一種磁珠與發光體共標記以檢測遺傳性耳聾的試劑盒的製作方法

2023-09-22 18:08:50 2

專利名稱：一種磁珠與發光體共標記以檢測遺傳性耳聾的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測相關領域，涉及一種檢測遺傳性耳聾的試劑盒，特別涉及一種磁珠與發光體共標記以檢測遺傳性耳聾的試劑盒。
背景技術：
遺傳性耳聾是通過遺傳由父母傳給其子女。不論父母方中的單方或者雙方是耳聾患者還是健康攜帶者，耳聾基因都會通過父母向子女遺傳。這種疾病通過常染色體顯性、常染色體隱性、X-連鎖隱性，或者線粒體遺傳等方式遺傳給下一代。大約0.的孩子生來具有深度耳聾，超過50%的語前耳聾患兒屬於遺傳因素致聾，通過對基因突變的識別不僅可用於遺傳諮詢、產前診斷和新生兒聽力篩查，還可以幫助和提醒醫生慎重使用特定種類的抗生素以避免造成攜帶基因突變的患者聽力損傷甚至致聾。近幾年微陣列晶片技術的發展使得高通量地並行分析成千上萬的分子相互作用成為可能。DNA微陣列晶片方法已被廣泛使用，包括基因表達分析、突變分型、單核苷酸多態性(SNP)、短串聯重複序列(STR)，對藥物開發、疾病診斷和司法鑑定起到重要作用 (Heller, Ann Rev Biomed Eng (2002) 4 :129-153 ；Stoughton, Ann Rev Biochem(2005) 74 53-82 ；Hoheisel, Nat Rev Genet (2006) 7 :200-210) 固定於微陣列晶片的特定核苷酸探針，充當解碼工具，通過空間上不同的位置把溶液中並行反應產生的多個靶標分子加以區別(Zhu et al.，Antimicrob Agents Chemother (2007) 51 :3707-3713)。這些探針甚至可以是通用探針，比如通用晶片上經過設計與人工合成的人造標籤(Tag)序列或者相互補的 歹Ij (Gerrey et al. ， J Mol Biol (1999) 292 :251-262 ；Li et al. ， Hum Mutat (2008) 29 306-314)。微陣列晶片方法與多重PCR結合在一起，可用於檢測SNP與基因突變，包括鹼基刪除、插入、以及長片段缺失，適用於常規的遺傳和診斷實驗室開展。與此同時，蛋白晶片和化學晶片也已經發展成為蛋白質組學領域兩個重要的工具(Xu and Lam, J Biomed Biotechnol (2003) 5 :257-266)。特定的蛋白質、抗體、小分子化合物、多肽及碳水化合物都可以固定在固體表面形成微陣列晶片，類似於DNA微陣列晶片。這些分子的微陣列晶片可以用於分析單一的分子組成或者複雜的分子組成。待檢樣本和固定在微陣列晶片表面的探針之間的相互作用可以通過多種方法加以檢測。通常情況下，微陣列晶片的檢測方法有基於螢光、化學發光或酶連標記的光學檢測方法，基於酶標記、二茂鐵標記或其他電活性標記的電化學檢測方法，以及基於表面等離子共振技術或微天平分析技術的無標記的檢測方法(Sassolas et al. ,Chem Rev(2008) 108 109-139)。當然，磁珠標記方法也被採用，其結果可以用基於電荷耦合器件(CCD)的相機、 攝像機或低倍顯微鏡進行成像分析(Guo et al.，J Anal Sci (2007)23 :1_4 ；Li et al.， supra ；Shlyapnikov et al.，Anal BiochemQOlO) 399 :125-131)，而且交叉反應和非特異性吸附能通過磁場或流體來快速地加以消除(Mulvaney et al. ,Anal Biochem(2009) 392 139-144)。理論上，上述發光方法與磁珠方法是可以進一步結合的，即將兩者的優點進行組合，應該能提高晶片檢測平臺的靈敏度和特異性，這對基因突變檢測尤其臨床相關的檢測
8非常有意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種磁珠與發光體共標記以檢測遺傳性耳聾的試劑盒。本發明提供了輔助檢測遺傳性耳聾的引物組I，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列21自5』末端第 23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列22自5，末端第23至41位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列23所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列21所示的DNA、序列表的序列22所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA。所述引物組I的(a)或(b)中，序列表的序列23所示DNA的5』末端可連接有生物素。所述引物組I的(a)或(b)中，所述序列表的序列23所示的DNA自5』末端第4位核苷酸可標記有螢光素Cy3。本發明提供了輔助檢測遺傳性耳聾的試劑I，由所述引物組I和探針組I組成；所述探針組I為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列1所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列1所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的引物組II，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列M自5』末端第 23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列25自5，末端第23至40位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列26所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列M所示的DNA、序列表的序列25所示的DNA和序列表的序列沈所示的DNA。所述引物組II的(a)或(b)中，序列表的序列沈所示DNA的5』末端可連接有生物素。所述引物組II的(a)或(b)中，所述序列表的序列沈所示的DNA自5』末端第6位核苷酸可標記有螢光素Cy3。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的試劑II，由所述引物組II和探針組II組成； 所述探針組II為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA ；
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(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列3所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列3所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的引物組III，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列27自5』末端第 25至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列觀自5，末端第M至40位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列四所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列27所示的DNA、序列表的序列觀所示的DNA和序列表的序列四所示的DNA。所述引物組III的(a)或(b)中，序列表的序列四所示DNA的5』末端可連接有生物素。所述引物組III的(a)或(b)中，所述序列表的序列四所示的DNA自5』末端第 6位核苷酸可標記有螢光素Cy3。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的試劑III，由所述引物組III和探針組III組成；所述探針組III為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列5所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列5所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的引物組IV，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列30自5』末端第 25至43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列31自5，末端第25至43位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列32所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列30所示的DNA、序列表的序列31所示的DNA和序列表的序列32所示的DNA。所述引物組IV的(a)或(b)中，序列表的序列32所示DNA的5』末端可連接有生物素。所述引物組IV的(a)或(b)中，所述序列表的序列32所示的DNA自5』末端第6位
10核苷酸可標記有螢光素Cy3。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的試劑IV，由所述引物組IV和探針組IV組成； 所述探針組IV為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列7所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列8所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列7所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列8所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的引物組V，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列33自5』末端第 25至47位核苷酸所示的DNA、序列表的序列34自5，末端第M至43位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列35所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列33所示的DNA、序列表的序列；34所示的DNA和序列表的序列35所示的DNA。所述引物組V的(a)或(b)中，序列表的序列35所示DNA的5』末端可連接有生物素。所述引物組V的(a)或(b)中，所述序列表的序列35所示的DNA自5』末端第6位核苷酸可標記有螢光素Cy3。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的試劑V，由所述引物組V和探針組V組成；所述探針組V為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列9所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列10所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列9所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列10所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的引物組VI，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列36自5』末端第 23至45位核苷酸所示的DNA、序列表的序列37自5，末端第23至43位核苷酸所示的DNA
11CN 102453761 A說明書5/26 頁
和序列表的序列38所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列36所示的DNA、序列表的序列37所示的DNA和序列表的序列38所示的DNA。所述引物組VI的(a)或(b)中，序列表的序列38所示DNA的5』末端可連接有生物素。所述引物組VI的(a)或(b)中，所述序列表的序列38所示的DNA自5』末端第5位核苷酸可標記有螢光素Cy3。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的試劑VI，由所述引物組VI和探針組VI組成； 所述探針組VI為如下(a)或(b)或(c) (a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列11所示DNA和序列表的序列12所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列11所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列12所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列11所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列12所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的引物組VII，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列39自5』末端第 24至46位核苷酸所示的DNA、序列表的序列40自5，末端第M至45位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列41所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列39所示的DNA、序列表的序列40所示的DNA和序列表的序列41所示的DNA。所述引物組VII的(a)或(b)中，序列表的序列41所示DNA的5』末端可連接有生物素。所述引物組VII的(a)或(b)中，所述序列表的序列41所示的DNA自5』末端第 4位核苷酸可標記有螢光素Cy3。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的試劑VII，由所述引物組VII和探針組VII組成；所述探針組VII為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列13所示DNA和序列表的序列14所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列13所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列14所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ； (c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列13所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列14所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的引物組VIII，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列42自5』末端第 23至43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列43自5，末端第23至44位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列44所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列42所示的DNA、序列表的序列43所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA。所述引物組VIII的(a)或(b)中，序列表的序列44所示DNA的5』末端可連接有生物素。所述引物組VIII的(a)或(b)中，所述序列表的序列44所示的DNA自5』末端第 4位核苷酸可標記有螢光素Cy3。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的試劑VIII，由所述引物組VIII和探針組 VIII組成；所述探針組VIII為如下(a)或(b)或(C)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列15所示DNA和序列表的序列16所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列15所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列16所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列15所示DNA的 5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列16所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。以上任一所述引物組或其組合或任一所述試劑或其組合均可用於製備輔助檢測遺傳性耳聾的試劑盒。本發明提供的輔助檢測遺傳性耳聾的試劑盒，為如下任意一種(一 )所述試劑盒包括引物組合物；所述引物組合物由所述的引物組I、所述的引物組II、所述的引物組III、所述的引物組IV、所述的引物組V、所述的引物組VI、所述的引物組VII和所述的引物組VIII組成；( 二)所述試劑盒包括試劑組合物；所述試劑組合物由所述的試劑I、所述的試劑 II、所述的試劑III、所述的試劑IV、述的試劑V、所述的試劑VI、所述的試劑VII和所述的試劑VIII組成；(三)所述試劑盒包括引物組合物；所述引物組合物由如下組分中的一種或幾種組成所述的引物組I、所述的引物組II、所述的引物組III、所述的引物組IV、所述的引物組V、所述的引物組VI、所述的引物組VII和所述的引物組VIII ；(四)所述試劑盒包括試劑組合物；所述試劑組合物由如下組分中的一種或幾種組成所述的試劑I、所述的試劑II、所述的試劑III、所述的試劑IV、所述的試劑V、所述的試劑VI、所述的試劑VII和所述的試劑VIII。
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所述試劑盒具體包括基片、所述試劑組合物和顆粒；所述試劑組合物中的探針組固定於所述基片上，形成微陣列晶片；所述基片的材質為矽、玻璃、塑料、水凝膠、硝酸纖維或尼龍；所述顆粒為微球或磁性微球。所述微陣列晶片上還可排列有陽性對照MC、陽性對照PC、陰性對照NC和陽性對照 QC ；所述陽性對照MC為序列表的序列17所示的DNA或在序列表的序列17所示DNA的5』 末端連接特異片段得到的DNA ；所述陽性對照PC為序列表的序列18所示的DNA或在序列表的序列18所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述陰性對照NC為序列表的序列19所示的DNA或在序列表的序列19所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的 DNA ；所述陽性對照QC為序列表的序列20所示的DNA或在序列表的序列20所示DNA的5， 末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA， 且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的 DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。所述試劑盒還可包括序列表的序列46所示的DNA和如下DNA (A)或(B)(A)序列表的序列45自5，末端第23至41位核苷酸所示的DNA ；(B)序列表的序列45所示的DNA。所述顆粒具體可為鏈黴親和素包被的顆粒；序列表的序列46所示DNA的5』末端可連接有生物素，自5』末端第8位核苷酸可標記有螢光素Cy3 ；序列表的序列17所示DNA 的3，末端可連接有生物素；序列表的序列20所示DNA的3，末端可連接螢光素HEX。本發明提供的方法包括如下步驟a)將發光體標記的靶標分子耦聯到顆粒上；b)將此靶標分子與固定在微陣列晶片上的探針分子相結合；c)檢測靶標分子與探針分子之間的相互作用，這裡所指的靶標分子包括多核苷酸，特定的蛋白多肽，抗體，小分子化合物，多肽和碳水化合物。任何合適的發光體都可以在本發明中使用，比如螢光團、磷光團、或者發色團。螢光團可以是量子點、蛋白質(如綠色螢光蛋白)，或小分子螢光染料。而小分子螢光染料可以選擇氧雜蒽衍生物(螢光素，羅丹明，俄勒R綠，曙紅組成的小組，德克薩斯紅等)，青色素衍生物(青色素，吲哚碳花青，羰花青，部花青等)，萘衍生物(丹磺醯和普羅丹等)，香豆素衍生物，二唑衍生物，芘衍生物(級聯藍色等)，惡嗪衍生物(尼羅河紅色，藍色尼羅河，甲酚紫，惡嗪170等)，吖啶衍生物(二氨基吖啶，吖啶橙，吖啶黃等)，次甲基衍生物(金胺， 結晶紫，孔雀石綠等)，CF染料，Alexa染料，四吡咯衍生物(卟吩，膽紅素等)，級聯黃色，天藍色乙，吖啶橙，DAPI，Hoechst 33258，吡羅昔康，奎寧。磷光團可以選擇過渡金屬化合物或各類稀土化合物。發色團可以選擇視網膜染料，食品著色劑，織物染料(偶氮化合物)， 番茄紅素，胡蘿蔔素，花青素，葉綠素，血紅蛋白，血藍蛋白，礦物(孔雀石，紫水晶等)。 靶標分子能直接或間接地被發光體標記，這裡間接是指靶標分子與發光體之間有分子進行連結。對靶標分子進行某種合適的處理過程中，可以將發光體引入，標記到靶標分子上。任何合適的顆粒都可以在本發明中使用，每個顆粒上可結合至少一個靶標分子。 所述顆粒可為微顆粒或磁性微球。所述顆粒的直徑可為0.1微米至10微米。所述顆粒可被標記基團或其它功能性基團的一種或幾種修飾，例如螢光分子，銀染試劑，化學發光試劑， 電化學試劑，納米粒子，量子點等。所述功能性基團可為化學功能團，如多核苷酸(poly-dT
14或poly-dA)、蛋白多肽、抗體、小分子化合物、多肽、碳水化合物、醛基，羥基，羧基，酯鍵，氨基，磺酸基或者巰基。所述功能性基團還可為鏈黴親和素、中性鏈親和素、親和素。除了被發光體所標記外，所述靶標分子可以進一步被修飾。修飾基團可為化學功能團、功能性基團、多核苷酸、蛋白多肽、抗體、小分子化合物、多肽或碳水化合物。所述化學功能團可為醛基、羥基、羧基、酯鍵、氨基、磺酸基、或巰基等。所述功能性基團可為鏈黴親和素、中性鏈親和素或親和素等。所述多核苷酸可為poly-dT或poly-dA。所述靶標分子可通過其上的修飾基團與所述顆粒上的功能性基團之間的相互作用耦聯到顆粒上。如鏈黴親和素與生物素之間的相互作用，中性鏈親和素與生物素之間的相互作用，親和素與生物素之間的相互作用，或者poly-dT/poly-dA之間的相互作用等。所述多核苷酸(靶標分子)可為雙鏈或單鏈。單鏈多核苷酸靶標至少存在部分序列與固定於微陣列晶片上的探針分子至少部分序列是完全或基本鹼基互補配對。當然，單鏈多核苷酸靶標序列與固定於微陣列晶片上的探針分子也可以完全互補配對。所述多核苷酸(靶標分子)可進行體外操作，這可能會產生單鏈或雙鏈多核苷酸片段。所述體外操作可為物理方式，如雷射、超聲、加熱、微波、壓電、電泳、介電泳、固相吸附、過濾或流體力等。所述體外操作還可為酶切、PCR擴增、反轉錄、反轉錄PCR、等位基因特異性PCR(ASPCR)、單鹼基延伸(SBE法)、等位基因特異性引物延伸(ASPE)、限制性酶切、鏈置換擴增(SDA)、轉錄介導的擴增(TMA)、連接酶反應(LCR)、基於核酸序列擴增(NASBA)JI 物延伸、滾環擴增(RCA)、自主序列複製(3SR)、使用Q-Beta複製酶、切口平移或環介導等溫擴增(LAMP)等。所述雙鏈多核苷酸靶標可以通過任何合適的方法變性為單鏈，例如化學反應、酶反應、或物理方式(比如加熱)，或者組合幾種方法。所述化學反應方法可為使用尿素、甲醯胺、甲醇、乙醇和氫氧化鈉中的一種或幾種。所述酶反應方法具體可為使用核酸外切酶和尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)。雙鏈多核苷酸靶標還可以加熱到30°C _95°C中合適溫度進行熱變性。所述微陣列晶片上可至少包括兩條探針。所述微陣列晶片上可包含多條寡核苷酸探針。所述微陣列晶片上的探針分子可能是多核苷酸，蛋白多肽，抗體，小分子化合物，多肽或者碳水化合物。獲得的單鏈靶標多核苷酸可能包括人工設計和優化的多核苷酸序列例如標籤序列，還可包含通用標籤陣列。這些標籤序列與通用標籤陣列上的寡核苷酸探針序列上互補配對或基本互補配對。不同標籤序列的Tm值之間的差異被設計在任何合適的範圍內，如不超過5°C。一些實例中，標籤序列相互之間沒有交叉反應。某些應用中，標籤序列與物種的基因組DNA之間的同源性很低。特別某些應用中，標籤序列內沒有發卡結構。某些應用中，標籤序列是單鏈寡核苷酸或者被修飾的類似物。另外一些應用中，標籤序列可以是鎖核酸(LNA)，編碼核酸(ZNA)或肽核酸(PNA)。另一些應用中，標籤序列通過體外操作方式被引入到靶標多核苷酸中。微陣列晶片可以由任意合適的技術方法製成。某些應用中，製成微陣列晶片技術方法包括用針點樣，利用預製的掩膜板光刻合成，利用動態微鏡光刻合成，噴墨印刷，微印章技術，電化學方法和微電極陣列方法。製備微陣列晶片的基地材料包括矽，玻璃，塑料，水凝膠，瓊脂糖，硝酸纖維和尼龍。固定於微陣列晶片上的探針分子包括多核苷酸，蛋白多肽，抗體，小分子化合物， 多肽和碳水化合物。探針分子可以通過任何合適的方法結合到晶片上，例如原位合成，非特異性吸附，特異性結合，非特異性的化學連接，或者化學選擇性連接。探針分子與微陣列晶片之間的結合可能是共價結合或者物理吸附。微陣列晶片的基底材料可以是任何合適的材料，比如矽，玻璃，塑料，水凝膠，瓊脂糖，硝酸纖維和尼龍。微陣列晶片上的探針點可以是任何合適的尺寸。某些應用中，這些探針點直徑上從約10微米到5000微米。另一些應用中， 這些探針為單鏈寡核苷酸或者被修飾的類似物。另外一些應用中，寡核苷酸探針可以是鎖核酸(LNA)，編碼核酸(ZNA)或肽核酸(PNA)。靶標分子與探針分子之間的結合可能是非共價鍵，共價可逆或共價鍵不可逆。包括磁力，介電力之類的外力可用於操縱顆粒或者微球，以提高雜交效率和效果。 雜交結果可以用任何合適的方式進行檢測，比如用微陣列晶片掃描儀，常規的圖像捕獲設備或者肉眼。某些應用中，微陣列晶片掃描儀通過螢光標記，化學發光標記或酶實現光學檢測。另一些應用中，微陣列晶片掃描儀通過酶、二茂鐵標記或其他電活性標記實現電化學檢測。還有一些應用中，微陣列晶片掃描儀通過表面等離子共振，磁力，巨磁阻效應或微天平技術實現非標記檢測。另一些應用中，常規的圖像捕獲設備是平板掃描儀，照相/攝像機，或可攜式設備。一些應用中，檢測結果是由照相/攝像機紀錄，無論是否加裝鏡頭、放大鏡或者顯微鏡。其他一些應用中，檢測結果是由帶有照相/攝像功能的可攜式設備記錄，例如手機、筆記本，同樣無論是否加裝鏡頭、放大鏡或顯微鏡。本發明可用於任何適當的用途。一方面，本發明提供了一種檢測遺傳信息的方法， 該方法包括a)將發光體標記的靶標分子耦聯到顆粒上；b)將靶標分子與固定在微陣列晶片上的探針分子相結合；和C)檢測靶標分子與探針分子之間的相互作用，這裡所指的靶標分子包含了遺傳信息，是多核苷酸，特定的蛋白多肽，抗體，小分子化合物，多肽或者碳水化合物。另一方面，本發明提供一種檢測遺傳信息的方法，它包括a)將發光體標記的雙鏈靶標分子耦聯到顆粒上；b)將顆粒上的靶標分子變成單鏈；C)將單鏈靶標分子與固定在微陣列晶片上的探針分子相結合，d)檢測靶標分子與探針分子之間的相互作用，這裡所指的靶標分子包含了遺傳信息，是多核苷酸。任何合適的遺傳信息都可以利用本方法進行檢測。例如遺傳信息可以是基因突變，包括鹼基替換，插入，刪除及多鹼基替換。一些應用中，遺傳信息具有單核苷酸多態性 (SNP)。另一些應用中，遺傳信息是基因。另外一些應用中，遺傳信息是遺傳物質，包括多核苷酸，蛋白多肽，抗體，小分子化合物，多肽和碳水化合物。含有或疑似含有遺傳信息的靶標多核苷酸可在檢測前擴增放大，發光體標記可以在此過程中直接引入，即產物將標記上發光體。例如，ASPCR可用於擴增放大遺傳信息。任何合適的引物都能用於擴增放大含有或疑似含有遺傳信息的靶標多核苷酸。一些應用中， ASPCR至少包括兩條等位基因特異性引物和一條通用引物。另一些應用中，等位基因特異性引物和通用引物的序列顯示在表2中，而通用引物中鹼基已用螢光標記，以「*」記號標註。 另外的實例中，等位基因特異性引物終止於多核苷酸序列的SNP/突變位點處。另一些應用中，等位基因特異性引物與野生型序列相比進一步引入了人工錯配。一些應用中，等位基因特異性引物包含天然的核苷酸或類似物。一些應用中，等位基因特異性引物序列中包括一個標籤序列。其他一些應用中，ASPCR使用的DNA聚合酶沒有3』到5』的外切酶活性。另一方面，本發明的組成包括對靶標分子進行發光體標記，並將耦聯到顆粒上的靶標分子和固定於微陣列晶片上的探針分子進行結合反應，其中靶標分子包括多核苷酸， 蛋白多肽，抗體，小分子化合物，多肽和碳水化合物。一些應用中，包含標籤序列的寡核苷酸探針的序列如表1所示。另一些應用中，通用標籤陣列中至少包括表1中的兩條標籤序列。另一些應用中，通用標籤陣列中至少包括表1中的四條標籤序列。另一些應用中，通用標籤陣列中至少包括表1中的八條標籤序列。 另一些應用中，通用標籤陣列包括表1中的所有標籤序列。進一步提供的引物序列如表2中所示，但不包含標籤序列和5』生物素標記的通用序列，而且引物序列不是全長的cDNA或全長的基因組DNA。一些應用中，引物基本上包含表2中所示的序列，同樣不包含標籤序列和5』生物素標記的通用序列。另一些應用中，弓丨物包含表2中所示的序列，同樣不包含標籤序列和5』生物素標記的通用序列。另一些應用中，引物包含表2中所示的序列。這裡提供了用於ASPCR擴增遺傳信息的一組引物，該組引物包含兩條等位基因特異性引物和一條共同引物，具體的引物序列如在表2中所示。另一個方面，本發明提供了一個用於檢測遺傳信息的試劑盒，該試劑盒包含通用標籤陣列。該試劑盒包括一個說明手冊。一些實例中，該試劑盒中的引物包含表2中所示序列，但不包含標籤序列和5』生物素標記的通用序列，而且引物序列不是全長的cDNA或全長的基因組DNA。另一些實例中，該試劑盒包含了一組用於ASPCR擴增遺傳信息的引物，該組引物包含兩條等位基因特異性引物和一條共同引物，具體的引物序列如在表2中所示。另一方面，本發明提供一個檢測分子相互作用的試劑盒，含有發光體，顆粒，微陣列晶片，和固定於微陣列晶片上的探針分子。本發明提出了一種基於微陣列晶片的方法，用於分析分子間相互作用，包括多核苷酸，蛋白多肽，抗體，小分子化合物，多肽和碳水化合物。該方法包括將發光體標記的靶標分子耦聯到顆粒上，然後與固定於微陣列晶片上的探針分子相結合。尤其是與核酸片段相關的遺傳分析可以實施。特定的基因，單核苷酸多態性或基因突變，如鹼基刪除，插入和多鹼基替換，都可以鑑定。本發明提供的引物組、試劑組以及試劑盒可以用於遺傳性耳聾的篩查，實現早期發現、提早預防以及產前指導，具有重大的商業價值和社會意義。


圖1為用本發明的方法(該發明集成了發光體、顆粒與微陣列晶片)分析分子間相互作用的原理示意圖。圖2為三類不同圖像獲取手段來檢測微陣列實驗結果，即明場下CXD器件(左圖)，螢光顯微鏡(中圖)，以及商用微陣列晶片掃描儀(右圖)。圖3為用本發明的方法(該發明集成了發光體、顆粒與微陣列晶片)檢測雙鏈靶標多核苷酸的原理示意圖。圖4為一個與遺傳性耳聾相關的8個SNP/突變檢測相對應的通用標籤陣列排布描述；QC和BC代表陽性和陰性點樣質控；PC和NC代表陽性和陰性雜交質控；MC是修飾在微球表面的基團與靶標分子結合的陽性質控。圖5為當本發明使用通用標籤陣列、發光體、微顆粒相結合，對遺傳性耳聾相關的 8個SNP/突變進行檢測時靈敏度評估，使用的是對這8個SNP/突變為野生型的模板。圖6為當本發明使用通用標籤陣列和微顆粒或微珠相結合，對遺傳性耳聾相關的 8個SNP/突變進行檢測時臨床樣品的檢測結果。
具體實施例方式本發明開發了一種創新技術，該技術將微陣列晶片技術與顆粒以及發光體結合在一起，通過靶標分子與探針分子的結合，最終實現解碼。一些應用中，該技術將微陣列晶片技術與顆粒以及發光體結合在一起，通過富集靶標多核苷酸，藉助靶標分子與探針分子之間的雜交將顆粒耦聯到微陣列晶片上的探針點上，並最終實現解碼。一些應用中，該技術將微陣列晶片技術與顆粒以及發光體結合在一起，通過富集雙鏈靶標多核苷酸片斷，收穫單鏈靶標多核苷酸片斷，藉助靶標分子與探針分子之間的雜交將顆粒耦聯到微陣列晶片上的探針點上，並最終實現解碼。除了擁有很好特異性和很高靈敏度之外，藉助顆粒與發光體聯合、或顆粒單獨顯示出來的結果，可以用合適的設備，甚至肉眼觀察檢測。以遺傳性耳聾相關的SNP/突變檢測為例，對該組合方法進行了驗證，驗證結果表明該方法用於遺傳分析時具有特異性高，靈敏度高，性價比高的特點，這特別適合於臨床樣品的相關診斷和疾病相關遺傳檢測。本發明並不限於實施例的描述過程中特定的方法，儀器設備，溶液、或者器材，因為這種方法，設備，溶液或器材都是可變的。也需要強調的是，文中使用的術語只是為了描述特定的實例，不是為了限制本發明的範圍。除非文中另有定義或文中另有明確規定，文中所有技術和科學術語與本發明所屬領域的普通的技術人員的通常理解有相同的意思。雖然實踐中任何與文中描述的方法和材料相類似的或等價的方法和材料都能被使用或者用於驗證本發明，但目前使用了首選的方法和材料進行描述本發明。文中所列的公開出版物均是作為參考文獻進行引用，用於提供和描述特定的材料和方法。文中談論到的出版物只是為了揭示在本發明的申請日之前的背景技術，這些背景技術不應解釋為承認在先發明揭示了本發明。A.本發明中涉及的定義如下術語「分子」指的是多核苷酸、蛋白多肽、抗體、小分子化合物、多肽或者碳水化合物。術語「發光體」指的是化合物中的能呈現發光性質的原子或原子簇，包括螢光團、 磷光團和發色團。術語「顆粒」或「微顆粒」指的是粒徑在約0. 01微米至1000微米範圍內的小顆粒。 一些實例中，「顆粒」或「微顆粒」具有某些內在屬性，比如磁性、螢光之類特性，可用來鑑定顆粒或者微顆粒是否劃歸為一組。術語「微球」指的是粒徑在約0. 01微米至1000微米範圍內的粒子，通常是球狀。一些實例中，微球上包含一種或多種識別標籤，比如磁性、螢光之類特性，這些標籤隨著微球上的聚合物、玻璃、其它基質或包被之類成形而形成。術語「磁性微球」，指的是粒徑在約0.01微米至1000微米範圍內的粒子，通常在微球的聚合物、玻璃、 基質或者包被中包含一個或多個磁性區域。術語「微球」或「磁性微球」並不排除球體以外的其它形狀，其包含球狀、扁平狀等其它形狀的粒子。術語「微陣列晶片」指的是多核苷酸、多肽及化合物微陣列晶片。特定的多核苷酸、蛋白多肽、抗體、小分子化合物、多肽和碳水化合物都可以被固定在固相表面，形成微陣歹丨J晶片。本發明將微陣列晶片技術與顆粒以及發光體相結合，通過靶標分子與探針分子之間的結合相互作用，最終實現靶標解碼。術語「結合」指的是兩個分子間的相互作用，結果是由於相互之間近距離接觸而形成穩定的複合體。分子間的結合相互作用分為非共價鍵， 共價可逆或共價鍵不可逆三種類型。能參與分子間的結合相互作用的分子包括多核苷酸、 多肽、脂類、碳水化合物和小分子化合物，比如藥物中小分子化合物。能夠與其它分子形成穩定複合體的多肽通常被稱為「受體」，而與之相結合的分子被稱為「配體」。多核苷酸可與自身或其它分子形成穩定的複合體，例如DNA-蛋白質複合體，DNA-DNA複合體，DNA-RNA複合體。術語「多肽」文中指的是蛋白質、蛋白質的片段或胺基酸多肽，可從自然界中分離， 通過重組技術生產或者化學方法合成。多肽可能包含一個或多個修飾，比如轉錄後修飾 (如糖基化修飾)或者其他修飾(如聚乙二醇修飾)。多肽中可能包含一個或多個非天然胺基酸(如一些側鏈有修飾的胺基酸)。本發明中所涉及的多肽通常包含至少10個胺基酸。術語「多核苷酸」、「寡核苷酸」、「核酸」及「核酸分子」文中可相互替代，指的是由核苷酸形成的任何長度的聚合物，包含核糖核酸、脫氧核糖核酸以及類似物或混合物之類。該術語文中只指分子的一級結構。該術語文中包括三鏈、雙鏈和單鏈的脫氧核糖核酸(DNA)， 三鏈、雙鏈和單鏈的核糖核酸(RNA)。該術語中的多核苷酸可以未經修飾，也可以進行修飾， 例如烷基化，蓋帽。術語「多核苷酸」、「寡核苷酸」、「核酸」及「核酸分子」也包含多聚脫氧核糖核酸(包含2-脫氧-D-核糖)，多聚核糖核酸(包含D-核糖)，包括轉運RNA (tRNA)，核糖體RNA (rRNA)，轉錄初級產物(hRNA)和信使RNA (mRNA)，無論是否經過剪接，包含任何類型的多核苷酸，其N端或C端為嘌呤或嘧啶，包含任何擁有類似核苷酸相連形成骨架的聚合物，例如醯胺類聚合物(比如肽核酸(PNA))，嗎啉聚合物(可從Anti-Virals，Corvallis, Neugene等公司購買)，以及其他合成的序列特異性核酸聚合物，這些聚合物包含鹼基可像 DNA或者RNA那樣實現鹼基配對和鹼基堆積。因而這些術語文中包含3』-脫氧-2』，5』-的 DNA,寡核苷酸N3』到P5』磷醯胺酯，2』 -0-烷基取代的RNA，DNA與RNA之間的形成的雜合體，PNA與DNA或者RNA之間形成的雜合體，也包含已知種類的修飾，例如標記，烷基化，蓋帽，一個或者多個核苷酸被類似物替代，核苷酸之間的修飾，例如不帶電的連接(舉例如甲基磷酸，磷酸三脂，磷醯胺，氨基甲酸酯等)，帶負電的連接(舉例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等等)，帶正電的連接(舉例如氨烷基亞磷酸脂，氨烷基磷酸三酯)，那些帶有修飾件的聚合物，這類修飾件包括蛋白質(舉例如酶(如核酸酶)，毒素，抗體，信號肽，多聚L-賴氨酸等等)，那些帶有嵌插集團的聚合物，這些嵌插集團如吖啶，補骨脂素等，那些帶有鰲合物的聚合物，這些鰲合物如金屬，放射性金屬，硼，氧化性金屬等等，那些帶有烷化集團的聚合物，那些帶有修飾連接的聚合物，例如α異位核酸，還有未作修飾的多核苷酸或寡核苷酸。
值得注意的是，術語「核苷」和「核苷酸」文中不僅包含已知的嘌呤和嘧啶，而且包含已被修飾的雜環鹼基。這些修飾包括甲基化嘌呤或嘧啶，醯基化嘌呤或嘧啶，或其他雜環化。被修飾核苷或核苷酸還包括對對糖結構的修飾，例如糖結構上的一個或多個羥基被滷素，脂肪基團所取代，或被醚，氨基之類功能化。術語「核苷酸單元」認為是包含了核苷和核苷酸。術語「核酸探針」和「探針」文中可相互替代，指的是由文中已定義的多核苷酸組成的結構，該結構包含一段核酸序列，可與對應的靶標特異性地結合。探針的多核苷酸區域可由DNA、RNA或合成的核苷類似物組成。術語「互補或配對」文中指的是兩段核酸序列同源性大於等於50%。最好兩段核酸序列同源性不低於 60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或 100%。「互補或配對」也意味著兩段核酸序列可在低、中或高嚴謹性的條件下進行雜交。序列同源性的比例可通過與相應的參照序列比對加以計算。術語「實質上互補或配對」文中指的是兩段核酸序列同源性大於等於90%。最好兩段核酸序列同源性不低於95 %，96 %，97 %，98 %，99 %或100 %。「實質上互補或配對」也意味著兩段核酸序列可在高嚴謹性的條件下進行雜交。序列同源性的比例可通過與相應的參照序列比對加以計算。總的而言，雜合體的穩定性是離子濃度和溫度的函數。通常情況下，雜交反應在較低嚴謹性的條件下進行，而隨後的清洗是在較高嚴謹性的條件下進行。中等嚴謹性的雜交條件允許核酸分子，例如探針，結合到互補的核酸分子上。已雜交的核酸分子通常有不低於 60 %的序列同源性，包括不低於70 %，75 %，80 %，85 %，90 %或95 %的序列同源性。中等嚴謹性的雜交相當於在由50%甲醯胺，5x Denhardt' s溶液，5x SSPE，0. 2% SDS組成的雜交液中進行42°C雜交反應，隨後在由0. 2x SSPE，0. 2% SDS組成的清洗液中進行42°C清洗。 高嚴謹性的雜交相當於在由50%甲醯胺，5x Denhardt' s溶液，5x SSPE,0. 2% SDS組成的雜交液中進行42°C雜交反應，隨後在由0. Ix SSPE，0. 1% SDS組成的清洗液中進行65°C清洗。低嚴謹性的雜交相當於在由10%甲醯胺，5xDenhardt，S溶液，6x SSPE，0. 2% SDS組成的雜交液中進行22V雜交反應，隨後在由Ix SSPE，0. 2% SDS組成的清洗液中進行37°C清洗。50x Denhardt' s溶液由1 % Ficoll，1 %聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和牛血清白蛋白 (BSA)組成。20x SSPE由3M氯化鈉，0. 2M磷酸二氫鈉和0. 025M EDTA組成。另外，RNA或DNA能在特定的雜交條件下與其相應的互補鏈進行雜交，產生實質上的互補性。通常情況下，鏈長在14到25的多核苷酸至少有65%互補性，最好至少75%互補性，至少90%互補性更佳，特異性雜交就能實現。術語「同源的」、「實質上同源的」和「實質上同源性」文中指的是胺基酸序列與相應的參考序列相比，至少有50 %，60 %，70 %，80 %或90 %的一致性。序列同源性的比例可通過與相應的參照序列比對加以計算。術語「多重」或者「多重檢測」文中指的是利用多種捕獲探針同時檢測多種靶標序列的方法或其它分析方法。所用的每種捕獲探針具有特定的檢測特徵，例如螢光特性(比如激發波長、發射波長、發射強度、半峰寬(FWHM)或螢光壽命)。當然，本發明在文中描述的方面和實例包括「由……組成的」或「基本上由……組成的」方面和實例。
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本發明的任何其它內涵、優點和特徵將通過後續的說明及相應附圖加以闡述說明。B.發光體「發光體」指的是化合物中的能呈現發光性質的原子或原子簇，存在無機和無機兩種類型，包括螢光團、磷光團和發色團。螢光團可以是量子點、蛋白質(如綠色螢光蛋白)， 或小分子螢光染料。而小分子螢光染料可以選擇氧雜蒽衍生物(螢光素，羅丹明，俄勒岡綠，曙紅組成的小組，德克薩斯紅等)，青色素衍生物(青色素，吲哚碳花青，羰花青，部花青等)，萘衍生物(丹磺醯和普羅丹等)，香豆素衍生物，二唑衍生物，芘衍生物(級聯藍色等)，惡嗪衍生物(尼羅河紅色，藍色尼羅河，甲酚紫，惡嗪170等)，吖啶衍生物(二氨基吖唆，吖啶橙，吖啶黃等)，次甲基衍生物(金胺，結晶紫，孔雀石綠等)，CF染料，Alexa染料， 四吡咯衍生物(卟吩，膽紅素等)，級聯黃色，天藍色乙，吖啶橙，DAPI，H0echst 33258，吡羅昔康，奎寧。磷光團可以選擇過渡金屬化合物或各類稀土化合物。發色團可以選擇視網膜染料，食品著色劑，織物染料(偶氮化合物)，番茄紅素，胡蘿蔔素，花青素，葉綠素，血紅蛋白，血藍蛋白，礦物(孔雀石，紫水晶等)。靶標分子能直接或間接地被發光體標記，這裡間接是指靶標分子與發光體之間有分子進行連結。對靶標分子進行某種合適的處理過程中，可以將發光體弓I入，標記到靶標分子上。C.微陣列晶片作為一種高通量的檢測技術，微陣列晶片技術能同時對成千上萬的分子間相互作用進行分析，已對生物、醫學和新藥開發產生了深遠的影響。DNA微陣列晶片技術已被廣泛應用於基因表達分析、突變分型、單核苷酸多態性(SNP)和短串聯重複序列(STR)。多肽微陣列晶片和化學微陣列晶片已經發展成為蛋白質組學領域兩個重要的工具。化學微陣列晶片，作為一種組合庫，也能用於先導化合物的鑑定，並優化這些先導化合物。在生物反恐領域，開發能監測環境中的多種生物戰劑或化學戰劑的微陣列晶片將引起執法機構的極大興趣。本發明的一些實例提供了一種分析分子間相互作用的方法。本發明的一些實例提供了一種多重分析靶標多核苷酸的方法。本發明技術上提高了基於微陣列晶片的檢測方法的特異性和靈敏度，同時降低了應用於基因檢測時的成本。圖1描述了將微陣列晶片與顆粒以及發光體集成在一起，用於分析分子間的相互作用的原理。用於分析的靶標分子包括多核苷酸、蛋白多肽、抗體、小分子化合物、多肽和碳水化合物。微陣列晶片是一項複雜的技術，已廣泛應用於分子生物學和醫學領域。它能用於分析多種靶標分子，包括多核苷酸、蛋白多肽、抗體、小分子化合物、多肽和碳水化合物。微陣列晶片可通過多種技術來製作，包括使用尖頭針點樣技術，基於預製掩模版光刻技術，基於動態微鏡裝置光刻技術，噴墨點樣技術，微接觸印章技術和微電極陣列上電化學技術。對於標準的微陣列晶片技術而言，探針分子通過表面工程方法被固定在晶片基底材料的表面上，這些基底材料包括玻璃、矽、塑料、水凝膠、瓊脂糖、硝酸纖維和尼龍。DNA微陣列晶片是把DNA寡聚核苷酸探針的微尺度點排成陣列構成。探針是基因上的一個短片斷或其他DNA片斷，能在嚴謹條件下與互補的多核苷酸樣品即靶標進行雜交。溶液中的靶標分子的檢測及定量可通過檢測已雜交到微陣列晶片上的螢光、銀染或者化學發光標記的靶標分子來實現。由於微陣列晶片上包含成千上萬條探針，一次微陣列晶片實驗能並行完成多個遺傳檢測。圖2為三類不同圖像獲取手段來檢測同一微陣列實驗結果，即明場下C⑶器件 (左圖)，螢光顯微鏡(中圖)，以及商用微陣列晶片掃描儀(右圖)。表明本發明對可見光檢測和螢光掃描檢測都適用。文中所用的微陣列晶片上可包含兩條或多條針對同一個靶標多核苷酸的探針。一些微陣列晶片的實例中，探針重複出現了多次，可能是2次，3次，4次，5次，6次，7次或者更多次。一些實例中，微陣列晶片上可包含兩條或多條針對同一個靶標多核苷酸的不同探針。 這些不同的探針可結合到同一個靶標多核苷酸的不同區域，無論區域之間是否有重疊。任何能確定靶標多核苷酸水平的探針都可用於微陣列晶片。一些實例中，探針是寡核苷酸。當然檢測靶標多核苷酸時，序列上的一定程度的變異是可以接受的。因而寡核苷酸序列或其互補序列可與相應的靶標多核苷酸序列上輕微的差別。對於本領域的技術人員而言，這種序列上的差異不會嚴重影響寡核苷酸探針確定靶標多核苷酸水平的能力。使用標準方法比對時，這些寡核苷酸序列上的變異具有較高的同源性。與靶標多核苷酸序列相比，本發明中所包含的寡核苷酸序列同源性至少為40 %，也可能至少50 %，60 %，70 %， 80^,90^,95%或更高的同源性。一些實例中，寡核苷酸探針包含兩部分，其中一部分用於檢測靶標多核苷酸。探針的另一部分另作他用，例如用於固定寡核苷酸探針到基底材料上。 另一些實例中，探針的另一部分包含非特異序列，比如poly-T或poly-dT，可用於增加探針上互補序列部分與基底材料表面之間的距離。文中所述的寡核苷酸探針包括DNA、RNA、PNA、ZNA、LNA，及他們的組合，或其修飾之後的形式。該寡核苷酸探針也包括被修飾的寡核苷酸骨架。一些實例中，寡核苷酸探針至少包含連續的9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或者更多個與全長或部分靶標多核苷酸互補或者相同的核苷酸序列。一條寡核苷酸探針可能包含兩段或更多段互補序列。一些實例中，寡核苷酸探針的5』或3』末端有活性基團，比如氨基，用於將該探針連接到基底材料上。一些實例中，探針是寡核苷酸。寡核苷酸探針可通過多種方式連接到微陣列晶片的基底材料上。這些方式包括但不限於已列出來的方式(1)基於光刻技術的原位合成，例如Affymetrix公司生產的高密度寡核苷酸陣列；(2)在玻璃、矽、尼龍或硝酸纖維上進行中低密度的點樣或者印製；C3)屏蔽選擇性合成；(4)在尼龍或硝酸纖維形成的雜交膜上打點雜交。寡核苷酸也可通過液相非共價鍵地固定到基底材料上，可利用微孔、微管道或毛細管等結構形成液相環境。眾所周知，許多技術都可用來把多核苷酸耦聯到固體載體上，比如玻璃基片。一種方法是將鹼基的修飾物或類似物插入到進行擴增的多核苷酸中，這些鹼基的修飾物或類似物包含能耦聯到固體載體上的基團，比如氨基，氨基的衍生物，或者帶正電荷的基團。 該擴增產物加到固體載體比如玻璃基片上。由於該固體載體上包被了醛基或其他的活性基團，使其可與擴增產物上的活性基團形成共價鍵，使得擴增產物共價連結到固體載體上。擴增產物構成的微陣列晶片可通過使用Biodot點樣儀(BioDot，Inc. Irvine, CA)和醛基玻片(CEL Associates, Houston, TX)製成。擴增產物能被點在醛基玻片上並按照文獻上公布的流程進行後續處理(Schena et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1995)，93 :10614-10619)。微陣列晶片可通過機械手點樣印製到玻璃，尼龍(Ramsay，G.，Nature Biotechnol. (1998), 16 :40-44)，聚丙烯(Matson, et al.，Anal Biochem. (1995), 224 (1) 110-116)，矽(Marshall and Hodgson,Nature Biotechnol. (1998)，16 :27-31)等固體載體上。製作微陣列晶片的其他方法包括電場下精確控制微量吸管(Marshall，and Hodgson, Nature Biotechnol. (1998)，16 :27-31)，多核苷酸直接點樣到帶正電荷的固體載體上。本發明方法可通過複雜的排布格式加以實施。這種複雜的分析方法可利用2，3，4， 5，10，15，20，25，50，100，200，500，1000或更多條捕獲探針，同時分析來自多個不同的靶標多核苷酸的擴增產物。一些實例中，這種複雜的分析方法用來分析沒有進行擴增放大的靶標多核苷酸序列。適合複雜分析的方法，例如這裡討論的方法，允許從更小的樣品中獲取更多的信息。這種對更小樣品的需求增加了研究人員為驗證新方法或簡化獲取數據而從人群中獲取更多個體的樣品的能力，當然更小的微創技術也是必要的。當不同的固體載體在複雜的分析方法中作為捕獲探針耦聯體的一部分而存在時， 這些不同的固體載體就可以通過編碼加以區分。任何編碼方案都可以使用。從方便角度看， 編碼方案可利用一種或多種不同的螢光集團，例如螢光半導體納米晶體。高密度的光譜編碼方案也可以使用。一種或多種不同光譜編碼的捕獲探針耦聯體可以構建出來。每種捕獲探針耦聯體上都包含一種或多種不同的捕獲探針，其被耦聯到固體載體上，而該固體載體通過一個或者多個螢光半導體納米晶體或螢光納米顆粒獲得特定的光譜編碼。這些不同的耦聯體可混合在一起分析，而不同的耦聯體可對應不同的試驗，那麼不同的試驗也可在耦聯體混合的狀態下完成。每個耦聯體因其所具有的光譜特性可進行掃描分析，通過對其光譜特性的解碼可鑑定出該耦聯體中的固體載體和固定於其上的捕獲探針。由於半導體納米晶體，螢光納米顆粒及其組合數目眾多且可通過光譜特性加以區分，於是大量的捕獲探針及相應的擴增產物就可同時進行分析研究。D.粒子本發明將顆粒，微顆粒或者微珠，最好是磁珠應用於基於微陣列晶片的分析中。顆粒或者珠子可通過各種不同的聚合物進行製備。這些聚合物包括但並不限於聚苯乙烯，交聯聚苯乙烯，聚丙烯酸，聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸/聚羥基乙酸共聚物，聚酸酐，聚甲基丙烯酸甲酯，乙烯/醋酸乙烯酯共聚物，聚矽氧烷，聚矽，乳膠，葡聚糖聚合物和環氧樹脂。可以理解，這些聚合物在溶脹和孔隙方面具有不同的特性。顆粒或者珠子粒徑在約10納米到 1毫米範圍內，粒徑在100納米到10微米範圍會更好。當這些顆粒懸浮在溶液中可通過常規的液體方面的技術對其加以操縱。術語「顆粒」，「珠子」，「球」，「微顆粒」，「微珠」和「微球」文中可相互替代。本發明中的微球可帶有檢測特性，這種檢測特性包括磁性，螢光，光吸收，反射，散射等。磁性顆粒適宜的化學成分可能是鐵磁材料，包括稀土比如含有鐵-鈷，鐵-鉬， 釤-鈷，釹-鐵-硼之類的材料。其他的磁性材料，例如氧化鐵0^304)之類的超順磁性材料也被使用。這些首選的磁性材料包括鐵-鈷材料都很容易被磁化，具有較強的磁化強度 (約1.7特斯拉)，且不易被腐蝕。由於顆粒的使用，昂貴的檢測儀器對結果檢測而言不是必需的。當微陣列晶片上探針點的尺寸超過0. 03毫米時，結合到探針點上顆粒可用肉眼直接觀察分析。另一種方
23式，當探針點的尺寸在0. 01毫米到5毫米範圍時，其對應的結果可用普通的相機/攝像機拍攝成像，或者通過一個適當放大倍率的顯微鏡來觀察。當然如果顆粒被修飾，比如用螢光，化學發光和酶標記進行修飾，那麼相對應的檢測方法就可用於結果檢測。例如用酶，二茂鐵或其他的電活性標記對顆粒進行修飾，就可用電化學方法進行檢測，也可以基於表面等離子共振或者微天平技術進行無標記檢測。有可能的話，商用的螢光微陣列晶片掃描儀可用於檢測螢光標記的顆粒或者帶有自身螢光的顆粒。E.靶標多核苷酸核酸靶序列(或「靶標多核苷酸」)可以是單鏈，雙鏈，或多條鏈，也可以是線性或圓形。一般單鏈的靶標多核苷酸，包括基因，rRNA基因，tRNA基因，hnRNA，小RNA，單鏈RNA 病毒基因組和單鏈DNA或類病毒。這些多核苷酸可能包含內部互補序列和重要的二級結構。一般雙鏈的靶標多核苷酸，包括基因組DNA，線粒體DNA，葉綠體DNA，雙鏈RNA或雙鏈 DNA病毒的基因組，質粒，噬菌體，shRNA (小髮夾RNA或短髮夾RNA)，與siRNA (小幹擾RNA)。 靶標多核苷酸可以直接合成或從生物材料提取。靶標多核苷酸可以純化，以消除或者減少不必需組成部分或進行濃縮，這樣也有利於多核苷酸擴增。相反，如果靶標多核苷酸濃度過大，可先稀釋。經過樣品採集和可選的核酸提取和純化，該靶標多核苷酸或其部分組分，可以經過一個或多個操作過程。這些操作過程可以包括體外轉錄，標記，片段化，擴增和其他反應。處理前，mRNA可先用逆轉錄酶和引物反轉錄成cDNA。核酸擴增方法增加了序列拷貝數，同時可通過帶標記的引物或帶標記核苷酸的引入，將產物多核苷酸進行標記。有諸多擴增方法可用，包括聚合酶鏈反應(PCR)，轉錄介導擴增(TMA)，連接酶鏈反應(LCR)，自持續序列複製(3SR)，基於核酸序列的擴增(NASBA)，滾環複製(RCA)，環介導等溫擴增(LAMP)， Q-Beta複製酶擴增，反轉錄，缺口翻譯擴增，等等。特別指出，擴增過程可同步進行標記。目前的檢測設備和方法可以適用檢測任何類型的核苷酸。這些核苷酸，AMP, GMP, CMP，UMP，ADP，⑶P，CDP，UDP，ATP，GTP，CTP，UTP，dAMP, dGMP, dCMP, dTMP, dADP, dGDP, dCDP, dTDP, dATP, dGTP, dCTP 和 dTTP。某些形式中，核酸靶序列並沒有對序列進行直接標記。如果對核酸靶序列進行直接標記，或者將帶標記的核酸靶序列引入，這個標記是不應該幹擾的捕獲探針結合能力以及檢測相關報告基團。如果是單鏈靶標多核苷酸，第一輪擴增形成了含有引物並與靶標多核苷酸互補的延伸物。如果靶標多核苷酸是單鏈RNA，先使用逆轉錄酶反轉錄成DNA，再進行複製擴增。用於PCR擴增的引物必須能與模板進行互補雜交，反覆以3』進行延伸，產生相應長度的擴增產物。靶標多核苷酸經由引物和聚合酶來擴增，可以複製靶標多核苷酸的全長或其中一部分。任何有聚合酶活性的酶類，都可能被用來複製的靶標多核苷酸，包括DNA聚合酶，RNA 聚合酶，逆轉錄酶，具有多重活性聚合酶。聚合酶耐熱或耐高溫。另外，酶的混合物也可採用。這些酶包括DNA聚合酶，比如DNA聚合酶I，Klenow片段，T4酶，T7酶，Tub酶，Taq酶， Tth酶，Pfx酶，Pfu酶，Tsp酶，Tfl酶，Tli酶，GB-DDNA聚合酶；RNA聚合酶，比如大腸桿菌， SP6，T3以及T7RNA聚合酶；反轉錄酶，如AMV，M_MuLV，MMLV，核糖核酸酶H減去MMLV，HIV-I 和RAV2逆轉錄酶。這些酶都可以在市場上找到。多重活性聚合酶，包括RAV2酶和Tli (外切)聚合酶。耐熱聚合酶，包括Tub酶，Taq酶，Tth酶，Pfx酶，Pfu酶，Tsp酶，Tfl酶，Tli 酶和GB-DDNA聚合酶。選擇適宜的反應條件進行多核苷酸擴增，包括pH值，緩衝液，離子強度，存在一種或更多種的鹽離子，反應物濃度和輔因子的濃度，如核苷酸，鎂或其他金屬離子，可選佐齊U，溫度，擴增聚合酶鏈反應的熱循環程序，並可能部分取決於使用的聚合酶以及樣品本身的性質。佐劑包括甲醯胺(通常約2-10%)，甘油(通常約5-10%)，和DMSO(通常約 0.9-10%)。一些技巧可用於擴增過程，以最大限度地減少假陽性或錯誤結果。這些技巧， 包括「降落」PCR技術，熱啟動技術，嵌套引物，或設計PCR引物使其一旦有引物二聚體就造成莖環結構以防止擴增。也有加速聚合酶鏈反應的技巧，例如，離心式PCR能促使更強的液體對流，還可以包括快速紅外線加熱和樣品冷卻。可採用一個或多個循環，用以擴增。使其中一個引物過量，可導致PCR擴增產物中這條引物的延伸物過量，而此延伸物最好正是待檢測的目標。多種不同的引物可用於擴增樣本內的不同區域的特定多核苷酸。此法可多重同步進行，即多個不同的檢測可以同時運行，使用不同的引物來針對不同的檢測區域；這些檢測區域可以是互不相關的靶標片段，來自不同的等位基因，不同的等位基因亞型，或者染色體重排。這意味著允許在一個樣本(例如，cDNA文庫中的特定基因)對多個靶標多核苷酸進行定量。通過一種獨特的捕獲序列或一個獨特的標記，可以對樣品中不同的多核苷酸產物進行區分。擴增的靶標多核苷酸還可以進行後續相關處理。例如，在某些情況下，可以對它進行小片段化，減少環狀結構形成和避免糾結多個捕獲探針，從而有利於與多核苷酸陣列雜交。核酸片段化的方法很多，只要能產生合適的片段大小均可採用，以物理的、化學的和酶的方法為常見。擴增的靶標多核苷酸可以耦合到顆粒上，通過直接連接，或多核苷酸/顆粒上的修飾功能基團。在一些具體形式中，靶標多核苷酸被修飾，如生物素化。在其他一些形式中，這些顆粒被修飾了功能基團，如鏈黴親和素，中性親和素，以及親和素等。靶標多核苷酸可以通過這種修飾基團和顆粒上的功能基團來耦聯。對於雙鏈靶標多核苷酸，與顆粒耦合之後可以用變性方法來製備單鏈靶標多核苷酸；變性的方法，比如化學反應，酶或加熱，或兩者兼而有之。在一些具體形式中，化學變性方法採用尿素，甲醯胺，甲醇，乙醇，酶，或氫氧化鈉。在一些具體形式中，酶法採用核酸外切酶和尿嘧啶N-糖苷酶。在其他一些具體形式中，雙鏈靶核酸熱變性採用30-95 °C之間的合適溫度。對本發明的方法適合於對某一樣品中的多個靶標多核苷酸進行分析。多個靶標多核苷酸可以經由多個擴增引物產生，或一套擴增引物產生，這些都是針對特定的核酸擴增靶序列進行特異性擴增。樣品可以是一個陽性對照，含有已知的靶標多核苷酸或相關成分。樣品也可以是陰性對照，雖然並不期望含有靶標多核苷酸，但實際也可能含有，以用於測試，便於確認給定實驗所用的試劑沒有靶標多核苷酸，以及確認給定的試驗條件是否產生假陽性，即無靶標多核苷酸情況下還有陽性信號。樣品可稀釋，溶解，懸浮，提取或以其他方式處理，以獲得或純化靶標多核苷酸，方便後續核酸擴增或檢測。如果樣品含有細胞，這些細胞可以裂解或通透釋放細胞內的多核苷酸。通透試劑也可用於裂解細胞，方便後續操作，比如聚合酶鏈反應。
F.遺傳信息本專利所指基於微陣列的分析方法可適用於檢測任何遺傳信息。例如，遺傳信息可以是基因突變形式中的一種或幾種，包括鹼基替換，插入，刪除，及插入刪除等。某一種具體的情況，此遺傳信息可以是單核苷酸多態性(SNP)。某一種具體的情況，此遺傳信息可以是基因。某一種具體的情況，遺傳信息是基因產物，包括蛋白質，抗體，小分子化合物，肽和碳水化合物。該靶標等位基因可能存在單鹼基替換，插入，或刪除，或多個基替換，插入，或刪除，或插入刪除。此外，核苷酸也可能有修飾，包括重排，添加，替換或改變的嘌呤或嘧啶鹼基的氫鍵形成，能影響各自互補的嘌呤嘧啶或功能。由此產生的改性核苷酸可以與其他改性的核苷酸形成互補配對，而不是通常的A、T、C、G或U。這些改性應該不影響核苷酸的功能。部分或全部多核苷酸殘基都可以根據需要進行修改。線粒體DNA (mtDNA)在有絲分裂和減數分裂期間都要經過複製分離，加之mtDNA突變率高，使得體細胞和生殖細胞中可以同時具有突變型和野生型mtDNA分子，稱為異質性 (heteroplasmy)。異質性細胞經過有絲分裂和減數分裂後，隨機分配到兩個子代細胞，突變型和野生型mtDNA的比例發生改變，分別向純合突變型或純合野生型漂變，再經過多次分裂後，細胞達到完全純合，稱為均質性(homoplasmy)。異質性和複製分離現象表明，即使核基因組完全相同的個體，如一卵雙生，也可具有不同的細胞質基因型，從而表型有所不同。典型的AT和GC鹼基對之間由氫鍵來形成，即胸苷的N3-H及C4-0H和腺苷的m-OH 及C6-NH2分別形成氫鍵，胞苷的C2-0H，N3-NH2及C4-NH2和鳥苷的C2_NH2，N，-H及C6-0H 分別形成氫鍵。因此，舉例來說，鳥苷可以被改性，形成異鳥苷(2-氧-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖嘌呤)，將不能有效地與胞嘧啶形成典型的氫鍵。然而，胞嘧啶改性，形成異胞嘧啶 (1- β -D-呋喃核糖-2-氨基-4-氧嘧啶)，將不會有效地與鳥苷形成鹼基對，而與異鳥苷則可以。多態性區域，這裡定義為遺傳位點的一部分，至少包含一個多態性位點。而遺傳位點是位於染色體上與基因，身體特徵，表型性狀相關的位置。多態性位點是在人群中存在並至少有兩個替換性的序列位置。多態性區域此處定義指相對於多態性位點來說的，即該區域可能是相鄰位點的5』端或位點的3』端，或者多態性區域可能包含多態性位點。多態性區域可以包括含有多態性位點的多核苷酸正義鏈和反義鏈，並且長度可能約100至5000個鹼基對。例如，多態性區域可能是基因調控區域的全部或部份，如啟動子，5』非編碼區，3』 非編碼區，內含子，外顯子等。多態性或等位的變種，可以是基因組DNA，cDNA，mRNA或多肽， 其具有核苷酸或者胺基酸序列的多態性位點。多態性位點是序列變異所產生的位點，包括核苷酸替換(單核苷酸多態性或SNPs)，插入，刪除，插入刪除和微衛星。多態性位點可能會也可能不會導致基因表達，蛋白結構或蛋白功能的差異。單體型此處定義為在染色體對的一條染色體上遺傳多態性位點組合的表現類型。 基因型則指多態性位點處的表現類型。本領域人士應該知道，與多態性區域互補的寡核苷酸能夠在一定嚴謹條件下與多態性位點區域雜交，並進行分析，如引物延伸的序列測定方法，限制性位點分析，核酸擴增方法，基於連接酶的測序方法，基於不匹配的序列測定方法，基於基因晶片的序列測定方
YA J寸寸ο
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G.用於靶標多核苷酸擴增的寡核苷酸引物在某些方面，這個發明還體現在那些適用於聚合酶鏈反應(PCR)或其他核酸擴增方法寡核苷酸引物對上。運用已有的知識並結合此處所學，普通本領域人士就能夠設計出合適的寡核苷酸引物對。運用這一方法設計的特異性寡核苷酸引物對系列見表2，這些特異性寡核苷酸引物對適用於擴增GJB2，SLC26A4和12S rRNA上多態性位點所在的多態性區域。其他適合擴增GJB2，SL(^6A4和12S rRNA上多態性區域的寡核苷酸引物對，也可以運用類似方法設計出來並且可以避免多餘的實驗。另一些方面，一個突變位點對應於至少兩個等位基因特異性引物。其中一個等位基因特異性引物包含一段相同或互補的含有突變位點的突變型等位基因的目標片段。等位基因特異性引物與模板結合可終止在突變位點的3』端。為了提高分辨靶基因上野生型和突變型等位基因的能力，在等位基因特異性引物中可以引入人工錯配。人工錯配可以是天然的鹼基，也可以是核苷酸類似物。該發明中的每個PCR弓丨物對可以用於任何PCR方法。 例如，該發明中的PCR引物被運用在美國的專利第4683195，4683202，4965188，5656493， 5998143,6140054, WO 01/27327和WO 01/27329中涉及的方法，諸如此類的還有很多。本發明中的PCR引物對也可用在進行PCR反應任何商用儀器，例如Applied Biosystems公司提供的GeneAmp 系統。現有引物可包括任何合適的核酸類型，例如DNA，RNA，PNA或其衍生物。另外，這些引物可以包括一段核苷酸序列或其互補鏈，具體的見表2所示。寡核苷酸引物可由任何適當的方法合成。例如，引物可以化學合成，也可以從天然來源中分離得到，也可以用重組的方法生產，或者多種方法結合使用。合成寡核苷酸也可以通過三酯法製備(Matteucci et al.，J. Am. Chem. Soc.，3 :3185-3191 (1981))。另外，自動合成可能是首選，例如，在一個Applied Biosynthesis DNA合成儀上使用氰乙基亞磷醯胺化學合成法。當然，引物最好是化學合成的。在本發明中，適用於合成寡核苷酸引物的鹼基可以從自然的核苷酸鹼基中選擇， 如腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤，尿嘧啶和胸腺嘧啶。它也可以從非自然或合成的核苷酸鹼基中選擇，如如8-羰基鳥嘌呤，6-巰基鳥嘌呤，4-乙醯胞苷，5-(羧基羥乙基)尿苷，2』-氧化甲基胞苷，5-羧基甲氨基-甲基-2-硫嘧啶，5-羧基甲氨基尿苷，二氫尿嘧啶核苷，2』-氧化甲基假尿苷，β -D-半乳糖苷-7- (4，5-順式)-二羥-2-環戊烯，2』 -氧化甲基鳥苷，肌苷，腺苷-異戊烯腺苷，I"甲基腺苷，I"甲基假尿苷，I"甲基鳥苷，I"甲基肌苷，2，2- 二甲基鳥苷， 2-甲基腺苷，2-甲基鳥苷，3-甲基胞苷，5-甲基胞苷，腺苷-甲基腺苷，7-甲基鳥苷，5-甲基氨甲基尿苷，5-甲氧基氨甲基-2-硫尿苷，β -D-甘露糖基-7- (4，5-順式)-二羥-2-環戊烯，5-甲氧基羰甲基尿苷，5-甲氧基尿苷，2-甲硫基-Ν6-異戊烯腺苷，N- ((9-, β . -D-呋喃核糖-2-甲基硫嘌呤-6-基)氨基甲醯)蘇氨酸，N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基) N-甲基氨基甲醯)蘇氨酸，尿苷-5-氧乙酸甲酯，尿苷-5-氧乙酸，wybutoxosine，假尿苷， 7- (4，5-順式)-二羥-2-環戊烯，2-巰基胞苷，5-甲基-2-硫尿核苷，2-硫尿核苷，2-硫尿核苷，5-甲基尿苷，N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨基甲醯)蘇氨酸，2』 -氧化甲基-5-甲基尿苷，2』 -氧化甲基尿嘧啶核苷，wybutosine和3_(3_氨基_3_羧丙基)尿苷。同樣的，寡核苷酸的化學類似物也可被利用(例如，寡核苷酸中的磷酸二酯鍵被修飾為磷酸甲酯，磷酸三酯，硫代磷酸酯，或氨基磷酸酯)。用3』端加帽」的方法可以保護寡核苷酸免受降解，因為在3』端加帽後，3』端的磷酸二酯鍵被抗核酸酶的鍵取代Ghaw et al·，Nucleic Acids Res.，19 :747 (1991))。在這種方式中，磷醯胺，磷酸酯和磷酸甲基鍵都充分體現其功能。在磷酸骨幹進行更廣泛的修飾已被證明能夠增加穩定性，同時增強親和力，及提高寡核苷酸細胞滲透力(Milligan et al.，J. Med. Chem.，36 1923 (1993))。許多不同化學方法的運用可使整個磷酸骨架被新的鍵所取代。骨架類似物有很多，例如磷硫醯，二硫代磷酸酯，磷酸甲酯，氨基磷酸酯，硼烷磷酸酯，磷酸三酯，甲醯醛縮醇，3』 -巰基甲醯醛縮醇，5』 -巰基甲醯醛縮醇，5』 -硫醚，碳酸鹽，5』 -N氨基甲酸酯，硫酸，磺酸，氨基磺酸，磺胺類，碸，亞硫酸鈉，亞碸，硫化物，羥胺，亞甲基等。磷硫醯和磷酸甲酯修飾是常見的寡核苷酸修飾，因為它們應用於自動寡核苷酸的合成過程中。寡核苷酸可能是一個肽核酸， 如 Milligan 描述的那樣(Milligan et al.，J. Med. Chem.，36 1923 (1993))。唯一的要求是，寡核苷酸引物序列應具有至少部分能與目標序列互補的一段序列。靶標多核苷酸可能是雙鏈，也可能是單鏈。在一些具體事例中，單鏈靶標多核苷酸的至少部分與固定在微陣列上的寡核苷酸探針完全或大體上互補。在其他事例中，單鏈靶標多核苷酸與固定在微陣列上的寡核苷酸探針是完全互補的。圖3是發明示意圖，是基於微陣列方法結合微粒以及發光體，用於檢測靶標雙鏈多核苷酸。利用PCR、RT-PCR或其他相關方法，可將多核苷酸分子轉換成生物素、地高辛等標記的多核苷酸片段，容易與顆粒表面基團耦聯。通過耦聯，溶液中的多核苷酸片段能得到富集。對雙鏈多核苷酸片段，它們可以通過變性成為單鏈多核苷酸。通過靶標-探針雜交反應，顆粒能耦合到特定微陣列表面，它們本身或者對其進一步修飾，能方便地通過非昂貴的檢測設備或商用晶片掃描儀的來讀取結果。特定的基因，基因突變，如刪除，插入，和插入刪除等，能因此得到檢測。此發明允許任何方法來檢測多核苷酸，這裡更特指檢測多態性位點。例如，等位基因特異性引物方法，引物延伸方法，基於連接酶的序列測定方法，基於不匹配的序列測定方法，或基於微陣列的序列測定方法。另外，限制性片段長度多態性(RFLP)，單鏈構象多態性檢測(SSCP)，變性梯度(DGGE)凝膠電泳，變性高效液相色譜(DHPLC) ,TaqMan PCR等，都可以使用。等位基因特異性引物用於檢測基因突變，分兩種策略，一種是採用等位基因特異性探針陣列，另一種是採用通用標籤微陣列。等位基因特異性PCR(ASPCR)也被稱作擴增阻滯突變系統(ARMQ或PCR-序列特異性引物(PCR-SSP)方法，具有很高的突變位點分辨能力。ASPCR適合已知多態性位點的基因序列分析，採用的DNA聚合酶沒有3』 -5』外切酶活性，如果3』端特異性引物與模板不匹配，此引物不能延伸從而導致PCR反應被阻止。利用多重PCR技術，可以同時擴增多個多態性位點，然後用DNA晶片進行區分。多重PCR擴增可以在單個管子或不同的管子中進行。採用通用陣列技術，標籤序列結合在引物上，其PCR產物可以方便地與標籤探針雜交。微陣列在這裡只是作為一個解碼工具。標籤序列(Tag)是人工設計的並加以嚴格篩選，他們有相應的互補序列，即cTag等。每個標籤序列及其互補標籤序列的組合對應等位基因上的一個基因突變位點。不同標籤序列之間的Tm值不大於5°C，並且標籤序列相互之間或者與引物之間無交叉雜交，與物種基因組DNA同源性很低，並且沒有髮夾結構。基因或基因型是根據雜交信號以及微陣列上標籤探針的位置來確定的。
圖4為通用標籤陣列的一個具體例子，與遺傳性耳聾相關的8個SNP/突變檢測相對應，其布局包括16種標籤，並且每種標籤水平重複5次。組成通用標籤探針陣列的標籤核苷酸序列如表1所示。在一些變化形式中，每個標籤探針進行5，-氨基修飾，其中5 』端還含有15聚胸苷的連接序列。QC和BC分別代表微陣列製作效果的陽性和陰性對照。PC和NC 分別代表微陣列雜交過程的陽性和陰性對照。MC代表顆粒表面修飾基團與靶標多核苷酸耦聯的陽性對照。這些考慮確保檢測過程中的每個步驟以及最終結果是正確無誤的。當然， 針對特定的應用，人們可以使用更多或更少標籤序列，以及水平複製的次數或不複製。這些標籤序列是由生物信息學方法設計的。標籤探針序列與靶標基因生物物種沒有同源性。例如，如果靶標來源是人類，標籤序列可以來自細菌序列。這種標籤序列可以是單鏈寡核苷酸或肽核酸。本發明所指的通用標籤微陣列與普通晶片是不同的。對於常見的基因微陣列，探針序列可能是基因特異性的寡核苷酸或多態性位點特異性寡核苷酸，這樣對不同的靶基因或多態性位點檢測需要不同的探針類型。然而，通用標籤微陣列是由專門設計的標籤序列探針組成的，因此他們並不與基因特異性引物或等位基因特異性寡核苷酸直接相關。該標籤序列可以作為同一物種基因突變或不同物種的基因突變的代碼。利用此通用的陣列格式，可用於檢測任何基因或基因型，即檢測過程變成類似於解碼過程。H.試劑盒本發明也提供一種試劑盒，用於檢測分子相互作用，包含發光體，顆粒，微陣列和晶片上固定的探針分子。在某些方面，發明的試劑盒含有通用探針序列微陣列。對檢測多態性位點來說，本發明的試劑盒包括一套等位基因特異性擴增引物和螢光標記的下遊共用引物，如表2所示。本發明的試劑盒還可能包括例如聚合劑(比如耐高溫的核酸聚合酶)， 等等。本發明的試劑盒還可能包括用於核苷酸鏈延伸的試劑，諸如dATP，dTTP，dGTP，dCTP， dITP，及它們的類似物，只要能在耐熱性核酸聚合酶催化下作為基質加入到核酸延伸鏈中即可。更具體的來說，試劑盒包括至少一對的寡核苷酸引物，聚合劑，鏈延伸用的核苷酸。本發明的試劑盒還可以包括緩衝液，容器，微孔板，使用說明書等。下面的實施例是用來解釋本發明，而不是對發明進行限制。實施例1、應用本發明的試劑盒檢測遺傳性耳聾以下以檢測遺傳性耳聾相關的8個SNP/突變的試劑盒為例，對本發明進行具體闡述。一、微陣列晶片通用標籤陣列是由16個標籤探針組成的矩陣，能與多重PCR產物進行雜交反應， 另外還有用於質控微陣列製作效果的陽性對照OiC)和陰性對照(BC)，質控微陣列雜交過程的陽性對照(PC)和陰性對照(NC)，以及質控顆粒表面鏈黴親和素與生物素化靶標多核苷酸耦聯的陽性對照(MC)。陽性對照OiC)是一種一端標記HEX螢光、另一端氨基修飾的寡核苷酸探針，用於監察微陣列點制和陣列上固定的效果。陰性對照(BC)僅是陣列點制緩衝液，用於監測交叉汙染的可能性。陰性對照(NC)是一種氨基修飾的寡核苷酸探針，理論上不會與溶液中的任何分子進行雜交，用於監測非特異性雜交的可能性。PC是一種氨基修飾的寡核苷酸探針，能與看家基因PCR產物雜交，用於監測PCR和雜交效果。MC是一種氨基修飾的生物素化寡核苷酸探針，能結合鏈黴親和素塗層的顆粒，用於監測鏈黴親和素與生物素化DNA片段的結合能力。通用標籤陣列的探針依格式進行設計NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-TagX，其中X是一個 1到16的序數。探針5』端有氨基修飾，接著是15聚胸苷(dTM)，再接著分別為表1所列 Tagl到Tagl6的序列。標籤探針中Tagl到Tagl6的核苷酸序列與擴增引物中的Tagl到 TaglB的其核苷酸序列一一對應相同。通用標籤陣列上的探針見表1。表1通用標籤陣列上的探針
權利要求
1.輔助檢測遺傳性耳聾的試劑盒，為如下⑴或⑵或⑶或⑷或(5)(1)所述試劑盒包括引物組合物；所述引物組合物由權利要求6所述的引物組I、權利要求9所述的引物組II、權利要求12所述的引物組III、權利要求15所述的引物組IV、權利要求18所述的引物組V、權利要求21所述的引物組VI、權利要求M所述的引物組VII 和權利要求27所述的引物組VIII組成；(2)所述試劑盒包括引物組合物；所述引物組合物由權利要求7所述的引物組I、權利要求10所述的引物組II、權利要求13所述的引物組III、權利要求16所述的引物組IV、權利要求19所述的引物組V、權利要求22所述的引物組VI、權利要求25所述的引物組VII 和權利要求洲所述的引物組VIII組成；(3)所述試劑盒包括試劑組合物；所述試劑組合物由權利要求8所述的試劑I、權利要求11所述的試劑II、權利要求14所述的試劑III、權利要求17所述的試劑IV、權利要求 20所述的試劑V、權利要求23所述的試劑VI、權利要求沈所述的試劑VII和權利要求四所述的試劑VIII組成；(4)所述試劑盒包括引物組合物；所述引物組合物由如下組分中的一種或幾種組成 權利要求6或7所述的引物組I、權利要求9或10所述的引物組II、權利要求12或13所述的引物組III、權利要求15或16所述的引物組IV、權利要求18或19所述的引物組V、權利要求21或22所述的引物組VI、權利要求M或25所述的引物組VII和權利要求27或 28所述的引物組VIII ；(5)所述試劑盒包括試劑組合物；所述試劑組合物由如下組分中的一種或幾種組成 權利要求8所述的試劑I、權利要求11所述的試劑II、權利要求14所述的試劑III、權利要求17所述的試劑IV、權利要求20所述的試劑V、權利要求23所述的試劑VI、權利要求沈所述的試劑VII和權利要求四所述的試劑VIII。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括基片、所述試劑組合物和顆粒；所述試劑組合物中的探針組固定於所述基片上，形成微陣列晶片；所述基片的材質為矽、玻璃、塑料、水凝膠、硝酸纖維或尼龍；所述顆粒為微球或磁性微球。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於所述微陣列晶片上還排列有陽性對照MC、 陽性對照PC、陰性對照NC和陽性對照QC ；所述陽性對照MC為序列表的序列17所示的DNA 或在序列表的序列17所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA ；所述陽性對照PC為序列表的序列18所示的DNA或在序列表的序列18所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述陰性對照NC為序列表的序列19所示的DNA或在序列表的序列19所示DNA 的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述陽性對照QC為序列表的序列20所示的DNA 或在序列表的序列20所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為 5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒還包括序列表的序列46所示的DNA和如下DNA (A)或(B)(A)序列表的序列45自5，末端第23至41位核苷酸所示的DNA；(B)序列表的序列45所示的DNA。
5.如權利要求2至5中任一所述的試劑盒，其特徵在於所述顆粒為鏈黴親和素包被的顆粒；序列表的序列46所示DNA的5』末端連接有生物素，自5』末端第8位核苷酸標記有螢光素Cy3 ；序列表的序列17所示DNA的3』末端連接有生物素；序列表的序列20所示 DNA的3，末端連接螢光素HEX。
6.輔助檢測遺傳性耳聾的引物組I，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列21自5』末端第23至 42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列22自5，末端第23至41位核苷酸所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列21所示的DNA、序列表的序列22所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA。
7.如權利要求6所述的引物組I，其特徵在於所述(a)或(b)中，序列表的序列23所示DNA的5』末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列23所示的DNA自5』 末端第4位核苷酸標記有螢光素Cy3。
8.輔助檢測遺傳性耳聾的試劑I，由權利要求6或7所述引物組I和探針組I組成；所述探針組I為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列1所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列1所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。
9.輔助檢測遺傳性耳聾的引物組II，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列M自5』末端第23至 42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列25自5，末端第23至40位核苷酸所示的DNA和序列表的序列26所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列M所示的DNA、序列表的序列25所示的DNA和序列表的序列沈所示的DNA。
10.如權利要求9所述的引物組II，其特徵在於所述(a)或(b)中，序列表的序列沈所示DNA的5』末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列沈所示的DNA自 5』末端第6位核苷酸標記有螢光素Cy3。
11.輔助檢測遺傳性耳聾的試劑II，由權利要求9或10所述引物組II和探針組II組成；所述探針組II為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列3所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列3所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。
12.輔助檢測遺傳性耳聾的引物組III，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列27自5』末端第25至 42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列觀自5，末端第M至40位核苷酸所示的DNA和序列表的序列四所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列27所示的DNA、序列表的序列觀所示的DNA和序列表的序列四所示的DNA。
13.如權利要求12所述的引物組III，其特徵在於所述(a)或(b)中，序列表的序列 29所示DNA的5』末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列四所示的DNA 自5』末端第6位核苷酸標記有螢光素Cy3。
14.輔助檢測遺傳性耳聾的試劑III，由權利要求12或13所述引物組III和探針組 III組成；所述探針組III為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列5所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列5所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。
15.輔助檢測遺傳性耳聾的引物組IV，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列30自5』末端第25至 43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列31自5，末端第25至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列32所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列30所示的DNA、序列表的序列31所示的DNA和序列表的序列32所示的DNA。
16.如權利要求15所述的引物組IV，其特徵在於所述(a)或(b)中，序列表的序列32 所示DNA的5』末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列32所示的DNA自 5』末端第6位核苷酸標記有螢光素Cy3。
17.輔助檢測遺傳性耳聾的試劑IV，由權利要求15或16所述引物組IV和探針組IV 組成；所述探針組IV為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列7所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列8所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列7所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列8所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。
18.輔助檢測遺傳性耳聾的引物組V，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列33自5』末端第25至 47位核苷酸所示的DNA、序列表的序列34自5，末端第M至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列35所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列33所示的DNA、序列表的序列；34所示的DNA和序列表的序列35所示的DNA。
19.如權利要求18所述的引物組V，其特徵在於所述(a)或(b)中，序列表的序列35 所示DNA的5』末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列35所示的DNA自 5』末端第6位核苷酸標記有螢光素Cy3。
20.輔助檢測遺傳性耳聾的試劑V，由權利要求18或19所述引物組V和探針組V組成； 所述探針組V為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列9所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列10所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列9所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列10所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。
21.輔助檢測遺傳性耳聾的引物組VI，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列36自5』末端第23至 45位核苷酸所示的DNA、序列表的序列37自5，末端第23至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列38所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列36所示的DNA、序列表的序列37所示的DNA和序列表的序列38所示的DNA。
22.如權利要求21所述的引物組VI，其特徵在於所述(a)或(b)中，序列表的序列38 所示DNA的5』末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列38所示的DNA自 5』末端第5位核苷酸標記有螢光素Cy3。
23.輔助檢測遺傳性耳聾的試劑VI，由權利要求21或22所述引物組VI和探針組VI 組成；所述探針組VI為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列11所示DNA和序列表的序列12所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列11所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列12所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列11所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列12所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。
24.輔助檢測遺傳性耳聾的引物組VII，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列39自5』末端第24至 46位核苷酸所示的DNA、序列表的序列40自5，末端第M至45位核苷酸所示的DNA和序列表的序列41所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列39所示的DNA、序列表的序列40所示的DNA和序列表的序列41所示的DNA。
25.如權利要求M所述的引物組VII，其特徵在於所述(a)或(b)中，序列表的序列 41所示DNA的5，末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列41所示的DNA 自5』末端第4位核苷酸標記有螢光素Cy3。
26.輔助檢測遺傳性耳聾的試劑VII，由權利要求M或25所述引物組VII和探針組 VII組成；所述探針組VII為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列13所示DNA和序列表的序列14所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列13所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列14所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列13所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列14所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。
27.輔助檢測遺傳性耳聾的引物組VIII，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列42自5』末端第23至 43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列43自5，末端第23至44位核苷酸所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列42所示的DNA、序列表的序列43所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA。
28.如權利要求27所述的引物組VIII，其特徵在於所述(a)或(b)中，序列表的序列 44所示DNA的5，末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列44所示的DNA 自5』末端第4位核苷酸標記有螢光素Cy3。
29.輔助檢測遺傳性耳聾的試劑VIII，由權利要求27或28所述引物組VIII和探針組 VIII組成；所述探針組VIII為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列15所示DNA和序列表的序列16所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列15所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列16所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列15所示DNA的5』末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列16所示DNA的5』末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優選為15個脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5』末端第一位核苷酸修飾有氨基。
30.權利要求6至四中任一所述引物組或試劑在製備輔助檢測遺傳性耳聾的試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明提出了一種磁珠與發光體共標記以檢測遺傳性耳聾的試劑盒。本發明的試劑盒包括針對GJB2(Cx26)基因、SLC26A4(PDS)基因和12S rRNA(MTRNR1)基因上的八個遺傳性耳聾的基因位點的引物組合物和探針組合物，可用於準確判斷相關位點為野生型、純合突變型或者雜合突變型，以實現遺傳性耳聾分子診斷。該引物組合物包含一些經發光體標記的引物。應用本發明的試劑盒可以通過螢光顯微鏡、微陣列雷射掃描儀、價廉的設備或者肉眼觀察進行檢測。本發明提供的引物組、試劑組以及試劑盒可以用於遺傳性耳聾的臨床輔助診斷及篩查，實現遺傳性耳聾的早期發現、提早預防以及產前指導，具有重大的商業價值和社會意義。
文檔編號C12Q1/68GK102453761SQ20101052768
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月27日 優先權日2010年10月27日
發明者程京, 蔣迪, 邢婉麗, 項光新, 高華方 申請人:博奧生物有限公司, 清華大學