一種整合型麥芽糖假絲酵母基因表達系統及其應用的製作方法

2023-09-22 13:17:45 2

專利名稱：一種整合型麥芽糖假絲酵母基因表達系統及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種新的整合型麥芽糖假絲酵母基因表達系統的構建，及其在蛋白質生產中的應用。
背景技術：
自40多年前(1964年)Komagata等首次描述無芽孢酵母——麥芽糖假絲酵母 (Candida maltosa)，就引起了廣泛的學術和工業興趣。麥芽糖假絲酵母能夠在以正構烷烴或脂肪酸作為唯一碳源作和能量的條件下生長。第一個麥芽糖假絲酵母分離株是從穀氨酸單鈉製造過程中的中和槽的膠黏劑中獲得。在19世紀60年代初期，碳氫生物化學成為工業研究的主題，大多數石油公司致力於微生物的潛在應用，用於生產作為食品(動物飼料) 的單細胞蛋白質和用於胺基酸、脂肪酸、留醇和其它有商業價值的物質的生物化學合成。通過基因工程技術對麥芽糖假絲酵母中宿主_載體系統的改進，帶來一個顯著的進步，使其更廣泛的應用於生物技術和生物工業，也將增加該酵母用於基礎研究的功用。與此同時，基於麥芽糖假絲酵母的特性，其可能被用於異源蛋白質的功能性表達，特別是用於疏水性蛋白質的生產。另一方面，其可用於有機化學生產中的生物轉化反應。基於麥芽糖假絲酵母中宿主-載體系統改進中的最新進展，從已構建，並進行異源和同源蛋白質表達測試的麥芽糖假絲酵母中分離得到數個強表達啟動子。在低拷貝複製表達質粒中使用麥芽糖假絲酵母的PGKl (磷酸甘油酸激酶)基因的啟動子和終止子區域， 證實了內生P450基因和編碼乳酸克魯維酵母β -半乳糖苷酶的異源基因的功能性表達。 ALKUALK4和Ρ450啟動子被用作麥芽糖假絲酵母細胞中的一些報告基因。強調控的，半乳糖-誘導和葡萄抑制的GALl (半乳糖激酶)啟動子，在高拷貝(>20)質粒中被用於Ρ450 基因的高表達，ALKl-A也得到了同樣的應用。另外，編碼過氧化物酶體乙醯輔酶A氧化酶蛋白質ΡΧΡ-2和ΡΧΡ-4的基因Ρ0Χ2和 Ρ0Χ4分別在麥芽糖假絲酵母中得到了表達。也有報導說，使用表達質粒，實現了大腸桿菌功能性內醯胺酶在麥芽糖假絲酵母中的表達。然而，本領域至今還沒有關於異源蛋白質在整合型麥芽糖假絲酵母中的表達的報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種整合型麥芽糖假絲酵母基因表達系統及其應用。在本發明的第一方面，提供一種蛋白表達(或生產)系統，其包括(1)麥芽糖假絲酵母，其是組氨酸營養缺陷型的酵母；(2)表達構建體，所述表達構建體從5』 一 3』依次包括以下可操作性相連的元件GALl啟動子，α-結合因子分泌引導序列，終止子，麥芽糖假絲酵母His5基因， Origin。在另一優選例中，所述的Origin是ApR-Origin。
在另一優選例中，所述的終止子是C-PGK1。在另一優選例中，所述的α-結合因子分泌引導序列和終止子之間，包括至少一個多克隆位點(酶切位點)，用於外源蛋白的編碼基因的插入。在另一優選例中，GALl啟動子，α-結合因子分泌引導序列，終止子，麥芽糖假絲酵母His5基因各個元件之間，包括或不包括間隔序列，該間隔序列的長度為I-IOObp ；較佳地 l-50bp。在另一優選例中，GALl啟動子，α-結合因子分泌引導序列，終止子，麥芽糖假絲酵母His5基因，Origin各個元件之間，包括或不包括多克隆位點(酶切位點)的DNA序列。在另一優選例中，所述的外源蛋白的編碼基因包括(但不限於)植酸酶基因，澱粉酶基因。在另一優選例中，所述的植酸酶基因是Non-K12大腸桿菌(Escherichia coli)植
酸酶基因。在另一優選例中，所述的澱粉酶基因是環狀芽孢桿菌(Bacillus circulars)澱粉
酶基因。在另一優選例中，所述的Origin的DNA序列如SEQ ID NO 5所示；或所述的GALl啟動子的DNA序列如SEQ ID NO 2所示；或所述的α -結合因子分泌引導序列如SEQ ID NO 3所示；或所述的終止子的DNA序列如SEQ ID NO 4所示；或所述的麥芽糖假絲酵母His5基因的DNA序列如SEQ ID NO=I所示；或所述的植酸酶基因的DNA序列SEQ ID NO 8所示；或所述的澱粉酶基因的DNA序列SEQ ID NO 9所示。在另一優選例中，所述的表達構建體是表達載體。在另一優選例中，所述的表達構建物的DNA序列如SEQ ID NO 7所示。在另一優選例中，所述的麥芽糖假絲酵母在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號是CGMCC No. 4499。在本發明的另一方面，提供所述的蛋白表達系統的用途，用於表達外源蛋白。在另一優選例中，所述的外源蛋白包括(但不限於)植酸酶基因，澱粉酶基因。在本發明的另一方面，提供一種表達外源蛋白的方法，其包括(a)提供所述的蛋白表達系統；(b)將外源蛋白的編碼基因的DNA序列插入到所述表達構建體的α-結合因子分泌引導序列和終止子之間，獲得攜帶外源蛋白的編碼基因的表達構建體；(c)將所述的攜帶外源蛋白的編碼基因的表達構建體轉入到所述麥芽糖假絲酵母中，從而獲得基因組中整合有該表達構建體的麥芽糖假絲酵母；(d)培養所述的基因組中整合有該表達構建體的麥芽糖假絲酵母，從而表達所述的外源蛋白。在另一優選例中，所述方法還包括(e)從培養物中分離(或純化)所述的外源蛋白。在本發明的另一方面，提供一種人工構建的核酸分子，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 8 (植酸酶的DNA序列)所示。
在本發明的另一方面，提供一種人工構建的核酸分子，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 9 (澱粉酶的DNA序列)所示。在另一優選例中，所述的核酸分子在麥芽糖假絲酵母基因表達系統中的表達出蛋白質。在另一優選例中，所述核酸分子是經過密碼子優化的核酸分子。在本發明的另一方面，提供一種宿主細胞，其是組氨酸營養缺陷型的酵母；且其中還包含表達構建體，所述表達構建體從5』一 3』依次包括以下可操作性相連的元件GAL1 啟動子，α -結合因子分泌引導序列，終止子，麥芽糖假絲酵母His5基因，Origin。在另一優選例中，所述的表達構建體整合於所述宿主細胞的基因組中。在另一優選例中，所述的宿主細胞是(但不限於)來自中國普通微生物保藏中心 (CGMCC)的細胞株 CGMCC No. 2. 1371。在本發明的另一方面，提供一種組氨酸營養缺陷型的麥芽糖假絲酵母，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號是CGMCC No. 4499。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1、組氨酸營養缺陷型麥芽糖假絲酵母CGMCC No. 2. 1371的突變株在各培養基平板上的生長狀態。圖2、麥芽糖假絲酵母CGMCC No. 2. 1371及其營養缺陷型突變株的生長曲線。圖3、麥芽糖假絲酵母CGMCC No. 2. 1371的GALl啟動子基因序列(SEQID NO 2)。圖4、麥芽糖假絲酵母基因表達系統的α -結合因子分泌引導序列(SEQ IDNO 3)。圖5、麥芽糖假絲酵母CGMCC No. 2. 1371的C-PGK1轉錄終止子序列(SEQID NO 4)。圖6、麥芽糖假絲酵母CGMCC No. 2. 1371的His5基因序列(SEQ ID NO :1)。圖7、大腸桿菌中DNA擴增片段ApR-Ori的基因序列(SEQ ID NO 5)。圖8、表達穿梭載體pGALHis5的構建圖。圖9、分泌型表達穿梭載體pGALHis5S的構建圖。圖10、表達穿梭載體pGALHis5的基因序列(SEQ ID NO 6)。圖11、分泌型表達穿梭載體pGALHis5S的基因序列(SEQ ID NO 7)。圖12、合成的Non-K12大腸桿菌植酸酶編碼基因序列(SEQ ID NO 8)。圖13、合成的環狀芽孢桿菌α -澱粉酶編碼基因序列(SEQ ID NO 9)。圖14、麥芽糖假絲酵母表達的Νοη-Κ12大腸桿菌植酸酶的SDS-PAGE。A 蛋白質標樣；B 植酸酶重組菌株發酵上清液(96hr)。圖15、麥芽糖假絲酵母表達的環狀芽孢桿菌α -澱粉酶的SDS-PAGE。A 蛋白質標樣；B α -澱粉酶重組菌株發酵上清液(48hr)；C α -澱粉酶重組菌株發酵上清液(96hr)。
具體實施例方式本發明人長期致力於改進蛋白的表達技術，經過深入的研究，揭示了一種新型整合型基因表達系統，包括組氨酸營養缺陷型的麥芽糖假絲酵母以及表達構建體，所述表達構建體包括元件=GALl啟動子，α -結合因子分泌引導序列，終止子(如C-PGK1)和麥芽糖假絲酵母His5基因，Origin (如ApR-Origin)。經驗證該表達系統可用於多種蛋白的表達， 表達效率和表達量良好。術語如本文所用，所述的「表達構建體(或稱DNA構建體)，，指一種已經通過人為幹預修飾，使其含有按照自然界中不存在的序列所組合和排列的DNA片段的單鏈或者雙鏈DNA 分子。如本文所用，「元件」是指一些對於蛋白的表達有用的一系列功能性的核酸序列， 本發明中，所述的「元件」被系統地構建以形成一種表達構建體。所述的「元件」的序列可以是本發明中所提供的那些，也包括它們的變體，只要這些變體基本上保留了所述「元件」 的功能，其通過插入或刪除一些鹼基(如l_50bp ；較佳地l_30bp，更佳地l-20bp，更佳地 I-IObp)，或進行隨機或定點突變等來獲得。如本文所用，「外源的」或「異源的」是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質序列之間的關係。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子對於該目的基因來說是外源的。特定序列對於其所插入的細胞或生物體來說是「外源的」。如本文所用，「外源蛋白(異源蛋白質)」是指可由本發明的整合型基因表達系統表達的蛋白。合適的蛋白包括但不限於植酸酶(如non-K12大腸桿菌植酸酶)，澱粉酶 (如環狀芽孢桿菌α-澱粉酶)，脂肪酶(如亞羅解脂酵母(Yarrowialipolytica)脂肪酶和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)脂肪酶)，葡聚糖酶(如地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)葡聚糖酶)，木聚糖酶(如裡氏木黴(Trichodermareesei)木聚糖酶)等。如本文所用，所述的「外源蛋白的編碼基因」也稱為「異源DNA」，指在所給定的宿主細胞中原本不存在的一種DNA分子，或一個DNA分子群；或指異於特定宿主細胞的DNA分子。例如，一個包含被操作性連接到組成轉錄啟動子的宿主DNA片段的編碼多肽的非宿主 DNA片段的DNA分子，可被當成一個異源DNA分子。如本文所用，所述的「操作性連接」或「可操作性相連」是指兩個或多個核酸區域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區被置於相對於目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被「可操作地連接」 到該核酸序列上。如本文所用，所述的「整合型轉化子」是異源DNA已經被介導進入其內部的細胞， 並且該異源DNA已經整合到細胞的基因組DNA中。如本文所用，所述的「線性DNA」是指有游離5』和3』端的DNA分子，其是非環狀 DNA分子。線性DNA能夠通過對閉合的環狀DNA分子如質粒進行酶切獲得，或通過PCR反應進行的DNA合成獲得。如本文所用，所述的「啟動子」或「啟動子區域」，代表本領域所共知的含義，表示一個基因的一部分，其含有可供RNA聚合酶結合的DNA序列和轉錄的起始點。啟動子，
6一般情況下，會在基因的5』端非編碼區被發現。啟動子中的在轉錄起始點起功用的序列組件常常用共知的核苷酸序列進行表徵。這些啟動子組件包括RNA聚合酶結合位點， TATA 序列，CAAT 序列，特異性組件(DSEs ；McGehee et al.，Mol. Endocrinol. 7 :551_560， 1993)，環腺苷酸響應組件(CREs)，血清響應組件(SREs ；Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1 :47-58，1990)，糖皮質激素響應組件(GREs)，和其它轉錄因子的結合位點，如CRE/ ATF (0，Reilly et al.，J. Biol. Chem. 267 19938-19943，1992)、AP2 (Ye et al.，J. Biol. Chem. 269 :25728_25734，1994)、SP1、環腺苷酸響應組件結合蛋白質(CREB ；Loeken, Gene Expr. 3 :253_264，1993)和八聚合體因子(參見 Watson et al.，eds. ,Molecular Biology of the Gene,4th ed.，The Benjamin/Cummings Pub 1 ishingCompany, Inc.，Menlo Park, Calif. , 1987 ；and Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303 1-14,1994.)。如本文所用，所述的「對數生長初期」是指培養基中細胞濃度從2X IO6個細胞/ml 增長到8 X IO6個細胞/ml的細胞生長階段。如本文所用，所述的「含有」，「具有」或「包括」包括了「包含」、「主要由……構成」、 「基本上由……構成」、和「由……構成」;「主要由……構成」、「基本上由……構成」和「由…… 構成」屬於「含有」、「具有」或「包括」的下位概念。本發明提供，用於介導異源DNA進入無芽孢酵母麥芽糖假絲酵母，用於選擇介導進入的細胞和用於在麥芽糖假絲酵母中生產異源多肽的方法。本發明中的方法可被用於多肽和蛋白質的生產，進一步的，生產的多肽和蛋白質可以是高級有機體的多肽和蛋白質，更進一步的，其所敘述的高級有機體可以是人。本發明還將進一步提供，用其它DNA分子轉化麥芽糖假絲酵母的方法，所述的DNA分子包括DNA文庫和合成DNA分子。本發明從而可提供，能夠用於表達基因多樣性文庫，產生能夠從中篩選新的生物活性物質的產品的技術；本發明還提供，能夠用作篩選複合物庫標靶的工程細胞，和能夠提高其在其它工序中的利用率的基因修飾細胞的技術。酵母細胞麥芽糖假絲酵母菌株可從中國普通微生物保藏中心(CGMCC)和其它機構獲得。在本發明的一個實施方式中，用異源DNA轉化的細胞將有一個能夠被異源DNA分子上的一個基因(一個「選擇性標記」)所補充的突變，該選擇性標記允許轉化的細胞在該條件下生長， 而非轉化的細胞則不能增長(「選擇性條件」)。選擇的一般原則為本領域所共知。常用的選擇性標記為編碼合成胺基酸或核苷酸所必需的酶的基因。在這些基因上有突變的細胞在缺少特定胺基酸或核苷酸的培養基中不能生長，除非該突變能夠被選擇性標記所補充。使用這樣的「選擇性」培養基，能夠確保穩定保持宿主細胞中的異源DNA。作為本發明的優選方式，在麥芽糖假絲酵母中使用的這種類型的選擇性標記是一個編碼組氨酸_磷酸轉氨酶的His5基因。當該His5基因轉化進入his5宿主細胞後，可使細胞在缺少組氨酸的條件下生長。一個代表性的麥芽糖假絲酵母His5基因序列的編碼鏈如SEQ ID N0:1所示。在本發明優選的一個實施方式中，一個由His5基因的核苷酸所組成的DNA片段被用作選擇性標記，更長的或更短的片段都能被使用，只要其編碼的一部分能夠被操作性連接到啟動子和終止子序列。本領域中的熟練技術人員將認可這裡所提供的這個序列和其它序列代表各自基因的單等位基因，並期望存在等位變異。任何功能性His5等位基因都可用於本發明。其它營養型標記也可用於發明，包括麥芽糖假絲酵母ADE2、HIS4和LEU2基因，在分別缺少腺嘌呤、組氨酸和亮氨酸的條件下可進行選擇。異源基因，如來源於其它真菌的基因也可用作選擇性標記。細胞首先被暴露在誘變條件下，如能夠引起細胞中基因突變的環境條件下，以獲取麥芽糖假絲酵母營養缺陷型突變株。細胞誘變的方法為本領域的人員所共知，包括化學處理，或紫外燈曝光(Lawrence,Methods Enzymol，194 :273_281，1991.)。獲得誘變細胞的比例與用於細胞處理的誘變劑的強度或劑量相關。低水平的誘變劑產生小比例的突變型細胞，高水平的誘變劑產生高比例的突變型細胞，但也會殺死更多的細胞。因此需要對誘變和致死進行平衡，從而獲得合理數量的突變型細胞。通常通過在不同條件下處理細胞，建立致死曲線，進行經驗性的平衡。一般地，細胞被暴露在誘變條件下，並培養1天，然後按照標準分析方法測定其細胞活性。在本發明中，優選使用會導致20-50%死亡率的誘變水平，在本領域中的熟練技術人員將認可該數值可根據需要進行調節，例如誘變時使用非常大量的細胞。然後在富集培養基中培養允許突變至少在細胞群的一部分中可以保持和複製的誘變細胞。該步驟允許基因組已經被改變為可複製突變，並能將其傳給它們子孫的細胞進行繁殖和增長，從而使突變在細胞群中得到保持。通過檢測處理後細胞的營養需求來確定和表徵營養缺陷型突變，在該檢測中常使用影印培養技術。細胞同時被接種於富集培養基和缺少特定營養的培養基平板上。細胞尤其不能在不含其營養缺陷所對應養分的平板上生長。互補分析可用於進行進一步的表徵。異源DNA可通過數種已知方法中的任一種被介導進入麥芽糖假絲酵母細胞中，這些方法包括鋰轉化(Hiep et al.，Yeast 9 :1189_1197，1993 ；Tarutina andTolstorukov, Abst. of the 15th International Specialized Symposium on Yeasts, Riga(USSR), 1991,137 ；Ito et al. , J, Bacteriol. 153 163,1983 ；Bogdanova etal. , Yeast 11 :343, 1995)，原生質體轉化(Beggs, Nature 275 :104，1978 ；Hinnenet al.，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 75 :1929,1978 ；Cregg et al.，Mol. Cell. Biol. 5 :3376，1985)，凍-融聚乙二醇轉化(Pichia Expression Kit Instruction Manual,Invitrogen Corp. ,San Diego,Calif., Cat.No.K1710-01)，或電轉化。在本發明優選的一個實施方式中，電轉化被用於促進DNA進入麥芽糖假絲酵母細胞的介導過程。電轉化是使用脈衝電場對細胞膜進行短暫的可滲透化處理(細胞膜打洞)，從而使其允許如DNA分子等大分子物質能夠進入細胞內的一個操作過程。目前已有關於電轉化用於哺乳動物(e. g.，Neumann et al.，EMBO J. 1 =841-845,1982) 和真菌(e. g.，Meilhoc et al.，Bio/Technology 8 :223_227，1990)宿主細胞的敘述。儘管如此，DNA轉移進入細胞的有效機制，還不是非常清楚。研究發現，對於麥芽糖假絲酵母的轉化，當細胞處於指數衰退期時，採用場強為2. 5-4. 5kV/cm和時間常數(.tau.)為1_40 毫秒的脈衝電場，電轉化有很高的效率。時間常數.tau.是指初始峰電壓V. sub. O下降到 V. sub. 0/e值所需要的時間。時間常數能夠根據脈衝電路所產生的總的電阻和電容進行計算，例如，.tau. =RXC0電阻和電容是預置的，還是可通過使用者進行選擇，通常依賴於所選擇的電轉化設備。無論如何，設備配置應該依照製造商的說明書所提供的如以上所討論的場強和衰變參數。電轉化設備均能夠從商業供給者處獲得(如BioRadLaboratories， Hercules, Calif.)。用於轉化麥芽糖假絲酵母的DNA分子將通常需被製備成雙鏈環狀質粒，並且在轉化前最好線性化。對於多肽或蛋白質生產，DNA分子應包含，除了如以上所討論的選擇性標記之外的一個由轉錄啟動子、編碼多肽或蛋白質的DNA片段(如一條基因)和轉錄終止子所組成的基因表達框。這些組件被操作性連接到所提供的用於轉錄的插入DNA片段。優選的啟動子和終止子是麥芽糖假絲酵母基因。有用的啟動子包含那些構建性啟動子和半乳糖誘導啟動子。啟動子序列通常含有一個基因編碼序列上遊的1.5kb，常常是lkb，或更小。 一般地，調節性啟動子比構建性啟動子要大，因其要有調節組件的存在。例如甲醇誘導啟動子，同時含有正、反調節組件，可能會從初始ATG往上遊延伸大於lkb。可通過功能和按照已知的方法進行克隆對啟動子進行鑑定。本發明中所使用的表達構建體將進一步包括一個能夠允許轉化子的鑑定、選擇和保持的選擇性標記。該表達構建體可能會進一步含有如一個複製區和一個選擇性標記等， 能夠使DNA可以在另外一個宿主(如大腸桿菌)中擴增和保持的添加組件。為了促進DNA 整合進入宿主染色體，優選使用完整的表達片段，其由啟動子_插入基因_終止子_選擇性標記所組成，其兩側均為宿主DNA序列。這可通過使表達片段下遊末端含有3』端未翻譯的 DNA序列，並使其依賴於啟動子序列的5』端，來方便地實現。當使用線性DNA時，表達片段的側面將會含有能夠允許分子線性化和從其它序列(如細菌的複製區和選擇性標記)中分離表達片段的剪切位點。優選的這種剪切位點是那些可被不會剪切DNA序列內部的限制性內切核酸酶所識別的位點，如那些識別8鹼基目標序列的內切酶位點等(如NotI)。使用本發明的方法能夠在麥芽糖假絲酵母被生產的蛋白質包括有工業價值和藥用價值的蛋白質。這些蛋白質包括來自植物和動物的高等真核生物蛋白質，尤其是如哺乳動物等脊椎動物，雖然微生物來源的某些蛋白質也有很高的價值。使用本發明的方法能夠製備的蛋白質包括如植酸酶、脂肪酶、葡聚糖酶、纖維素酶和蛋白酶等等的酶，包括蛋白酶抑制劑在內的酶抑制劑，如血小板源生長因子、成纖維細胞生長因子和表皮生長因子等等的生長因子，如紅細胞生成素和血小板生成素等等的細胞因子，以及如胰島素、瘦素和胰高血糖素等等的激素。本發明中所使用的麥芽糖假絲酵母細胞，在由充足的碳源、氮源和微量營養所組成的培養基中，於25-35°C的溫度下進行培養。採用常規手段，如小的震蕩搖瓶和氣升式發酵罐等為液體培養提供足夠的通氣。一種優選的培養基為YEPD培養基。細胞可稀釋到新的培養基進行傳代，或在平板上冷藏進行短期保藏。優選將細胞置於50%甘油溶液中， 於-70°C下進行長期保藏。麥芽糖假絲酵母的電轉化最好在其對數生長初期進行。在固體培養基上培養得到細胞的單克隆菌落，最優的為YEPD固體培養基。在30°C下大約培養2天後，來自新平板上的單克隆被接種預置體積的富集培養基中(如YEPD)，培養至細胞密度約為5-10X IO5個細胞/ml。在25-35°C下，最優的為30°C下，孵育細胞(劇烈震蕩)，直至細胞到達對數生長初期。然後收穫細胞，如通過3000Xg離心2-3分鐘，並再次懸浮細胞。通過還原細胞壁中的二硫鍵來製備電轉感受態細胞，在一種與電穿孔條件相兼容的離子溶液中對細胞進行平衡，並冷卻細胞。細胞通常被製備成電轉感受態通過在含有如二硫蘇糖醇(DTT)或β-巰基乙醇(BME)等的還原劑的，ρΗ6-8的緩衝溶液中孵育細胞，來還原細胞壁蛋白質以促進其隨後吸收DNA。一種優選的孵育緩衝液為新配置的50mM磷酸鉀緩衝液(pH7. 5)，其含有25mM DTT0在該緩衝液中孵育細胞(通常使用1/5原培養液體積的緩衝液)，於約30°C下，大約5-30分鐘，最優的為約15分鐘。然後收穫細胞，並用合適的電穿孔緩衝液(已預冰冷的) 洗滌細胞。在本研究中合適的緩衝液包括PH6-8的溶液，其含有弱緩衝液、二價陽離子(如 Mg2+，Ca2+)和滲透穩定劑(如糖)。洗滌後，用小體積的緩衝液重新懸浮細胞，在其成為電轉感受態時，能夠直接被使用或等體積分裝後冷凍保藏(最優的為在_70°C下)。優選的電轉化緩衝液為STM(270mM蔗糖，IOmM Tris, pH7. 5，ImM MgCl)。在優選的一個方案中，對細胞進行兩次洗滌，先使用原培養液體積的緩衝液(已預冰冷的)洗滌，再使用1/2原培養液體積的緩衝液(已預冰冷的)洗滌。第二次洗滌後，收穫並重新懸浮細胞，對於原培養液體積為200ml的細胞，通常使用約3-5ml緩衝液。使用小量的(通常約為0.1ml)電轉感受態細胞和不超過其1/10體積的線性 DNA分子進行電轉化。例如，0. Iml懸浮於離子強度不超過50mM的緩衝液中的細胞可與 0. I-IOug DNA結合。將電轉感受態細胞和線性DNA分子的混合物放入已預冰冷的電轉化杯中，然後將其置於指數衰減的脈衝電場中，場強為2. 5-4. 5kV/cm，優選3. 75kV/cm,時間常數為1-40毫秒，優選10-30毫秒，更優選15-25毫秒，最優選20毫秒。用實際使用的儀器設施實現預期的脈衝參數，將取決於所使用的儀器。當使用BioRad(Hercules，Calif.) Gene Pulser. TM.電轉儀，並用2mm電轉化杯進行轉化時，設定電阻為600ohms或更高，優選「極大地」電阻，設定電容為25uF，以獲得預期的電場特徵。電轉化結束後，將細胞加入到 Iml YEPD液體培養基中(稀釋約10倍)，然後於30°C下培養1小時。然後收穫細胞，並塗布接種選擇性培養基平板。在一個優選的實施方式中，先用小量的(等於稀釋後已電轉化細胞的體積)IX酵母氮源(6. 7g/L無胺基酸酵母氮源；Difco Laboratori es，Detro i t，Mi ch.)洗滌細胞一次，再將其塗布接種於選擇性基本培養基平板。 已被用His5選擇性標記轉化的含有his5突變的細胞，能夠在缺少組氨酸的基本培養基平板上生長。蛋白質生產工藝中優選使用整合型轉化子。這樣的細胞可以在沒有持續的選擇性壓力的條件下傳代，因為DNA很少會從基因組中丟失。通過基因雜交分析(Southern blot analysis)能夠確定DNA已整合進入宿主染色體。簡要的說，即用限制性內切核酸酶酶切轉化的和未轉化的宿主DNA，進行電泳分離，將其印跡到一個支持膜上，再用合適的宿主DNA 片段進行探針檢測。未轉化和已轉化細胞中可見的碎片圖形上的差異代表整合型轉化。可選擇限制性內切酶和探針來鑑定基因組碎片中的轉化DNA片段(例如啟動子、終止子、異源 DNA和選擇性標記序列)。異源蛋白質在表達水平上的差異，是由如整合位點、表達框的拷貝數和單獨分離株之間啟動子活性的差異等因素引起的。因此，在選擇一個生產菌株之前，對大量的分離株的表達水平進行篩選是有益的。各種適用的篩選方法都可使用。例如，生長在用膜(如硝酸纖維素膜)覆蓋的培養基平板上的轉化子克隆。蛋白質通過分泌或隨後裂解細胞的方式從細胞中釋放出來，並結合到膜上。然後使用常規的方法對這些結合蛋白質進行分析，可使用的常規方法包括免疫分析法。可通過在液體培養基中培養細胞，並分析條件培養液或細胞裂解物(具體視情況而定)來實現對表達水平更準確的分析。可用一些重要的蛋白質進行實驗，來部分確定用於從培養液和裂解物中濃縮和純化蛋白質的方法。這些方法易於被熟練的技術人員選擇和操作。對於小規模的蛋白質生產(如平板或搖瓶生產)，可在存在半乳糖和幹擾量的其它碳源(如葡萄糖)的培養基中培養攜帶由半乳糖調控啟動子(如GALl啟動子)組成的表達框的麥芽糖假絲酵母轉化子。對於小規模的實驗，包括表達水平的初步篩選，可於 30°C下，在固體培養基上培養轉化子，其所用的一個固體培養基比如含有20g/L細菌瓊脂 (Difco)、6.7g/L無胺基酸酵母氮源(DifCO)、10g/L半乳糖和0.4ug/L生物素。由於半乳糖是容易揮發的碳源，其在長期誘導過程中會迅速損失。可在倒置平板的蓋子中加入一些 20%半乳糖水溶液，來實現半乳糖的持續供給，因為半乳糖可以通過蒸發轉移到生長細胞。 略大規模的實驗，可通過在搖瓶中進行培養來實施。在通常的操作程序中，細胞於30°C下培養2天。對於生產規模的培養，需先在搖瓶中製備高產克隆的新鮮培養液，然後將最終的培養液接種到發酵罐培養基中。通常情況下，將500ml在YEPD培養基中，30°C下培養1_2天的培養液，接種於5L發酵罐中。使用合適的培養基(含有鹽、葡萄糖、生物素和微量元素)， 在28°C、pH5. 0和> 30%溶解氧的條件下培養細胞。在初始添加的葡萄糖被消耗之後(可用耗氧降低作為指示)，向發酵罐中加入半乳糖，以誘導目標蛋白質的產生。由於大規模發酵是在限制碳源的條件下進行，所以培養基中存在的葡萄糖，不會抑制半乳糖誘導啟動子。 在生理生長期，碳到生物質的轉化會高效、快速的進行，儘管仍然在對半乳糖；誘導基因啟動子進行全誘導。在常規的發酵過程中，細胞密度大約可達到80-400g/L(菌溼重)。「菌溼重」是指從發酵罐中單位體積的培養液收穫細胞時，所得到的細胞質量，通常採用對培養液進行離心來收穫細胞。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等，《分子克隆實驗室指南》(美國紐約州冷泉港實驗室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press), 1989)；趙永芳等，生物化學技術原理及其應用(第二版)(科學出版社，2008)；朱檢等，生物化學實驗[Μ](上海科學技術出版社，1995)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件進行。除非另外說明，百分比和份數均按重量計算。I.實驗材料和試劑1.菌株和載體麥芽糖假絲酵母細胞CGMCC No. 2. 1371購自中國普通微生物保藏中心，大腸桿菌 DH5a和載體pUC 19均購自上海生工公司。2.酶類及其它生化試劑限制性內切酶、DNA標記物、蛋白質標記物、磷酸單酯酶Pmase、T4多核苷酸激酶、 [Y -32P] ATP均購自Fermentas (MBI)公司，其他常規試劑購自中國上海生物工程有限公司或上海Sigma公司。3.培養基LB培養基、YPD、YEPD、MM、MD培養基均參照英傑公司畢氏酵母操作手冊製備。YEPD 培養基1% (w/v)酵母粉；2% (w/v)蛋白腖；2% (w/v)葡萄糖；1. 34% (w/ ν)酵母氮源；IOOmM磷酸鉀pH6. 0。基本培養基IOOmM磷酸鉀pH6.0; 1.34% (w/v)無胺基酸酵母氮源；4X 10_5 % (w/v)生物素；2% (w/v)葡萄糖。
II.實施例實施例1、製備麥芽糖假絲酵母營養缺陷型菌株將麥芽糖假絲酵母細胞(CGMCC No. 2. 1371，中國普通微生物保藏中心)在YPD培養基(1% (w/v)酵母粉，2% (w/v)蛋白腖，2% (w/v)葡萄糖)上，28°C培養16小時。離心收集細胞，並將其重新懸浮於無菌水中。通過計數測定細胞濃度後，將其塗布接種於YPD培養基平板上。將平板置於紫外燈下(採用G8T5紫外殺菌燈(Sylvania)和30釐米照射距離)，進行不同時間段的照射。照射完後，將平板置於28°C下培養，測定克隆數，並以此計算存活率。將細胞進行稀釋後，塗布接種YEPD培養基平板，並採用影印接種法同時接種匪(1.34% (w/v)無組氨酸酵母氮源，2% (w/v)葡萄糖，0.002% (w/v)生物素)培養基平板，對營養缺陷型菌株進行傳代培養。從YPD培養基平板上，挑選出其在匪培養基平板上對應位置不能生長的克隆，劃線培養獲得單克隆，並在補充有組氨酸的匪培養基平板上進行試驗，所述的麥芽糖假絲酵母營養缺陷型菌株(C41 His5-)在各培養基上的生長狀況如圖1，其在補充有組氨酸的YEPD培養基中的生長曲線如圖2。該麥芽糖假絲酵母營養缺陷型菌株(C41His5-)在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為 CGMCCNo. 4499。實施例2、麥芽糖假絲酵母Hi s5基因的克隆過夜培養麥芽糖假絲酵母(營養缺陷型)，收集細胞，分離、提取基因組DNA，然後用限制性內切酶EcoRI進行酶切。在λ噬菌體(Lamda GT 11，獲自Invitrogen公司)中構建麥芽糖假絲酵母的基因組文庫。用人工合成的麥芽糖假絲酵母IAM 12247 (T. Hikiji et al. 1989, Curr Genet 16 :261_266)的 His5 寡核苷酸，其序列為5，-AAAACTGGTATCTTGT TAGATGCTAATGAAAATACTCATGGTCC-3，(NCBI :Χ17310· 1) (SEQ ID NO 10)，從基因組文庫中篩選麥芽糖假絲酵母CGMCC No. 2. 1371的His5基因片段。根據λ構建庫中麥芽糖假絲酵母 His5 基因片段的序列設計 PCR 引物 5，-AGCTAGCTTGACTCATACTTGAGCGCGGTAAAG-3』 (SEQ ID NO 11)和 5，-AGAATTCTTCATCATGAACAAGGAAATCTTTTCTAG-3』 (SEQ ID NO 12)(分別含有酶切位點NheI和EcoRI，如劃線部分所示)，進行PCR，擴增含有5』端啟動子和3』端側翼序列的His5基因。His5基因的長度為1614bp，含有5，端和3，端側翼序列，DNA序列及編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO :1 (圖6)所示。實施例3、合成GALl啟動子從以上所述的麥芽糖假絲酵母基因組文庫中，篩選GALl (編碼半乳糖激酶)基因片段。根據麥芽糖假絲酵母IAM 12247的GALl基因序列合成GALl寡核苷酸，其序列為5，-TTTTATTCCAACGTCGAAACCTAATCAACAGAGATTCACTGAAGTC-3，(SEQ ID NO 13)(NCBI D29759. 1)，用P32標記(先用磷酸單酯酶PMase去掉寡核苷酸片段端點核苷酸的游離磷酸根，露出-0H，再用T4多核苷酸激酶和放射性同位素P32 (簡記為γ -P32)標記過的ATP，將寡核苷酸片段5』末端核苷酸的5』位上接上Y-P32，即得到P32標記的寡核苷酸片段)後， 用於GALl基因片段的篩選。將GALl基因片段克隆的pUC 19載體上，進行DNA序列測定。根據篩選得到的GALl 基因的DNA序列設計2個寡核苷酸引物，其序列分別為5』 -TACCTAGGATGATTATTATTGGAGTA AGTG-3' (SEQ ID NO 14)和 5，_ATCTCGAG CATATG Γ A CCG A TT A A GTTT A ΓΤΓΤΓΓΓΤΓτΓτ A G-.^i ^S
12EQ IDNO 15)(分別帶AvrII和XhoI, NdeI酶切位點，如劃線部分所示)。並用其進行PCR 反應，擴增GALl啟動子。GALl啟動子的長度為828bp，DNA序列如SEQ ID NO 2所示。鑑定了潛在的TATA框和重複序列，如圖3所示。實施例4、α-結合因子分泌引導DNA片段的合成根據麥芽糖假絲酵母偏好密碼子對克魯維乳酸酵母α -結合因子分泌引導的DNA 序列(NCBI =XM 454814. 1)進行優化，送英俊公司(中國上海)人工合成該DNA片段，並在合成的DNA片段中加入5，端NdeI限制性酶切位點和3，端XhoI.StuI和NotI序列。合成的α -結合因子分泌引導的DNA序列如SEQ ID NO 3所示(圖4)。實施例5、轉錄終止子DNA片段的合成從以上所敘述的麥芽糖假絲酵母基因組文庫中，篩選麥芽糖假絲酵母C-PGKl (磷酸甘油酸激酶I)基因。根據麥芽糖假絲酵母IAM 12247的C-PGK基因序列設計、併合成寡核苷酸片段，其序列為 5，-TTATCCAACAAATTATCTGTCAAAGACTTAAACGTCACTGGTAAAAGAGT-3， (SEQ ID NO 16) (NCBI :D12474. 1)，用P32對其進行放射性同位素標記後，用於進行C-PGK 基因的篩選。PCR合成C-PGK轉錄終止子DNA所使用的引物為5』 -CTCGAGG CGGCCGC TTGATTTTTTATGACACTTGTG-3，(SEQ ID NO 17)和 5』 -ATGAATTCTTTGAACAATCTGAGGTTGTGG-3，(SEQ ID NO 18)(分別含有酶切位點XhoI.NotI和EcoRI，如劃線部分所示)。C-PGK轉錄終止子的長度為578bp，DNA序列如SEQ ID NO 4所示(圖5)。實施例6、大腸桿菌中DNA擴增片段Apr-Ori的合成DNA擴增片段包含突變區(pMBl複製子)和選擇性標記，可通過PCR從質粒 pUC19(購自上海生工)上製備的編碼β -內醯胺酶的bla(ApR)基因(來自Tn3轉座子)， 其作為選擇性標記，可賦予對氨苄青黴素的抗性。以PUC19為模板，PCR所用5』端引物為 5』-GCTAGCCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTT-3』 (SEQ ID NO 19)(含有酶切位點 NheI)，3，端引物為 5，-CCTAGGTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAG-3』 (SEQ ID NO 20)(含有酶切位點 AvrII)。 可依照相應的條件進行PCR反應，具體的說，可依據本發明通過使用引物設定擴增反應，此為本領域熟練技術人員所熟知。例如，常使用的一個PCR設定條件為先94°C加熱5分鐘； 然後94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 2分鐘，如此重複30個循環；最後再72°C 7分鐘。進行 PCR反應時可使用常規熱循環儀，如Perkin Elmer公司製造的9600型等；可使用商品化熱穩定的DNA聚合酶，如ExTaq DNA聚合酶(Invitrogen Biotechnology Inc)等。反應混合物的組成，可以依照附於以上聚合酶產品的生產廠商的說明書進行調整。擴增片段Apr-Ori 的長度為2191bp，DNA序列如SEQ ID NO 5所示(圖7)。實施例7、構建表達穿梭載體pGALHis5第一步將GAL啟動子和C-PGK轉錄終止子DNA片段進行組合，具體的為用限制性內切酶XhoI對GAL啟動子PCR DNA片段進行酶切，與同樣用XhoI酶切後的C-PGK轉錄終止子PCR片段進行連接。第二步使用引物(對應於5』端GAL和3』端C-PGK轉錄終止子)，依照本發明進行擴增，獲得含有GAL啟動子和C-PGK轉錄終止子DNA的新的PCR產物GAL-C-PGK。PCR反應的設定條件可為先94°C加熱5分鐘；然後94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 1分鐘，如此重複 30個循環；最後再72°C 7分鐘。第三步純化第二步所得到的PCR DNA片段，用於進一步的實驗。
第四步用限制性內切酶AvrII和EcoRI對含有GAL啟動子和C-PGK轉錄終止子 DNA序列的組合PCR DNA片段GAL-C-PGK進行酶切，用NheI和AvrII對Apr-Ori DNA片段進行酶切，用NheI和EcoRI對His5 DNA片段進行酶切。然後將以上三種酶切後的DNA片段混合，進行DNA連接，之後將其用於轉化大腸桿菌。第五步將第四步中DNA的連接物轉入DH5 α感受態細胞中，通過進行DNA製備、 限制性酶切和DNA測序，對大腸桿菌轉化子進行篩選，獲得pGALHis5質粒。表達穿梭載體pGALHis5的構建圖如圖8所示，所測得的DNA序列如SEQID NO 6 所示(圖10)，與設計的組合及序列完全一致，說明獲得了正確的構建質粒。實施例8、構建分泌型穿梭載體pGALHis5SpGALHis5S載體擁有用於外源蛋白質分泌的α-結合因子分泌引導序列 (Alpha-F)。合成α -結合因子分泌引導序列DNA(SEQ ID NO :3)，在其5，端和3，端分別加入限制性酶切位點NdeI和XhoI, StuI, NotI0用限制性內切酶NdeI和NotI對合成的 α -結合因子分泌引導序列DNA進行酶切後，將其插入到同樣用NdeI和NotI進行酶切的 pGALHis5質粒中。α -結合因子分泌引導序列中的限制性酶切位點XhoI被用於克隆清除掉Kex2蛋白酶剪切位點的目標基因，以表達天然N-端蛋白質。將a-factor和pGALHis5 的DNA連接物轉入DH5a感受態細胞中，通過進行DNA製備、限制性酶切和DNA測序，對大腸桿菌轉化子進行篩選，獲得pGALHis5S質粒。質粒pGALHis5S的多克隆位點如圖9所示，所測得的DNA序列如SEQ IDNO 7所示 (圖11)，與設計的組合及序列完全一致，說明獲得了正確的構建質粒。實施例9、Non-K12大腸桿菌植酸酶的克隆和表達將密碼子優化後的編碼Non-K12大腸桿菌植酸酶的核苷酸分子送基因合成公司 (上海英俊，中國上海)進行人工合成。基因閱讀框序列如SEQ ID NO 8所示(圖12)。在合成DNA的5』末端和3』末端，分別設定兩個酶切位點StuI和NotI。用StuI和NotI對合成的DNA片段進行酶切後，將其克隆到同樣經StuI和NotI酶切的載體pGALHis5S中。然後將重組DNA轉化進入大腸桿菌DH5 α，進行DNA複製和DNA測序。將含有植酸酶基因的 pGALHis5S的構建DNA分子命名為pGALHisPhy，用AvrII對其進行線性化酶切後，用於轉化麥芽糖假絲酵母(組氨酸營養缺陷型)細胞。實施例10、環狀芽孢桿菌澱粉酶基因的克隆和表達依照如SEQ ID NO 9所示(圖13)的序列，委託基因合成公司(上海英俊，中國上海)人工合成環狀芽孢桿菌澱粉酶基因，該序列的5』端和3』端分別含有限制性酶切位點StuI和NotI。按照以上所敘述的操作步驟將澱粉酶基因片段克隆到pGALHis5S載體上。 將pGALHis5S中含有植酸酶基因的構建DNA分子命名為pGALHisAmy，用AvrII對含有澱粉酶基因的重組質粒進行線性化酶切，然後用於轉化麥芽糖假絲酵母細胞(組氨酸營養缺陷型)。實施例11、製備麥芽糖假絲酵母電轉感受態細胞從YEPD培養基平板上挑取單克隆(組氨酸營養缺陷型)，接種到50ml (250ml三角瓶)液體YPD培養基中，28-30°C震蕩(250rpm)培養過夜。培養過程中，用分光光度計測定培養液在600nm處的OD值，直至0D600 = 0.6-0.8。1600 X g室溫離心5分鐘，收集細胞。 將細胞重新懸浮於新配置的50mM的磷酸鉀緩衝液(pH7.5，並含有25mM二硫蘇糖醇)中，置於30°C下孵育15分鐘。1600Xg，4°C離心5分鐘，收集細胞，然後用已預冰冷的STM緩衝液 (250mM蔗糖，IOmM Tris-HCl (pH7. 6)，ImM MgCl2)洗滌細胞3次。第3次洗滌完後，聚集細胞，並將細胞重新懸浮於Iml STM緩衝液中，用作轉化。實施例12、麥芽糖假絲酵母的電轉化按照BioRad實驗室(Hercules，Calif.)所提供的操作流程進行電轉化。對於每一個轉化，將IOOul電轉感受態酵母細胞(組氨酸營養缺陷型)與2ugDNA 混合，然後加入到0. 2cm電轉化杯中。冰浴5分鐘後，設定條件750V和25uF，進行電轉化。 立即向電轉化杯中加入Iml YEPD培養基(室溫)，然後轉移到培養管中。在30°C下培養細胞1小時後，1600Xg室溫離心5分鐘，聚集菌體。將細胞重新懸浮於0. 2ml MD培養基中， 然後塗布接種於2個MD培養基平板上。28-30°C下培養平板2_3天，直至克隆菌落出現。MD 培養基(minimal dextrose medium) 1. 34% (w/v)酵母氮源，4Χ1(Γ5% (w/v) 生物素，2% (w/v)葡萄糖，餘量為蒸餾水。實施例13、用於小規模表達的操作流程從轉化平板上挑取單克隆酵母菌落(組氨酸營養缺陷型)，接種到Iml YEPD培養基中，28-30°C震蕩培養16小時。次日，將培養管IOOOOrpm離心5分鐘，棄去上清液，再向每個培養管中分別加入0. 5ml新配製的MG培養基，28-30°C下劇烈震蕩(至少250rpm)培養3-5天。用SDS-PAGE分析細胞碎片和培養液中的基因表達水平。MG培養基(minimal galactose medium) :1· 34(w/v)酵母氮源，4X l(T5(w/v)生物素，0.5 (w/v)半乳糖，餘量為蒸餾水。選擇在搖瓶培養基中表現出半乳糖誘導表達外源蛋白質最高水平的菌落，在高細胞密度發酵條件下，對其進行進一步的分析。先將細胞於0.5L YEPD液體培養基中， 30°C下劇烈攪拌培養1-2天，然後接種到5L發酵罐中(e. g.，BioFlowIII ；New Brunswick Scientific Co.，Inc.，Edison, N. J.)。先向發酵容器中加入礦物鹽(57. 8g(NH4)2S04、68g KH2PO4,30. 8g MgSO4 · 7Η20、8· 6g CaSO4 · 2Η20、2· Og NaCl)和 IOml 消泡劑(PPG)，再用水補充至總體積為2. 5L，攪拌使礦物鹽完全溶解後，將溶液121°C滅菌40分鐘(在發酵容器中進行滅菌)。待其冷卻後，在無菌條件下，向發酵罐中加入350ml 50%葡萄糖、250ml IOX 微量元素、25ml200mu. g/ml生物素(均已單獨滅菌)，攪拌混合均勻後，接種250ml細胞培養液。IOX 微量元素IOOmM(27. 8g/L)FeSO4 · 7H20、2mM(0. 5g/L) CuSO4 · 5H20、 8mM(l. 09g/L)ZnCl2、8mM(l. 35g/L)MnSO4 · H20、2mM(0. 48g/L) CoCl2 · 6H20、lmM(0. 24g/L) Na2MoO4 · 2H20、8mM(0. 5g/L) H3B03、0. 5mM(0. 08g/L)KI、5mg/L 生物素、0. 5g/L 硫胺素(維生素 Bl)、l-2ml/L H2S04。設定在28°C，pH5.0*> 30%溶解氧條件下運行發酵罐進行發酵。細胞將消耗初始添加的葡萄糖，在葡萄糖消耗過程中，對氧的需求急劇增加，隨後，當葡萄糖消耗完後， 耗氧量降低。初始添加的葡萄糖耗盡後，向發酵罐中流加補充有NH4+和微量元素的葡萄糖-半乳糖料液，先維持發酵液中0.2% (w/v)葡萄糖和0.2% (w/v)的水平5小時，然後再維持0.1% (w/v)葡萄糖和0.4% (w/v)的水平25小時。通過發酵罐的一個口所補充的總的半乳糖量為550g，所使用的初始流加速度為12. 5ml/hr，最終流加速度為25ml/hr。通過發酵罐的另一個口補充700ml葡萄糖溶液，其含有175g葡萄糖、250ml IOX微量元素和
1599g(NH4)2S04。在這些條件下，葡萄糖和半乳糖可同時被利用，並在葡萄糖-半乳糖飼餵時就開始誘導蛋白質表達。採用以上所敘述的用於分析搖瓶培養液的方法，分析發酵罐中細胞的基因表達水平。將實施例9和實施例10中構建得到的載體pGALHisPhy和pGALHisAmy，按照實施例11和實施例12中所述的方法，轉化到麥芽糖假絲酵母中，得到分別含有植酸酶和澱粉酶的重組菌株Candida maltosa Phy和Candida maltosaAmy。然後按照實施例14中的方法， 對兩個重組菌株進行培養、發酵，及重組酶的誘導表達，並分別對發酵液進行SDS-PAGE分析和酶活力分析，評判兩種重組酶在麥芽糖假絲酵母表達系統中的表達水平，結果如圖14 和圖15所示。從結果可以看出，重組植酸酶和α-澱粉酶均在麥芽糖假絲酵母系統中得到了表達，其分子量分別約為45kDa和55kDa，與其理論分子量44. 6kDa和54. 8kDa相近；半乳糖誘導表達96小時後，兩種重組酶在發酵上清液中的酶活力分別為113. 6U/ml和58. 3U/ml, 進一步說明兩種重組酶在麥芽糖假絲酵母(組氨酸營養缺陷型)中得到了表達和積累。菌種保藏本發明的組氨酸營養缺陷型麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)已經保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo. 4499，保藏日為 2010年12月21日。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種蛋白表達系統，其包括(1)麥芽糖假絲酵母，其是組氨酸營養缺陷型的酵母；(2)表達構建體，所述表達構建體從5』一 3』依次包括以下可操作性相連的元件 GALl啟動子，α-結合因子分泌引導序列，終止子，麥芽糖假絲酵母His5基因，Origin。
2.如權利要求1所述的蛋白表達系統，其特徵在於，所述的α-結合因子分泌引導序列和終止子之間，包括至少一個多克隆位點，用於外源蛋白的編碼基因的插入。
3.如權利要求2所述的蛋白表達系統，其特徵在於，所述的外源蛋白的編碼基因包括 植酸酶基因，澱粉酶基因。
4.如權利要求1-3任一所述的蛋白表達系統，其特徵在於， 所述的Origin的DNA序列如SEQ ID NO 5所示；或所述的GALl啟動子的DNA序列如SEQ ID NO 2所示；或所述的α-結合因子分泌引導序列如SEQ ID NO :3所示；或所述的終止子的DNA序列如SEQ ID NO 4所示；或所述的麥芽糖假絲酵母His5基因的DNA序列如SEQ ID NO=I所示；或所述的植酸酶基因的DNA序列SEQ ID NO 8所示；或所述的澱粉酶基因的DNA序列SEQ ID NO 9所示。
5.如權利要求1-3任一所述的蛋白表達系統，其特徵在於，所述的麥芽糖假絲酵母在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號是CGMCC No. 4499。
6.權利要求1所述的蛋白表達系統的用途，用於表達外源蛋白。
7.—種表達外源蛋白的方法，其包括(a)提供權利要求1所述的蛋白表達系統；(b)將外源蛋白的編碼基因的DNA序列插入到所述表達構建體的α-結合因子分泌引導序列和終止子之間，獲得攜帶外源蛋白的編碼基因的表達構建體；(c)將所述的攜帶外源蛋白的編碼基因的表達構建體轉入到所述麥芽糖假絲酵母中， 從而獲得基因組中整合有該表達構建體的麥芽糖假絲酵母；(d)培養所述的基因組中整合有該表達構建體的麥芽糖假絲酵母，從而表達所述的外源蛋白。
8.—種人工構建的核酸分子，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
9.一種人工構建的核酸分子，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
10.一種宿主細胞，其是組氨酸營養缺陷型的酵母；且其中還包含表達構建體，所述表達構建體從5』 一 3』依次包括以下可操作性相連的元件GAL1啟動子，α-結合因子分泌引導序列，終止子，麥芽糖假絲酵母His5基因，Origin。
11.一種組氨酸營養缺陷型的麥芽糖假絲酵母，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號是CGMCC No. 4499。
全文摘要
本發明涉及一種整合型麥芽糖假絲酵母基因表達系統及其應用。所述系統包括組氨酸營養缺陷型的麥芽糖假絲酵母以及表達構建體，所述表達構建體包括元件Origin，GAL1啟動子，α-結合因子分泌引導序列，終止子和麥芽糖假絲酵母His5基因。經驗證該表達系統可用於多種蛋白的表達，表達效率和表達量良好。
文檔編號C12N15/56GK102212546SQ20111004796
公開日2011年10月12日 申請日期2011年2月28日 優先權日2011年2月28日
發明者傅仙玉, 葉秀雲, 應喜娟, 張洋, 羅鋆琳, 陳萍, 靳偉剛 申請人:福建福大百特科技發展有限公司