以啤酒廢棄物為原料製作Bt培養基的方法及產品的製作方法

2023-10-22 02:58:02 2

專利名稱：以啤酒廢棄物為原料製作Bt培養基的方法及產品的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物培養基，具體涉及一種以啤酒廢棄物為原料製作蘇雲金芽胞桿菌(Bacillus thuringimsis,H\m)培養基的方法及產品。
背景技術：
Bt是一種革蘭氏陽性細菌，主要特性在於形成芽胞的同時，在菌體內形成具有蛋白質性質的一個或多個伴胞晶體。由於這類蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目昆蟲及動植物寄生線蟲等有較強的毒殺作用，而對人和家畜無毒、不汙染環境、不產生抗藥性等優點，在全球農、林、衛生害蟲防治中得到廣泛應用，是最普遍適用的微生物殺蟲劑之一。據 2005年統計，我國生物農藥年產量只佔農藥總量的1% (約佔1.4%的化學農藥)，離「世界環境與發展大會」提出生物農藥要達到60%的目標甚遠，其中主要原因之一是生產成本。生物農藥其開發成本只有化學農藥的十分之一，但其生產成本要高於化學農藥。一般工業化生產Bt的培養基是由大豆粉、魚粉、葡萄糖、酵母浸膏、蛋白腖、微量元素組成，其成本都很高，其價格約佔總生產成本的35% -59%。隨著環境要求的提高和農業的不斷發展，Bt的需求不斷增大，而糧食類原料成本日益漲價，引起Bt的生產成本「水漲船高」，限制了 Bt殺蟲劑的普及。研究表明Bt在含氮0. 075% -0. 225%、含糖0. 1%-1.5% 和C:N 0.44-20.0的範圍內都能生長良好。為了降低Bt的生產成本，促進Bt的應用，利用便宜的培養基培養Bt是明智的選擇。最近50年不少研究者利用較便宜的原料，如工農業副產品、廢棄物、汙水、汙泥等廉價原料，替代傳統原料生產Bt殺蟲劑，以達到節約糧食、 就地取材、降低成本、提高經濟的效果。採用低成本、當地易得的生產原料發酵生產Bt殺蟲劑，是近年來國內外Bt發酵行業的研究熱點。研究表明利用汙泥/汙水培養Bt，基本可達到工業化的水平，與傳統培養基比較， Bt增殖快，毒力更大或達同一數量級，形成芽胞更早，是Bt發酵的良好培養基。但存在消毒殺菌難、營養成分波動大，培養基營養受到汙泥濃度的限制等問題，未見具體的工業生產應用的報導；農產品或農產品加工的廢棄物、廢水從理論上說也均可作為Bt的發酵原料或 Bt的培養基，基本可以滿足Bt生產的需要，但很多原料來源受限，如玉米浸泡液、丙酮丁醇廢液、酒精醪液、玉米漿、澱粉等；並且有些加工的工業廢水需要進行複雜的預處理，消除對 Bt生長有害的物質，預處理繁瑣、昂貴，如去除高濃度有毒的苯類有機物、脫脂、蛋白洗脫或濃縮等，因處理而導致原料成本提升；同時因原料不穩定，營養成分變化大，發酵難於控制， 因此有大量有機廢棄物不適合作為工業發酵培養基；因此Bt殺蟲劑商業化中，生產發酵的培養基的選擇尤為重要，一個有效的發酵培養基既要原料來源廣、營養成分相對穩定、發酵水平高、原料成本低，又能充分發揮殺蟲活性菌株的毒力和致病率。

發明內容
本發明的目的是提供一種綜合利用啤酒廢水、釀酒廢酵母及其他碳源、氮源、磷素和金屬離子配製成高效的Bt液體發酵培養基，該培養基Bt發酵增殖快，毒力更大，對 Π -ΠΙ齡小菜蛾幼蟲毒力大，4 校正死亡率在95%以上，達到更高的水平。本發明所述的一種以啤酒廢棄物為原料製作Bt培養基劑的方法，以啤酒廠啤酒廢水、破壁滅菌後的酵母泥浸出液、調節劑組成；調節劑由葡萄糖、麥芽糖、(NH4)2S04、 ZnSO4, HPO4-2 或 H2PCT14 的 Na+1 和 K+1 鹽和吐溫 80 組成。各種原輔料組配及成份調整方法如下
1、培養基基本成分按重量百分比是啤酒廢水70%_80%+破壁滅菌後的酵母泥浸出液 20-30% ；
2、加調節劑調整後的混合液組成的目的培養基的全碳(TC)全氮(TN):全磷(TP) =15-25 :1-1. 5 :1-1. 5，其中 TC :3500_4500mg/L、TN: 200_300mg/L、TP: 250_400mg/L、 Zn+2 :0. 03-0. 04%、Na+1 0. 25-0. 35%、K+1O. 035—0. 040%、吐溫 80 為 0· 10-0. 25%。3、調節劑的的調整方法先根據啤酒廢水的成分，按要求加入20-30%破壁滅菌後的酵母泥浸出液，再根據其混合液的各成分的含量分別加入氮源調節劑(MM)2SO4、碳源調節劑麥芽糖或葡萄糖、鉀離子與磷素調節劑KH2PO4或K2HPO4、鈉離子與磷素調劑NaH2PO4 或Na2HPO4微調。TN不足加入(MM)2SO4調節，TC不足加入葡萄糖或麥芽糖調節，TP不足加入吼 04或1(2朋04調節，以確保培養基成分達到目的培養基的要求，最後加入吐溫80至 0. 10-0. 25% ；再經混合溶解，121°c高壓蒸汽滅菌45min，即為產品。根據上述方法，製成以啤酒廢棄物為原料製作的Bt培養基產品。啤酒生產工業十分發達，生產過程中主要的副產品及廢棄物有糖化過程中的糖化糟、酒花糟、沉澱蛋白，發酵過程中的剩餘酵母，以及各工藝中排出的廢水和廢水處理沉澱下來的活性汙泥等。啤酒廢水廢棄物的特點①我國啤酒產量已連續多年居世界第一，廢棄物排放量大，啤酒廠分布於每個城市；②營養成分豐富(較城市汙水高)，數量比較穩定， 含有大量的糖類、蛋白質和纖維素、多糖、醇類等中低分子有機物；③B0D/C0D比值一般大於0. 5，可生化性較好；④衛生性好包裝車間生產時，PH高達10以上，溫度40-60度，整個生產過程致病菌汙染機會少，重金屬含量低，國家汙水檢測要求36項，而啤酒廢水只要求檢測其中6項，而不檢測重金屬元素。研究表明，啤酒廢棄物不經預處理和營養配方即可以滿足Bt生長的需要；但由於啤酒廢水生產過程營養成分會波動，且啤酒廢水+破壁滅菌後酵母泥浸出液培養Bt存在營養不均衡，發酵速度過短，產芽胞數和晶體量少，引起毒力效價低且波動大。而採用本發明的方法，以破壁滅菌後的酵母泥浸出液、啤酒廢水、葡萄糖、麥芽糖為碳源，以破壁滅菌後的酵母泥浸出液為主要氮源，提供了該菌生長和代謝所需的碳源和氮源；加入的金屬離子無機鹽是微生物細胞內分子的結構成分，並具有生理調節和酶激活劑的功能；還使用磷酸氫鹽調節培養基的酸鹼度，維持該菌生長所需的最適的PH，滿足了該菌快速生長增殖的營養需要。蘇雲金芽胞桿菌菌株8010發酵培養25-30h，95%以上芽胞脫落。發酵液稀釋1000倍後，對Π -ΠΙ齡的小菜蛾幼蟲48h的致死率可達到95%以上；明顯優於直接使用啤酒廢水及城市汙泥培養基，4 對Π - ΠΙ齡的小菜蛾幼蟲的校正死亡率提高了十個百分點以上，效益十分明顯。
具體實施例為了更充分公開本發明的方法與產品，以下結合實施例加以說明。實施例由啤酒廢水、破壁滅菌後的啤酒酵母泥浸出液、調節劑組成；各種原料所佔的重量百分率如下原料1:破壁滅菌後的酵母泥浸出液成分(mg/L) =TC 14850，TP 327. 6，TN 604 原料 2:啤酒廢水成分(mg/L) =TC 843，TP 0. 72，TN 80
上述原料以啤酒廢水75%+破壁滅菌後的啤酒酵母泥浸出液25%混合，測的的混合液含有TC、TN, TP符合要求，Zn離子含量約為0，Na離子含量0. 03%, K離子含量0. 0026%o根據目的培養基的營養要求，此時調節劑應該加入=ZnCl2 0. 05% (Zn+2O. 032%)；加入NaCl 0. 6% (Na 離子含量計 0. 27%)加入 KH2PO4 0. 12% (K 離子含量 0. 037%)；吐溫 80 0. 10-0. 25% ；調整後TP為350 mg/L。TC :ΤΡ=12· 5 1 ；TC :ΤΝ=20· 6符合目的培養基要求。按上述培養基配方混合溶解後，121°C蒸汽滅菌45min，即可使用。具體培養使用方法IOL發酵罐裝6L按以上配方的啤酒廢棄物為原料的Bt菌株發酵培養基，用氫氧化鈉調培養基PH值至7. 5，接種活化過夜的Bt種子液5%，所述菌種為含10%甘油-20°C保存的蘇雲金芽胞桿菌8010菌株；發酵溫度設定30士 1°C，轉速180r/min，培養時間25h，至95% 以上芽胞脫落髮酵結束。發酵液做芽胞計數，並做小菜蛾生物測定。發酵液芽胞計數方法取發酵液85°C加熱處理5min，迅速冷卻，採用稀釋平板活菌技術法計數；
毒力測定方法發酵液稀釋1000倍浸小白菜，晾乾製成大小一樣的小片於培養皿，每個培養皿放10隻小菜蛾，三個重複，24h、4 !觀察。測定結果見下表
權利要求
1.一種以啤酒廢棄物為原料製作Bt培養基的方法，其特徵是以啤酒廠啤酒廢水、破壁滅菌後的酵母泥浸出液和調節劑組成；調節劑由葡萄糖、麥芽糖、(NH4)2S04、aiS04、HP04-2 或H2P0-14的Na+Ι和K+1鹽和吐溫80組成，各種原輔料組配及成份調整方法如下A、基本培養基按重量百分比取啤酒廢水與破壁滅菌後的酵母泥浸出液混合，其啤酒廢水佔70%-80%、破壁滅菌後的酵母泥浸出液佔20-30% ；B、把A的基本培養基加調節劑根據A的各成分的含量分別加入氮源調節劑 (NH4)2S04、碳源調節劑麥芽糖或葡萄糖、鉀離子與磷素調節劑KH2P04或K2HP04、鈉離子與磷素調劑NaH2P04或Na2HP04微調；TN不足可加入(NH4) 2S04調節，TC不足加入葡萄糖或麥芽糖調節，TP不足加入KH2P04或K2HP04調節，或NaH2P04或Na2HP04調節，以確保培養基成分達到目的培養基的要求，最後加入吐溫80，佔目的培養基的0. 10-0. 25% ；經上述各步驟調製後的目的培養基，其TC =TN :TP=15-25 :1-1. 5 :1-1. 5，具體是TC 3500-4500mg/L, TN: 200_300mg/L、TP: 250_400mg/L ；按重量百分比 Zn+2 :0. 03-0. 04%、 Na+1 0. 25-0. 35%、K+10. 035-0. 040%、吐溫 80 為 0. 10-0. 25% ；經混合溶解 121°C 蒸汽滅菌 45min，即為成品。
2.一種以啤酒廢棄物為原料製作的Bt培養基產品，其特徵是按權利要求1所提供的方法製成以啤酒廢棄物為原料製作的Bt培養基產品。
全文摘要
一種以啤酒廢棄物為原料製作Bt培養基的方法，按重量百分比，以啤酒廢水70%-80%和20-30%破壁滅菌後的酵母泥浸出液混合做為基本培養基，以(NH4)2SO4、ZnSO4、麥芽糖或葡萄糖、KH2PO4或K2HPO4、NaH2PO4或Na2HPO4和吐溫80為調節劑；基本培養基加調節劑調節後的目的培養基劑含TC3500-4500mg/L、TN200-300mg/L、TP250-400mg/L，按重量百分比含Zn+20.03-0.04%、Na+10.25-0.35%、K+10.035-0.040%、吐溫80為0.10-0.25%；該培養基培養Bt菌株8010，發酵25-30h有95%以上芽胞脫落。其發酵液稀釋1000倍後，對Ⅱ-Ⅲ齡小菜蛾幼蟲的校正死亡率可達95%以上，發酵培養十分良好。
文檔編號C12N1/20GK102206603SQ201110094440
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月15日 優先權日2011年4月15日
發明者何金清, 關雄, 吳麗雲, 鄭毅, 陳國榮, 陳宇熹, 黃麗萍, 黃穎, 龔英 申請人:福建農林大學