細胞內生基因活性化的優化方法

2023-10-22 02:56:07

專利名稱：細胞內生基因活性化的優化方法
技術領域：
本發明涉及細胞內基因表達的優化方法，首先，本發明涉及一個改變內生存於一個真核細胞內的目標基因的表達方法，其中藉助於同源重組作用，把異源的表達控制序列或/和擴增標記基因引入到細胞的基因組中，而且該方法中還包括插入的外來DNA的、部位特異重組酶介導的切除，以及用其他的異源表達控制序列或/和擴增標記基因代替之。本發明還涉及把一個或多個結合到一個激活蛋白質或激活蛋白複合物例如一個缺氧誘發因子(HIF)上的核酸序列通過同源重組，引入到一個真核細胞的基因組內，以便修改目標基因的表達。本發明還涉及一種方法，它通過確定報導基因的表達來測定在5』部位或3』部位上的未編碼的核酸片段對目標基因表達的影響。此外，本發明還涉及含有重組酶-目標序列的DHFR負真核細胞的製備，以及插入到該重組酶-目標序列中的核酸序列的表達。
細胞中的基因表達可以決定性地，例如對所謂的持家基因，或調節性地進行。尤其是對於必須只在細胞的一個確定的發展階段中或在環境條件改變時必需進行調節表達。
通過與編碼的核酸序列結合的有效啟動子，可以在轉錄水平上調節該表達，並可通過阻遇物及激活劑來調節其活性。使阻遇物或激活劑結合到基因的未編碼的核酸序列上，就可以起到降低或提高啟動子活性的作用(L.Stryer，《生物化學》，第12章。科普出版社、海德堡，1990年)。另一方面，又可以通過一些因素，例如環境條件來調節細胞中所含的阻遇物或激活劑的量。上述激活劑的實例包括缺氧誘導因子(HIF)，它可以通過減少O2供給量誘導並導致促紅細胞生成素基因表達的提高(Blanchard K.L.等人，人類促紅細胞生成素基因的缺氧誘導啟動子與增強子之間的協同作用，它們各自含有甾類受體響應要素，(1992年)，分子細胞生物學，12，5373-5385；Wang G.L.與Semenza G.L.缺氧誘導因子1的特性及因缺氧造成的對DNA結合活性的調節，(1993年)，《生物化學》雜誌，268，21513-21518；Wang G.L.等人，缺氧誘導因子1是一個受細胞的O2張力調節的基本的螺旋-環-螺旋-PAS異源二聚體(1995年)，美國國家科學院院報，92，5510-5514)。
此外，表達蛋白質的量取決於mRNA的穩定性。用於分解mRNA的酶的識別序列定位於mRNA的3』部位區域中，它們影響mRNA的穩定性及表達高度(Shaw G.與Kamen R.從GM-CSF mRNA的3』-未翻譯區域的保守All序列傳遞選擇性mRNA的降解，《細胞》(1986年)，659-667。mRNA的半衰期與蛋白質的表達量有關。第三級表達調節就是轉譯。
基因的表達受到複雜調節機理的影響，在個別情況下，它們可以是極有區別的。
可以藉助於重組DNA工藝獲得蛋白質，其中利用了表達調節的識別(Sambrook等人。1989年《分子克隆》，實驗室手冊，Cold SpringHarbot)。在這裡，使用了載體。它們包含在適合的啟動子控制下，給相應的蛋白質編碼的核酸序列，以及其他的用於表達蛋白質與複製載體所需的序列。可以根據已知方法，將載體加入到宿主細胞中，接著培養該細胞，並從該細胞或培養介質中獲得重組蛋白質。
可以用原核細胞或真核細胞作為上述宿主細胞。原核細胞特別是大腸桿菌細胞在它們的操作中是不存在問題的，然而，在真核細胞蛋白質的重組表達方面則存在一系列的缺陷。
原核細胞與真核細胞的區別在於表達後的加工方式，細胞培養條件，以及在表達加工時參與的陪伴蛋白不同，因此，在原核細胞中製備的真核細胞蛋白質與相應的原生蛋白質相比較有很大的區別。例如，蛋白質的縮並形式與蛋白質的活性可以有所變化。在原核宿主細胞中的蛋白質通常也不能糖基化。然而，在許多情況下，一個正確的糖基化形式，例如在製備用於醫藥藥劑的蛋白質過程中，具有顯著的活性與相容性的特徵。
因此，可以借用真核宿主細胞或細胞系，例如CHO(中國侖鼠卵巢)細胞，製備糖基化的蛋白質。儘管在使用真核細胞時，由於物種的區別，例如在非人類細胞中表達一個人類蛋白質時，可以在重組製備的蛋白質中出現變化。但是在許多應用方面卻是無用的。
在蛋白質的重組製備過程中，可用表達載體瞬間地或穩定地轉化宿主細胞。其中，特別是在大規模製備方法中，採用穩定轉化的細胞。
在宿主細胞的基因組中的表達載體序列的非特異性隨機整合，可以導致細胞生產率的減小或細胞的不穩定性。例如，在生產過程中使生產率下降，或者使細胞表達重組蛋白質的能力完全喪失。
提高基因表達的方法產生了基因的擴增。其中，用於編碼蛋白質的核酸序列與擴增標記基因相結合。通過一個選擇步驟，可以使兩個序列達到複製擴大，這會導致表達的提高(Schimke R.T.(Ed.)(1982年)，基因擴增。Cold Spring Harbor實驗室，Cold Spring Harbor，NY)。
可以用為二氫葉酸酯還原酶(DHFR)編碼的核酸作為擴增標記基因(Kaufmann R.J.Sharp P.A.(1982年)，與調節的二氫葉酸酯還原酶互補DNA基因共轉染序列的擴增與表達，分子生物學雜誌159601頁)。
通過用氨甲喋呤實施的選擇步驟，可以得到對氨甲喋呤呈抗性的細胞，而且在該細胞基因組中，為DHFR編碼的，並與其相結合的核酸序列含有20-50倍的擴增(R.Knippers，1982年，分子遺傳學，Thieme，Stuffgarg)。
上述基因擴增的方法，可以最有效地用DHFR負細胞實施。日本專利文獻JP-62265992就描述過人體的DHFR負細胞。可是應該指出，藉助於在該細胞中的該序列的同源重組與擴增，卻沒有出現表達載體的部位特異的整合。
在實施基因擴增方法中，也會由於在該細胞的基因組中表達載體偶然整合，從而出現了上述的缺陷，例如細胞的不穩定特性。
唯有在通過同源重組，使外來DNA特異部位整合在選定的基因座上時，它導致了內生基因的活化，才有可能避免上述的缺陷。WO 90/11354與WO 91/09955公開了這種方法，並以基因目標為特徵。其中，用載體使細胞轉化，該載體中含有一個正的選擇標誌基因，並置於核酸序列的兩側，該序列與基因座上的序列是同源的。在該基因座上，該載體應該整合到該細胞的基因組中。在同源的核酸序列之間，還有異源的表達控制序列，以便使細胞中的目標基因的表達可得到提高。必要時，還可以有擴增標記基因，以便增加目標基因的複製數量。
迄今已知的基因目標方法存在一個缺點，即當以商業目的儘可能大批量製備所希望得到的高質量的蛋白質時，經常是成本高耗費大。特別是，為了選定用於表達所希望的目標蛋白質基因，最佳的表達控制序列或/和擴增標記基因，經常需要進行大量的、同源重組的一系列試驗，由於進行昂貴的、用於實現所希望的重組作用的克隆(無性繁殖系)的分離工序，需要非常昂貴的耗費。
也可以採用同源的重組作用，以便在一個切除細胞的確定基因中進行表達及進行蛋白質的功能研究。這裡是由剔除老鼠產生的。其中，通過同源重組，使為欲試驗的蛋白質編碼的、在胚胎幹細胞中的基因被切除，經其他的處理步驟以後，該老鼠可以得到，即該基因的兩個等位基因，由於失活，從無功能的蛋白質的孵育一開始，就可以進行表達。(Thomas K.R.，Capeccki M.R.，(1987年)，在老鼠胚胎衍出的幹細胞中的，通過基因目標形成的定點誘變，《細胞》51503-512)。
為了對確定的基因進行組織特性及時間特性的切除與研究，可以加入Cre-Lox系統。其中，可以通過同源重組，把一個被兩個loxp序列置於兩側的核酸片段插入到細胞的基因組中，接著，可以通過在該細胞中表達的Cre重組酶，重新從該基因組中切除出去(Sauer B.，Henderson N(1989年)置於哺乳動物細胞的基因組中的、在loxp部位上的部位特異DNA的重組。核酸研究17147-161；Sauer B.，Henderson N.(1990)，通過Cre重組酶的作用，使外源DNA目標插入到真核細胞的基因組中，New Biol 5441-449)。必須指出，在現有技術中，迄今沒有發現，可以用Cre-lox系統或其他任一的部位特異重組酶系統，形成在真核細胞的基因組中的擴增標記基因或表達控制序列的部位特異整合，以達到內生基因表達的變化。
本發明的目的在於提供一個新的、可以通過同源重組使得內生基因活性化達到優化的方法，其中，至少可以部分地克服現有技術中存在的缺陷。
本發明的上述目的通過採用新的方法與載體結構得以實現，它使在真核細胞內的基因表達功能的優化可非常容易實現。本發明的第一個方面涉及改變在真核細胞中內生存在的核酸序列的表達的方法，其特徵是，(a)將第一種載體轉入該細胞，其中包括(i)至少一個選自第一種異源表達控制序列和第一種擴增標記基因的序列，(ii)一個正的選擇標記基因，(iii)用於部位特異重組酶的、至少兩個位於序列(i)與序列(ii)兩側的目標序列，(iv)置於序列(i)、(ii)與(iii)兩側的DNA序列，它們與細胞基因組中的核酸片段同源，以便可形成同源的重組，
(b)在一定條件下培養該被轉入的細胞，其中可形成載體的同源重組，(c)獲得根據步據(b)製得的細胞。
根據本發明的方法，可以製備一種細胞，它具有與一種異源表達控制序列和/或擴增標記基因有效結合的內生基因。其中，該序列被用於部位特異的重組酶，例如，Cre重組酶的目標序列的兩側。這種細胞特別適用於試驗目標基因表達的優化。因為由於該用於部位重組酶的目標序列的存在，就有可能很容易地用第二種異源的表達控制序列和/或第二種擴增標記基因代替第一種異源的表達控制序列和/或第一種擴增標記基因。
按本發明術語「部位特異重組酶」是指這樣的蛋白質與蛋白質複合物，它們可促進DNA在特異的DNA目標序列上的重分布，它們包括整合酶-或解離酶-轉化酶類的部位特異的重組酶(Stark等人，Trends Genet8(1992年)，432-439；Abremski與Hoess，《蛋白質工程》5(1992年)，87-91；Khan等人，《核酸研究》19(1991年)，851-860)，以及通過內含子編碼的內核酶促進的部位重組酶(Perrin等人，EMBO J.12(1993)，2939-2947)。較佳的重組酶蛋白質是選自釀酒酵母的2μ附加體的FLP重組酶(如，Falco等人，《細胞》(1982)，573-584；Cox，美國國家科學院院報，80(1983)，4223-4227；Konslaki等人，新生物學家4(1992)，551-557)，大腸桿菌噬菌體P1的Cre重組酶(如，Sauer與Henderson(1989).Supra)，由rouxii接合酵母質粒pSR1製成的R重組酶(Matsuzaki等人，《細菌學》雜誌172(1990)，610-618)。由果繩屬克魯維酵母菌屬質粒pKD1製成的A重組酶(chen等人，《核酸研究》14(1986)，4471-4481)，由Waltii克魯維酵母菌屬質粒pKW1製成的A重組酶(chen等人.《基因微生物》雜誌138(1992)，337-345)，一種λ-Int-重組系的成分(Landy，生物化學年度綜述5(1989)，913-949)，以及一種噬菌體μ的Gin重組系的成分(Klippel等人，EMBO J.12(1993年)，1047-1057)。此外，還有歐洲專利文獻EP-B-0707599描述的由一種部位特異的重組酶與一種核受體或與其適應的配位結合的結構域所組成的融合蛋白。本發明的方法最好採用Cre重組酶的目標序列，即loxP序列。
通過異源基因的部位特異整合，重組製備蛋白質會帶來一些缺點。與此相反，根據本發明的方法，通過同源重組，會有利於部位特異的內生的基因活化。通過對異源表達控制序列與擴增標記基因的相適應重組的簡單選擇，我們就會有更大的可能性得到具有穩定特性的最佳製備克隆，其中，可以製備一種蛋白質，該蛋白質在結構與活性方面與原蛋白質一致。
所選擇的同源序列置於異源表達控制序列擴增標記基因、正的選擇標記基因與重組酶目標序列的兩側，並可以據專利文獻WO90/11354與WO91/09955所述的方法獲得。
此外，在該同源序列中也可以含有改性因子，它們可在被表達的蛋白質中引起突變，例如，引起個別胺基酸或整個胺基酸片段的插入或/和缺失，以及點突變。
根據本發明的方法，可以只在一個方法步驟上，不僅能改變內生核酸序列的表達高度，而且同時還可以在內生的核酸序列的編碼區域內引起突變。為此，本發明的方法特別有利於製備用於醫藥的蛋白質。這種蛋白質應該顯示出，除了蛋白質的效力提高的突變外，與原蛋白質相比較，並沒有其他的變化。
本發明可以採用任一個真核細胞，特別是哺乳動物的，尤其是人體的細胞。根據本發明的方法，可以用非無限增殖化細胞，例如成纖維細胞，或也可用無限增殖化細胞，如腫瘤細胞系加以實施。最好是用無限增殖化細胞實施。
在實施本發明方法中所選用的溶液與介質最好是這樣選擇，它們使得在每一個方法步驟中都有最佳條件。用介質完成對細胞的培養，該介質中含有用於細胞充分生長所需的全部物質，必要時是緩衝的。這些細胞最好是可在不含血清的介質中培養。所用的上述細胞最好是Namalwa-，HT1080或Hela S3細胞。
根據本發明的方法，可以使一種內生存於細胞中的核酸序列的表達得到優化。也就是說，通過選定一種最佳表達控制序列，一種最佳擴增標記基因或/和通過選定一種表達控制序列與擴增標記基因的最佳結合，使一種目標基因的表達得到優化。
可用任一種核酸序列作為異源表達控制序列。在前者整合到細胞基因組中後，就會影響目標基因的表達。它包括核酸序列，後者直接與轉錄成分相互作用，例如，可以接受轉錄引發因子或RNA聚合酶。而核酸序列，通過與激活劑或阻遇物的相互作用，將促進對轉錄的影響，該異源表達控制序列最好包括一個啟動子/增強子，特別是病毒性啟動子，最好是一個CMV啟動子。
上述異源表達控制序列也可以包括一個在其3』部位上未編碼的序列。上述在3』部位上未編碼的序列可以對mRNA起穩定或不穩定性的作用，並因此提高或降低其半衰期。通過加一種穩定mRNA的序列，就會提高mRNA的半衰期，並為此提高被其編碼的蛋白質的產率。
根據一個較佳的實施方案，通過上述同源重組，可以去掉目標基因的內生表達控制序列。當該內生序列包括結合阻遇物的序列時，這就特別有利了。一種在3』部位上未編碼的序列也可以顯示降低該表達的作用。該序列對mRNA起不穩定性的作用。由此可以使轉釋的蛋白質量減少。
此外，本發明的方法還可以選擇一種最佳化的擴增標記基因。該擴增標記基因最好是以可表達形，即以與相應的啟動子有效結合的形式插入的，並安置在載體上，以使得在把載體同源整合在真核細胞的基因組後，該擴增標記基因就處於靠近目標基因的空間位置上。實施上述擴增步驟，可以導致細胞中目標基因複製數量的增加。由此，可以形成內生的核酸序列的表達的進一步提高。上述擴增標記基因可以包括二氫葉酸酯還原酶(DHFR)，腺苷脫氨酶，鳥氨酸脫羧酶以及該基因的突變蛋白。上述擴增標記基因最好是一種DHFR基因或其突變物(Simonsen等人，《核酸研究》1998，16(5)2235-2246)，特別是含有內生的DHFR基因的細胞。
可以用每個適用於真核細胞的抗性基因作為正的選擇標記基因，它可導向一種可選擇的表現型，例如一種抗菌抗性。該正的選擇標記基因最好是一個新黴素、卡那黴素、原生黴素或潮黴素的抗性基因。該正的選擇標記基因最好是以可表達的形式，即與一個合適的啟動子有效結合的形式存在。
若使用一種負的選擇標記基因，則通常除了上述的正的選擇步驟外，還輔加地實施一個第二個負的選擇步驟。這會帶來一個優點，即在實施上述選擇步驟以後，這些鑑定的克隆就會含有更少的假的正克隆部分，即偶然地整合在基因組中的載體上。上述負的選擇標記基因最好是一種胸苷激酶基因(TK)或/和次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶基因(HGPRT)。
由於上述部位特異的重組酶的目標序列的存在，可以使定位於該序列中間的核酸序列，在使用部位特異重組酶的情況下，從該細胞的基因組中切除出去。上述定位於目標序列之間的核酸序列最好通過細胞中的相應重組酶瞬間激活，而從該基因組中切除出去。通過下列步驟實現上述的重組酶的瞬間激活，(a)將第二種載體轉入細胞，其中包括為該重組酶編碼的、並與在該細胞中活化的或可活化的表達控制序列有效結合的核酸序列，和(b)在使該重組酶表達和活化的條件下，培養由此被轉入的細胞，(c)必要時，獲取該細胞。
在使用重組酶/核受體-融合蛋白質時，可以通過有控制地加入用於核受體的配位體，實現細胞的瞬間激活。
在除去位於該目標序列之間的DNA以後，可以把剩餘的目標序列，例如，loxP序列，再用於其他的方法步驟中。
在另一個較佳實施方案中，本發明方法的特徵是，(a)將第三種載體轉入該細胞，包括(i)至少一種選自第二種異源表達控制序列與第二種擴增標記基因的序列，(ii)一個正的選擇標記基因，它最好與第一種載體的正的選擇標記基因不同，(iii)至少兩個位於序列(i)和(ii)兩側的重組酶-目標序列，(b)在一定條件下培養該被轉入的細胞，其中被目標序列置於兩側的序列整合在細胞基因組的目標序列上，(c)獲得步驟(b)的細胞，(d)必要時，可以各用改變的表達控制序列和/或擴增標記基因至少重複一次(a)至(c)的步驟。
根據本發明的方法，可以容易與迅速地測試許多表達控制序列、擴增標記基因或表達控制序列與擴增標記基因的結合物。因此，不必進行為調查每單個目標基因的最佳表達/放大系統所進行的、為每單個異源表達控制序列或每單個擴增標記基因的耗時耗費的部位特異整合。
在第三種載體中的正的選擇標記基因最好區別於在第一種載體中的正的選擇標記基因，以便能簡化選擇方法，並使假的正克隆的數量達到最少。
本發明所用的載體重組酶目標因可以與天然存在的目標基因相適應，或者必要時呈現突變，其中不會削弱部位特異重組的效力。
本發明的另一個目的是得到一種用於同源重組的載體，特別是用於在一個細胞的基因組內部位特異地引入重組酶目標基因的載體，其中包括(i)至少一種選自一種表達控制序列與一種擴增標記基因的序列，(ii)一個正的選擇標記基因，(iii)至少兩個置於序列(i)與(ii)兩側的、用於部位特異重組酶的目標序列，(iv)該置於序列(i)、(ii)與(iii)兩側的DNA序列與細胞基因組中的核酸片段同源，並可形成一個同源的重組，(v)必要時，一個負的選擇標記基因。
所有的本發明的載體最好還含有為在適宜的宿主細胞內的繁殖和增加數量所需的序列成分，例如複製源，選擇標記基因，等。
本發明的另一個目的是得到一種載體，特別是藉助一個部位特異重組酶系統，旨在向細胞的基因組內引入DNA的載體，其中包括(i)至少一種選自一種異源表達控制序列與一種擴增標記基因的序列，(ii)一種正的選擇標記基因，(iii)至少兩種位於序列(i)與(ii)兩側的重組酶-目標序列。
本發明的又一個目的是得到一種真核細胞，特別是人體的細胞，可以據上述的方法得到該細胞。該細胞，例如一種人體的細胞，具有一些特徵，即(a)它含有至少一個與內生存在的核酸序列有效連接的選自異源表達控制序列與擴增標記基因的染色體定位的序列，(b)重組酶-目標序列置於該序列兩側。
本發明的另一個目的是提供一種改變內生存在於真核細胞中的核酸序列表達的方法，其特徵是，(a)將一種載體轉入該細胞，包括(i)至少一個激活蛋白質，例如能結合缺氧(Hypoxia)誘導因子(HIF)的核酸序列(ii)一個正的選擇標記基因，(iii)置於序列(i)與(ii)兩側的DNA序列，它們與細胞基因組中的核酸片段同源，以便可形成同源重組，(b)在一定的條件下培養該被轉入的細胞，該條件可使載體進行同源重組，(c)獲得根據步驟(b)製得的細胞。
通過核酸序列的基因整合，其中結合一個或多個激活蛋白質(通過在核酸序列上的結合提高基因表達的蛋白質)，在目標基因表達控制序列區域內，特別是在其調節區域內，令人驚奇地是不會降低目標基因的表達，相反地，甚至在適宜的培養條件下，還會提高內生存在的目標基因的表達或者還會導誘未表達的、內生存在的目標基因的表達。
較適宜的激活蛋白質包括缺氧誘導因子HIF-1α與HIF-1β，以及幹擾素調節因子1(IRF-1)，其中，通過在幹擾素交感序列(ICE)上的結合，可以提高轉錄(Tanaka.N.，Kawakami T.，Taniguchi T.，分子細胞生物學(1993)8月，13(8)4531-4538)。
經過一個或多個的、結合HIF或其他激活蛋白質的核酸序列與內生存在目標基因的有效結合，可以在選定的較適宜培養條件下，調節目標基因的表達。這對大規模的製備是特別有利的。因為蛋白質的表達會導致製備過程達到最佳化。這將有利地使合成產物在培養介質上清液中的平均停留時間縮短。由此，也可以使不希望得到的蛋白質分解產物的量減少。這勢必會對後續的純化步驟產生積極的影響，即降低製造成本，並會使最終產品的質量得到提高。
根據本發明的方法，可以滿足一個或多個結合激活劑的核酸序列與目標基因有效結合的要求。最好是採用兩個結合HIF的核酸序列。特別是選自根據序列ID No.1的53bp序列，根據序列1D No.2的43bp序列，一種對該序列同源的序列，或一種在嚴格條件下與該序列雜交的序列的結合HIF的核酸序列。
使用兩種結合HIF的核酸序列，會令人驚奇地獲得協同作用。由此，正如只單獨使用單個序列一樣，會使內生核酸的表達得到更大的提高。
一旦需要，與在目標基因區域內引入的激活序列相結合的激活蛋白質的表達，可以誘導到該細胞中或/和得到提高。這可以通過用一種載體轉化該細胞來實現，其中包括(i)一種用於編碼激活蛋白質的核酸序列，它們與在這個細胞中活性的表達控制序列操縱結合，(ii)必要時，一個正的選擇標記基因。
我們可以使用每種為激活蛋白質編碼的核酸序列，其表達產物可以結合到在該基因組內整合的結合激活劑的核酸序列。該激活蛋白質最好是一種HIF-1α或/和HIF-1β蛋白質。當該內生存在的核酸序列已經含有結合激活劑或結合HIF的核酸序列時，只要在該細胞內加入一種載體，即可滿足要求。其中包括為激活蛋白質或HIF蛋白質編碼的核酸序列，後者可以與在細胞內活化的表達控制序列有效地結合，以及，必要時一個正的選擇標記基因。
上述與為激活蛋白質編碼的核酸序列有效結合的表達控制序列可以是可誘導的，以致於通過適當的培養條件，例如加入激素或重金屬，可以達到附加的激活作用。由此，可以使內生目標基因的表達可以誘導出對製備過程最佳化的時刻。
使用一種結構上活性的表達控制序列有利於使該激活蛋白質不依賴於加入到培養介質中的激活劑，就可以得到結構上的表達。
當上述結合激活蛋白質的核酸序列是一種結合HIF的核酸序列時，就可以通過適當的培養條件，如0.1-2％的O2濃度，誘導出該目標基因的表達。
本發明的另一個目的是得到一種用於同源重組的載體，其中包括，(i)至少一種結合激活蛋白質的核酸序列，(ii)一個正的選擇標記基因，(iii)位於序列(i)與(ii)兩側的DNA序列，它們與一個細胞基因組中的核酸片段同源，以便可形成同源重組。
本發明的另一個目的是得到一個真核細胞，特別是人體細胞，可根據上述方法製得該細胞。該細胞的特點是，至少含有異源的、染色體定位的、結合激活蛋白質/複合物的、並與內生存在於細胞內的基因有效結合的核酸片段。藉助於上述部位特異的重組系統，可以替換基因組內的結合激活蛋白質的核酸片段。以致於可以容易地鑑別針對一個確定的目標基因的最佳化的激活劑序列。
因此，本發明的另一個方面還涉及一種方法，即一種測驗在真核細胞中內生存在的目標基因範圍的、未編碼的核酸序列對該表達的影響的方法，其特徵是，(a)將一種載體轉入該細胞，其中包括，
(i)一種異源的、在細胞中活性的或可能激活的、並與報導基因操縱結合的表達控制序列，(ii)目標基因範圍內的、在5』部位或3』部位上未編碼的核酸片段，(b)在一定條件下培養該細胞，在該條件下該表達控制序列是活性的，(c)測定報導基因的表達。
用本發明的方法可以容易地確定，為什麼必須使異源的表達控制序列安置於基因組內的目標基因區域內，以便使目標基因達到一個最佳的表達率，而且在目標基因區域的、在5』部位或/和3』部位上未編碼的序列的存在或不存在對表達有什麼樣的影響。上述試驗載體最好瞬間轉入到細胞中，並確定報導基因的表達。為此，可以迅速並費用適中地測試許多的異源表達控制序列與目標基因的組合試驗，以及許多不同的表達控制序列試驗。上述異源的表達控制序列包括可以與轉錄成分、例如轉錄起始因子或RNA聚合酶、直接相互作用的核酸序列、以及通過與激活劑或阻遏物的相互作用可以影響轉錄的核酸序列。該異源的表達控制序列宜為一個啟動子/增強子，尤其是一個病毒性啟動子，而最好是一個CMV啟動子。特別是在具有昂貴的製備步驟的方法中，本發明的方法有助於大大降低成本。例如，在製備動物，例如老鼠、羊或牛的轉化基因時，其中，應該提高在確定細胞型中的確定的內生核酸序列的表達。
從目標基因區域選出的、在5』部位或3』部位上未編碼的核酸片段最好是安置於載體內的相應於其基因組布置的、報導基因的5』部位或3』部位上。
我們可以採用一般技術人員熟悉的報導基因，它可以在細胞中表達。最好採用為氯酶素-乙醯基-轉移酶(CAT)，β-半乳糖苷酶(β-Gal)或LacZ編碼的報導基因。另一方面，也可以採用用於編碼相關蛋白質如EPO的報導基因。並用免疫方法，如ELISA，證實其表達。
在一個較佳實施方案中，至少兩個載體-它們彼此含有不同的在5』部位或/和3』部位上未編碼的目標基因的核酸片段-向各自不同的細胞中轉入，而且可用一般技術人員已知的方法，證實不同細胞的報導基因的表達。用本發明的方法可以輕鬆地證實，什麼樣的異源表達控制序列的配置可對一個確定的宿主細胞提供一個最佳化的表達。
另一方面，本發明還涉及DHFR-負的真核細胞，最好是哺乳動物細胞或人體細胞的製備方法，其特徵是，(a)將第一種載體轉入該細胞，其中包括(i)至少一種用於部位特異重組酶的目標序列，(ii)置於序列(i)兩側的DNA序列，它們與內生存在於該細胞中的DHFR核酸序列同源，以便可形成同源的重組，(iii)必要時，一種正的選擇標記基因，以及一種負的選擇標記基因，(b)在一定條件下培養該被轉入的細胞，其中可使載體實現同源重組，(c)獲得根據步驟(b)的細胞。
在本發明方法中，根據上文描述來選擇與使用上述重組酶-目標基因與同源序列。
該正的選擇標記基因被置於與DHFR基因同源的序列之間。上述負的選擇標記基因被置於上述同源序列之外。
在DHFR-基因座上實現同源重組後，合成沒有功能的細胞中的DHFR蛋白質。該載體序列可以如此安置，以使DHFR基因的啟動子失活，或/和由於在DHFR基因的編碼序列中的插入或缺失，再次合成沒有功能的DHFR蛋白質。
為了使DHFR基因的兩個等位基因失活，首先，用本發明的載體轉化、選擇和獲得該細胞。該細胞中的DHFR基因的一個等位基因失活，也就是說，它們對於DHFR基因而言是異合子的(+/-)。然後，可以再次用本發明的載體轉化該細胞。該載體最好含有與第一種載體的不同的正的選擇標記基因。經選擇步驟後獲得該細胞。其中的兩個DHFR等位基因已失活。或者選擇壓力的提高導致了基因轉變，並使兩個等位基因失活(參照，Mortensen等人，分子細胞生物學，12(1992)，2391-2395)。
本發明的方法可提供一種DHFR負的細胞，其應用有利於基因擴增方法。它沒有合成內生的DHFR蛋白質。在實施用於擴增異源的核酸序列的選擇步驟中，該序列與用於編碼DHFR蛋白質的核酸序列相結合，而且對內生的DHFR基因的表達產物沒有產生不利影響。因此，使基因擴增的效率提高了。
可以用每種適合的選擇標記基因作為正的選擇標記基因，它可以導致可選擇的表現型。例如抗菌素抗性。這個為該正的選擇標記基因編碼的核酸序列最好是新黴素、卡那黴素、原生黴素或潮黴素的抗性基因。
我們可以使用一般技術人員公知的每種負的選擇標記基因。用來編碼負的選擇標記基因的核酸序列最好是胸苷激酶基因(TK)，或/和次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶基因(HGPRT)。
這個被重組酶目標基因置於兩側的序列，可以通過相應重組酶的瞬間激活，從細胞基因組中切除出去，例如，通過(a)將一種載體轉入該細胞，其中包括一種用來編碼重組酶、並與在該細胞中活性的表達控制序列有效結合的核酸序列，(b)在一定條件下培養上述被轉入的細胞，其中該重組酶被表達，而且是活性的，(c)必要時，獲取該細胞。
用本發明的方法，不僅可以使DHFR基因失激活，而且通過重組酶參與的反應，使置於重組酶-目標基因之間的DHFR基因的序列、以及加入的選擇標記基因從細胞基因組中切除。
當上述被重組酶-目標基因置於兩側的序列含有正的選擇標記基因時，含有該序列的細胞是抗生素抗性的。它可以容易地根據一般技術人員公知的方法，進行選擇。
本發明方法製備DHFR-負細胞的另一個優點在於，可以用一般技術人員已知的方法識別其特性，而且該細胞還可以被用於其他方法中。此外，可以通過在DHFR基因座上引入的重組酶-目標序列，把部位特異的核酸序列整合在該基因組中。
本發明的另一個較佳實施方案涉及向真核細胞引入異源DHFR基因的方法，其特徵是，把按上述方法製得的DHFR負細胞，(a)將第三種載體轉入，其中該載體包括(i)必要時，一種正的選擇標記基因，它最好可被第一種載體的正的選擇標記基因所識別，(ii)一種用來編碼DHFR的核酸序列，(iii)一種待擴增的、用來編碼蛋白質的核酸序列，其中，來自部分序列(i)、(ii)與(iii)的核酸序列在5』部位與3』部位上各自被至少一個重組酶-目標序列置於兩側，
(b)在一定條件下培養該被轉入的細胞，在該條件下上述被重組酶-目標序列置於兩側的核酸序列被整合到已經在細胞的基因組中存在的重組酶-目標細胞上，(c)獲取根據(b)步驟得到的細胞。
上述正的選擇標記基因、DHFR基因、以及為所希望的蛋白質編碼的目標基因，最好各自與一種在該細胞中活性的或可激活的表達控制序列有效地結合。原則上也可以是一種具有內部核糖核蛋白體的結合部位的多順反子結構。然而，上述目標基因待擴增的核酸序列應該被分離的啟動子所驅動。上述表達控制序列最好是病毒的啟動子/增強子。最好是用於表達蛋白質的CMV啟動子。
本發明的在一個細胞基因組中的異源序列的整合最好是部分特異地進行。因此，排除了異源序列對基因組序列的幹擾。所以，由此產生的上述缺點，例如不穩定的製備克隆，就可以得到避免。
為了提高異源的用來編碼蛋白質的核酸序列的表達率，可以在已知的方法步驟之後，再實施一個用氨甲碟呤的擴增步驟。
本發明的目的還涉及一種載體，其中包括(i)必要時，一個正的選擇標記基因，(ii)一種為DHFR編碼的核酸序列，(iii)一種為所希望的蛋白質編碼的，可表達的核酸序列，其中來自部分序列(i)、(ii)和(iii)的核酸序列在5』部位和3』部位上各自被至少一種重組酸-目標序列置於兩側。
本發明的目的還涉及一種用於同源重組的載體，其中包括(i)必要時，一個正的選擇標記基因，(ii)至少一種重組酶-目標序列，它被放置於該序列(i)的兩側，(iii)置於序列(i)和(ii)兩側的DNA序列，它們與內生存在於細胞中的DHFR一核酸序列同源，以便能形成同源的重組，(iv)必要時，一個置於同源序列(iii)之外的負的選擇標記基因。
本發明還涉及一種真核細胞，最好是人體細胞，可根據上述方法製備該細胞。該細胞的特徵在於，(a)至少一種內生的、為DHFR編碼的核酸序列是失活的，最好是兩個內生的等位基因，
(b)在為DHFR編碼的核酸序列區域內，至少一種重組酶-目標序列整合在該基因組中。
本發明的另一個目的是一種真核細胞，最好是人體細胞，其特徵是，在內生的DHFR基因座範圍中的異源核酸序列，其中包括(i)一種為DHFR編碼的核酸序列，(ii)一種為希望的蛋白質編碼的核酸序列，(iii)至少一種重組酶-目標序列。
用下列實施例，附圖與序列記錄進一步詳述本發明。
附圖描述

圖1(A)示出了一種用於同源重組的載體，它被用作第一種載體。HR同源序列，Seq1第一個異源表達控制序列，R1正的選擇標記基因，LoxP帶定位的LoxP序列，(B)顯示基因組的序列(a)經過有效的同源重組以後，(b)經過一個被LoxP序列置於兩側的序列的一個Cre重組酶催化切除以後，(C)顯示一種用於Cre重組酶參與的整合的載體，它包括一個放置於LoxP序列之間的序列，(c)顯示在一種第二種載體整合在LoxP序列後的基因組序列。R2正的選擇標記基因，它必要時不同於R1，Seq2第二個異源表達控制序列。
圖2(A)顯示一種用於同源重組的載體，HR同源序列，R-box正的和，及必要時，負的選擇標記基因，LoxP具有定位的LoxP序列，HSV-tk疤疹單純胸苷激酶。
(B)顯示一種為同源重組的、具有單側面同源序列的載體。
圖3顯示CMV啟動子/HIF控制的、HeLa S3細胞的促紅細胞生成素(EPO)表達，用載體pHYG、pHIF-1α與pARNT(pHIF-1β)轉化該細胞，在轉染第3，4與5天後，測定在細胞上清液中的EPO表達(促紅細胞生成素濃度是以μg/ml計)。
pHYG控制載體，pHIF-1α受一個SRα啟動子控制的HIF-1αcDNA，pARNT受一個CMV啟動子控制的HIF-βcDNA。
圖4顯示4種不同的載體，它們各自含有一個CMV啟動子(C)與報導基因β-半乳糖苷酶(B)。其中，在這些序列之間，插入了目標基因(S)的不同長度的未編碼的核酸片段。上述未編碼的核酸片段的長度計為在A3-178載體中是Okb，在A3-177載體中2.5kb，在A3-175載體中是3.7kb，而在A3-181載體中是5.7kb。上述控制載體pNASSβ含有報導基因β-半乳糖苷酶，不含有CMV啟動子。
圖示5顯示經過用圖4的載體(稀釋系列為1∶2-1∶128)對HeLa S3細胞的轉染後，對報導基因β-半乳糖苷酶表達的測定。
圖6(A)顯示在DHFR基因座中同源重組的pNDI載體。一個正的選擇標記基因(Neo)被兩個LoxP序列置於兩側。一個LoxP序列的5』部位或另一個Loxp序列的3』部位上有與一個DHFR基因同源的序列(5』-，3』-DHFR區域)。
(B)顯示在DHFR基因座中同源重組的pHDI載體，一個正的選擇標記基因(Hyg)被兩個LoxP序列置於兩側。一個LoxP序列的5』部位或另一個LoxP序列的3』部位上有與一個DHFR基因同源的序列(5』-，3』-DHFR區域)。
圖7(A)顯示具有Exonl，Exon2及Exon3(Exon即外顯子)的一個DHFR基因的基因組結構，以及置於其間的內含子，(B)圖示顯示一個與圖6相應的載體、目標結構，(C)顯示用於在DHFR基因中同源重組的載體的有效同源重組後的基因組結構。在EcoR1切除部位之間的距離是，當使用pNDI載體時為2.9kb，當使用pHDI載體時為3.7kb。Neo新黴素，Hyg潮黴素，Kb千鹼基圖8顯示一種載體，它包括用於蛋白質x編碼的核酸序列與用於DHFR蛋白質編碼的核酸序列，各自包括調節序列。它們被兩個LoxP序列置於兩側。這種載體可用於使Cre重組酶催化整合到一個LoxP序列的基因組中。
SEQ ID NO.1顯示第一個能結合HIF的核苷酸序列，SEQ ID NO.2顯示第二個能結合HIF的核苷酸序列，SEQ ID NO.3顯示一個LoxP序列實施例實例1 由CMV啟動子控制的促紅細胞生長素基因的表達與HIF過表達將pHYG、pHIF-1α與pARNT載體(見圖3)轉入到基因改變了的HeLa-S3細胞中。在該細胞中，把CMV(巨細胞病毒)啟動子插入到EPO同位基因的促紅細胞生長素基因轉譯起始點近端，該啟動子控制EPO表達。通常該細胞是每24小時，每107細胞生產1μg的促紅細胞生長素。在轉染前24個小時，向每個6孔板中通入濃度為6×104的細胞。在轉染那天，用一種DNA-DOTAP混合物培育該細胞。該混合物含有1.25μg的各種載體，10μl的DOTAP(Boehringer Mannheim 1202375)，及75μl的20mM的N-2-羥乙基-N』-2-乙基磺酸緩衝液(每孔)。將上述混合物在室溫下預培育10-15分鐘。用DNA-DOTAP將該細胞在每孔3ml介質中培育6個小時。接著用PBS緩衝液洗滌該細胞兩次。然後，在全介質中培育5天。在第3，4與5天時，分別取100μl的上清液樣，並用促紅細胞生長素ELISA分析。第5天時結束上述試驗，並確定細胞數量。每孔的促紅細胞生長素的量按相同的細胞數量計算(參見圖3)。
該實例表明，用HIF誘導促紅細胞生長素基因總是可能的。雖然，會有異源的表達控制序列(CMV啟動子)進入到該促紅細胞生長素基的同位基因的啟動子區域中，所測得的促紅細胞生長素濃度的提高意味著單個缺氧誘導因子或多個缺氧誘導因子對兩個同位基因的協同作用。
由此明顯看出，通過加入異源的表達控制序列，可以提高內生的核酸序列的表達。當在細胞中表達激活結合劑(HIF)時，則使其存在於結合表達控制序列的核酸序列中，使得該基因的表達可以進一步提高。如果相關的序列並不存在該基因座時，它們可以通過本發明的方法，藉助於同源重組加入到基因組中。
實例2 表達控制序列的最佳布置以提高內生核酸的表達內生基因的5』部位序列不僅能夠顯示刺激特性，而且也能顯示阻礙特性。當在目標基因的5』部位上將異源的表達控制序列加入到該基因組時，該表達高度將受到該內生的5』部位序列的影響。這樣藉助於一個異源的表達控制序列應該達到目標基因的最佳表達。為此，必須這樣布置，即通過目標基因的5』部位未編碼的序列，可以使異源表達控制序列的活性不會降低，最好是做到有目標的布置，以便達到各個序列的協同效應。以便能試驗該異源表達控制序列的不同布置。以便確定，例如，該細胞的基因組中的異源表達控制序列必須以多大距離整合到目標基因的編碼序列的轉譯起始點。為此，用不同的目標基因的5』部位未編碼的核酸片段測試不同的載體(參見圖4)。圖4中的載體被轉入到HeLaS3細胞中，並測試報導基因β-半乳糖苷酶的表達(參見圖5)。
在試驗前24個小時，向每10釐米的北特利平皿中通入濃度為1×106細胞的細胞，在轉錄的當天，用一種DNA-DOTAP混合物培育該細胞，該混合物含有1pmol的各種載體(A3-178，A3-177，A3-175，A3-181或PNASSβ，參見圖4)，60μl DOTAP(Boehringer Mannheim 1202375)，以及300μl的20mM HEPES緩衝液。在室溫中培育該混合物10-15分鐘。每個平皿中的細胞在6ml無血清介質中用DNA-DOTAP預培育6個小時，然後用PBS緩衝液洗滌該細胞兩次，並在全介質中培育22個小時，為了測定上述β-半乳糖苷酶表達，獲取在200μl PBS中的細胞，冷卻至-20℃，進行溶胞作用，並把10μl的溶胞產物用底物以1∶10稀釋(3.29mM氯酚紅-β-D-半乳糖吡喃糖苷(Boehringer Mannheim 884308)，100mM HEPES，150mM NaCl，2mM MgCl2，1％BSA，0.1％Triton X-100，0.1％疊氮化合物，PH＝7。在1:2步驟中稀釋試樣，並放入一個96孔板中，在37℃中培育，這時發現形成暗紅色，然後，在570/580nm或550nm中測試該試樣。
由圖5可看出細胞中報導基因的表達最高，用載體A3-178轉化該細胞，該異源的表達控制序列出現在該載體中編碼序列的轉譯起始點近端。
用本方法可以容易與迅速地確定，必須選擇什麼樣的異源表達控制序列在一個宿主細胞的基因組中的位置，才能達到內生目標基因的最佳化表達。
實例3 DHFR-負細胞的製備在第一步驟中，製備本發明的用於重組的載體。在第二步驟中，將該載體轉入到人體的細胞系中，並篩分在同源的重組事件上，據這方法可以首先將一個、然後將第二個用於DHFR基因的同位基因失活。
用於同源重組的DHFR-載體該人體的DHFR基因定位於染色體5上，並包含分成6個外顯子的30kb。一個1.8kb大的EcoR1片段(其中含有部分啟動子，部分外顯子2與完整的外顯子1)可以被用以製備用於同源重組的載體，可以用一個Aapl消化物除去外顯子，並在形成的空隙(0.45kb)中，通過接頭加入Neo-(1.4kb)-或Hyg-(2.2kb)抗性基因，該接頭除了接合體核苷酸外，還含有最小的序列TAT TG AAG CAT ATT ACA TAC GAT ATG CTF CAA TA(loxP-序列)。該接頭序列以相同的方法定向，即該抗性基因最好與DHFR基因抗性布置。在加入抗性基因後，該同源區域就擴大了，為此會使圍繞EcoR1片段的載體從3』區域(6.0kb)擴展(圖6)。這樣就可以獲得本發明的目標結構物pNDI(11.5kb)與pHDI(12.3kb)。
經過有效的同源重組以後，就可除去完整的外顯子1(胺基酸1-28)與部分的DHFR基因的啟動子。現在，該細胞就不再能表達功能的DHFR蛋白質。
細胞的轉染上述所用的人體的細胞系不應該對染色體5呈多倍體，而且不能保持在MTX選樣下。在上述兩種情況下，有兩個以上的同位基因失活。
HeLa S3-細胞(ATCC CCL-2.2)把該細胞放入裝有RPMI 1640介質，其中含有10％胎牛血清，2mM L-穀氨醯胺與1mM MEN(非基本的胺基酸)的細胞組織瓶中培育，並在37℃溫度與5％CO2氣氛中溫育。該電泳緩衝液含有20mM Hepes(N-2-羥乙基哌嗪-N』-2-乙基磺酸)，138mM NaCl，5mM KCl，0.7mM Na2HPO4，6mM D-葡糖-單水化物，PH7.0。把10μg的線性載體DNA(pNDI)在960μF與250V的1×107細胞中電泳(多孔基因脈衝發生器)，經電泳後，採集在含有600μg/ml G418(原生黴素Boehringer Mannheim)介質中的該細胞中，並進行培育。經過10天的選擇後(每2天更換介質)，離析其中的正克隆，並使其膨脹。
HT1080細胞(ATCC CCL-121)本細胞的培育與選擇過程與上述HeLa S3細胞類同，採用了DMEM介質，其中含有10％胎牛血清，2mM L-穀氨醯胺與1mM丙酮酸鈉。
Namalwa細胞(ATCC CRL-1432)
這種細胞系是懸浮液細胞系，而且必須進行相應培養，所用的介質相對應於用於Hela S3細胞的介質，經轉染後，將細胞分布到40個96孔盤皿上，正的克隆是在48-，24-，12-與6-孔盤皿中膨脹。用1mg/ml G418進行選樣。
DHFR-負(+/1)細胞的證實借用Southern Blot分析儀或PCR證實載體的插入，在正確有效的同源重組中，通過EcoR1-消化物證實，除了一個代表未受損傷的DHFR基因的1.8kb帶以外，還有一個2.9kb的帶，它是通過插入Neo基因形成的(圖7C)。混合克隆(在Southern Blot中顯出不同比例的帶區強度)通過在FACS的單細胞沉積進行分離，亞克隆且隨後膨脹。其中，一個作為正的識別克隆的DHFR基因的同位基因失活。
DHR-角(+/-)細胞的製備細胞克隆(其中的DHFR-同位基因(+/-)失活)可以再進行同源重組，為此，如上述可用10μg的載體pHDI的線性DNA轉化，並在含有500μg/ml潮黴素B(Boehringer Mannheim)的介質中進行選樣。
通過提高介質中的G418濃度，可以提高在DHFR+/-細胞上的選擇壓力，並得到DHFR-/-細胞，基因轉換導致了染色體間的重組，其中使第二個DHFR-同位基因失活。
該DHFR-/-細胞含有兩個失活的DHFR同位基因，並且不能再合成四氫葉酸鹽。為此，必須加入介質胸苷、甘氨酸與嘌呤(互補)，必要時，該細胞可以在α-介質(Gibco BRL)中培養。
如上述可以證實了DHFR-/-細胞。對於純合子的DHFR-負細胞的情況，不能證實為野生區帶(1.8kb)。用pHDI轉化的細胞，經過同源重組後，在EcoRI Southern Blot中顯示為一個新的3.7kb區帶(圖7C)。
DHFR-負細胞(-/-)的用途本發明的細胞可用於高產率地製備蛋白質。其中，把本發明的載體(據圖8)和編碼Gre-重組酶的表達載體轉入到該DHFR-/-細胞中。該Cre重組酶將抗菌素抗性從該DHFR基因部位中除去，並整合到本發明的載體的DHFR-/-細胞的基因組中的LoxP序列中。該細胞將重新具有抗菌素過敏性，而且不依賴於胸苷、甘氨酸與嘌呤互補體。
通過使用不含互補體的介質，或通過向培養介質中加入適當的抗菌素進行選擇。為此，該抗菌素適應抗性基因，它是通過Cre重組酶從細胞的基因組中除去。上述整合在LoxP序列中的載體含有一個正的選擇標記基因。通過向介質中加入該抗菌素進行上述選擇。
通過基因放大提高生產效率為了提高用於重組蛋白質的細胞的生產效率，需進行氨甲喋呤(MTX)選擇。其中，使引入到細胞中的DHFR基因與異源的、為蛋白質編碼的核酸序列放大。
為了實現放大，應使上述細胞在有其濃度不斷提高(100-1000mM)的MTX的參與下，進行培養。相對比較用的Southern Blots(在加入MTX之前，期間與之後)，通過密度測定法測評出上述放大的程度。
經過上述放大步驟後獲得的本發明的細胞，在LoxP基因座上，含有多個引入的DHFR基因與引入的異源核酸序列的複製物。它們的特徵是可以提高上述異源核酸的生產率。
下面是作為本發明說明的要素的本發明實施方案1、改變內生於真核細胞中的核酸序列的表達的方法，其特徵是，(a)將第一種載體轉入該細胞，其中包括(i)至少一種選自第一種異源表達控制序列與第一種擴增標記基因的序列，(ii)一個正的選擇標記基因，(iii)用於部位特異重組酶的、至少兩個位於序列(i)與序列(ii)兩側的目標序列，(iv)在序列(i)、(ii)與(iii)兩側的DNA序列，它們與細胞基因組中的核酸片段同源，以便可形成同源的重組，(b)在一定條件下培養該被轉入的細胞，在該條件下可形成載體的同源重組，(c)獲得按步驟(b)製得的細胞。
2、根據第1點的方法，其特徵是，使用LoxP-序列作為重組酶-目標序列。
3、根據第1或2點的方法，其特徵是，該細胞是人體細胞。
4、根據前述幾點中之一的方法，其特徵是，該細胞是無限增殖化了的細胞。
5、根據第4點的方法，其特徵是，該細胞是HT1080細胞，Namalwa細胞，或Hela S3細胞。
6、根據前述幾點中之一的方法，其特徵是，該異源表達控制序列優選啟動子/增強子，最好是病毒啟動子，特別是CMV啟動子。
7、根據第1-6點中之一的方法，其特點是，該異源表達控制序列是3』-部位編碼的序列。
8、根據前述幾點中之一的方法，其特點是，該同源序列是這樣選擇的，即通過同源重組，除去內生存在的核酸序列的內生表達控制序列。
9、根據前述幾點中之一的方法，其特點是，該正的選擇標記基因是新黴素、原生黴素或潮黴素抗性基因。
10、根據前述幾點中之一的方法，其特點是，該載體還包括負的選擇標記基因，其中根據權利要求1的(a)(iv)安置於同源序列的外部。
11、根據前述幾點中之一的方法，其特點是，該定位於重組酶-目標序列之間的核酸序列通過一個識別目標序列的部位特異重組酶的瞬時激活，從細胞基因組切除。
12、根據第11點的方法，其特點是，(a)將第二種載體轉入該細胞，包括(i)至少一種選自第二種異源表達控制序列與第二種擴增標記基因的序列，(ii)一個正的選擇標記基因，它最好與第一種載體的正的選擇標記基因不同，(iii)至少兩個位於序列(i)和(ii)兩側的重組酶-目標序列，(b)在一定條件下培養該被轉入的細胞，在該條件下能將目標序列置於其兩側的序列整合在細胞基因組的目標序列上，(c)獲得按步驟(b)製得的細胞，(d)必要時，可以用各種改變的表達控制序列和/或擴增標記基因，至少重複一次(a)至(c)的步驟。
13、用於同源重組的載體，其中包括(i)至少一種選自一種表達控制序列與一種擴增標記基因的序列，(ii)一個正的選擇標記基因，(iii)至少兩個置於序列(i)與(ii)兩側的、用於部位特異重組酶的目標序列，(iv)置於該序列(i)、(ii)與(iii)兩側的DNA序列，它與細胞基因組中的核酸片段同源，以便可形成同源的重組，(v)必要時，一個負的選擇標記基因。
14、載體，其中包括(i)至少一種選自異源表達控制序列與擴增標記基因的序列，(ii)一個正的選擇標記基因，(iii)至少兩個位於序列(i)與(ii)兩側的重組酶-目標序列，和(iv)必要時，一個負的選擇標記基因。
15、真核細胞，最好是人體細胞，可根據第1-12點中之一的方法獲得。
16、真核細胞，最好是人體細胞，其特徵在於，(a)它含有至少一個與內生存在的核酸序列有效連接的選自異源表達控制序列與擴增標記基因的染色體定位的序列，且其中(b)重組酶-目標序列置於該序列兩側。
17、一種改變內生存在於真核細胞中的核酸序列的表達的方法，其特徵是，(a)將一種載體轉入該細胞，包括(i)至少一種能結合激活蛋白質的核酸序列，(ii)一個正的選擇標記基因，(iii)置於序列(i)與(ii)兩側的DNA序列，它們與細胞基因組中的一個核酸片段同源，以便可形成同源的重組，(b)在一定的條件下培養該被轉入的細胞，在該條件下可使載體進行同源重組，(c)獲得按步驟(b)製得的細胞。
18、根據第17點的方法，其特徵是，使用至少一種可結合缺氧誘導因子(HIF)的核酸序列。
19、根據第18點的方法，其特徵是，該可結合HIV的核酸序列是選自根據序列ID NO.1的53bp序列，根據序列ID NO.2的43bp序列，一種與該序列同源的序列或一種在嚴格條件下與該序列雜交的序列。
20、根據第17-19點中之一的方法，它還包括用一種載體轉入該細胞，其中包括(i)一種能為激活蛋白質編碼的核酸序列，它與在這種細胞中活性的表達控制序列操縱結合，(ii)必要時，一個正的選擇標記基因。
21、根據第20點的方法，其特徵是，上述激活蛋白質是HIF-1α或/和HIF-1β蛋白質。
22、根據第18-21點中之一的方法，其特徵是，該細胞在0.1-2％的氧濃度下培養。
23、用於同源重組的載體，其中包括(i)至少一種能連接激活蛋白質的核酸序列，(ii)一個正的選擇標記基因，(iii)位於序列(i)與(ii)兩側的DNA序列，它們與細胞基因組中的核酸片段同源，以便可形成一種同源重組。
24、真核細胞，最好是人體細胞，可根據第17-21點中之一的方法製得。
25、真核細胞，最好是人體細胞，其特徵是，它至少含有一個異源的、染色體定位的、與一個存在於細胞中的內生基因操縱結合的、並能與一個激活蛋白質/複合物結合的核酸片段。
26、一種測驗在真核細胞中內生存在的目標基因範圍未編碼的核酸序列對該表達影響的方法，其特徵是，(a)將一種載體轉入該細胞，其中包括(i)一種異源的、在細胞中活性的或可激活的、並與報導基因操縱結合的表達控制序列，(ii)來自目標基因範圍的、在5』部位或/和3』部位上未編碼的核酸片段，(b)在一定條件下培養該細胞，在該條件下該表達控制序列是活性的，(c)測定報導基因的表達。
27、根據第26點的方法，其特徵是，該報導基因為氯黴素-乙醯基-轉移酶-(CAT)，β-半乳糖苷酶(β-Gal)或LacZ編碼。
28、根據第26或27點中之一的方法，其特徵是，(a)至少兩個載體，它們含有相互不同的在5』部位或和3』部位上未編碼的目標基因的核酸片段，被轉入到各不同的細胞中，和(b)確定在不同的細胞中報導基因的表達。
29、一種DHFR負的真核細胞的製備方法，其特徵是，(a)將第一種載體轉入該細胞，其中包括(i)至少一種用於部位特異重組酶的目標序列，(ii)置於序列(i)兩側的DNA序列，它們與內生存在於該細胞中的DHFR核酸序列同源，以便可形成同源的重組，和(iii)必要時一個正的選擇標記基因，以及必要時一個負的選擇標記基因，(b)在一定條件下培養該被轉入的細胞，在該條件下可使載體實現同源重組，(c)獲得根據步驟(b)的細胞。
30、根據第29點的方法，其特徵是，使用Lox-P序列作為重組酶目標序列。
31、根據第29點或30點中之一的方法，其特徵是，上述能為該正的選擇標記基因編碼的核酸序列是新黴素-、卡那黴素-、原生黴素-或潮黴素抗性基因。
32、根據第29-31點中之一的方法，其特徵是，上述能為負的選擇標記基因編碼的核酸序列是一個胸苷激酶基因(TK)和/或次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因(HGPRT)。
33、根據第29-32點中之一的方法，其特徵是，上述被重組酶-目標序列置於兩側的序列，通過相關的重組酶的瞬時激活作用，從基因組中切除。
34、向真核細胞中引入異源DHFR基因的方法，其特徵是，把根據第33點的方法製得的細胞，(a)將第三種載體轉入，其中該載體包括(i)必要時，一個正的選擇標記基因，它最好與第一種載體的正的選擇標記基因不同，(ii)一種能為DHF編碼的核酸序列，(iii)一種待擴增的、可為蛋白質編碼的核酸序列，其中，來自部分序列(i)、(ii)與(iii)的核酸序列在5』部位與3』部位上各自被至少一個重組酶-目標序列置於兩側，(b)在一定條件下培養該被轉入的細胞，在該條件下上述被重組酶-目標序列置於兩側的核酸序列被整合到已經在細胞的基因組中存在的重組酶-目標序列上，(c)獲取根據第(b)步驟得到的細胞。
35、載體，其中包括(i)必要時，一個正的選擇標記基因，(ii)一種能為DHFR編碼的核酸序列，(iii)一種能為所希望的蛋白質編碼的、處於可表達形式的核酸序列，其中來自部分序列(i)、(ii)和(iii)的核酸序列在5』部位和3』部位上各自被至少一個重組酸一目標序列置於兩側。
36、用於同源重組的載體，其中包括(i)必要時，一個正的選擇標記基因，(ii)至少各一種重組酶-目標序列，它被置於該序列(i)的兩側，(iii)置於序列(i)和(ii)兩側的DNA序列，它們與內生存在於一個細胞中的DHFR-核酸序列同源，以便能形成同源的重組，(iv)必要時，一個置於同源序列(iii))之外的負的選擇標記基因。
37、真核細胞，最好是人體細胞，可通過根據第29-34點中之一的方法獲得。
38、真核細胞，最好是人體細胞，其特徵是，(a)至少一個內生的能為DHFR編碼的核酸序列是失活的，(b)在上述能為DHFR編碼的核酸序列範圍內，至少一種重組酶-目標序列被整合到基因組內。
39、真核細胞，最好是人體細胞，其特徵是，在內生DHFR基因座範圍中的異源核酸序列，其中包括(i)一種能為DHFR編碼的核酸序列，(ii)一個能為希望的蛋白質編碼的核酸序列和(iii)至少一個重組酶-目標序列。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)名字Boehringer Mannheim Gmbh(B)街號Sandhofer街112-132(C)地區Mannheim(E)國別德國(F)郵政編碼D-68305(ii)發明名稱「用於細胞中內生基因活化的最佳化方法」(iii)序列數量3個(iv)計算機可辨認的框架(A)數據載體軟盤(B)計算機IBM相容型PC機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體Patent In Release#1.0，Version#1.30(EPA)(2)序列SEQ ID NO1的資料(i)序列特徵(A)長度53鹼基對(B)種類核苷酸(C)繩狀雙(D)拓樸結構線型(xi)序列描述SEQ ID NO1CCTCTCCTCT AGGCCCGTGG GGCTGGCCCT GCACCGCCGA GCTTCCCGGG ATG(2)序列SEQ ID NO2的資料(i)序列特徵(A)長度43鹼基對(B)種類核苷酸(C)繩狀雙(D)拓樸結構線型
(xi)序列描述SEQ ID NO2CTACGTGCTG TCTCACACAG CCTGTCTGAC CTCTCGACCC TAC(2)序列SEQ ID NO3的資料(i)序列特徵(A)長度34鹼基對(B)種類核苷酸(C)繩狀雙(D)拓樸結構線型(xi)序列描述SEQ ID NO3TATTGAAGCA TATTACATAC GATATGCTTC AATA
權利要求
1.一種改變內生存在於真核細胞中的核酸序列表達的方法，其特徵是，(a)使一種載體轉入該細胞，包括(i)至少一種能結合激活蛋白質的核酸序列，(ii)一個正的選擇標記基因，(iii)置於序列(i)與(ii)兩側的DNA序列，它們與細胞基因組中的一個核酸截段同源，以便可形成同源的重組，(b)在一定的條件下培養該轉入了的細胞，在該條件下可使載體進行同源的重組，(c)獲得按步驟(b)製得的細胞。
2.根據權利要求1的方法，其特徵是，使用至少一種能連接缺氧誘導因子(HIF)的核酸序列。
3.用於同源重組的載體，其中包括(i)至少一種能連接激活蛋白質的核酸序列，(ii)一個正的選擇標記基因，(iii)位於序列(i)與(ii)兩側的DNA序列，它們與細胞基因組中的核酸截段同源，以便可形成一種同源重組。
4.真核細胞，最好是人體細胞，可根據權利要求1-3之一的方法獲得。
5.真核細胞，最好是人體細胞，其特徵是，它至少含有異源的、染色體定位的、與存在於細胞中的內生基因操縱結合的、並可與一個激活蛋白質/複合物結合的核酸片段。
全文摘要
本發明涉及細胞內生基因表達的優化方法。首先，涉及一種改變內生存在於真核細胞中的目標基因的表達的方法，其中，藉助於同源重組作用，把一種異源表達控制序列引入到細胞的基因組中，而且該方法中還包括使插入的外來DNA的、部位特異重組酶介導的切除，以及用其他的異源表達控制序列或/和擴增標記基因代替之；本發明還涉及把一個或多個在其上結合存在一個激活因子蛋白質或一個激活蛋白質複合物例如一個缺氧誘導因子(HIF)上的核酸序列通過同源重組引入到一個真核細胞的基因組內，以便改變目標基因的表達。本發明還涉及一個通過對報導基因表達的確定，測定在5』部位或3』部位上未編碼的核酸片段對目標基因表達的影響的方法。此外，本發明還涉及一種含有重組酶－目標序列的、DHFR－負真核細胞的製備方法，以及插入在該重組酶－目標序列中的核酸序列的表達。
文檔編號C12N15/79GK1590551SQ20041006387
公開日2005年3月9日 申請日期1998年12月1日 優先權日1997年12月1日
發明者K·豪諾德, T·浩特史克, A·斯特恩 申請人:羅切診斷學有限公司