一種α-酮戊二酸高產菌及其篩選方法和用該菌株發酵法生產α-酮戊二酸的製作方法

2023-10-22 17:14:32 3

專利名稱：：一種α-酮戊二酸高產菌及其篩選方法和用該菌株發酵法生產α-酮戊二酸的製作方法一種ot-酮戊二酸高產菌及其篩選方法和用該菌株發酵法生產a-酮戊二酸一種a-酮戊二酸高產菌及其篩選方法和用該菌株發酵法生產a-酮戊二酸，屬於生物工程
技術領域：
，特別是一株高產a-酮戊二酸的解脂亞洛酵母。技術背景a-酮戊二酸，又稱a-膠酮酸，2-氧代戊二酸或a-羰基戊二酸，是三羧酸(TCA)循環中重要的中間產物之一，在微生物細胞的代謝中起著重要的作用，也是合成多種胺基酸、蛋白質的重要前體物質。其結構式為a-酮戊二酸在醫藥、有機合成、營養強化劑等領域有著重要的應用前景，目前主要應用領域為作為運動營養飲料的成分；有機中間體；生化試劑和測肝功能的配套試劑；體格增強補劑；降低術後患者和長期病人的機體損耗；在腦部作為酪氨酸和穀氨酸的前體；同時研究還表明，a-酮戊二酸具有抗氰作用，與亞硝酸鈉、硫代硫酸鈉配合使用可提高抗氰能力，且有抗驚厥作用。a-酮戊二酸目前主要消費於醫療機構，用來診斷和對神經疾病進行治療。隨著a-酮戊二酸應用範圍不斷擴大，a-酮戊二酸的市場需求也在不斷增長。但是目前a-酮戊二酸的生產主要還是採用有機合成方法，包括一系列複雜的化學合成過程，這在原料來源和安全生產上存在一定的問題，主要是存在爆炸的危險。所以開發一種利用微生物發酵生產a-酮戊二酸的高效安全的方法很重要。發酵法生產a-酮戊二酸的研究最早始於1946年，當時Lockwood和Stodola對利用細菌生物合成oc-酮戊二酸進行了初步的研究。之後Asai等人發現假單胞菌屬、產氣桿菌和粘質沙雷氏菌可以過量合成a-酮戊二酸，並且提出過量合成a-酮戊二酸的必要條件是培養基中碳源、氮源的濃度。上世紀60年代中期，T.V.FiriogeiKwa等人在利用解脂亞洛酵母發酵生產單細胞(SCP)蛋白的過程中發現了該酵母也具有過量合成有機酸(a-酮戊二酸、2-羥基酮戊二酸、檸檬酸等)的能力。在硫胺素(一種該酵母菌不能合成，但對於a-酮戊二酸脫氫酶活性是必需的維生素)缺乏的情況下，解脂亞洛酵母可以利用烷烴分泌大量的a-酮戊二
技術領域：
a-酮戊酸結構式目前對發酵法生產a-酮戊二酸研究較多的是俄國的一個微生物生化和生理研究所。該研究所發現不同種屬的硫胺素缺陷型酵母可能都有生產a-酮戊二酸的能力，合成a-酮戊二酸的主要條件就是硫胺素缺乏引起的生長限制。1999年，T.V.Finogenova等人利用y"mH7'"/z>o/_K/c"VKMY-2373的突變菌株N1在以乙醇為碳源的培養基上通過調節硫胺素的添加量、氮源、溶氧以及pH值等條件使得a-酮戊二酸的產量達到49g/L，對乙醇的產率是42。/。。並且確定了生產a-酮戊二酸的最重要條件是由硫胺素缺乏引起的生長限制和過量的氮源(碳源不足時，碳源流向檸檬酸合成)。並且在基於對乙醇代謝和a-酮戊二酸合成途徑中關鍵酶活性的分析中，初步肯定了a-酮戊二酸的合成與氮源代謝之間具有密切的關係。後來又以l^row^/^o/j^^自然菌株為生產菌，在以石蠟為碳源的培養基上得到了109g/L的a-酮戊二酸，產率為120%。目前國內對發酵法生產a-酮戊二酸的研究很少，仍處於研究的初步階段。
發明內容本發明的目的是提供一種a-酮戊二酸高產菌及其篩選方法和用該菌株發酵法生產a-酮戊二酸。本發明的技術方案一種a-酮戊二酸高產菌，分類命名為解脂亞洛酵母(Tamw/a/^o/,'c^WSH-Z06,巳保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M207143。解脂亞洛酵母CCTCCNO:M207143的篩選方法，從煉油廠附近的土壤中經對照在完全培養基、基本培養基和補充培養基平板上菌落生長情況篩選出硫胺素營養缺陷型的菌株，然後對初篩出的硫胺素缺陷型菌株採用一級發酵逐一搖瓶培養，發酵液利用矽膠層析方法分析，將保留有a-酮戊二酸顯色斑點的菌株再轉接於裝有發酵培養基的搖瓶中進行發酵復篩，發酵液經高效液相方法測定，比較a-酮戊二酸產量高低而得到高產a-酮戊二酸的菌株。一種a-酮戊二酸的生產方法，採用解脂亞洛酵母CCTCCNO:M207143為出發菌株，經種子培養和液體發酵生產a-酮戊二酸；(1)種子培養種子培養基以g/L計葡萄糖20，蛋白腖10，七水硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀1，pH5.5;培養條件溫度28'C、搖床轉速200rpm條件下，培養20-24h;(2)液體發酵培養發酵培養基以g/L計甘油50-150，硫酸銨1.5-7，磷酸二氫鉀1-5，七水硫酸鎂0.1-1.5，氯化鈉0.5，磷酸氫二鉀0.1，碳酸鈣10-30，初始pH4-6;發酵條件接種量10%，溫度25-30°C、搖床轉速170-200rpm條件下，發酵卯-144h。所生產的ot-酮戊二酸產量達到39.3g/L。微生物菌株的篩選與鑑定在本發明中建立一個快速有效的篩選高產oc-酮戊二酸菌株的模型。根據高產a-酮戊二酸的菌株的活性較低，而a-酮戊二酸脫氫酶的活性由該酶重要的輔因子硫胺素調控這一特點，可初步設計一種以篩選硫胺素營養缺陷型菌株為目標的實驗方案。即首先將在CM上培養好的菌株分別點種到MM和含有微量硫胺素的SM上，篩選出在MM上不能生長而在SM上生長良好的菌株，及硫胺素缺陷型菌株。由於硫胺素不僅是a-酮戊二酸脫氫酶的重要輔因子，也是丙酮酸脫氫酶的輔因子，因此硫胺素營養缺陷型菌株在亞適量的硫胺素水平發酵可以積累a-酮戊二酸和丙酮酸兩種有機酸。所以需對篩選到的硫胺素營養缺陷型菌株進行發酵初篩，用矽膠層析方法確定出產a-酮戊二酸的菌株，然後對這些菌株進一步進行發酵，用HPLC方法分析以獲得高產a-酮戊二酸的菌株。本發明從無錫煉油廠附近的土壤中取樣，採土樣於含硫胺素的富集培養基中富集培養2-4次，菌液經適當稀釋後塗布於CM上，30°C培養2-3天，然後分別點種於MM和SM上，篩選出硫胺素營養缺陷型菌株。然後通過進行發酵初篩選取在TCL中保留有a-酮戊二酸顯色斑點的菌株再轉接於裝有發酵培養基的搖瓶中進行發酵復篩，4天後，用HPLC法測定發酵液中a-酮戊二酸的含量。經過對多個土壤樣品的大量菌株篩選工作，從分離出來的數十株硫胺素營養缺陷型土壤微生物中篩選得到雜酸較少，遺傳穩定性好的產a-酮戊二酸菌株WSH-Z06菌株。本發明篩選得到的能有效積累a-酮戊二酸的微生物WSH-Z06，經18SrRNA基因測定和按《微生物分類學》生理生化鑑定，認為屬子囊菌綱假絲酵母屬的解脂亞洛酵母。該菌有兩種形態。在液體培養基中可見典型的酵母菌特徵，即散開的卵形、橢圓形，大小為2-5.5x3.5-15iam，有菌環和醭膜，可見出芽生殖現象；在YPD瓊脂培養基上的菌落呈奶酪狀、乳白色至灰白色，表面有鈹褶、不透明，邊緣不平整，在3(TC條件下培養3天，直徑可達3-5mm，菌體較黏，電鏡觀察可見大量成鏈狀的假絲，並可見子囊和孢子。種子培養基和發酵培養基的滅菌溫度為115-121'C，15min。維生素等熱敏性材料配製後經0.2pm膜濾除菌，接種前加入。將實驗菌株接種到種子培養基中，500mL搖瓶裝液50mL，於28°C，200rpm條件下培養20-24h。按10%的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，25-30°C，170-200rpm條件下培養90-144h。本發明的有益效果本發明的特點是從土壤中分離出有效產生CC-酮戊二酸的解脂亞洛酵母CCTCCNO:M207143,其在適宜條件下，能顯著地積累a-酮戊二酸，產a-酮戊二酸達到13.2-39.3g/L。生物材料樣品保藏解脂亞洛酵母(Tam9Ka/o/;/"cWSH-Z06，保藏日期2007年9月10日，包藏單位名稱及簡稱中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCCNO:M207M3。具體實施方式以下是解脂亞洛酵母CCTCCNO:M207143篩選、鑑定及發酵生產ot-酮戊二酸的實施例。實施例1從無錫市某煉油廠附近的土壤中採樣，稱取5g土樣(溼重)，加到裝有50mL含硫胺素的富集培養基的三角瓶中，30°C，200rpm條件下培養2-3天，按10%的接種量再進行兩次富集。取富集培養物用PBS(0.145mol/L氯化鈉，0.01mol/L磷酸鈉水溶液)稀釋並塗布於CM上，30°C培養2-3天，對應點種MM和SM上，選擇不能在MM而能在SM上生長的菌株，即硫胺素營養缺陷型菌株，進一步進行發酵初篩。28°C，200rpm條件下培養3天後取發酵液離心，上清液點樣到矽膠層析薄板上，於苯乙酸乙酯乙酸體積比為2:1:0.03系統中展層，用溴酚蘭顯色。將保留有oc-酮戊二酸顯色斑點的菌株再轉接於裝有發酵培養基的搖瓶中進行發酵復篩，4天後，用HPLC法(StableBondd8反相柱250x4.6mm，流動相0.1%(v/v)H3PO3，pH2.7，溫度28。C，紫外檢測波長210nm)測定ot-酮戊二酸的含量。其中富集培養基(g/L):葡萄糖20，瓊脂20，土壤浸出液200，蒸餾水800，調pH5.5;121°C高壓蒸汽滅菌15min。土壤浸出'液製備用蒸餾水與等量的上層土或沙壤土混合，去掉重的顆粒，然後過四層紗布得清液。完全培養基(CM)(g/L):葡萄糖20，酵母膏10，蛋白腖10，pH5.5，加入2%瓊脂即為固體CM。基本培養基(MM)(g/L):葡萄糖20，KH2P041，MgS047H200.5，(NH4)2S043，青黴素0.05，制黴菌素0.08，pH5.5，加入2%瓊脂即為固體MM。補充基本培養基(SM)(g/L):在MM中添加10|ag/L的硫胺素，加入2%瓊脂即為固體SM。斜面培養基(g/L):葡萄糖20,蛋白腖IO，酵母膏IO，瓊脂20，28。C培養3天。種子培養基(g/L):葡萄糖20,蛋白腖10，磷酸二氫鉀1，七水硫酸鎂0.5，pH5.5，28°C，搖床轉速200rpm，培養時間20-24h。6發酵培養基(g/L):葡萄糖IOO，硫酸銨3，磷酸二氫鉀1，七水硫酸鎂0.7，氯化鈉0.5，磷酸氫二鉀0.1，碳酸鈣20，初始pH4.5;發酵條件28°C，200rpm，發酵時間6天。實施例2對篩選的WSH-Z06菌株按《微生物分類學》進行生理生化特性鑑定(見表1、2、3)，並按精編分子生物學指南的方法提取染色體DNA，以pl和p2為正向和反向引物，pl:5'-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'，p2:5，-GATCCTTCCGCAGGTTCACC扁3'，用PCR擴增18SrDNA基因，委託上海生工生物工程公司進行18SrDNA測序，得到本菌株部分18SrDNA基因片斷後，在NCBI網站上用BLAST檢索GenBank中相關菌株的18SrDNA的基因序列，並進行同源性比對，基於18SrDNA序列分析和生理生化特性鑑定，結合對該菌的生長和發酵特性研究，認為是解脂亞洛酵母的變種，命名為解脂亞洛酵母(Kwow/a/*0/>^力WSH-Z06，此菌株已保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCNO:207143。表1菌株的碳源發酵葡萄糖+蜜二糖_麥芽糖一甘露醇+半乳糖_甘油+蔗糖_檸檬酸鹽—乳糖_醋酸鹽_棉子糖—乙醇+表2碳源和氮源的同化及其它生理和生化特徵葡萄糖+甘油+.可溶性澱粉—￡30。C+麥芽糖一檸檬酸鹽+海藻糖—■〉35。C半乳糖±醋酸鹽+纖維二糖—50。/。葡萄糖庶糖一乙醇(<3g/L)+D-阿拉伯糖60%葡萄糖—乳糖一肌醇_木糖無硫胺素—棉子糖一認04+L-阿拉伯糖一無生物素+蜜二糖一(NH4)2S04++甘露醇+甲醇一表3假菌絲和類澱粉化合物形成假菌絲+類澱粉化合物一實施例3將培養好的CCTCCNO:M207143種子以10%的接種量接種到含相同碳濃度(32g/L)的葡萄糖、乙酸鈉、甘露醇、乙醇、甘油等不同碳源的發酵培養基中，發酵培養基其餘組成為硫酸銨3g/L，磷酸二氫鉀1g/L，七水硫酸鎂0.7g/L，氯化鈉0.5g/L，磷酸氫二鉀0.1g/L，硫胺素4pg/L,培養基初始pH4.5，接種後補加碳酸鈣20g/L用來調節pH，在28t:，200rpm條件下發酵90h，用HPLC測定發酵液中的a-酮戊二酸的含量。結果表明以甘油為碳源發酵時明顯優於其它種類的碳源(32g/L的碳源折算成甘油的濃度為82g/L)，發酵結束時，a-酮戊二酸產量為13.2g/L;而以葡萄糖為碳源時產量僅為9.5g/L;當採用其它種類的碳源時則產生更少量或不產生a-酮戊二酸。實施例4以甘油為碳源，向發酵培養基中添加不同濃度(0-16pg/L)的微量硫胺素，發酵培養基其餘組成同實施例3，接入培養好的CCTCCNO:M207143種子液，在上述的條件下進行發酵6天，用HPLC測定發酵液中的a-酮戊二酸的含量。結果顯示硫胺素濃度為1pg/L時相對最有利於a-酮戊二酸的積累，產量達到29.2g/L。實施例5以甘油為碳源，向接種後的發酵培養基中添加不同濃度(10-60g/L)的碳酸鈣，發酵培養基其餘組成同實施例3，以上述的條件進行發酵6天，用HPLC測定發酵液中的a-酮戊二酸的含量。結果發現向發酵培養基中添加20g/L的碳酸鈣最有利於a-酮戊二酸的發酵生產，發酵結束時a-酮戊二酸的產量可達到39.3g/L。權利要求1、一種α-酮戊二酸高產菌，分類命名為解脂亞洛酵母(Yarrowialipolytica)WSH-Z06，已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNOM207143。2、一種解脂亞洛酵母CCTCCNO:M207143的篩選方法，其特徵是從煉油廠附近的土壤中經對照在完全培養基、基本培養基和補充培養基平板上菌落生長情況篩選出硫胺素營養缺陷型的菌株，然後對初篩出的硫胺素缺陷型菌株採用一級發酵逐一搖瓶培養，發酵液利用矽膠層析方法分析，將保留有a-酮戊二酸顯色斑點的菌株再轉接於裝有發酵培養基的搖瓶中進行發酵復篩，發酵液經高效液相方法測定，比較a-酮戊二酸產量高低而得到高產a-酮戊二酸的菌株。3、一種a-酮戊二酸的生產方法，其特徵是採用解脂亞洛酵母CCTCCNO:M207143為出發菌株，經種子培養和液體發酵生產a-酮戊二酸；(1)種子培養種子培養基以g/L計葡萄糖20，蛋白腖10，七水硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀1，pH5.5;培養條件溫度28。C、搖床轉速200rpm條件下，培養20-24h;(2)液體發酵培養發酵培養基以g/L計甘油50-150，硫酸銨1.5-7，磷酸二氫鉀1-5，七水硫酸鎂0.1-1.5，氯化鈉0.5，磷酸氫二鉀0.1，碳酸鈣10-30，初始pH4-6;發酵條件接種量10%，溫度25-3(TC、搖床轉速170-200rpm條件下，發酵90-144h。全文摘要一種α-酮戊二酸高產菌及其篩選方法和用該菌株發酵法生產α-酮戊二酸，屬於生物工程
技術領域：
。本發明菌株為一株解脂亞洛酵母(Yarrowialipolytica)WSH-Z06，保藏編號CCTCCNOM207143。該菌株是從煉油廠附近的土壤中經在完全培養基、基本培養基和補充培養基平板上菌落生長情況的對照篩選出硫胺素營養缺陷型的菌株，然後對篩選出的硫胺素缺陷型菌株採用一級發酵逐一搖瓶培養初篩，發酵液利用矽膠層析方法分析，將保留有α-酮戊二酸顯色斑點的菌株再轉接於裝有發酵培養基的搖瓶中進行發酵復篩，發酵液經高效液相方法測定，比較α-酮戊二酸產量高低而得到的高產α-酮戊二酸的一株菌，通過對發酵培養基中重要組成成分進行優化，發酵6天時α-酮戊二酸產量可達到39.3g/L。文檔編號C12N1/16GK101215529SQ20071030244公開日2008年7月9日申請日期2007年12月26日優先權日2007年12月26日發明者劉立明,周海巖,堅陳申請人:江南大學