應用腫瘤特異性啟動子表達報告基因來檢測循環血中腫瘤細胞的方法和試劑的製作方法

2023-09-22 19:20:50 5

專利名稱：應用腫瘤特異性啟動子表達報告基因來檢測循環血中腫瘤細胞的方法和試劑的製作方法
應用腫瘤特異性啟動子表達報告基因來檢測循環血中腫瘤
細胞的方法和試劑大多數癌症患者死於腫瘤轉移，轉移是指腫瘤細胞通過循環系統從原發部位擴散到遠離部位，並在新的器官中繁殖生長成新的轉移瘤(Ecclesand Welch，2007)。據估計，每克腫瘤組織每天約有106細胞進入血液(Chang et al. ,2000 ；Butler and Gullino，1975)， 不過這其中的大部分很快會清除(Butler and Gullino, 1975 ；Luzzi et al.，1998)。但是，眾所周知，腫瘤細胞的侵入和轉移在早期就會發生，甚至在癌症確診前的很多年就會發生。因此，檢測血液中的循環腫瘤細胞是癌症早期診斷的有效方法(Husemarmet al.,
2008；Gray, 2003 ；Kohn and Liotta，1995)。另外，最近一項研究表明手術前的循環腫瘤細胞(CTC)水平與癌症患者的總存活期存在相關性，而且術前術後循環腫瘤細胞數量的比較可能是治療反應的指示劑(Scher et al. ,2009 ；de Bono et al.，2008)。因此，有效的檢測循環血中腫瘤細胞不僅有益於癌症的早期診斷，而且對預後和治療反應很有幫助。目前檢測循環血中腫瘤細胞的方法有三種1)檢測上皮細胞特異性蛋白的免疫測定；幻基於分子測定的檢測腫瘤或上皮細胞特異性mRNA的PCR方法；幻檢測與癌症有關的染色體畸變或基因擴增的螢光原位雜交。免疫測定是通過使用固定在磁性顆粒上的抗體來捕獲表達某些組織、器官或腫瘤特異性抗原的細胞。由於大多數實體瘤來自上皮細胞源的細胞，因此在上皮細胞中特異性表達的蛋白(如角蛋白 cytokeratins(19，8，18and 20)和 EpCam(Litvinov et al.， 1994))已經被用作區分上皮細胞病和有核血細胞的生物標誌物。但是，這個方法可能會導致一些假陽性或假陰性結果。第一，因為入侵的腫瘤細胞因上皮細胞向間質細胞轉變， 而丟失原有的上皮抗原，這將導致假陰性結果(ffillipinski-Stapelfeldt et al. ,2005 ； Went et al.，2004)。第二，非腫瘤上皮細胞可能會存在於血液中，或者抗體可能會非特異性地與血細胞結合，這將導致假陽性結果。據估計，在正常對照中，約0% -20%的角蛋白 cytokeratin陽性細胞是白細胞(Goeminne etal. ,2000)。同時用血細胞特異性的抗體(如 CD45)對染可能會減少假陽性。抗器官特異性標誌物的抗體，如前列腺特異抗原(PSA)，癌胚抗原(CEA)，mucin-l (MUC-I)，表皮生長因子受體(EGFR)，癌胚蛋白(AFP)，HER-2，也被用來檢測循環腫瘤細胞，不過由於不是所有的腫瘤細胞都表達那些生物標誌物，所以經常會產生假陰性結果。但是此方法的優點是可以用別的方法，如形態學、mRNA或基因擴增測定， 來富集和分析磁性顆粒捕獲的循環血腫瘤細胞。循環血腫瘤細胞也可以通過其物理特性 (如大小和密度)富集。大部分血白細胞(淋巴細胞和中性粒細胞)的大小是8 llum， 而乳腺癌患者血液中腫瘤細胞的平均直徑是四 35um(Meng et al.，2004)。使用螢光原位雜交(FISH)，比較基因組雜交(CGH)和突變分析等染色體組學分析可以進一步證明癌症是相關的染色體畸變、基因擴增、突變的存在(Swermenhuis et al. ,2009 ；Leversha et al. ,2009) 但是這些方法通常費用昂貴，而且耗時。反轉錄 PCR(RT-PCR)，尤其是實時定量反轉錄PCR，是一種敏感的、實際的，用來檢測某些組織或器官(如上面提及的上皮細胞和器官特異性蛋白)的mRNAs特異性的方法(Kitago et al.，
2009； Iakovlevet al.，2008)。此方法可以與免疫測定法結合使用。例如，與免疫磁珠富集的循環血腫瘤細胞可以被進一步分析它們的組織或腫瘤特異性mRNAs的含量。雖然PCR方法在檢測信號方面靈敏度高，但是需要採取嚴格的控制，避免過程中可能會產生的汙染。由於缺乏高腫瘤特異性分子，免疫測定法和定量反轉錄PCR法的應用受到限制， 因此測定循環血腫瘤細胞的存在需要分析多種分子標誌物。我們研發出一種新的檢測血標本和骨髓標本中腫瘤細胞的方法。此方法使用由組織或腫瘤特異性啟動子驅使報告基因表達，達到腫瘤細胞的檢測目的。由報告基因驅使的腫瘤特異性啟動子的表達盒被轉染到血標本和骨髓標本中有核細胞中。然後培養細胞 12-48小時。隨後用不同的方法和試劑檢測報告基因的表達。表達盒運載所用的載體會在腫瘤細胞中，而不是在有核血細胞中有選擇性地擴增或表達，所以檢測出的信號對腫瘤細胞的特異性更高。基於所用的方法和用來檢測報告基因的信號強度可以測定血標本和骨髓標本中的循環腫瘤細胞。此方法可靠，簡單，在檢測血標本和骨髓標本中的循環腫瘤細胞方面特異性高，並且對癌症患者的早期診斷，治療反應的預測及其預後非常有益。可用於此目的的報告基因包括編碼各種螢光蛋白(如綠色、紅色、藍色、黃色、 紫色螢光蛋白)的基因，螢火蟲螢光素酶基因，海腎螢光素酶基因，細菌半乳糖苷酶 (LacZ)基因等。上述報告基因的表達可以由不同的方法檢測。螢光蛋白的表達可以由螢光顯微鏡和螢光激活流式細胞分析法(FACQ檢測。觀察螢光顯微鏡下的細胞可以對細胞的大小和形狀進行分析，這可能有益於進一步區分正常細胞和腫瘤細胞。螢光激活流式細胞分析法可以富集螢光陽性細胞，並進一步採用傳統方法驗證，如用免疫測定法和PCR測定法，進一步確認細胞。生物發光測定法可以檢測螢火蟲螢光素酶基因，海腎螢光素酶基因，細菌半乳糖苷酶(LacZ)基因的表達。啟動子是調控細胞表達的順式序列。有些啟動子不論其組織類型，生物種類，發育階段，在大多數細胞中有活性。這種啟動子叫做泛在啟動子 (ubiquitous promoter)，如巨細胞病毒早期啟動子(CMV)，勞斯肉瘤病毒長末端重複序列 (RSV)，SV40病毒啟動子，PGK和EFl α啟動子。有些啟動子僅在某些類型的細胞中有活性。 例如，白蛋白啟動子主要在肝細胞中有活性，probasin和前列腺特異性抗原啟動子在前列腺組織中有活性。有些基因只在腫瘤細胞中表達，其轉錄調控序列是腫瘤特異性的。但是， 儘管可能這些啟動子在腫瘤細胞中的活性比在正常細胞中的活性高一些，大多數啟動子是組織或細胞型特異性的，而不是腫瘤特異性的。它們僅在一些腫瘤細胞中有活性。如肝癌的甲胎蛋白α，前列腺癌的前列腺特異性抗原(PSA)，胃癌的癌胚抗原(CEA)就是這樣的例子。酪氨酸酶啟動子在黑色素瘤中有活性，mucin-1啟動子在黏膜細胞中有活性。相反，人 survivin基因，端粒體反轉錄酶基因(TERT)，midkine基因在很多種癌症中有活性。組織或腫瘤特異性啟動子已經被用來在一些細胞或腫瘤細胞中的基因特異性表達。例如，這些啟動子已經被用於癌症基因療法中治療基因的腫瘤特異性表達。有時這些啟動子也用於轉基因動物，控制某些特定組織中轉基因的表達。端粒酶是一種特別的反轉錄酶，它負責染色體末端或端粒的複製(Morin，1989 ； Blackburn, 1992)。它在永生化細胞系和85 %人癌細胞中活性很高，但是在分化的正常人體細胞中是沉默的(Kim et al.，1994 ；Counter etal.，1992 ；Shay and Bacchetti，1997)。 越來越多的事實表明端粒體反轉錄酶催化亞基基因(TERT)在活化端粒酶方面扮演重要角色，並且端粒體反轉錄酶基因在原發性腫瘤細胞、多種癌細胞系和端粒酶陽性細胞中的基因表達水平很高(Nakamura et al. , 1997 ；Nakayama et al. , 1998 ；Meyerson et al., 1997)。因此，人端粒體反轉錄酶基因啟動子可以作為廣泛適用的腫瘤特異性啟動子。體外研究表明人端粒體反轉錄酶基因啟動子在人和鼠的肺癌、肝癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌、 腦癌的癌細胞中活性很高(Gu et al. ,2000 ；Gu et al. ,2002a ；Gu et al. ,2002b ；Huang et al.，2002 ；Lin et al. ,2002a ；Lin etal.，2002b)，在正常人纖維母細胞中(Gu et al.， 2000)、正常人氣管(Gu et al.，2000)、乳房(Lin et al.，2002b)、卵巢(Huang et al.， 2002)的上皮細胞中、正常人原代肝細胞中(Lin et al.，200 )、正常人⑶34+祖細胞中 (Gu et al.，200 )、正常鼠纖維母細胞(Gu et al. ,2002a)中沒有活性。端粒酶啟動子也被用來控制條件複製型病毒(包括溶瘤腺病毒)所需的病毒基因表達(Daviset al.，2006 ； Huang et al. ,2004 ；Irving et al.，2004)。端粒酶特異性溶瘤腺病毒可在腫瘤細胞中複製，於是會增加報告基因的拷貝量或表達水平，增加檢測信號。通常組織特異啟動子的活性較弱。為了提高啟動子的轉錄激活性，同時保留其細胞特異性，研究者可以通過組合不同啟動子的序列來設計啟動子，從而形成混合型或嵌合型的啟動子。使用最為廣泛的是CAG啟動子，它是結合了巨細胞病毒早期基因的增強子，雞肌動蛋白基因啟動子和兔子球蛋白基因剪接受體序列。這種混合型的啟動子通過一些病毒或非病毒載體，驅使了許多基因在各種組織中的高表達。巨細胞病毒增強子的另一個運用是結合了組織特異啟動子以加強目的基因的組織特異性的表達。例如，把巨細胞病毒增強子加入到端粒酶逆轉錄酶啟動子中，將會加強端粒酶逆轉錄酶啟動子的活性並且保留它的特異性。我們使用的基因工程的啟動子包括端粒酶逆轉錄酶啟動子序列和巨細胞病毒增強子，用於驅使報告基因的表達。甚至是任何一種的組織和腫瘤特異性啟動子，或者是他們的嵌合型啟動子都能被用來代替端粒酶逆轉錄酶/巨細胞病毒嵌合啟動子。組織或腫瘤特異性啟動子的活性也可以通過二元表達系統來加強，其中的弱腫瘤特異性啟動子被用來表達強活性轉錄因子，例如GAL4-VP16融合蛋白，該轉錄因子接著啟動第二個啟動子來驅使目的基因表達。這種方法可以在不減少啟動子特異性的情況下，增加弱腫瘤特異性啟動子活性，有時可超過100多倍(Koch et al 2001)。GAL4-VP16體系已經成功地用於增強癌胚抗原和端粒酶逆轉錄酶啟動子的活性。這些二元體系也將提高報導基因在腫瘤細胞中的表達，有助於檢驗循環血中腫瘤細胞。啟動子，基因和多聚腺苷酸信號序列，這三個要素是報告基因和其他任何靶基因在哺乳動物細胞中表達成功的必要因素。這三個部分在單一 DNA片段中順序排列叫做「表達盒」。多聚腺苷酸信號序列對組織細胞通常是非特異性的。因此，理論上來說，來自於任何基因的多聚腺苷酸信號序列都可用在表達盒中。通常使用的多聚腺苷酸信號序列來自於牛生長素基因，猿猴病毒40大T抗原基因，球蛋白基因和一些病毒基因。一個表達盒通常會和一個載體DNA連在一起，轉染靶細胞，用於基因表達，例如在循環血腫瘤細胞中表達。一個能被用來轉染細胞，用於表達核酸序列的載體核酸分子，被稱之為載體。載體包括質粒，粘粒(cosmid)，病毒(噬菌體，動物病毒，植物病毒)和人工染色體，例如酵母人工染色體。表達盒能通過標準的重組技術克隆到載體。質粒能通過不同的方法轉染到哺乳動物的細胞，例如，物理性的電穿孔法，和化學性的類脂和轉染試劑。質粒，粘粒和人工染色體屬於非病毒載體。某些病毒通過受體介導的內吞作用有效地轉染或者進入細胞，並表達報告基因，這使得它們成為了轉移外來核酸進入細胞(例如哺乳動物的細胞)的常用載體。用來轉染報告基因或者其他任何基因進入細胞的病毒叫做病毒載體。通常使用的病毒載體來自腺病毒，腺相關病毒(AAV)，逆轉錄病毒，慢病毒的逆轉錄病毒(特定類型)，牛痘病毒，巨細胞病毒和單純皰疹病毒等。有些病毒載體只能在包裝(製備)細胞中複製，並不能在其它靶細胞中複製。這些病毒稱為複製缺陷型載體。大多數逆轉錄病毒載體，慢病毒載體，腺相關病毒載體，和El缺失腺病毒載體都屬於有複製缺陷型載體。有些病毒載體，能夠在某些種類的靶細胞中複製， 但是不能在其他種類的細胞中複製。他們被稱為有條件複製能力的載體。舉例來說，溶瘤病毒能夠在腫瘤細胞中複製，但不能在其他正常的細胞中複製。溶瘤病毒之所以有這種細胞特異性複製能力，是因為一些病毒基因發生突變，或腫瘤特異性啟動子取代了病毒啟動子， 從而使一些病毒複製必需基因只能在腫瘤細胞中表達。用端粒酶逆轉錄酶啟動子代替腺病毒El啟動子，能導致溶瘤腺病毒在具有高端粒酶逆轉錄酶活性的癌細胞中複製(Davis et al. ,2006 ；Huang et al. ,2004 ；Irving et al.，2004)。複製缺陷型和條件複製型病毒載體，只要它們帶有一個被腫瘤特異性啟動子驅使的報告基因，就能夠被用於循環血腫瘤細胞的檢驗。有些病毒載體被進一步進行了修改，改變了其表面的蛋白，使其具有靶向性和轉染某些特定的細胞。更改病毒細胞表面蛋白，能加強它們在一些腫瘤細胞中的傳染性。例如，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列能夠和腺病毒纖維蛋白整合在一起，因此，腺病毒可以不通過腺病毒受體來傳染細胞(Wiclcham 2000)。這些被更改過的載體能有效地檢驗循環血腫瘤細胞和低腺病毒受體水平的細胞。為了通過對報告基因的表達的分析，來檢驗循環血腫瘤細胞，報告基因應該僅在腫瘤細胞中表達，或者在被檢驗的細胞中表達，而不能在正常的血細胞中表達。例如不能在中性粒細胞，淋巴細胞和血小板中表達。兩種方法可以用來實現這種選擇性報告基因的表達，1)定向性的基因轉染和2、選擇性基因的表達。定向性的基因轉染是通過選擇特定類型的載體和轉染方法來實現的，所以載體只能進入腫瘤細胞，上皮細胞和被檢驗的細胞。一些病毒載體就具有此類細胞特異性轉染能力。舉例來說，腺病毒通常不會感染白血細胞，因此，報告基因不會進入白血細胞。當分析報告基因表達時，這些細胞會保持陰性。選擇性基因表達能通過使用腫瘤啟動子或者特定細胞類型啟動子來實現。因此，即使報告基因被轉染到正常的血細胞中，其也不會被表達，並且，正常血細胞會保持陰性。腫瘤細胞，上皮細胞的特定啟動子就可用於報告基因在腫瘤細胞或上皮細胞中表達，而不在血細胞中表達。例如端粒酶逆轉錄酶啟動子，生存素啟動子，probasin啟動子，MUCl啟動子，癌胚抗原啟動子，甲胎蛋白啟動子，酪氨酸酶啟動子，和其嵌合性的啟動子都可用於此目的。通過腫瘤和組織特異性啟動子驅動的報告基因的表達，來檢驗循環血腫瘤細胞的方法包括以下一些步驟，每一步驟應該採取保護措施來防止樣本汙染和保持樣本無菌。1.用抗凝血劑採集血液樣本(5毫升-10毫升)，放入無菌管中。通常使用的抗凝血劑是乙二胺四乙酸和肝素。任何抗凝血劑，只要可以防止血液凝固的都可以使用，只要他們不會對以後的細胞培養產生副作用。2.對血液樣本進行處理，除去紅細胞。這可以通過梯度離心分離法，穿過聚蔗糖的方案解決，或用75-200毫摩爾氯化銨來溶解紅細胞等，包括用其他藥劑來減少對有核細胞的危害。可重複溶解的過程以達到紅細胞的完全溶解。用此兩種方法分離的有核細胞應該用磷酸鹽緩衝鹽水(PBQ或培養基清洗2-3次。3.用攜帶有腫瘤或者組織特異性啟動子驅動的報告基因的表達載體轉染細胞，接著將細胞培養在培養基中培養。培養時間取決於所用的表達載體和所用的報告基因表達和檢測方法。有時，基因轉染和細胞培養可同時進行。4.任何用於培養哺乳動物細胞的培養基都可用於此項用途。例如RPMI-1640， MEM, DMEM等培養基。培養基常常會被補充以5%-20%胎牛血清或小牛血清。培養基還可以補充以抗生素，如氨苄青黴素(50-200單位/毫升)和/或鏈黴素(50-200微克/毫升)。培養基能夠被直接添加到含表達載體的溶液中。細胞被置於細胞培養箱中培養過夜， 或24-48小時。5.分析檢測細胞樣本中表達報告基因的細胞。取決於報告基因的性質，用不同分析方法檢測表達報告基因的細胞。對於螢光蛋白，螢光顯微鏡，螢光激活流式細胞分析儀可用於檢測表達螢光蛋白的陽性細胞。對螢光素酶和半乳糖苷酶檢測，可使用生物發光和酶活性測定。至關重要的是，在正常值建立之前，對照組應該包括在測定中。陽性對照樣品和陰性對樣品都應在測試開始時就使用。具體地，本發明提供下列技術方案在一個方面中，本發明提供一種腫瘤特異性啟動子，其在腫瘤細胞中的活性比其在正常細胞中的活性要高。在第一方面的一個實施方案中，所述腫瘤特異性啟動子包括人端粒酶逆轉錄酶啟動子，survivin啟動子，medkine啟動子，癌胚抗原啟動子，MUC-I啟動子和probasin基因啟動子。在第一方面的一個實施方案中，所述端粒酶逆轉錄酶啟動子序列如SEQ ID NO :1所顯示。在第一個方面的一個實施方案中，所述腫瘤特異性啟動子可以是組織或者細胞型特異性基因的原啟動子，也可以是經改造的組合啟動子。在第一個方面的一個實施方案中，所述所述組合啟動子是含有源自組織或細胞型特異性啟動子的序列和源自其他啟動子的增強子的嵌合型啟動子。在第一方面的一個實施方案中，所述嵌合型啟動子是TC嵌合啟動子，其包含人體端粒酶逆轉錄酶啟動子和巨細胞病毒增強子。在第一個方面的一個實施方案中，其中所述嵌合啟動子序列如SEQ IDNO :8所顯示。在第二個方面中，本發明提供一種載體，其是包括由第一方面的腫瘤特異性啟動子驅使表達的報告基因基因表達載體。在第二個方面的一個實施方案中，其中提及的報告基因是一種通常作為啟動子活性指示劑的基因。在第二個方面的一個實施方案中，其中所述報告基因包括螢光蛋白(綠色，紅色，黃色和藍色螢光蛋白)的基因，螢火蟲螢光素酶基因，海腎螢光素酶基因，細菌半乳糖苷酶(LacZ)基因。在第二個方面的一個實施方案中，其中所述基因表達載體指任何一種用於基因轉染的載體。在第二個方面的一個實施方案中，其中所述基因表達載體包括質粒，質粒/脂質複合物以及病毒載體。在第二個方面的一個實施方案中，其中提及的病毒載體是指複製缺陷型病毒載體和可複製型病毒載體，例如腺病毒載體，可複製型腺病毒載體，皰疹病毒載體，牛痘病毒載體等。在第二方面的一個實施方案中，所述腺病毒載體是第5型人腺病毒。本發明提及的腺病毒載體是在穩定腺病毒載體活性的緩衝液中配製的。緩衝液含Tris，NaCl, EDTA，乙醇，組氨酸，蔗糖。在第二個方面的一個實施方案中，其中所述病毒載體是經過病毒纖維改進後的。在第二個方面的一個實施方案中，其中所述病毒纖維改進是通過將編碼精氨酸-甘油酸-天冬氨酸(RGD)序列插入到位於圖距單位86-91的腺病毒基因組中，從而使病毒纖維蛋白含RGD序列，改變其受體特異性，改進後的載體可經整合素蛋白進入靶細胞。在第二個方面的一個實施方案中，其中組織或腫瘤特異性啟動子的活性通過二元表達系統來加強。 在第二個方面的一個實施方案中，所述二元表達系統應用綠色螢光蛋白/TRAIL融合基因。 在第二個方面的一個實施方案中，所述綠色螢光蛋白/TRAIL融合基因如SEQ ID NO :5所顯示。在第二個方面的一個實施方案中，其中提及的基因表達載體包括可複製型腺病毒載體 Ad/El-GFP 和 Ad/El-GFP-RGD，複製缺陷型腺病毒載體 Ad/TERT_GFP，Ad/TERT-LacZ, Ad/ GFP-TRAIL 和 Ad/TERT-Luciferase。在第三個方面中，本發明提供一種試劑盒，其用於癌症患者的早期診斷，治療反應的預測及其預後，其包含第一方面的腫瘤特異性啟動子和/或第二個方面的載體。在第三個方面中的一個實施方案中，所述試劑盒用於檢測血標本和骨髓標本中的腫瘤細胞。在第四個方面中，本發明提供一種診斷劑，其用於癌症患者的早期診斷，治療反應的預測及其預後，包含第一方面的腫瘤特異性啟動子和第二個方面的載體。在第四個方面的一個實施方案中，所述診斷劑用於檢測血標本和骨髓標本中的腫瘤細胞。在第五個方面中，本發明提供第一方面的腫瘤特異性啟動子用於製備第二個方面的載體以及第三方面的試劑盒和第四方面的診斷劑的應用。


圖1，比較LacZ基因在正常細胞(NHBE，NHLF，⑶;34+)，正常組織(脾和肝)及癌細胞(H1299，AM9，UV-2237M)中的表達。細胞或小鼠用相同劑量的腺病毒載體(Ad/CMV_GFP， Ad/CMV-LacZ, Ad/hTERT-LacZ))轉染。用Χ-gal染色法檢測LacZ基因(β -半乳糖苷酶) 活性。陽性細胞為藍色。細胞名稱列於左側。上方為所用載體，右方提示細胞(組織)屬性，正常或癌細胞。圖2，癌細胞(HU99，A549，L0V0，DLD1)和正常細胞(OKM+，NHFB，NHBE)用相同劑量的腺病毒載體(Ad/CMV-GFP，Ad/CMV-LadZ，Ad/hTERT-LacZ)轉染後，用發光法分析β-半乳糖苷酶活性。β-半乳糖苷酶活性用相對光強度(relative light units (RLU) / μ g蛋白)表示。所示值為三次分析的均值+標準差(SD)。圖3.由腺病毒載體Ad/hTERT-gBax介導的GFP-Bax融合基因在腫瘤中的特異表達。左側，腫瘤細胞(H1299，AM9，H322，H358)和正常成纖維細胞(NHFB)用相同劑量的Ad/ CMV-GFP或Ad/TERT-GFP/Bax (2000病毒顆粒/細胞)轉染，48小時後在螢光顯微鏡下觀察 GFP或GFP/Bax的表達。CMV驅動的GFP在所有細胞中都表達，而TERT驅動的GFP-Bax僅在腫瘤細胞中表達，而不在NHFB中表達。右側，帶瘤小鼠用Ad/CMV-GFP或Ad/TERT_GFP/ Bax治療後腫瘤和肝GFP和GFP-Bax，Bax的表達。Bax表達用免疫組化法檢測。細胞調亡用TUNEL法檢測。GFP-Bax和Bax僅在腫瘤中表達並引起調亡，但不在正常肝組織中表達。圖4.上方，腺病毒載體Ad/gTRAIL示意圖.腺病毒El區(map unit 1. 3-9. 3)被由GT啟動子表達GFP/TRAIL的表達盒和由TERT啟動子表達Gal4/GV16的表達盒取代。下方，腫瘤細胞(DLD-I)和正常細胞(NHFB)用相同劑量的Ad/CMV-GFP或Ad/gTRAIL轉染，48 小時後觀察GFP或GFP-TRAIL的表達及細胞狀態。GFP-TRAIL僅在DLDl細胞中表達並殺死細胞。圖5。TERT/CMV(TC)融合啟動子示意圖。本圖含TC-GFP表達盒。TC啟動子序列見SEQ ID NO:8。圖6，條件複製型腺病毒(Ad/GFP-El)示意圖(上方)及其El基因在正常細胞 (NHFB)和腫瘤細胞(MiaPaca2, H1299, DLD1)中的表達。Ad/GFP-El由TC啟動子驅動GFP 和El。El蛋白表達用蛋白印跡法(Western blot)檢測。圖7。條件複製型腺病毒(Ad/ GFP-E1)攜帶的GFP基因在腫瘤細胞(HU99)和正常細胞(NHFB)中的表達(左側)，圖上方為轉染劑量。右側，條件複製型腺病毒(Ad/GFP-El)攜帶的GFP基因在實體腫瘤中的表達。圖8，纖維蛋白修飾後的條件複製型腺病毒(Ad/GFP-El-RGD)。上方，病毒載體示意圖，與圖6所示相同，由TC啟動子驅動GFP和E1。但病毒的纖維蛋白含RGD序列。下方，比較Ad/CMV-GFP，Ad/GFP-El, Ad/GFP-El-RGD在實體瘤中的表達。將病毒載體注射到實體瘤中，兩周後觀察GFP表達。Ad/GFP因不能在腫瘤中複製，隨腫瘤增長而表達消失。 Ad/GFP-El, Ad/GFP-El-RGD均有GFP在腫瘤中表達，而不在周圍正常細胞中表達。但Ad/ GFP-El-RGD的GFP表達更高。圖9，正常血樣，加腫瘤細胞(上方)與不加腫瘤細胞(下方)，分別用Ad/GFP-El， 和Ad/GFP-El-RGD轉染，24小時後在螢光顯微鏡下觀察GFP表達。GFP陽性細胞僅在加腫瘤細胞的血樣中，而不在無腫瘤細胞的血樣中。圖10。比較正常人(normal)與腫瘤(肺癌)患者的血樣。各取5毫升血，分離白細胞，並用Ad/GFP-El轉染白細胞二4小時後在鏡下觀察細胞。左側，螢光鏡(黑白照)，右側，普通鏡，但相通視野。正常血樣中無GFP陽性細胞，而肺癌患者血中則有GFP陽性細胞 (腫瘤細胞)。圖11是Ad/CMV-LacZ的圖譜。第5型人腺病毒的El基因G56bp-322m3p，圖譜單位1.3-9. 3)被刪除，並在該區域插入一基因表達盒(如圖所示).AD/TERT-LacZ的表達盒含有TERT啟動子，LacZ基因(LacZ)和牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpA)。第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方。圖12是Ad/TERT-LacZ的圖譜。第5型人腺病毒的El基因056bp-3228bp，圖譜單位1.3-9. 3)被刪除，並在該區域插入一基因表達盒(如圖所示).AD/TERT-LacZ的表達盒含有TERT啟動子，LacZ基因(LacZ)和牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpA)。第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方。圖13是Ad/TERT-Bax的圖譜。第5型人腺病毒的El基因056bp-3228bp，圖譜單位1. 3-9. 3)被刪除，並在該區域插入雙基因表達盒(如圖所示).AD/TERT-Bax的雙表達盒含有TERT啟動子，TetR-GV16基因(TetR_GV16)，牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpA)， TRE 啟動子，GFP/Bax 基因(GFP/Bax)，和 SV40 多聚 A 信號序列(sv40polyA)。第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方。TERT =人端粒酶逆轉錄酶基因啟動子TRE =四環素反應因子啟動子TetR =四環素抑制蛋白圖14是Ad/TERT-gTRAIL的圖譜。第5型人腺病毒的El基因056bp-3228bp，圖譜單位1.3-9. 3)被刪除，並在該區域插入雙基因表達盒(如圖所示).AD/TERT-gTRAIL的雙表達盒含有TERT啟動子，GAL4-GV16基因(GAL4-GV16)，牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpA)，GT 啟動子，GFP/TRAIL 基因(GFP-TRAIL)，禾口 SV40 多聚 A 信號序列(sv40polyA)。TERT =人端粒酶逆轉錄酶基因啟動子GT = GT 啟動子，含 GAL4/TATA 序列第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方。圖15是Ad/GFP-El的圖譜。第5型人腺病毒的El基因啟動子(45 - ,圖譜單位1.3-1。5)被刪除，並在該區域插入一基因表達盒(如圖所示).AD/GFP-E1的表達盒含有TC啟動子，GFP基因(GFP)，牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpolyA)。接著又是TC啟動子，並由它控制El基因的表達。TC = TC啟動子，含人端粒酶逆轉錄酶基因啟動子和CMV增強子序列。第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方。圖16是AD/CMV-GFP的圖譜。第5型人腺病毒的El基因G56bp-322m3p，圖譜單位1.3-9. 3)被刪除，並在該區域插入一基因表達盒(如圖所示).AD/CMV-GFP的表達盒含有CMV啟動子，綠色螢光蛋白基因(GFP)和牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpA)。第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方圖17是Ad/GFP-El-R⑶的圖譜。第5型人腺病毒的El基因啟動子(45 - , 圖譜單位1.3-1。5)被刪除，並在該區域插入一基因表達盒(如上圖所示).AD/GFP-E1-RGD 的表達盒含有TC啟動子，GFP基因(GFP)，牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpolyA)。接著又是TC啟動子，並由它控制El基因的表達。本載體的病毒纖維蛋白被改進，含RGD序列。TC = TC啟動子，含人端粒酶逆轉錄酶基因啟動子和CMV增強子序列RGD = Arg-Gly-Asp胺基酸序列，它被插入到圖譜單位約86-91的腺病毒纖維蛋白基因中，這使表達的纖維蛋白含⑶CRGDCFC胺基酸序列。第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方。本發明將通過下列具體實施方式
進一步舉例說明，但需要注意的是本發明並不限於所述實施例。本發明的範圍僅由後附的權利要求限定。
實施例材料與方法本發明所用的具體的腺病毒載體為第5型人腺病毒(human adenovirustype 5)， 構建腺病毒載體的質粒可以購自Stratagene公司(http://www. stratagene. com/lit/ vector, aspx) (catalog#240010)或 CellBiolabs, Inc.公司(http://www. cellbiolabs. com)(catalog#VPK-250)。下述實施例中所述的腺病毒載體(構建腺病毒載體的質粒來自Mratagene 公司，catalog#240010)構建方法與文獻報導相同，(見文獻FangB，Eisensmith RC, Li XHC, Finegold MJ, Shedlovsky A, Dove W, Woo SLC. Gene Therapy for Phenylketonuria :phenotypic correction in a geneticallydficient mouse model by adenovirus-mediated hepatic gene transfer. GeneTherapy 1; 1994)。 一般先用分子克隆技術將目的基因的表達盒，如TERT-GFP，插入到一穿梭質粒中(shuttle plasmid)。使該表達盒的倆端分別含有一小段來自重組腺病毒的DNA序列。再將穿梭質粒和另一含有幾乎全部或極大部分重組腺病毒載體序列的質粒(如PJM17，pBHGlO)，共轉染到293細胞中。將細胞在培養箱中培養1 2周。穿梭質粒與PJM17或pBHGlO會在四3細胞中發生同源重組，形成重組的腺病毒載體。再用多聚酶鏈反應法或檢測目的基因表達的方法來檢測所得到腺病毒是否是所需要的重組腺病毒載體。最後，提取腺病毒的DNA進行序列分析，進一步驗證重組腺病毒載體重組部位的序列。實施例1.端粒酶逆轉錄酶啟動子(端粒酶逆轉錄酶)驅動腫瘤特異性報告基因 LacZ的表達。圖1顯示，比較人類端粒酶逆轉錄酶啟動子和巨細胞病毒啟動子驅動報告基因 LacZ的表達。在實驗中，我們用載有378bp長的端粒酶逆轉錄酶核心啟動子(SEQID NO 1)驅動的LacZ基因(SEQ ID NO 2)的複製缺陷型人腺病毒載體(Ad/TERT-LacZ)(該載體是經重組DNA技術而構建(Gu et al,2000)構建的載體圖譜見圖12)感染(具體的感染方法見Gu J et al,2000)正常或腫瘤細胞。將載有CMV啟動子(SEQ ID NO 9)驅動的LacZ 基因的腺病毒載體(Ad/CMV-LacZ)(其構建方法見Gu et al，2000，啟動子、LacZ基因在載體上的排列見所附載體圖譜圖11)用作陽性對照。病毒感染單位為1000顆粒/細胞。培養的人體肺癌細胞株(H1299和A549)，小鼠纖維肉瘤細胞(UV-2237)，正常的人體成纖維細胞(NHLF)，⑶34+間質主細胞，正常的人體支氣管上皮細胞(NHBE)(購自American Type CultureCollection或Clonetics Corp (San Diego, CA)，用相同劑量的腺病毒顆粒感染細胞M小時後，用X-gal染色法分析半乳糖苷酶活性(具體方法見Gu J etal，2000)。X-gal 染色法分析顯示，在所有癌細胞株中，CMV啟動子和端粒酶逆轉錄酶啟動子都能驅動較強的 β -半乳糖苷酶表達。而在兩個正常的細胞株裡，只有感染了 Ad/CMV-LacZ病毒的細胞產生了高水平的LacZ基因表達(將近100% )(圖1)。用同樣藥劑量的Ad/TERT-LacZ病毒感染的正常細胞僅僅產生了非常少的LacZ-陽性細胞。在所有細胞的檢測中，在癌細胞裡的端粒酶逆轉錄酶啟動子的活性顯著高於在正常細胞中的(P ^ 0. 05)。同樣的結果也出現在對小鼠的實驗中。將^clOici腺病毒載體注入小鼠尾靜脈，兩天後將小鼠處死，並取各器官進行半乳糖苷酶活性分析。注射生理鹽水的小鼠用作背景對照品。在注射Ad/CMV-LacZ病毒的小鼠肝臟和脾臟裡檢測(具體方法見Gu J et al, 2000)到了高水平的β-半乳糖苷酶活性。在用Ad/CMV-LacZ病毒處理的小鼠的其他器官裡，酶的活性和背景對照品(即注射生理鹽水的小鼠)保持一致。在對比後可發現，在注入 Ad/TERT-LacZ的小鼠肝臟，脾臟和其他小鼠的器官中的酶的活性，都在背景對照品所見的範圍之內。說明Ad/TERT-LacZ的報導基因表達與經磷酸鹽緩衝液，對照載體處理的小鼠相同。(結果詳見圖1)實施例2.端粒酶逆轉錄酶啟動子和巨細胞病毒啟動子活性的比對用磷酸鹽緩衝液，對照載體(Ad/CMV-GFP)(構建方法見Gu et al. ,2000.載體圖譜見附圖16),Ad/TERT-LacZ(圖12)或Ad/CMV-LacZ.(圖11)轉染(即在細胞培養液中加入磷酸鹽緩衝液或重組腺病毒顆粒(1000病毒顆粒/細胞))癌細胞(HU99，A549, Lovo, 和DLD1)和正常細胞(人體成纖維細胞(NHFB)，CD34+間質主細胞，正常的人體支氣管上皮細胞(NHBE))(購自Clonetics Corp (San Diego, CA))。用β -半乳糖苷酶活性分析法檢驗LacZ表達(具體方法見Gu et al，2000)。來自於巨細胞病毒或端粒酶逆轉錄酶啟動子的半乳糖苷酶活性，在癌細胞中只相差了 2-10倍。但是，在正常的細胞中，它們卻相差超過500倍。結果詳見圖2。
實施例3. CMV啟動子和端粒酶逆轉錄酶啟動子驅使綠色螢光融合蛋白的表達同樣的結果也在巨細胞病毒(CMV)啟動子和端粒酶逆轉錄酶啟動子驅使綠色螢光融合蛋白的實驗中獲得。 用Ad/CMV-綠色螢光蛋白(Ad/CMV-GFP)(圖16)或Ad/TERT-綠色螢光蛋白/ Bax (Ad/TERT-GFP/Bax)(圖 13)轉染人肺癌細胞(H1299, A549, H322 和 H!358)，即在細胞培養液(MEM或DMEM)中加入1000病毒顆粒/細胞。Ad/CMV-GFP(圖16)禾口 Ad/TERT-GFP/ Bax (具體構建方法見Gu etal.，2002b.載體圖譜見附圖1 均為複製缺陷型腺病毒載體， 由它們各自的表達盒(CMV-GFP (GFP基因序列見SEQ ID NO 3)或TERT_GFP/Bax (GFP/Bax 基因融合序列見SEQ ID NO :4))插入並取代腺病毒El區(見所附在圖譜)而構建的，表達盒的啟動子見基因所附序列(TetR和TRE序列，編號為SEQ ID NO 11和12)。轉染後的細胞經培養(37°C，5% CO2，培養液為含10%小牛血清的DMEM) 24-48小時，可在螢光顯微鏡(Olympus)下檢測到綠色螢光蛋白和綠色螢光蛋白-Bax融合蛋白的表達。圖3顯示，巨細胞病毒-綠色螢光蛋白能在所有癌細胞(H1299，AM9，H322和H358)和正常細胞(NHFB) 中表達。但是，端粒酶逆轉錄酶-綠色螢光蛋白只能在癌症細胞裡表達，而不能在正常的 NHFB細胞裡表達。在小鼠體內的測試也得到了同樣的結果(具體的測試方法見Gu et al., 2002b)。將切101(1腺病毒載體注入小鼠尾靜脈或小鼠的腫瘤中，兩天後將小鼠處死，取其肝臟組織或腫瘤組織，冷凍切片後螢光顯微鏡(Olympus)下觀察。CMV-GPF在腫瘤組織和正常的肝臟組織裡得到表達。但是，TERT-GFP/Bax只在腫瘤組織裡得到表達。這些結果表明腫瘤特異的報告基因或目的基因表達是通過端粒酶逆轉錄酶啟動子獲得的，結果如圖3。實施例4.用二元表達系統進行腫瘤特異性基因表達應用綠色螢光蛋白/TRAIL融合基因(GFP/TRAIL其序列見SEQ IDNO 5)觀察腫瘤細胞特異性基因表達。這顯示說明書中提到的二元表達系統進行腫瘤特異性基因表達。在這種情況下，Gal4/VP16融合轉錄因子(其序列如SEQ ID NO 6所示)被用來增強腫瘤特異性基因表達。端粒酶逆轉錄酶啟動子被用來驅動fel4/VP16表達。被表達的 Gal4/VP16再激活它的靶啟動子Gal4/TATA(GT)(其序列如SEQ ID NO 7所示)啟動子，後者用於驅使綠色螢光蛋白-TRAIL的表達。這個二元表達系統的好處是，轉基因表達水平可顯著增強(超過100倍)，但啟動子的特異性卻被保留(Koch et al 2001)。如圖4所見，將由GT啟動子表達GFP/TRAIL的表達盒和由TERT啟動子表達feil4/ GV16的表達盒一起插入腺病毒El區，構建成載體Ad/gTRAIL(具體的載體圖譜見圖4和圖14。這兩個表達盒以頭尾方式相連接。從右到左，依次為GT啟動子-GFP/TRAIL融合基因-SV40多聚A信號-TERT啟動子-GAL4/GV16轉錄因子基因-牛生長基因多聚A信號)。 用Ad/gTRAIL和Ad/CMV-GFP (對照載體)分別轉染(轉染劑量為500 2000moi)結腸癌細胞DLDl和正常成纖維細胞(NHFB)，培養M-48小時後觀察綠色螢光蛋白(GFP或GFP/ TRAIL)的表達及細胞形態。CMV-GFP在癌細胞和成纖維細胞中均表達，但不引起細胞死亡。 而Ad/gTRAIL僅在癌細胞DLDl得到表現並將細胞殺死，卻不在成纖維細胞中表現。實施例5.構建TC嵌合啟動子TC嵌合啟動子包含人體端粒酶逆轉錄酶啟動子和巨細胞病毒增強子(其具體序列如SEQ ID N0:8所示)。這種嵌合式啟動子具有端粒酶逆轉錄酶啟動子的特異性，並且啟動子的活性也比野生型的端粒酶逆轉錄酶啟動子要強很多。嵌合啟動子包括了相應的端粒酶逆轉錄酶的起始密碼子之前的鹼基對(-456到-2(基因庫編號僅2192幻)和巨細胞病毒啟動子的小片段增強子序列，即人體巨細胞病毒早期蛋白起始密碼子的-1017到-901序列(基因庫編號M21925)。這種嵌合式啟動子被命名為TC啟動子(SEQ ID NO :8)。圖5 中顯示的是質粒結構，其包括了驅使於綠色螢光蛋白表達盒的TC啟動子。實施例6.條件複製型腺病毒表達報告基因綠色螢光蛋白(Ad/GFP-El)。綠色螢光蛋白基因和腺病毒El基因均由TC嵌合性啟動子(見實施例幻驅使。Ad/GFP-El的構建是將TC-GFP表達盒(表達盒具體的構建見Davis JJet al， 2006)插入到腺病毒El區之前，用TC啟動子取代腺病毒El啟動子(即將TC啟動子序列插入到El基因的上遊，圖譜見附圖15)。用同樣劑量(IOOOmoi)的Ad/GFP-El轉染成纖維細胞(NHFB)和癌細胞(MiaPaca2(購自ATCC. ORG)，DLDl和HU99，M-48小時後用蛋白印跡法 (Western blot)檢測El蛋白的表達(具體方法見Davis JJ et al.，2006)，或在螢光顯微鏡下觀察GFP表達。可見條件複製型腺病毒能在癌細胞裡表達綠色螢光蛋白和E1A，但是不能在正常的細胞裡表達這些基因，例如不能在正常的纖維原細胞(NHFB)表達這些基因(見圖6和圖7)。當細胞被載有CMV-GFP的病毒載體(Ad/CMV-GFP，CMV啟動子驅動綠色螢光蛋白的表達)感染時，癌細胞(HU99)和正常細胞(NHFB)都表達綠色螢光蛋白。但是，當細胞被Ad/GFP-El感染時，只有H1299細胞表達綠色螢光蛋白。NHFB細胞不表達綠色螢光蛋白(圖7)。同樣的，當Ad/GFP-El被注入到腫瘤裡，只有腫瘤能表達綠色螢光蛋白，而腫瘤周圍的正常的組織卻不能表達(圖7)。實施例7.纖維蛋白修飾的條件複製型腺病毒載體病毒纖維改進後的條件複製型腺病毒表達報告基因綠色螢光蛋白(Ad/ GFP-E1-RGD)(圖 17)。在圖8中的條件複製型腺病毒和在圖6裡的是(見上述實施例6) —樣的，但是它的表面纖維蛋白被修改。編碼精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列被插入到位於圖距單位86-91的腺病毒基因組中，從而使病毒纖維蛋白頭部(knob)含有(RGD)序列(見所附腺病毒纖維蛋白基因序列，如SEQID N0:10所顯示)。這種腺病毒能感染含低水平的腺病毒受體或不含腺病毒受體的腫瘤細胞。圖8就是對照載體(Ad/CMV-GFP)，Ad/GFP-El和Ad/ GFP-El-RGD在腫瘤中的綠色螢光蛋白的表達。先將小鼠纖維肉瘤細胞(UV-2237)接種在小鼠腿部，在其形成腫瘤後(約一周左右)，將相同劑量(5xl09病毒顆粒/小鼠)的Ad/CMV-GFP (對照載體)，Ad/GFP-El和Ad/ GFP-El-RGD注射到腫瘤內，兩周後觀察GFP在腫瘤和腫瘤周圍正常組織中的表達，結果顯示，在被Ad/GFP-El-RGD感染的腫瘤裡，綠色螢光蛋白比較強。注，周圍正常組織沒有報告基因能表達。實施例8.在血液樣本中檢驗腫瘤細胞。測試腺病毒能否通過嵌合式的TC啟動子表達綠色螢光蛋白被用來檢測腫瘤細胞。把100個人體腫瘤細胞(培養的人肺癌細胞HU99)加入到5毫升正常的人體血液樣本裡。血液樣本用低滲氯化銨溶液溶解去除紅血細胞。用磷酸鹽緩衝液把白血細胞清洗三次，然後用IxlO4病毒顆粒的Ad/GFP-El或Ad/GFP-El-RGD感染細胞(即在0. 5ml培養液中加入IxlO4病毒顆粒，直接加到上述白細胞中，混勻)，在37°C下，將轉染後的白細胞和腫瘤細胞在RPMI 1640培養基裡培養M小時。在螢光顯微鏡下觀察細胞。沒有添加腫瘤細胞的血液樣本也用同樣量的Ad/GFP-El或Ad/GFP-El-RGD進行培養。結果顯示，只有添加了腫瘤細胞的血液樣本出現綠細胞(圖幻。沒有腫瘤細胞的血液樣本沒有出現任何綠細胞。 這樣的結果表明腫瘤特性啟動子能用於檢驗血液樣本裡腫瘤細胞的報告基因表達。實施例9.癌症患者血樣本檢測。從一例肺癌患者及一例正常對照取血5毫升，用Ficoll梯度離心方法分離有核細胞後，加10000病毒感染單位的Ad/GFP-El於白細胞中。再將白細胞培養於一 48孔板的培養板(購自Fisher kientific)，每孔一個樣品，培養兩天後在螢光顯微鏡下觀察。在正常樣品中未見綠色螢光蛋白陽性細胞，而在肺癌患者的樣品中，一個視野就有幾個陽性細胞 (圖10)。圖10左側在螢光顯微鏡下；右側，與左側相同視野，但在普通顯微鏡下。注，螢光蛋白在黑白照中顯白色。附錄1，所述啟動子或基因序列人端粒酶逆轉錄酶核心啟動子序列(SEQ ID NO 1)accctgggagcgcgagcggcgcgcgggcggggaagcgcggcccagacccccgggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggcacagacgcccaggaccgcgctccccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccacccccgccLacZ 基因序列(SEQ ID NO 2)atgtcgtttactttgaccaacaagaacgtgattttcgttgccggtctgggaggcattggtctggacaccagcaaggagctgctcaagcgcgatcccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtaacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttaactcggcgtttcatctgtggtgcaacgggcgctgggtcggttacggccaggacagtcgtttgccgtctgaatttgacctgagcgcatttttacgcgccggagaaaaccgcctcgcggtgatggtgctgcgttggagtgacggcagttatctggaagatcaggatatgtggcggatgagcggcattttccgtgacgtctcgttgctgcataaaccgactacacaaatcagcgatttccatgttgccactcgctttaatgatgatttcagccgcgctgtactggaggctgaagttcagatgtgcggcgagttgcgtgactacctacgggtaacagtttctttatggcagggtgaaacgcaggtcgccagcggcaccgcgcctttcggcggtgaaattatcgatgagcgtggtggttatgccgatcgcgtcacactacgtctgaacgtcgaaaacccgaaactgtggagcgccgaaatcccgaatctctatcgtgcggtggttgaactgcacaccgccgacggcacgctgattgaagcagaagcctgcgatgtcggtttccgcgaggtgcggattgaaaatggtctgctgctgctgaacggcaagccgttgctgattcgaggcgttaaccgtcacgagcatcatcctctgcatggtcaggtcatggatgagcagacgatggtgcaggatatcctgctgatgaagcagaacaactttaacgccgtgcgctgttcgcattatccgaaccatccgctgtggtacacgctgtgcgaccgctacggcctgtatgtggtggatgaagccaatattgaaacccacggcatggtgccaatgaatcgtctgaccgatgatccgcgctggctaccggcgatgagcgaacgcgtaacgcgaatggtgcagcgcgatcgtaatcacccgagtgtgatcatctggtcgctggggaatgaatcaggccacggcgctaatcacgacgcgctgtatcgctggatcaaat
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AtgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatcaccgcccccattaccgacgtcagcctgggagacgaactccgcctggacggcgaggaggtggatatgacgcccgccgacgccctggacgacttcgacttggagatgctgggggacgtggagtcccccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggtagGal4/TATA(GT)啟動子序列(SEQ ID NO 7)gtcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagactctagagggtatataatTC嵌合啟動子序列(劃線部份來自CMV啟動子，其餘來自TERT啟動子)(SEQ ID NO 8)accctgggagcgcgagcggcgcgcgggcggggaagcgcggcccagacccccgggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggcacagacgcccaggaccgcgctccccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttaccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagcCctRRccccRRccacccccRccaRatctRatctRtaRRcRtRtaCRRtRRRaRRCCtatataaRCaRaRCtCRtttaRtRaaccRtcaRatcRcctRRaRacRccatccacRctRttttRacctccataRaaRacaccRRRaccRatccaCMV 啟動子序列(SEQ ID NO 9)Gcccggttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacggacctgc腺病毒纖維蛋白序列(劃線部分為插入序列，含RGD序列)(SEQ ID NO 10)atgaagcgcgcaagaccgtctgaagataccttcaaccccgtgtatccatatgacacggaaaccggtcctccaactgtgccttttcttactcctccctttgtatcccccaatgggtttcaagagagtccccctggggtactctctttgcgcctatccgaacctctagttacctccaatggcatgcttgcgctcaaaatgggcaacggcctctctctggacgaggccggcaaccttacctcccaaaatgtaaccactgtgagcccacctctcaaaaaaaccaagtcaaacataaacctggaaatatctgcacccctcacagttacctcagaagccctaactgtggctgccgccgcacctctaatggtcgcgggcaacacac
tcaccatgcaatcacaggccccgctaaccgtgcacgactccaaacttagcattgccacccaaggacccctcacagtgtcagaaggaaagctagccctgcaaacatcaggccccctcaccaccaccgatagcagtacccttactatcactgcctcaccccctctaactactgccactggtagcttgggcattgacttgaaagagcccatttatacacaaaatggaaaactaggactaaagtacggggctcctttgcatgtaacagacgacctaaacactttgaccgtagcaactggtccaggtgtgactattaataatacttccttgcaaactaaagttactggagccttgggttttgattcacaaggcaatatgcaacttaatgtagcaggaggactaaggattgattctcaaaacagacgccttatacttgatgttagttatccgtttgatgctcaaaaccaactaaatctaagactaggacagggccctctttttataaactcagcccacaacttggatattaactacaacaaaggcctttacttgtttacagcttcaaacaattccaaaaagcttgaggttaacctaagcactgccaaggggttgatgtttgacgctacagccatagccattaatgcaggagatgggcttgaatttggttcacctaatgcaccaaacacaaatcccctcaaaacaaaaattggccatggcctagaatttgattcaaacaaggctatggttcctaaactaggaactggccttagttttgacagcacaggtgccattacagtaggaaacaaaaataatgataagctaactttgtggaccacaccagctccatctcctaactgtagactaaatgcagagaaagatgctaaactcactttggtcttaacaaaatgtggcagtcaaatacttgctacagtttcagttttggctgttaaaggcagtttggctccaatatctggaacagttcaaagtgctcatcttattataagatttgacgaaaatggagtgctactaaacaattccttcctggacccagaatattggaactttagaaatggagatcttactgaaggcacagcctatacaaacgctgttggatttatgcctaacctatcagcttatccaaaatctcacggtaaaactgccaaaagtaacattgtcagtcaagtttacttaaacggagacaaaactaaacctgtaacactaaccattacactaaacggtacacaggaaacaggagacacaacttgtgactgccgcggagactgtttctgcccaagtgcatactctatgtcattttcatgggactggtctggccacaactacattaatgaaatatttgccacctcgagttacactttttcata cattgcccaagaataagTRE sequence(SEQ ID NO :11)TttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgggtcgagtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctTetR sequence (SEQ ID NO 12)atgtctagattagataaaagtaaagtgattaacagcgcattagagctgcttaatgaggtcggaatcgaaggtttaacaacccgtaaactcgcccagaagctaggtgtagagcagcctacattgtattggcatgtaaaaaataagcgggctttgctcgacgccttagccattgagatgttagataggcaccatactcacttttgccctttagaaggggaaagctggcaagattttttacgtaataacgctaaaagttttagatgtgctttactaagtcatcgcgatggagcaaaagtacatttaggtacacggcctacagaaaaacagtatgaaactctcgaaaatcaattagcctttttatgccaacaaggtttttcactagagaatgcattatatgcactcagcgctgtggggcattttactttaggttgcgtattggaagatcaagagcatcaagtcgctaaagaagaaagggaaacacctactactgatagtatgccgccattattacgacaagctatcgaattatttgatcaccaaggtgcagagccagccttcttattcggccttgaattgatcatatgcggattagaaaaacaacttaaatgtgaaagtgggtccgcgtacagccgcgcgcgtacgaaaaacaattacgggtctaccatcgagggcctgctcgatctcccggacgacgacgcccccgaagaggcggggctggcggctccgcgcctgtcctttctccccgcgggacacacgcgcagactgtcgacggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggc
gatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggtag參考文獻Blackburn，Ε. H. (1992). Telomerases. Annual Review of Biochemistry 61， 113-129.Butler, T. P. and Gullino, P.M. (1975). Quantitation of cell shedding into efferentblood of mammary adenocarcinoma. Cancer Res. 35,512-516.Chang，Y. S.，di Tomaso, Ε.，McDonald，D. Μ.，Jones，R.，Jain, R. K.，andMunn， LL (2000). Mosaic blood vessels in tumors :frequency of cancercells in contact with flowing blood. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97，14608—14613.Counter，C. M.，Avilion，A. A.，LeFeu vre , C. E.，Stewart, N. G.， Greider, C. W.，Harley, C. B.，and Bacchetti, S. (1992). Telomere shortening associated withchromosome instability is arrested in immortal cells which expresstelomerase activity. EMBO Journal 11，1921—1929·Davis, J. J.，Wang, L，Dong，F.，Zhang，L，Guo, W.，Teraishi，F.，Xu, K.，Ji，L， andFang，B. (2006). 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權利要求
1.一種腫瘤特異性啟動子，其在腫瘤細胞中的活性比其在正常細胞中的活性要高。
2.權利要求1的腫瘤特異性啟動子，其包括人端粒酶逆轉錄酶啟動子，survivin啟動子，medkine啟動子，癌胚抗原啟動子，MUC-I啟動子和probasin基因啟動子。
3.權利要求1的腫瘤特異性啟動子，其可以是組織或者細胞型特異性基因的原啟動子，也可以是經改造的組合啟動子，例如含有源自組織或細胞型特異性啟動子的序列和源自其他啟動子的增強子的嵌合型啟動子。
4.權利要求3的腫瘤特異性啟動子，其中所述腫瘤特異性啟動子是改造的人端粒酶逆轉錄酶啟動子，其含有人端粒酶逆轉錄酶啟動子序列以及源自CMV啟動子的增強子序列。
5.權利要求4的腫瘤特異性啟動子，所述啟動子序列如SEQID N0:8所示。
6.一種載體，其是包括由權利要求1-5任一項的腫瘤特異性啟動子驅使表達的報告基因的基因表達載體。
7.權利要求6的載體，其中提及的報告基因是一種通常作為啟動子活性指示劑的基因。
8.權利要求7的載體，其中所述報告基因包括螢光蛋白(綠色，紅色，黃色和藍色螢光蛋白)的基因，螢火蟲螢光素酶基因，海腎螢光素酶基因，細菌半乳糖苷酶(LacZ)基因。
9.權利要求7的載體，其中所述基因表達載體指任何一種用於基因轉染的載體。
10.權利要求7的載體，其中所述基因表達載體包括質粒，質粒/脂質複合物以及病毒載體。
11.權利要求10的載體，其中提及的病毒載體是指複製缺陷型病毒載體和可複製型病毒載體，例如腺病毒載體，可複製型腺病毒載體，皰疹病毒載體，牛痘病毒載體等。
12.權利要求11的載體，其中所述病毒載體是經過病毒纖維改進後的。
13.權利要求12的載體，其中所述病毒纖維改進是通過將編碼精氨酸-甘油酸-天冬氨酸(RGD)編碼序列插入到位於圖距單位86-91的腺病毒基因組中，從而使病毒纖維蛋白含RGD序列，改變其受體特異性，改進後的載體可經整合素蛋白(integrin)進入靶細胞。
14.權利要求7的載體，其中組織或腫瘤特異性啟動子的活性通過二元表達系統來加強。
15.權利要求7的載體，其中提及的基因表達載體包括可複製型腺病毒載體Ad/El-GFP 和 Ad/El-GFP-RGD，複製缺陷型腺病毒載體 Ad/TERT_GFP，Ad/TERT-LacZ, Ad/GFP-TRAIL 和 Ad/TERT-Luciferase.。
16.一種試劑盒，其包含權利要求1-5任一項的腫瘤特異性啟動子和/或權利要求 6-15任一項的載體，用於癌症患者的早期診斷，治療反應的預測及其預後。
17.權利要求16的試劑盒，其用於檢測血標本和骨髓標本中的腫瘤細胞。
18.—種診斷劑，其包含權利要求1-5任一項的腫瘤特異性啟動子和/或權利要求 6-15任一項的載體，用於癌症患者的早期診斷，治療反應的預測及其預後。
19.權利要求18的診斷劑，其用於檢測血標本和骨髓標本中的腫瘤細胞。
20.權利要求1-6中任一項的腫瘤特異性啟動子用於製備權利要求7-15任一項的載體以及權利要求16-17任一項的試劑盒和權利要求18-19任一項的診斷劑的應用。
全文摘要
本發明提供用於檢測循環血樣本和骨髓樣本中腫瘤細胞的方法與試劑，即應用腫瘤特異性啟動子驅使報告基因表達，來檢測血樣本和骨髓樣本中的腫瘤細胞。腫瘤特異性啟動子，如人端粒酶逆轉錄酶啟動子(TERT)，在大多數腫瘤細胞中有很高的活性，但是在正常細胞中沒有活性。用含有腫瘤特異性啟動子驅使的報告基因表達盒的基因載體，例如腺病毒載體，轉染血樣本或骨髓樣本中的有核細胞，然後檢測樣本中是否存在報告基因高表達的細胞，從而確認樣本中是否存在腫瘤細胞。本發明提供包含所述啟動子，報告基因和載體的診斷試劑盒，可用於癌症患者的早期診斷及治療反應的預測。
文檔編號C12Q1/02GK102191245SQ20101013175
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月15日 優先權日2010年3月15日
發明者方效良 申請人:浙江東方基因生物製品有限公司