高轉導效率、嗜肝細胞性C型肝炎擬似病毒及其包膜蛋白編碼序列的製作方法
2023-10-22 11:44:42 3
專利名稱：高轉導效率、嗜肝細胞性C型肝炎擬似病毒及其包膜蛋白編碼序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥工程技術領域，是一種含高轉導效率、高肝細胞嗜性C型肝炎包膜蛋白的擬似病毒顆粒及其製備方法。
背景技術：
C型肝炎病毒Q^patitis C virus, HCV)是一種嗜肝單股正鏈RNA病毒，屬於黃病毒屬成員，該病毒嗜肝特性的機制目前尚不十分清楚。目前鑑定出人四次跨膜素家族成員⑶81、清道夫受體SR-BI和緊密連接蛋白claudin 1、occludin是HCV感染必須依賴的受體，但這四種分子也同時表達於其他組織細胞，因此不能以此完美解釋HCV的嗜肝特性。 HCV的體外細胞培養非常困難，目前尚不能用感染者血清在體外感染靶細胞從而達到分離培養的目的，這給研究HCV帶來了很大困難。2003年法國和美國的兩個實驗室分別報導，用編碼小鼠白血病病毒(MMLV)或人類免疫缺陷病毒(HIV)包裝信號RNA序列及報告基因序列的質粒與衣殼蛋白-逆轉錄酶表達質粒以及HCV包膜蛋白表達質粒共轉染人胚胎腎成纖維細胞，可以獲得可感染性與HCV相似的嵌合病毒，該病毒表面的雙層脂質膜中鑲嵌有生物活性的HCV包膜糖蛋白，內部含有MLV或HIV的衣殼蛋白-逆轉錄酶。嵌合病毒表面的HCV包膜蛋白是該嵌合病毒具有與HCV相似生物特性(肝細胞嗜性、能被HCV中和抗體中和等)的結構基礎。由於該嵌合病毒能模擬HCV的感染，但內部並非HCV的結構，因此被稱為 HCV 擬似病毒(HCV pseudo-particle, HCVpp)。大量研究顯示，HCVpp的細胞嗜性與天然HCV完全一致，只能感染人類肝組織來源的某些細胞系，感染性也嚴格依賴四種受體的表達，HCV包膜蛋白中和抗體能有效中和 HCVpp的感染性。HCVpp的這些特點使其成為研究HCV感染機制的重要模型，同時，也為開發靶向感染肝細胞的病毒載體提供了一種有效途徑。然而，目前所有實驗室建立的HCVpp 製備方法均存在一個共同的問題，就是病毒產量及轉導效率很低，293T細胞培養上清中的病毒滴度均低於105FFU(fOcus forming unit)/ml，這在很大程度上限制了 HCVpp的應用， 因此高滴度、高轉導效率、高肝細胞嗜性的C型肝炎擬似病毒顆粒的研製在HCV研究及生物技術運用上意義重大。
發明內容
本發明的目的在於建立一種能製備高滴度、高轉導效率、高肝細胞嗜性HCVpp的方法，高滴度、高轉導效率、高肝細胞嗜性的HCVpp不僅可用於研究HCV的感染機制，評價 HCV疫苗誘導抗體的保護作用，還能用作肝組織靶向感染的基因治療載體。HCV擬似病毒顆粒的主要包括三個基本成分1)慢病毒/逆轉錄病毒衣殼蛋白-逆轉錄酶，在細胞漿中主要負責識別並結合病毒核酸、構成病毒樣結構及分泌出牙新的病毒顆粒，是病毒滴度的主要決定元件；在感染靶細胞後，該蛋白元件負責將病毒核酸RNA變成雙鏈DNA，在其它蛋白的參與下將該DNA插入到核內染色體中完成病毒核酸插入宿主染色體以達到複製繁殖的目的。幻報告基因，是將報告基因綠色螢光蛋白/螢光素酶等編碼序列與衣殼蛋白-逆轉錄酶識別序列合理拼接起來的一段RNA，在擬似病毒感染靶細胞後，該RNA能按照逆轉錄病毒/慢病毒在感染細胞內部的生活史，完成從RNA變成雙鏈DNA的過程，並插入宿主染色體內，依靠宿主信使RNA的生理代謝特點，完成報告基因的表達，從而為人工製作的擬似病毒提供方便可靠的評測手段。幻HCV包膜蛋白，該蛋白元件在擬似病毒顆粒中的主要職能是負責模擬相關病毒的靶細胞嗜性，能很好地代表病毒感染早期階段病毒包膜蛋白與宿主細胞發生的一切生物學現象。大量研究顯示，含愛滋病毒包膜蛋白的擬似病毒顆粒能很好的呈現愛滋病毒包膜蛋白的生物學特性，含流感病毒包膜蛋白的擬似病毒顆粒也能很好地代表流感病毒感染早期包膜蛋白的生物學特性。HCV包膜蛋白能有效、高靶向地將HCVpp導入某些肝癌細胞株或者原代肝細胞、該特性能有效地被HCV 感染病人血清中和說明該包膜蛋白能很好地代表HCV感染特性，是區別不同擬似病毒顆粒的最關鍵元件。HCV主要分成1-6個主要基因型別，近百種基因亞型，每種型別具備不同的生物學特性，如1型佔世界流行株的一半以上，也是幹擾素加利巴韋林治療不敏感的一個基因型。這些特性暗示著這個型別的HCV在宿主和病毒漫長的自然選擇中具備比較強的生存能力。擬似病毒技術出現之前，人們沒有辦法來研究各個型別HCV包膜蛋白的生物學特性的差異，如，感染能力等，因此，研究不同基因型別HCV包膜蛋白的感染能力，篩選出具備高感染力的HCV包膜蛋白意義重大。本發明主要體現在篩選、優化了一株HCV包膜蛋白全長基因(lb亞型)，含有該序列編碼的包膜蛋白的擬似病毒感染滴度可達到107FFU/ml。具體內容如下一，HCV包膜蛋白全長基因的克隆從50名HCV RNA陽性感染者血清中抽提病毒核酸RNA，然後用逆轉錄和聚合酶鏈反應擴增出HCV包膜蛋白全長基因，將擴增的基因插入高效表達載體，然後對擴增的基因進行測序鑑定。二，功能性HCV包膜蛋白編碼序列的篩選運用50株HCV包膜蛋白全長基因插入表達質粒，結合衣殼蛋白-逆轉錄酶、報告基因表達系統，共同轉染細胞，分別製作成50種HCVpp，50種HCVpp同時分別感染人肝癌Huh7細胞，72小時後用流式細胞儀檢測Huh7細胞內報告基因綠色螢光蛋白(慢病毒質粒表達)的表達，以此判斷50種HCVpp將報告基因轉導到靶細胞的效率。通過該實驗篩選出一株可製備出5X105FFU/ml HCVpp的HCV包膜蛋白編碼基因。三、HCV包膜蛋白基因的優化HCV包膜蛋白E2氨基末端的27個胺基酸高度變異，被成為高變區 1 (hypervariable region 1，HVR1)，HVRl 是介導 HCV 包膜蛋白與 HCV 受體 SR-BI 結合的關鍵功能肽段，該肽段序列的變異不僅可使得HCV逃避免疫應答，還能通過調節HCV包膜蛋白與SR-BI的親和力而影響HCV的感染性。我們將HVRl的第8和第12位胺基酸殘基同時突變為組氨酸，並缺失第16 M位胺基酸殘基，構成優化的HCV包膜蛋白表達序列，運用該序列編碼的HCV包膜蛋白構建新的HCVpp，比較該擬似病毒與未優化的擬似病毒基因轉導效率，結果顯示該HCVpp感染性滴度能達到1 X 107FFU/mlo四，HCVpp細胞嗜性的鑑定
我們進一步將HCVpp感染9種細胞系，結果表明，HCVpp僅能感染人肝組織來源的 Huh7細胞和HepIBB細胞系。集合國際同行的結果，含該包膜蛋白顯示很好的肝細胞嗜性。本發明中用於製備HCVpp的HCV包膜蛋白基因序列如SEQ ID NO. 1所示，胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
圖1 :50株HCVpp的感染性檢測圖2 =HVRl突變對HCVpp感染性的影響圖3 =HCVpp對不同細胞系的易感性
具體實施例方式實施例1 :HCV包膜蛋白全長基因的克隆1、HCV核酸的抽提分別從50名HCV RNA陽性感染者血清中抽提病毒核酸RNA，採用QIAGEN公司 QIAamp Ultraseus virus 試齊[|盒。具體方法取Iml血清至2ml EP管並平衡溫度至15°C _25°C，加800ul Buffer AC, 加5. 6ulcarrier RNA到EP管蓋子裡，然後漩渦振蕩IOs混勻；室溫培育10分鐘，3200rpm 3min離心，棄去全部上清；加300ul Buffer AR(60°C預熱)加20ul蛋白酶K，漩渦振蕩使沉澱全部溶解；40°C水浴10分鐘期間漩渦振蕩一次5秒鐘，將其全部移入QIAamp Spin Column 6000rpm Imin 離心棄去廢液；加 500ul Buffer Affl 7500rpm Imin 離心棄去廢液， 加 500ul Buffer AW2 15000rpm;3min 離心棄去廢液，加 30ul Buffer AVE 7500rpm Imin 離心，收集含HCV RNA洗脫液，-20°C保存。2、逆轉錄和聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增HCV包膜蛋白全長基因用hvitrogen逆轉錄試劑盒(Super Script II)對抽提的病毒RNA進行逆轉錄， 引物採用隨機引物。逆轉錄產物進行PCR擴增。具體方法取1. 5ml離心管，加去離子水5ul、隨機引物(IOuM) Iul、樣品RNA 5ul、 dNTP 11^1(101111)1111，651孵育51^11後置於冰上，加5\卩化8{-8^^11(1 Buffer 4ul、0. 1M、 DTT 2ul、RNase0UT Iul，25°C孵育 2min，加 Superscript IIRT lul，25°C孵育 lOmin，42°C 孵育50min，70°C孵育15min，取2ul進行PCR擴增。逆轉錄產物進行PCR擴增。用Roche的高保真耐熱DNA聚合酶(Pwo SuperYield DNA Polymerase)對逆轉錄產物進行擴增，分兩輪進行。第一輪PCR擴增，引物5'引物660"^601^￥01^1666614化=00
3'引物GATGCAGCCATCTCYCGGTC(Y = CT)退火溫度58°C，延伸時間2分鐘，35個循環，PCR產物取4微升進行第二輪擴增。第二輪PCR擴增，引物5' :GTTGCTCTTTYTCTATCTTC(Y = CT)3'引物GCTATCAGCAGCATCATCCA
退火溫度58 V，延伸時間2分鐘，；35個循環。3、PCR產物的克隆和測序將第二輪擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收擴增的分子量約1900bp的DNA片段，與pMDlS-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α，獲得抗氨苄青黴素的轉化子接種LB，抽提質粒，酶切鑑定有相應的DNA片段插入後，對質粒進行DNA測序。獲得了來源於50例HCV感染者的HCV包膜基因全長克隆。具體方法取50ul PCR 產物加 IOXloading buffer 5ul, 1% agarose, TBE 電泳液，IOOmv 40min電泳，回收1900bp的DNA片段。將電泳所得到的E1E2條帶(1900bp)分別切下回收至以稱重的1. 5ml EP管中，用QIAEX II Gel Extraction Kit純化加入3倍體積的 Buffer QXl(100mg 加 300ul QXl)。加 30ul Buffer QIAEX II 然後 50°C水浴 10 分鐘，期間每兩分鐘漩渦振蕩一次。13000rpm 30s離心，棄去上清，加500ul QIAEX I洗一次， 加Buffer PE 500ul洗兩次棄去上清，空氣乾燥15min直至沉澱變白。加入20ulTE漩渦振蕩30秒培育5min，13000rpm, 30s離心將上清移入1. 5mlEP管。取純化後的PCR產物2ul， PMD18-T vector lul，去離子水 2ul 加入 5ul 的 solution I，16°C反應 30min。全量加入至 100ulDH5a，冰中放置30min，42°C加熱45秒鐘後，再冰中放置Imin。加入LB培養基，37°C振蕩培養60min。取IOOul塗含有氨苄青黴素的L-瓊脂平板培養基，37°C培養16小時，形成單菌落，挑出單菌落至含氨苄青黴素LB培養基培養8小時，將培養8小時的菌液用QIApr印 Spin Miniprep Kit小提質粒將菌液倒入標記好的1. 5ml離心管中，13000rpm，4°C，3min， 離心棄去上清；加250ul Buffer P1，混勻(不留塊狀沉澱)，加250ul Buffer P2，迅速輕輕顛倒4-6次；加入350ul Buffer N3，顛倒4-6次混勻，有白色絮狀物析出，13000rpm, 4°C，IOmin ；把QIApr印spin column放於一 1. 5ml EP管中(收集廢液)然後將上清移入 QIAprep spin column 中，8000rpm 4°C Imin ；棄去廢液，加 750ul Buffer ΡΕ, 13000rpm, 4°C, lmin，棄去廢液，13000rpm，4°C, Imin離心，將QIApr印 spin column移入新的 1. 5ml 離心管中，豎直加30ul Buffer EB於膜上，放置Imin後，4°C，13000rpm, Imin離心獲得液體單克隆的質粒。然後酶切鑑定，用限制性內切酶Nhe I和EcoRI對上步所得質粒進行雙酶切鑑定。酶切體系為10XNEBuffer (3) 2ul、BSA lul.Nhe I 0.5ul、EcoRI 0.5ul、DNA 0. 8ug、 雙蒸水補足20ul，37°C溫育1小時，瓊脂糖電泳。挑選酶切正確的克隆進行測序鑑定。實施例2 功能性HCV包膜蛋白編碼序列的篩選1、HCV包膜蛋白表達質粒的構建將經過酶切、測序鑑定正確的HCV包膜蛋白基因用PCR擴增，引物序列根據測序獲得的5'和3'端序列設計、合成，在5'和3'端分別加入酶切位點Nhe I和EcoRI。PCR 擴增產物用Nhe I和EcoRI酶切，插入質粒表達載體pCI-neo (Promega產品)，酶切鑑定後再測序鑑定。正確的質粒用於製備HCVpp。具體方法A限制性內切酶消化將鑑定正確的帶有HCV包膜蛋白編碼序列的克隆和pCI-neo 表達質粒分別用Nhe I和EcoRI限制性內切酶消化，酶切體系為=IOXNEBuffer (3) IOul、 Nhe I 5ul、EcoRI 5ul、BSA lul、質粒 DNA 5ug、雙蒸水補足至 lOOul，37°C溫育 2 小時。1% 瓊脂糖電泳，回收1900bp的DNA片段和pCI-neo載體片段。將電泳所得到的E1E2條帶和 pCI-neo條帶分別切下回收至以稱重的1. 5ml EP管中，用QIAEX II Gel Extraction Kit純化加入 3 倍體積的Buffer QXl (IOOmg加 300ul QX1)。加 30ul Buffer QIAEX II 然後 50°C 水浴10分鐘，期間每兩分鐘漩渦振蕩一次。13000rpm 30s離心，棄去上清，加500ul QIAEXI 洗一次，加Buffer PE 500ul洗兩次棄去上清，空氣乾燥15min直至沉澱變白。加入20ulTE 漩渦振蕩30秒培育5min，13000rpm, 30s離心將上清移入1. 5mlEP管。按E1E2基因片段與 pCI-neo載體基因片段3 1比例用T4連接酶Gnvirtogen公司)分別進行定向連接，連接體系5X Ligase Reaction Buffer 4ul、pCI-neo 載體 30fmol、E1E2 基因片段 90fmol、 T4DNA Ligase 1U、去離子水補足至20ul，混勻後室溫靜止1小時。取2ul轉化至DH5 α，塗布 L-瓊脂平板培養基(氨苄青黴素)，37°C培養16小時。挑取單克隆至LB (含氨苄青黴素)， 370C 200rpm振蕩培養8小時。提取質粒；酶切鑑定，酶切反應體系10 XNEBuffer (3) 2ul、 Nhe I 0. 5ul、EcoRI 0. 5ul、BSA 2ul、質粒 DNA 0. 5ug、雙蒸水補足 lOOul，37°C溫育 40min， 瓊脂糖電泳。測序鑑定。2、HCVpp 製備將HCV包膜蛋白表達質粒與基於HIV的慢病毒包裝質粒Gnvitrogen產品)共轉染細胞。全部質粒包括HCV包膜蛋白表達質粒，pLPl質粒anvitrogen產品)， PLP2質粒(Invitrogen產品)，pLenti-EGFP質粒(Invitrogen產品)。各質粒用量比例 2:5:3:3。轉染48小時後收集細胞培養上清，過濾45 μ m濾器，用於感染Huh7細胞。具體方法A. Huh7和293T細胞株的培養Huh7和細胞株培養用DMEMlO % FBSU % HEPES, 1 % PS (Invirtogen公司)，傳代倒掉原有培養基，用0. OlM PBS清洗兩次，加 0. 25% Trypsin-EDTA Iml將細胞消化下來後，加入完全培養基吹打兩次使細胞分散開，取適量細胞懸液到新的培養瓶37°C 5% C02培養。B.擬似病毒顆粒製作將HCV包膜蛋白表達質粒，pLPl質粒，pLP2質粒， pLenti-EGFP 質粒使用 PolyFect Transfection Kit 共同轉染 37 °C 5 % C02 二氧化碳培養箱72小時，收集上清用0. 45umPVDF膜過濾，4 °C保存。轉染試驗按PoIyi^ect Transfection kit說明操作方法如下1. 5ml EP管取HCV包膜蛋白表達質粒(0. Iug/ ul)2ul pLPl 質粒(0. lug/ul)5ul pLP2 質粒(0. lug/ul)3ul pLenti-EGFP 質粒(0. lug/ ul) 3ul加DMEM87ul充分混勻，加Polyfect 20ul混勻，室溫靜止5-10分鐘。取一瓶293T 細胞(培養瓶75cm2)用0. OlM PBS洗兩遍，0. 25% Trypsin EDTA消化後，加完全培養基吹打分散，計數，6孔板每孔種150萬個細胞補足每孔培養基終體積1. 5ml，將準備好的質粒轉染試劑混合液加600ul完全培養基吹打兩次加入6孔板，輕拍使細胞均勻分布，37°C 5% C02 二氧化碳培養箱培養72小時。收集上清，用0. 45umPVDF膜過濾，4°C保存。3、HCVpp感染人肝癌Huh7細胞系分別取上述過濾處理的細胞培養上清100 μ 1，加入預先接種有8000個Huh7細胞的96孔板(先吸除原培養上清)，5小時後換液，然後繼續培養72小時。具體方法將Huh7細胞用0. OlM PBS洗兩遍，用0. 25% Trypsin EDTA消化後加完全培養基，吹打幾次，使細胞充分分散，計數，96孔板，每孔8000個細胞，37°C 5%二氧化碳培養箱培養8小時。將上面準備的96孔板培養基吸出，用將過濾處理的細胞上清與完全培養基1 1混合每孔加IOOul病毒混合液。37°C 5%二氧化碳培養箱5小時後換成完全培養基。繼續培養72小時。
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4、用流式細胞檢測表達綠色螢光蛋白(EGFP)的細胞陽性率，根據檢測的細胞總數、EGFP陽性率以及投入的HCVpp上清體積(100 μ 1)，計算HCVpp的滴度FFU。結果如圖所示，50株HCVpp的感染性差異顯著，41株低於1 X 104FFU/ml,8株介於1 X IO4-I X IO5FFU/ ml，一株為5 X 105FFU/ml，將該株命名為C50。實施例3 =HCV包膜蛋白基因的優化1、我們前期的研究表明，HCV包膜蛋白HVRl中的鹼性胺基酸殘基對於HCVpp的感染性有重要影響，尤其是第8和第12位胺基酸殘基如果是鹼性胺基酸，能明顯增強HCVpp 的感染性。根據這些研究結果，我們將C50株HCV包膜蛋白基因中編碼HVRl的第8位纈氨酸殘基(V)和第12位蘇氨酸殘基(T)單獨或同時突變為組氨酸殘基，採用Mratagene 試劑盒(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)進行突變。突變體分別命名為 C50-V8H、C50-T12H、C50-VT-2H。2、我們前期的研究還表明，HCV包膜蛋白HVRl中的第16- 位胺基酸殘基在空間上阻礙HCV包膜蛋白與SR-BI受體的結合，刪除該肽段能明顯增強HCVpp的感染性。因此， 我們將C50⑶C株HCV包膜蛋白基因中編碼第16-M位胺基酸殘基刪除，採用Mratagene 試劑盒進行突變，突變體命名為C50-D9。3、同時將HVRl的第8位纈氨酸殘基和第12位蘇氨酸殘基突變為組氨酸殘基，並缺失第16- 位胺基酸殘基，突變體命名為C50-2HD9。4、分別以上述包膜蛋白突變體製作HCVpp (實施例2. 2)，感染Huh7細胞，然後用流式細胞儀檢測報告基因EGFP的表達，獲得HCVpp的感染性滴度(圖幻，上述突變體包裝的 HCVpp 感染性滴度分別為:C50-V8H :9. 2X 105FFU/ml、C50-T12H :8. 4X 105FFU/ml、 C50-VT-2H :3. 3X106FFU/ml、C50-D9 :5. 8X 106FFU/ml、C50-2HD9 :1 X 107FFU/ml。與原型 C50的5X 105FFU/ml滴度相比，這些突變均能增加HCVpp的感染性滴度，尤其是突變具有協同效應，使得C50-2HD9突變體HCVpp滴度能高達1 X 107FFU/ml,目前沒有任何相關技術報導。實施例4 =HCVpp細胞嗜性的鑑定將C50-HCVpp和突變體C50_2HD9HCVpp感染不同組織來源的細胞，包括細胞 (人胚腎成纖維細胞)、Huh7細胞(人肝癌細胞)、Η印;3Β細胞(人肝癌細胞)、Raji細胞(人 B淋巴瘤細胞)、Molt4細胞(人T淋巴瘤細胞)、Hela細胞(人宮頸癌細胞)、NIH3T3細胞 (小鼠成纖維細胞)、CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)、Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)。將上述細胞接種96孔板，每孔8000個細胞，過夜培養後，吸除原培養液，每孔加入C50-HCVpp 或突變體C50-2HD9HCVpp上清100 μ 1，5小時候換液，繼續培養72h，檢測EGFP的表達。結果C50-HCVpp和突變體C50-2HD9HCVpp僅感染Huh7細胞和HepIBB細胞，不感染其他任何細胞，表明製備的HCVpp具有嗜肝細胞的特徵(圖3)。
權利要求
1.一種高滴度特異性感染肝細胞的C型肝炎擬似病毒的製備方法，其特徵在可獲得感染性達到lX107FFU/ml的C型肝炎擬似病毒。
2.根據權利要求1所述的一種高滴度特異性感染肝細胞的C型肝炎擬似病毒的製備方法，其特徵在於C型肝炎擬似病毒具有人肝細胞靶向感染的特性，專一感染人肝組織來源的細胞。
3.根據權利要求2所述的一種高滴度特異性感染肝細胞的C型肝炎擬似病毒的製備方法，其特徵在於HCV包膜蛋白序列是從HCV感染者血清中克隆並篩選而獲得，並對高變區 1進行了突變，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
4.根據權利要求3所述的一種高滴度特異性感染肝細胞的C型肝炎擬似病毒的製備方法，製備的C型肝炎擬似病毒可用於研究HCV的感染機制，評價抗體以及小分子藥物對 HCV感染的阻斷作用。
5.根據權利要求4所述的一種高滴度特異性感染肝細胞的C型肝炎擬似病毒的製備方法，製備的C型肝炎擬似病毒可用做肝組織靶向性基因治療載體。
全文摘要
本發明涉及生物醫藥工程技術領域。本發明篩選並通過基因突變的方法獲得一株高轉導效率、高肝細胞嗜性的C型肝炎病毒包膜蛋白基因，將該基因的表達質粒與基於HIV的慢病毒包裝質粒共轉染可獲得感染性滴度達到1×107FFU/ml的C型肝炎病毒擬似病毒，該方法獲得C型肝炎病毒擬似病毒的感染滴度比其他方法高100倍，由於C型肝炎病毒擬似病毒為肝細胞特異性感染，因此除了用於研究C型肝炎的感染機制、評價中和抗體、篩選小分子藥物以外，還可能作為肝細胞靶向性基因治療載體，具有重要的應用前景。
文檔編號A61K48/00GK102234634SQ20101056731
公開日2011年11月9日 申請日期2010年12月1日 優先權日2010年12月1日
發明者王嶽, 譚文杰, 趙平 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所