段(SpeI/NheI)，從而破壞了Fab片段與基因III蛋白的翻譯融合。連接後，將該質粒集合轉化到100μl熱休克感受態大腸桿菌XL1Blue中，並在羧苄青黴素LB-瓊脂板上培養。將單克隆培養在10ml LB-Carb-培養物/20mM MgCl2中，6小時後，加入最終濃度為1mM的異丙基-β-D-硫半乳糖苷(IPTG)誘導Fab表達。
20小時後，離心收穫細胞，經4次-70℃冷凍和37℃融解循環後，細菌的外膜被溫度衝擊所破壞，包括Fab抗體片段在內的可溶性周質蛋白於是釋放進入液體。離心去除完整細胞和細胞碎片，用ELIDA測定上清液中Fab抗體片段與ζ肽-BSA偶聯物的結合。
用與辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠IgG+IgM抗體的F(ab′)2片段(0.16μg/ml)檢測與固定化ζ肽-BSA偶聯物結合的Fab抗體片段(Pierce，Rockford，USA，Prod.No.311448)。加入底物溶液(含2，2′-聯氮-雙-(3-乙基苯並噻唑啉磺酸)和過硼酸鈉，進行信號顯色，並在405nm處檢測。
與體外選擇前取自文庫的克隆相反，不同輪次篩選後的被測克隆在ζ肽-ELISA中證明呈陽性，頻率全面提高，直至用純化CD8+T細胞進行的第7輪篩選(圖2)。但從第7輪到用純化NK細胞進行的第8輪篩選，陽性克隆數顯著下降。這顯示，憑藉其在T細胞上結合活性而富集的克隆大多數不結合NK細胞，只有克隆90例外，它在最後的NK細胞篩選後仍然存在。
為了驗證ζ肽反應性Fab片段在CD8+T細胞和NK細胞上的結合活性，進行流式細胞計數分析。1×106個PBMC在50μl周質製劑原液中冰上孵育30分鐘，然後與螢光素(FITC)偶聯的山羊抗小鼠IgG+IgM抗體的F(ab′)2片段(JacksonImmunoresearch Laboratories，West Grove，USA，Code No.115-096-068)的1∶100 PBS稀釋液一起孵育。為了避免非特異性結合，在以後的標記步驟中，加入50μl 1∶10稀釋的小鼠血清(Sigma immunochemicals，Deisenhofen)反應30分鐘，封閉FITC-抗體的游離價。為了區分兩PBMC亞組，將先前標記的細胞一分為二。一半用1∶100稀釋的三色偶聯的抗CD8抗體(Caltac Laboratories，USA，Code.No.MHCD0306)染色；另一半用1∶25稀釋的藻紅蛋白(PE)偶聯的抗CD56抗體(Becton Dickinson，Heidelberg，Cat.No.347747)染色。陰性對照使用特異性不相關的Fab抗體周質製劑。分別用非標記的抗CD16抗體和抗CD6抗體作為NK細胞和CD8+T淋巴細胞的陽性對照。
在FACS掃描儀(Becton Dickinson)上進行雙色螢光分析，對CD8+細胞和CD56+施加正柵極，這樣，只分別檢測到CD8+T淋巴細胞和NK細胞上的FITC螢光。按照「現代免疫學方法」(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)所述的方法進行細胞標記和螢光強度測定。
用以上方法，在PBMC上分析了60個不同克隆，它們都在ELISA分析中被證明與ζ肽-BSA偶聯物反應。雖然陽性對照表現出明顯的陽性FACS信號，但抗ζ鏈Fab片段周質製劑都不能與CD8+細胞和NK細胞的表面結合。這可以解釋為，用T細胞表面篩選得到的Fab片段的親和反應性低，這對於體外選擇過程中的富集可能已足夠，但卻低於流式細胞計數分析的靈敏度。然而，最後在NK細胞上選擇時，ζ肽反應性克隆消失，這明確顯示，這些潛在的T細胞反應性克隆完全不與NK細胞表面結合。另一方面，克隆90，根據其可變區序列與體外篩選過程中早期出現的其他ζ肽反應性克隆的可變區序列的比較，在最後的NK細胞表面選擇時才首次出現，很可能具有結合NK細胞表面的低親和力，但與T細胞不反應。所以，直到第二輪NK細胞選擇，克隆90才出現，用相應的Fab片段進行的流式細胞計數分析在T細胞或NK細胞上都沒有檢測到結合信號。實施例3用ζ肽-KLH偶聯物免疫大鼠，並用雜交瘤技術產生抗ζ肽抗體3月齡時，用人T細胞系Jurkat(ATCC TIB-152)通過腹腔內注射1×107細胞免疫Spargue Dawley大鼠。3個月後，用ζ肽-KLH偶聯物免疫大鼠。將該偶聯物溶於0.9％NaCl中達200μg/ml的濃度。用Freund完全佐劑將該溶液按1∶2乳化，取100μl進行腹腔內注射和皮下注射。4周後，以相同方式但不加佐劑，對大鼠進行加強免疫。加強免疫後3天，殺死動物取出脾細胞，按標準方法，將其與P3X63Ag8.653細胞(ATCC CRL-1580)融合，生成雜交瘤細胞系。PEG融合後，按100.000/格將細胞接種在微滴板上，培養在200μl補充了10％胎牛血清和HAT添加劑的RPMI 1640培養基中進行選擇。8天後，完全除去培養上清液，換以新鮮的培養基。又4天後，各格的培養上清液按1∶1稀釋，並進行ELISA測試(參見實施例1)。挑選與固定化ζ肽-BSA偶聯物反應最強烈的45格的上清液，如實施例1就鼠單克隆抗體篩選所述，在CD8+T淋巴細胞和NK細胞上進行FACS分析，但使用的是FITC標記的抗大鼠免疫球蛋白抗體(IgG+IgM)(Dianova/Jackson，Hamburg，Cat.No.112-016-044)而不是FITC偶聯的大鼠抗小鼠Ig抗體的F(ab′)2片段。在被測的45種不同大鼠單克隆抗體中，只有克隆2-B-5在CD8+T淋巴細胞和NK細胞上都結合。所以，在實施例4-7中，對該克隆進行更詳細的分析。實施例4在CD8+T淋巴細胞和NK細胞上進行的抗ζ鏈抗體2-B-5的流式細胞計數分析為了測試抗體2-B-5在CD8+T淋巴細胞和NK細胞上的結合活性，取兩名健康供者的外周血，通過Ficoll密度梯度離心分離出單核細胞。將細胞按100.000/格接種在微滴板上，分別與2-B-5雜交瘤培養上清液原液及其幾個濃度的稀釋液一起孵育。陰性對照用的是同型但特異性不相關的抗體(大鼠IgM)的培養上清液。冰上孵育30分鐘後，細胞用PBS洗滌兩次，然後用兩種不同的抗體標記混合物染色。同時，CD8+T淋巴細胞與螢光素(FITC)偶聯的山羊抗大鼠Ig(IgG+IgM)抗體((Dianova/Jackson，Hamburg，Cat.No.112-016-044)的1∶100 PBS稀釋液，藻紅蛋白(PE)偶聯的CD56抗體(Becton Dickinson，Heidelberg，Cat.No.347747)的1∶25PBS稀釋液，和三色偶聯的CD3抗體(Caltac Laboratories，Burlingame，USA，Cod.No.MHCD0306)的1∶50PBS稀釋液一起在冰上孵育30分鐘。為了避免抗大鼠抗體與小鼠抗體的非特異性結合，在該標記混合物中加入1∶10稀釋的小鼠血清(Sigma Aldrich，St.Louis，USA，Cat.No.054H-8958)。
NK-細胞與相同的山羊抗大鼠抗體1∶100 PBS稀釋液，三色偶聯的CD8抗體((Caltac Laboratories，Cod.No.MHCD0806)的1∶100 PBS稀釋液，和藻紅蛋白(PE)偶聯的CD16抗體(Becton Dickinson，Heidelberg，Cat.No.347617)的1∶25PBS稀釋液一起孵育。也在該混合物中加入小鼠血清。標記後的細胞用PBS洗滌兩次，然後用PBS/1％聚甲醛固定。
在FACS掃描儀(Becton Dickinson，Heidelberg)上對細胞進行流式細胞計數分析。按現代免疫學方法(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)所述，進行FACS染色和螢光強度測定。
進行三色螢光分析，對CD8+細胞(三色)加以正柵極，對CD16+細胞(PE)加以副柵極，這樣，檢測到的只是CD8+T淋巴細胞(表型CD8+，CD16+)上的FITC螢光，而沒有來自CD8+NK細胞的幹擾。同樣，進行三色螢光分析，對CD56+細胞(PE)加以正柵極，對CD3+細胞(三色)加以副柵極，這樣，檢測到的只是NK細胞(表型CD56+，CD3+)上的FITC螢光，而沒有來自CD56+T淋巴細胞的幹擾。
如圖3所示，2-B-5雜交瘤抗體與不同供者的T淋巴細胞和NK細胞都特異性地結合。實施例5用夾心ELISA驗證2-B-5抗體的ζ鏈特異性為了驗證2-B-5抗體的ζ鏈特異性，進行夾心ELISA。
為此，純化已知表達ζ鏈的CD8+T淋巴細胞的裂解液，與固定化的識別胞外ζ鏈結構域的抗體一起孵育。細胞裂解液的ζ鏈分子於是被該抗體捕捉，繼而被抗ζ鏈胞外部分的2-B-5抗體檢測到。如實施例1所述，用順磁性微珠分離CD8+T淋巴細胞。具體步驟按照生產商(Dynal，Oslo，Norway)的說明書進行。用除垢劑NP-40(Sigma，deisenhofen)，在蛋白酶抑制劑苯甲基磺醯氟(PMSF)(Merk，Darmstadt)存在下，裂解純化的CD8+T淋巴細胞。有關詳細的緩衝液配方，參見Sambrook，分子克隆實驗室手冊，第二版，Cold Spring Habor Laboratory Press，Cold Spring Hobart，NY(1989)。
如下進行夾心-ELISA一種ζ鏈特異性抗體(Santa Cruz Biotechnology，Cat-No1124)識別ζ鏈羧基末端的144-163位胺基酸，叫將它以5μg/ml的濃度塗在96格U形底微滴板(Nunc，Maxisorb)上。塗層在4℃保持過夜，用BSA的3％PBS溶液室溫下封閉1小時。然後，加入CD8+T淋巴細胞裂解液原液和幾個濃度的稀釋液，培養1小時。陰性對照是與PBS而不是細胞裂解液一起孵育的孔。在以下步驟中，加入1μg/ml的純化單克隆抗體2-B-5，孵育1小時。先加生物素化小鼠抗大鼠IgM抗體(Zymed，San Francisco，CA.USA；Cat-No.03-9840；工作濃度為400ng/ml)，然後加親合素-過氧化物酶偶聯物(Dako，Hamburg；Code-No.P03347；工作濃度位1μg/ml)，檢測結合的2-B-5抗體。最後加入ABTS底物溶液(Boehringer Mannheim，Mannheim，Cat-No.1682008)進行ELISA的顯色。用ELISA讀數儀在405nm測定有色沉澱。
按照生產商的說明使用Bakerbond Abx柱(J.T.Baker，Greisheim，Germany)，用離子交換層析法，從雜交瘤培養上清液中純化大鼠IgM抗體2-B-5。
如圖4所示，單克隆抗體2-B-5與T細胞裂解液中的ζ鏈分子結合，被識別胞外ζ鏈結構域的固定化抗體所捕捉，ζ特異性的ELISA信號依賴於裂解液的稀釋度，而且明顯高於陰性對照。實施例6ζ抗體2-B-5可變區的克隆，和其相應Fab片段在大腸桿菌內的表達按照Chomczynski等的方法(生物化學年報，Vol.162，p.156-9，1989)，從5×106個大鼠雜交瘤細胞系2-B-5細胞中分離RNA。按照標準方法(Sambrook，Cold SpringHarbour Laboratory Press 1989，第二版)，用MMLV逆轉錄酶Superscritpt II(Gibco BRL，Eggenstein)逆轉錄總RNA。大鼠cμRT(GTGCAGGGCCAGAGAAGGCATC)與大鼠μ鏈恆區的一段短序列匹配，大鼠ckRT(GTAGGTCGCTTGTGGGGAAGTCTC)與輕鏈(κ鏈)3′非翻譯區的一部分互補，用這兩段寡核苷酸特異性合成cDNA，兩引物分別位於轉錄產物IgM-CH1-重鏈或κ輕鏈恆區的核苷酸序列末端下遊70鹼基對(bp)處。兩種情況中的核苷酸信息都來自Genebank資料庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/)，κ鏈登錄號J02574，μ鏈登錄號X68312。然後，按照標準方法，用末端轉移酶(Pharmacia，Freiburg)給cDNA第一鏈加上聚G尾。根據Gilliland，L.K.等公開(Tissue Antigens 47，1-20，1996)的錨引物5′-Anc尾(CGTCGATGAGCTCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCD)，用一段含聚C延伸的有義引物對加尾cDNA進行PCR擴增。將該錨引物與分別對編碼κ輕鏈恆區C末端或IgM-CH1重鏈C末端的核苷酸序列具有特異性的反義引物混合。將該兩引物稱為3′大鼠ck(GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA)和3′大鼠cμ(ATTGGGACTAGTCTCAACGACAGCTGGAAT)。如下進行PCR初變性94℃ 4分鐘；30輪擴增93℃30秒，55℃30秒，72℃30秒；最後延長72℃3分鐘。這些引物都含有一個限制酶剪切位點(5′-Anc尾EcoRI；3′大鼠ckXbaI；3′大鼠cμSpeI)，從而可將相應PCR片段插入分別用EcoRI/XbaI消化或EcoRI/SpeI消化的質粒載體；為此，使用bluescript KS+質粒載體(Genebank Accession No X52327)，因為它允許用一般測序引物方便地對所得插入片段進行序列分析。因為重鏈(VH)可變區內有一個SpeI剪切位點，必須先部分消化，然後克隆全長片段，才能獲得VH鏈的全序列信息。部分消化按照標準方法進行(Sambrook，Cold Spring Harbour Laboratory Press，1989，第二版)。重鏈和輕鏈的幾個克隆分別被證明具有相同的序列，可認為編碼功能性VL或VH區(參見圖6和7)。
通過與Genebank資料庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/)中序列比較，鑑定兩可變區的成熟N末端，然後設計第二組PCR引物，以便根據亞克隆到細菌表達載體中的要求，引入一個與2-B-5Fab抗體片段編碼序列同框的合適的限制酶剪切位點。這兩個引物是5′RVHZXhoI(CAGGTACAGCTGCTCGAGTCTGGGGC-TGAGCTAG)和5′RVKZSacI(GTAAATGTGAGCTCCAGATGACACAGTCTCCTG)，分別與3′大鼠cμ和3′大鼠ck引物聯用。PCR擴增，並用合適的限制酶組合(XhoI/SpeI用於重鏈片段，SacI/XbaI用於κ輕鏈)消化後，將所得的DNA片段分別克隆到相應製備的bluestript質粒載體中，然後進行序列驗證(測序結果，參見圖6和7)。
為了在大腸桿菌的周質中表達2-B-5-Fab片段，用限制酶SacI/XbaI從BluescriptKS+中切取相應的κ輕鏈，亞克隆入相同酶消化的載體pComb3HHis。然後，用限制酶XhoI/NheI消化所得的質粒，以其為載體亞克隆2-B-5重鏈Fd片段(VH+CH1)；該DNA片段用XhoI/SpeI切自相應的Bluescript KS+克隆。
pComb3HHis是pComb3H和pComb3(Barbas等，美國科學院院報88，7978-82(1991))經以下修飾而得用NheI剪切pComb3H載體，通過連接插入一段帶有合適末端的雙鏈寡核苷酸。該雙鏈寡核苷酸是5′磷酸化引物His6s(CTAGCCATCACCATCACCATCACA)和His6as(CTAGTGTGATGGTGATGGTGATGG)退火(94℃10分鐘；65℃30分鐘；52℃30分鐘；30℃10分鐘)而成。引物末端的設計為在與載體融合後，3′NheI限制酶位點被破壞，而5′NheI剪切位點保持完好。最後，進行插入片段的測序，驗證克隆成功。
用滲透性衝擊製備細胞周質，並用ELISA檢測與ζ肽-KLH偶聯物結合的Fab片段。為此，將以含2-B-5重鏈Fd片段和κ輕鏈的pComb3Hhis轉化的大腸桿菌XL1Blue的單克隆培養在10ml補充了羧苄青黴素和20mM MgCl2的Super肉湯培養基中，6小時後，加入最終濃度為1mM的異丙基-β-D-硫半乳糖苷(IPTG)，誘導Fab的表達。20小時後，收穫細胞，重溶於1ml PBS中。4輪-70℃冷凍和37℃融化後，細菌的外膜被破壞，含有Fab片段的可溶性周質蛋白被釋放到上清液中。離心去除完整細胞和細胞碎片，收集含ζ-Fab抗體片段的上清液，用於以後的檢測。
用以下ELISA檢測周質表達的單克隆抗體2-B-5 Fab片段與ζ肽-KLH偶聯物的結合將抗原固定在96U格ELISA板(Nunc maxisorb)上，濃度為每格50μl磷酸鹽緩衝液(PBS)中的200μg/ml。塗層在4℃保持12小時，然後用PBS/0.05％Tween洗滌一次。然後用PBS/3％牛血清白蛋白(BSA)封閉ELISA板一小時，再洗滌一次。然後，加入含Fab的周質製劑原液和幾個濃度的稀釋液，培養2小時。先加1∶200稀釋的小鼠抗His-尾抗體(Dianova，Hamburg，cat.no.DIA900)，然後加1∶5000稀釋的過氧化物酶偶聯的多克隆山羊抗小鼠IgG(Fcγ特異性)抗體(Dianova/Jackson，Hamburg，cat.no.115-035-071)，檢測與ζ肽-KLH偶聯物結合的Fab片段。最後，加入ABTS底物溶液(Boehringer Mannheim，Mannheim，Cat-No.1682008)進行ELISA顯色。用ELISA讀數儀在405nm測定有色底物的轉變率，結果見圖5。陰性對照是與PBS而不是周質製劑一起培養的細胞。
可檢測到幾個克隆與ζ肽-KLH偶聯物的特異性結合，克隆8和9的結果見圖5。信號強度明顯高於陰性對照，可用樣品稀釋液進行滴定。因此，克隆的2-B-5Fab片段的ζ鏈特異性得到了證實。實施例7用抗ζ鏈抗體2-B-5激發T淋巴細胞和NK細胞。
本實驗的目的是分析受抗體2-B-5誘導的T細胞，NK細胞和PBMC的激發和增殖。為此，採用基於測定DNA合成時摻入的5-溴脫氧脲苷(BrdU)的比色免疫試驗(Boehringer Mannheim，Mannheim，Cat.No.1647229)。
第一步，用純化的2-B-5抗體的幾個濃度的稀釋液覆蓋96格平底微滴板(有關2-B-5的純化，參見實施例5)。塗層在4℃保持過夜。用PBS洗滌3次後，在微滴板的格內加入100.000 CD8+T淋巴細胞、NK細胞和非分離的PBMC，一式三份，按照實施例2的說明，用磁性微珠和第一抗體抗CD8+(MT-811)和抗CD16(3G8，小鼠IgG1，Dianova，Hamburg，Cat.No.0813)，分離CD8+T淋巴細胞和NK細胞。
作為2-B-5介導激發的特異性的對照，使用同濃度，特異性不相關的同型抗體(大鼠IgM)。抗體OKT3(同型IgG2a，Ortho.，Prod.Code 710320，Johnson+Johnson，NewYork，USA)識別人CD3複合物，用它作為陽性對照，以1μg/ml覆蓋濃度分別用於T細胞和NK非分離PBMC的激發。用特異性不相關的IgG2a抗體作為OKT3的同型對照。還包括一個空白對照(無細胞的格)和一個背景對照(沒有BrdU)格。培養3天後，加入BrdU標記溶液反應24小時。在此標記期間，嘧啶類似物BrdU取代胸腺嘧啶摻入增殖細胞的DNA。去除培養基後，固定細胞，加入變性性溶液變性DNA。DNA的變性是必需的，這是為了提高用與過氧化物酶偶聯的抗BrdU抗體檢測摻入BrdU的可接近性。該抗體與新合成的細胞DNA內摻入的BrdU結合。然後用底物反應檢測結合的抗BrdU抗體。用ELISA讀數儀進行反應產物的定量。以405nm處的吸光度作為有色底物的轉化率，它與DNA合成水平即增殖細胞數直接相關。所有步驟都按照試劑盒生產商的說明進行。
圖8中，該試驗的結果清楚地顯示，抗體2-B-5不僅與T淋巴細胞和NK細胞上的ζ鏈短胞外域結合，而且還通過這一相互作用強烈誘導以上兩種細胞的激發。實施例8抗ζ鏈抗體結合誘導的TCR/CD3複合物內化的流式細胞計數分析對許多受體來說，配體結合的激活作用後緊跟著受體的內化。所以，在抗CD3抗體結合後，典型地觀察到了T細胞上TCR複合物的內化。因此，2-B-5抗體通過胞外ζ鍊表位結合TCR複合物後的內化驗證了本發明抗體的獨特特異性。(Boyer，C.，Auphan，N.，Luton，F.，Malburet，J.M.，Barad，M.Bizozzero，J.P.，Reggio，H.和Schmitt-Verhulst，A.M.(1991)。溶胞性T細胞克隆活化後T細胞受體/CD3複合物的內化非蛋白激酶C依賴性星形孢菌素敏感性步驟的證據。歐洲免疫學雜誌21，1623-34)。
為了測定2-B-5抗體與T細胞表面結合後的受體內化作用，在不同溫度進行流式細胞計數試驗，觀察表面結合抗ζ鏈抗體的消失。
為此，用Ficoll密度梯度離心法分離來自健康供者外周血的單核細胞。在微滴板的各格中，200.000個細胞與1μg/ml抗ζ鏈抗體2-B-5在4℃或37℃培養30或60分鐘，從而為加帽反應提供足夠的時間。用大鼠抗人CD3抗體(大鼠IgG2B)(克隆26-II 6-5)進行平行實驗作為陽性對照。通過兩次冷PBS洗滌終止加帽反應。為了標記細胞表面結合的抗體，將細胞與PBS1∶100稀釋的螢光素(FITC)偶聯的山羊抗大鼠Ig(IgG+IgM)抗體(Dianova/Jackson，Hamburg，Cat.No.112-016-044)一起培養。單純用第二抗體作為陰性對照。標記後細胞用PBS洗滌兩次，然後用PBS/0.1％聚甲醛固定。
在FACS掃描儀(Becton Dickinson，Heidelberg)上，對細胞進行流式細胞計數分析。按現代免疫學方法中所述的方法(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)進行FACS染色和螢光強度的測定。
結果清楚地顯示，在抗ζ鏈抗體2-B-5結合後，可觀察到37℃培養和4℃培養的細胞樣品間發生明顯的螢光強度漂移。抗CD3抗體結合後，也可看到類似的內化方式。與在37℃的受體內化相反，在加帽反應無法進行的4℃培養的樣品，其螢光方式不變。實施例9根據本發明的抗ζ鏈特異性構建雙特異性抗體為了獲得抗ζscFv片段，以克隆在各自質粒載體內的VL和VH區作為模板，分別用寡核苷酸引物對5′VL2B5BsrGI-EcoRV/3′VL2B5GS15和5′VH2B5GS15/3′VH2B5BspEI，進行VL和VH特異性PCR。由此，將重疊的互補序列引入PCR產物，在融合PCR過程中，組合成一段15胺基酸(Gly4Ser1)3接頭的編碼序列。用引物對5′VL2B5BsrGI-EcoRV/3′VH2B5BspEI進行該擴增步驟，用限制酶EcoRV和BspEI剪切得到的融合產物(或抗ζ鏈scFv片段)，克隆到質粒(參見PCT/EP98/07313)中，該質粒經相同的限制酶消化，含有特異性結合EpCAM抗原的scFv片段，和用於純化和分析的組氨酸尾C末端。接著，將編碼抗ζ鏈/抗EpCAM的雙特異性單鏈抗體(其結構域排列為VL抗ζ-VH抗ζ-VH抗EpGAM-VL抗EpCAM)的DNA片段通過EcoRI/SalI亞克隆入哺乳動物表達載體PEF-DHFR(Mack，M.，Riethmuller，G.，和Kufer，P.(1995)。「一種以功能性單鏈分子形式表達的高腫瘤細胞毒性雙特異性抗體小構建物」。美國科學院院報92，7021-5)。經序列驗證(圖10)後，所得的質粒DNA通過電穿孔轉染到DHFR缺陷型CHO細胞中；如Mack等所述，選擇穩定的轉化子，進行基因擴增和蛋白質生產。如Mack等所述，在Ni-NTA-柱上，用親合性層析，通過C末端的組氨酸尾純化該雙特異性抗體。
引物表5′VL2B5BsrGI/EcoRV 5′-AGG TGT ACA CTC CGA TAT CCA GAT GAC ACA GTC TCC-3′3′VL 2B5 GS15 5′-GGA GCC GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC TTT CAGCTC CAG CTT GGT CCC-3′5′VH 2B5 GS15 5′-GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT CAG GTACAG CTG CAG CAA TCT GG-3′3′VH 2B5 BspEI 5′AAT CCG GAA GAG ACA GTG ACC AGA GTG-3′實施例10因雙特異性抗ζ鏈/抗EpCAM抗體而再抗EpCAM陽性靶細胞的PBMC和CD8+T淋巴細胞的細胞毒性在本試驗中，靶細胞用51Cr標記，洗滌，與效應細胞按效靶比20∶1的比例混合，然後與不同濃度的雙特異性抗ζ鏈/抗EpCAM抗體一起培養。定量測定因靶細胞被殺傷而釋放到上清液中的51Cr，並計算各抗體濃度的比裂解率。
從健康供者血液的新鮮黃色白細胞層中分離人外周血單核細胞(PBMC)或細胞毒T淋巴細胞作為效應細胞用於本試驗。先ficoll密度梯度離心，然後離心(100g)去除血小板，分離PBMC。用CD8+亞組柱試劑盒(RD System，Wiesbaden，Cat-No.HCD8C-1000)，按照生產商的方案，分離細胞毒T淋巴細胞。100μl補充了10％FCS的RPMI1640培養基中加200000個未激發的PBMC或CD8+T淋巴細胞，將其分別加入圓底微滴板的各孔。靶細胞是Kato III細胞(ATCC HTB-103)，一個EpCAM陽性的胃癌細胞系，已用鉻-51(NEN-Life Science，Koln；Cat-No.NEZ030S)(約100μCi)標記12小時；在微滴板的各格內加入100μl體積內的10.000個靶細胞。加入50μl濃度為40ng/ml至5μg/ml的雙特異性抗體。微滴板於37℃，5％CO2培養16小時，結束時，從各格取50μl上清液，在γ計數儀(Wallac，1480Wizard 3″，Freiburg)中分析釋放出的51Cr。用含Triton-X100(1.0％的PBS溶液)緩衝液裂解靶細胞，測定最大51Cr釋放。將靶細胞在無效應細胞和雙特異性抗體存在下培養，測定自發性51Cr釋放。靶細胞與雙特異性抗體一起孵育沒有引起可測的裂解。如下計算比裂解比裂解(％)＝[(cpm，實驗釋放)-(cpm，自發釋放)]/[(cpm，最大釋放)-(cpm，自發釋放)]×100。所有測試都平行進行3份。所有實驗的3份平行實驗的SD都低於6％。
用流式細胞計數分析分離的CD8+效應細胞的純度，用PE偶聯的抗人CD56抗體染色排除NK細胞汙染。如實施例1所述進行FACS分析。使用了以下抗體偶聯物FITC抗人CD3抗體(Pharmingen Cat-No.30140X)1∶50；PE抗人CD56(BectonDickinson Cat-No.347747)1∶20；三色小鼠抗人CD8(Caltac Lab Code No.MHCD0806)1∶100(Becton Dickinson)。FACS結果驗證了CD8+細胞群的高純度(＞99％)。
鉻釋放試驗的結果(圖11)清楚地顯示雙特異性抗ζ鏈/抗EpCAM抗體能夠令未激發的PBMC或CD8+細胞毒淋巴細胞再抗EpCAM陽性KATO III細胞。非分離PBMC介導和分離的細胞毒T淋巴細胞介導的比裂解率之間的差異是因為NK細胞的細胞毒性。實施例11因雙特異性抗ζ鏈/抗EpCAM抗體而再抗EpCAM陽性靶細胞的PBMC和NK細胞的細胞毒性該實驗是為了證明雙特異性抗ζ鏈/抗EpCAM抗體能夠令NK細胞再抗EpCAM陽性靶細胞。為了進行該試驗，用NK細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec，BergischGladbach；Order No.465-02)從人外周血單核細胞(PBMC)中分離NK細胞。該分離方法是基於磁性去除非NK細胞。先加半抗原偶聯的CD3、CD14、CD19、CD36和抗IgE抗體的混合物，接著加順磁性微珠結合的抗半抗原單克隆抗體，間接標記T細胞、B細胞、單核細胞、嗜鹼性粒細胞、樹狀細胞和血小板。與磁性微珠結合的細胞因磁場而滯留。未標記的NK細胞從柱上洗脫，並保持完好。將3名不同健康供者的100000個NK細胞加入100μl補充了10％FCS的RPIM1640培養基中，將此加入圓底微滴板的各格中。在各格內加入靶細胞即51Cr標記的Kato細胞(每格100μl，內含10000個靶細胞)。加入50μl 1μg/ml雙特異性抗體。微滴板在37℃，5％CO2中培養4小時。結束時，取50μl上清液，在γ計數儀(Wallac，1480Wizard 3″，freiburg)中分析釋放的51Cr。用含Triton-X100(1.0％的PBS溶液)緩衝液裂解靶細胞，測定最大51Cr釋放。將靶細胞在無效應細胞和雙特異性抗體存在下培養，測定自發性51Cr釋放。靶細胞與雙特異性抗體一起孵育沒有引起可測的裂解。如下計算比裂解比裂解(％)＝[(cpm，實驗釋放)-(cpm，自發釋放)]/[(cpm，最大釋放)-(cpm，自發釋放)]×100。所有測試都平行進行3份。所有實驗3份平行實驗的SD都低於6％。
用流式細胞計數分析分離的NK效應細胞的純度，用三色偶聯的小鼠抗人CD8抗體染色排除CD8+細胞汙染。如實施例1所述進行FACS分析。使用了以下抗體偶聯物FITC抗人CD3抗體(Pharmingen Cat-No.30140X)1∶50；PE抗人CD56(BectonDickinson Cat-No.347747)1∶20；三色小鼠抗人CD8(Caltac Lab Code No.MHCD0806)1∶100(Becton Dickinson)。FACS結果驗證了NK細胞群的高純度(＞98％)。
鉻釋放試驗的結果顯示了3種情況下，能夠具有重複性地，令NK細胞再抗EpCAM陽性靶細胞。
序列表110Connex GmbH120與人ζ鏈胞外域特異性相互作用的免疫試劑130C1368PCT140141150EP 98 11 2867.11511998-07-1016018170PatentIn Ver.2.1210121133212DNA213褐鼠220221CDS222(1)..(33)4001cag gca agc cag gac att ggt aat tgg tta gca33Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp Leu Ala1 5 10210221111212PRT213褐鼠4002Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp Leu Ala1 5 10210321121212DNA213褐鼠220221CDS222(1)..(21)4003agt gca acc agc ttg gca gac 21Ser Ala Thr Ser Leu Ala Asp1 521042117212PRT213褐鼠4004Ser Ala Thr Ser Leu Ala Asp1 5210521127212DNA213褐鼠220221CDS222(1)..(27)4005cta cag cgt tat agt aat ccc aac acg 27Leu Gln Arg Tyr Ser Asn Pro Asn Thr1 521062119212PRT213褐鼠4006Leu Gln Arg Tyr Ser Asn Pro Asn Thr1 5210721130212DNA213褐鼠220221CDS222(1)..(30)4007ggc tac aca ttc acc agt tac gat atg cac 30Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Met His1 5 10210821110212PRT213褐鼠4008Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Met His1 5 10210921151212DNA213褐鼠220221CDS222(1)..(51)4009tgg att tat cct gga aat ggt aat act aag tac aat caa aag ttc aat48Trp Ile Tyr Pro Gly Asn 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Phe50 55 60aat ggg aag gca aca ctc act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tat 240Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat ttc tgt 288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95gca aga gat tgg cat tac tat agc agc tat atc cgt ccc ttt gct tac 336Ala Arg Asp Trp His Tyr Tyr Ser Ser Tyr Ile Arg Pro Phe Ala Tyr100 105 110tgg ggc caa ggc act ctg gtc act gtc tct tca 369Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 12021014211123212PRT213褐鼠40014Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Asp Met His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Trp His Tyr Tyr Ser Ser Tyr Ile Arg Pro Phe Ala Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 12021015211321212DNA213褐鼠220221CDS222(1)..(321)40015gac atc cag atg aca cag tct cct gct tcc ctg tct gcg tct ccg gaa48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Glu1 5 10 15gaa att gtc acg atc aca tgc cag gca agc cag gac att ggt aat tgg96Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp20 25 30tta gca tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa tct cct caa ctc ctg atc 144Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile35 40 45tat agt gca acc agc ttg gca gac ggg atc cca tca agg ttc agc ggc 192Tyr Ser Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60agt aga tct ggt aca cag tat tct ctt aag atc agc aga cta cag gtt 240Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Arg Leu Gln Val65 70 75 80gaa gat act gga atc tat tac tgt cta cag cgt tat agt aat ccc aac 288Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Tyr Ser Asn Pro Asn85 90 95acg ttt gga gct 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ctattactgt ctacagcgtt atagtaatcc caacacgttt 360ggagctggga ccaagctgga gctgaaaggt ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt 420ggtggtggtt ctcaggtaca gctgcagcaa tctggagctg agctagtgaa gcctgggtcc 480tcagtgaaaa tttcctgcaa ggcttctggc tacacattca ccagttacga tatgcactgg 540ataaaacagc agcctggaaa tggccttgag tggattgggt ggatttatcc tggaaatggt 600aatactaagt acaatcaaaa gttcaatggg aaggcaacac tcactgcaga caaatcctcc 660agcacagcct atatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcagt ctatttctgt 720gcaagagatt ggcattacta tagcagctat atccgtccct ttgcttactg gggccaaggc 780actctggtca ctgtctcttc cggaggtggt ggttctgagg tgcagctgct cgagcagtct 840ggagctgagc tggcgaggcc tggggcttca gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac 900accttcacaa actatggttt aagctgggtg aagcagaggc ctggacaggt ccttgagtgg 960attggagagg tttatcctag aattggtaat gcttactaca atgagaagtt caagggcaag 1020gccacactga ctgcagacaa atcctccagc acagcgtcca tggagctccg cagcctgacc 1080tctgaggact ctgcggtcta tttctgtgca agacggggat cctacgatac taactacgac 1140tggtacttcg atgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg tggtggtggt 1200tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt tctgagctcg tgatgaccca gactccactc 1260tccctgcctg tcagtcttgg agatcaagcc tccatctctt gcagatctag tcagagcctt 1320gtacacagta atggaaacac ctatttacat tggtacctgc agaagccagg ccagtctcca 1380aagctcctga tctacaaagt ttccaaccga ttttctgggg tcccagacag gttcagtggc 1440agtggatcag ggacagattt cacactcaag atcagcagag tggaggctga ggatctggga 1500gtttatttct gctctcaaag tacacatgtt ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctt 1560gagatcaaac gtacgactag ccatcaccat caccatcaca ctagctaatt aatttaagcg 1620gccgctctag agtcgac 163721018211532212PRT213人造序列220223人造序列的描述人造序列40018Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala20 25 30Ser Pro Glu Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile35 40 45Gly Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln50 55 60Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Ile Pro Ser Arg65 70 75 80Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile 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Thr Ser His His His His515 520 525His His Thr Ser530
權利要求
1.一種核酸分子，含有編碼一種抗體的可變區的至少一個互補決定區(CDR)的核酸序列，該抗體特異性地與人ζ鏈的胞外域相互作用，該抗體可以通過先用Jurkat細胞，接著用載體分子與含有大鼠ζ鏈N末端11個胺基酸的肽構成的偶聯物免疫大鼠來製取。
2.根據權利要求1所述的核酸分子，它含有編碼所述可變區至少兩個CDR的核酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的核酸分子，它含有編碼所述可變區三個CDR的核酸序列。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的核酸分子，所述的核酸序列編碼VH鏈。
5.根據權利要求1-3中任一項所述的核酸分子，所述的核酸序列編碼VL鏈。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的核酸分子，它是DNA分子。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的核酸分子，所述CDR具有以下核苷酸序列之一(a)SEQ ID No.1；(b)SEQ ID No.3；(c)SEQ ID No.5；(d)SEQ ID No.7；(e)SEQ ID No.9；(f)SEQ ID No.11。
8.根據權利要求4所述的核酸分子，所述的VH鏈具有核苷酸序列SEQ ID No.13或編碼胺基酸序列SEQ ID No.14。
9.根據權利要求5所述的核酸分子，所述的VL鏈具有核苷酸序列SEQ ID No.15或編碼胺基酸序列SEQ ID No.16。
10.根據權利要求1-6中任一項所述的核酸分子，所述CDR編碼以下胺基酸序列之一(a)SEQ ID No.2；(b)SEQ ID No.4；(c)SEQ ID No.6；(d)SEQ ID No.8；(e)SEQ ID No.10；(f)SEQ ID No.12。
11.一種載體，它含有權利要求1-10中任一項所述的核酸分子。
12.一種宿主，它是用權利要求11所述載體轉化或轉染的。
13.一種產生由權利要求1-10中任一項所述核酸分子編碼的肽或多肽的方法，包括在合適的條件下培養權利要求12所述的宿主，和從培養物中分離所述肽或多肽。
14.一種肽或多肽，它是由權利要求1-10中任一項所述核酸分子所編碼的，或是用權利要求13所述方法產生的。
15.一種抗體或其片段或衍生物，它包含至少一種權利要求14所述的肽或多肽。
16.根據權利要求15所述的抗體，它是單克隆抗體。
17.根據權利要求15所述的抗體，它是雙特異性抗體。
18.根據權利要求17所述的抗體，它的第一特異性針對完整細胞表面上人ζ鏈的胞外域，第二特異性針對T淋巴細胞、自然殺傷細胞或它們前體細胞表面上可能的另一種分子。
19.根據權利要求17所述的抗體，它的第一特異性針對完整細胞表面上人ζ鏈的胞外域，第二特異性針對另一種細胞表面上另一種分子，該另一種細胞不是T細胞、NK細胞或它們的前體細胞，該另一種分子是病毒編碼的抗原、腫瘤相關抗原或抗原呈遞細胞(APC)或非APC上的表面抗原，所述APC以樹狀細胞為佳。
20.權利要求15所述抗體的衍生物，它是scFv鏈。
21.根據權利要求16所述的抗體，它是IgM。
22.一種雙特異性受體，它含有權利要求14所述的肽或多肽和一種天然受體、天然配體或它們的衍生物，後者與同一或另一細胞上的一種表面分子相互作用，所述的受體或配體優選CD4、CTLA-4、B7-1、B7-2、LFA-3、ICAM-1、-2、-3或MIP-1α、MIP-1β、RANTES或SDF-1等趨化因子。
23.一種藥物組合物，它含有權利要求1-10中任一項所述的核酸分子，權利要求11所述的載體，權利要求12所述的宿主，權利要求14所述的肽或多肽，權利要求15-21中任一項所述的抗體或其片段或衍生物和/或權利要求22所述的雙特異性受體。
24.權利要求18所述抗體用於製備藥物組合物的用途，所述的藥物組合物用於治療或預防自身免疫病，免疫缺陷，T細胞性惡性腫瘤，感染性疾病，或用於抑制免疫反應以避免例如器官移植後移植物排斥。
25.根據權利要求19所述抗體用於製備藥物組合物的用途，所述的藥物組合物用於治療或預防惡性腫瘤、病毒感染或其他感染性疾病。
26.權利要求14所述肽或多肽，或權利要求15-21中任一項所述的抗體或其片段或衍生物，或權利要求22所述的雙特異性受體用於製備藥物組合物的用途，所述的藥物組合物用於增強或抑制NK細胞依賴性免疫，或用於治療NK細胞衍生的惡性腫瘤。
27.一種測定NK細胞、T淋巴細胞或它們的前體細胞上ζ鏈或η鍊表達的方法，包括(a)權利要求14所述的肽或多肽，或權利要求15-21中任一項所述的抗體或其片段或衍生物與所述NK細胞、T淋巴細胞或它們的前體細胞接觸；(b)測定被結合的肽或多肽、抗體或衍生物的量。
28.一種試劑盒，它包含權利要求1-10中任一項所述的核酸分子，權利要求11所述的載體，權利要求12所述的宿主，權利要求14所述的肽或多肽，權利要求15-21中任一項所述的抗體或其片段或衍生物和/或權利要求22所述的雙特異性受體。
29.一種轉基因動物，它的種系內含有權利要求1-10中任一項所述核酸分子或權利要求11所述載體的至少一份拷貝。
全文摘要
本發明涉及一種核酸分子,其序列編碼一種抗體的可變區的至少一個互補決定區(CDR),該抗體特異性地與人ζ鏈的胞外域反應,該抗體可以通過先用Jurkat細胞,接著用載體分子與含有大鼠ζ鏈N末端11個胺基酸的肽構成的偶聯物免疫大鼠來製取。較好的是,本發明核酸分子所編碼的肽或多肽是一種單特異性或雙特異性抗體。本發明還涉及包含本發明的核酸分子或抗體的藥物組合物,還涉及包含上述化合物的試劑盒。最後,本發明還涉及用本發明抗體測定NK細胞、T細胞或其前體細胞上ζ鏈或η鍊表達的方法。
文檔編號A61P31/00GK1308675SQ99808382
公開日2001年8月15日 申請日期1999年7月9日 優先權日1998年7月10日
發明者C·派特爾 申請人:康納克斯有限公司