多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒的製作方法

2023-10-22 14:48:47

多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒。本發明的多肽由SEQIDNO：1所示的胺基酸序列構成。本發明的多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒在乾燥症候群的診斷中是有用的。
【專利說明】多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明主要涉及多肽、包含該多肽的檢測器件及檢測試劑盒，屬於生物【技術領域】。【背景技術】
[0002]乾燥症候群(Sjogren Syndrome, SS)是一種以侵犯淚腺、唾液腺等外分泌腺體為主的慢性自身免疫性疾病，又稱為自身免疫性外分泌腺體病。主要表現為乾燥性角膜結膜炎、口腔乾燥症或伴發類風溼性關節炎等其它風溼性疾病，它可累及其他系統如呼吸系、消化系、泌尿系、血液系、神經系以及肌肉、關節等造成多系統、多器官受損。
[0003]乾燥症候群是一個全球性疾病，90 %以上為女性，發病年齡大多為40—60歲的中老年，小兒較少。由於至今缺少統一的診斷標準，所以該病的患病率很不準確。一般估計為
0.1 %-0.7 %。在美國，乾燥症候群的發病率僅次於類風溼關節炎。在我國的患病率也不低於類風溼關節炎0.3 %~0.4 %的發病率。
[0004]乾燥症候群診斷主要依賴於臨床症狀體徵表現(口乾澀症，乾燥性角膜炎等)來進行診斷。但僅通過症狀判斷還難以與如結締組織疾病等其他的自身免疫性疾病相區分，因此還需要藉助檢測血清中特定的自身抗體檢測來輔助診斷。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在於提供一種對乾燥症候群的診斷有用的多肽、編碼該多肽的核酸、包含該核酸的表達載 體、導入了該表達載體的宿主細胞、抗該多肽的抗體、包含該多肽的檢測器件、包含該多肽或該檢測器件的檢測試劑盒、以及該多肽在檢測乾燥症候群中的用途、該多肽在製備用於檢測乾燥症候群的試劑盒或檢測器件中的用途。即，本發明包含下述技術方案:
1.由SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列構成的多肽。
[0006]2.編碼權利要求1所述的多肽的核酸。
[0007]3.包含權利要求2所述的核酸的表達載體。
[0008]4.導入了權利要求3所述的表達載體的宿主細胞。
[0009]5.一種檢測器件，其包括:
固體載體，以及
連接於該固體載體上的權利要求1所述的多肽。
[0010]6.根據權利要求5所述的檢測器件，其中，所述固體載體是SJ改性矽膠。
[0011]7.一種檢測試劑盒，其包括權利要求1所述的多肽、或者權利要求5或6所述的檢測器件。
[0012]8.抗權利要求1所述的多肽的抗體。
[0013]9.權利要求1所述的多肽在製備用於檢測乾燥症候群的試劑盒或檢測器件中的用途。
[0014]將本發明的多肽應用於乾燥症候群的診斷，能夠取得令人滿意的效果。【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1將多肽通過化學共價固定於SJ改性矽膠表面的示意圖。
[0016]圖2對化學合成的本發明的多肽進行確認的HPLC圖譜。
[0017]圖3是對化學合成的本發明的多肽進行確認的MS表徵圖譜。
[0018]圖4對SJ改性矽膠(iPDMS薄膜)的製作過程進行說明的示意圖。
[0019]圖5對多肽微陣列化學固定過程進行說明的圖。
[0020]圖6說明多肽微陣列點樣模式的示意圖。
[0021]圖7顯示對健康正常人或非乾燥症候群病人血清進行檢測的結果照片。
[0022]圖8顯示對乾燥症候群病人血清進行檢測的結果照片。
【具體實施方式】
[0023]本發明的多肽
本發明的多肽是30肽。本發明的30肽由SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列構成，SP:GLLAVNQRFQDNGRALLPFDNLHDDPCLLT。如實施例所示，其對乾燥症候群病人的血清呈陽性反應，而對健康正常人或非乾燥綜 合徵病人血清呈陰性反應。因此，該30肽作為乾燥症候群的診斷工具是有用的。
[0024]本發明的多肽在有市售的情況下，可以使用市售品，此外，還可以適宜採用⑴化學合成方法、或(2)酶反應合成方法等公知方法來獲得，其中化學合成更為簡便。在化學合成本發明的多肽情況下，通過使用肽合成儀合成或者半合成該多肽來進行。作為化學合成方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成的肽可以採用常規手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進行純化。這樣的肽固相合成方法以及其後的肽純化都是本【技術領域】公知的。
[0025]此外，在通過酶反應生產本發明的多肽的情況下，可以採用例如國際公開小冊子W02004/011653號所述的方法:將一方的胺基酸或二肽的羧基末端被酯化或醯胺化而得到的胺基酸或二肽、與胺基酸處於游離狀態的胺基酸(例如羧基保護的胺基酸)在肽合成酶的存在下進行反應，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出:具有生成肽的能力的微生物的培養物、由該培養物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體處理物、或該微生物來源的肽合成酶。
[0026]而且，除了上述的酶方法、化學合成方法以外，有些情況下，本發明的多肽還可能是天然存在(但未被分離出來)的。在天然存在的情況下，還可以將其分離出來。
[0027]本發明的核酸、表達載體宿主細胞，以及抗本發明的多肽的抗體
本發明還涉及編碼該多肽的核酸(本發明的核酸)、包含該核酸的表達載體(本發明的表達載體)、導入了該表達載體的宿主細胞(本發明的宿主細胞)，它們優選可用於生產本發明的多肽。本發明的核酸、表達載體、宿主細胞可以採用本領域技術人員公知的方法來製備。本發明還涉及抗本發明的多肽的抗體，其可用於檢測本發明的抗體。本發明的抗體可以採用本領域技術人員公知的方法來製備。
[0028]本發明的檢測器件
本發明還涉及一種檢測器件(本發明的檢測器件)，其包括固體載體、以及連接於該固體載體上的本發明的多肽。
[0029]在本發明中，對固體載體沒有特殊限制，只要是作為固體或不溶性材料(例如是可以通過過濾、沉澱、磁性分離等從反應混合物中分離的材料)的載體即可。
[0030]構成固體載體的材料包括但不限於:矽膠(聚二甲基矽氧烷，PDMS)、纖維素、特氟隆?、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、聚酯、聚碳酸酯、聚醯胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化矽、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、銀、銅、鐵、不鏽鋼、鐵氧體、矽晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白(白蛋白等)、碳或它們的組
入坐I=I 寸 O
[0031]固體載體的形狀包括但不要限於:珠子、磁珠、薄膜、微細管、濾膜、板、微量板、碳納米管、傳感器晶片等。正如本【技術領域】公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設置凹坑、溝槽、濾膜底部等。
[0032]在本發明中，磁珠可以具有約25ηπ-約Imm範圍的球體直徑。在優選的實施方式中，磁珠具有約50ηπ-約IOym範圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選擇。
[0033]在本發明中，由Sepharose等高交聯球形瓊脂糖製成的珠子具有約24 μ π-約165 μ m範圍的直徑。優選地，高交聯球形瓊脂糖珠具有約24 μ π-約44 μ m範圍的直徑。高交聯球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選擇。
[0034]具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences, Warrington, PA或Spherotech, Liberville, IL購買的製品等聚苯乙烯膠乳珠。
[0035]二氧化矽(SiO2)-處理或二氧化矽(SiO2)基的固體載體的例子包括可從Polysciences, Warrington, PA購買的超常磁性二氧化娃珠等,其可以用於捕捉核酸(例如DNA) ο或者，還可以使用可從Dynal Biotech購買的M-280等。
[0036]具有親水性表面的磁珠可用於捕捉增殖期的細菌細胞、核酸以及其它成分。作為該磁珠的例子，可以列舉出Polysciences, Warrington, PA銷售的珠子(名稱:Biomag(註冊商標)羧基)、或者 Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN 的名稱為 MC02N/2928 的珠子。或者，可以使用Dynal Biotech銷售的M-270等。
[0037]在本發明的一個優選實施方式中，所述固體載體是SJ改性矽膠。蘇州傯聚生物材料有限公司開發的一種矽橡膠材質的微陣列固體支撐材料(又名iPDMS薄膜，參見中國專利CN101265329A)。這種材料是以生物學研究常用的PDMS為基礎，在其中加入特定的引發劑成份(使該材料可通過表面引發聚合反應(SIP)實現表面功能化修飾)，再經過聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly (oligo (ethylene glycol) methacrylate) , pOEGMA)表面修飾獲得的。SJ改性矽膠具有優秀的抗蛋白質非特異性吸附(Nonspecific proteinadsorption, NPA)能力，可以將複雜蛋白免疫檢測中的非特異性蛋白質吸附控制到接近「絕對O」水平(接近或低於儀器的檢測極限)，不僅可以免除封閉和多次清洗的麻煩，還可以通過使用更強的信號擴增手段來提高蛋白質微陣列的靈敏性。而且其矽橡膠的本質賦予了該材料較強的機械性能和良好的可操作性。蘇州傯聚已經成功地將SJ改性矽膠應用於11個腫瘤標誌物組成的多指標聯檢微陣列ELISA試劑盒，實現了高通量和高靈敏的檢測，證明了這種材料是一種優秀的蛋白質微陣列固體支撐材料。同時，這種材料還具有表面性質可調的特性，可以通過控制修飾反應時間在一定範圍內調整其表面形貌。
[0038]本發明的多肽與固體載體的連接可以採用本領域技術人員公知的多肽與固體載體的連接方法來進行。例如，對於蛋白質/多肽與改性矽膠表面的連接而言，可以通過1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺[l_ethyl_3-(3-dimethyl am1-nopropyl)carbodiimide, EDC]和N-羥基玻拍酸亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)的反應將改性娃膠表面高分子鏈上的羧基(-C00H)基團改為活化基團，該活化基團可與蛋白/多肽上所帶的氨基(-NH2)反應從而實現將蛋白/多肽固定於固體載體表面(參見圖1)。
[0039]對於點樣時使用的點樣液中本發明的多肽的濃度沒有特殊限制，本領域技術人員可以依常規選擇，優選為I μ g^lOOO μ g/mL,更優選10 μ g^500 μ g/mL。此外，對於本發明的多肽在固體載體上分布的密度沒有特殊限制，本領域技術人員可以依常規選擇，優選為1~100 點 /10_2，更優選 5~50 點 /10_2。
[0040]本發明的檢測器件可以用於檢測乾燥症候群、或者製備用於檢測乾燥症候群的試劑盒。
[0041]本發明的檢測試劑盒
本發明還涉及一種檢測試劑盒(本發明的檢測試劑盒)，其包括本發明的多肽或檢測器件。該檢測試劑盒優選用於檢測乾燥症候群。
[0042]本發明的檢測器件或本發明的多肽是本發明的檢測試劑盒的要件。本發明的檢測試劑盒還可以包括:
1.配好的血清稀釋液或血清稀釋液組分溶液:血清稀釋液，例如有北京賽馳生物科技有限公司的樣本稀釋液(產品編號070021-S2)、鄭州博威嘉生物科技有限公司的加樣變色樣本稀釋液(產品編號bw j010103)等。該血清稀釋液用來稀釋血清，試劑盒檢測的血清要稀釋適當倍數，例如2~200倍，優選10-100倍。
[0043]本發明的檢測試劑盒還可以包括:
2.濃縮洗液:固體載體表面孵育血清及酶標二抗後，需用洗液清洗掉固體載體表面未結合的抗體和酶標二抗。濃縮洗液例如是1%的吐溫20水溶液，使用時需稀釋2~40倍、優選5~20倍。
[0044]本發明的檢測試劑盒還可以包括:
3.酶標二抗溶液:乾燥症候群病人血清中的乾燥症候群自身抗體(IgG)可與固體載體(例如SJ改性矽膠)上的本發明的多肽結合，二抗可與抗體結合，而二抗上的標記物可與發光底物反應，從而發出可檢測的光。酶標二抗可以是例如辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG0作為酶標二抗溶液，可以列舉出北京中杉金橋生物技術有限公司生產的辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG(H+L)，產品編號ZB-2304。對酶標二抗在酶標二抗溶液中的濃度沒有特殊限制，可以是例如lng~1000ng/mL。
[0045]本發明的檢測試劑盒還可以包括:
4.發光液組分溶液:發光液可與二抗上標記的辣根過氧化物酶反應，使得反應發出儀器可檢測到的化學光。發光液由兩種溶液混合而成，分別是A液一過氧化氫溶液，及B液一發光氨溶液。發光氨(魯米諾)只有用氧化劑處理過才會發光。通常使用雙氧水和一種氫氧化物鹼的混合水溶液作為激發劑。在辣根過氧化物酶催化下，雙氧水分解為氧氣和水:
2 H2O2 — O2 + 2 H2O
魯米諾與氫氧化物反應時生成了一個雙負離子，它可被過氧化氫分解出的氧氣氧化，產物為一個有機過氧化物。該過氧化物很不穩定，立即分解出氮氣，生成激發態的3-氨基鄰苯二甲酸。激發態至基態轉化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長位於可見光的藍光部分。發光液組分溶液的例子例如Thermo Seientific公司的SuperSignal? ELISA FemtoMaximum Sensitivity Substrate,貨號 37074。
[0046]本發明的檢測試劑盒還可以包括:
5.一個或兩個以上的反應腔體(例如中國專利授權公告CN202054829U)。
[0047]本發明的檢測試劑盒還可以包括:
6.其他用於檢測乾燥症候群的檢測分子(例如多肽、蛋白質、核酸等)。
[0048]本發明的檢測試劑盒還可以包括:
7.使用說明書。
[0049]
實施例
[0050]以下，通過實施例對本發明進行更具體的說明，但並不是對本發明技術範圍的限定。通過本說明書的記載，本領域技術人員可以容易的對本發明進行修飾/改變，這些包含在本發明的技術範圍內。
[0051]1.30肽的製備與確認
實施例中使用的30肽具有SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列，由吉爾生化(上海)有限公司合成，該多肽的表徵圖譜見圖2和圖3，可以確認合成了所述多肽。
[0052]2.檢測器件的製備
檢測晶片是以SJ改性矽膠(iPDMS薄膜)為固體支撐材料，在其上通過點樣固定多肽溶液製備而成。改性矽膠是在傳統的聚二甲基矽氧烷材料中加入帶烯烴末端的、表面引發聚合反應的引發劑，並通過熱交聯(矽氫鍵鍵合)固定到聚二甲基矽氧烷的三維結構中，得到一種新的材料即SJ改性矽膠。其製作過程如圖4所示。
[0053]其中的A和B為聚二甲基矽氧烷的兩個組分，聚二甲基矽氧烷(Poly (dimethylsiloxane), Sylgard 184)購買自美國道康寧(DowCorning)公司，包含液態組分A (成分為金屬鉬催化劑與帶乙烯基的二甲矽氧烷高分子前體混合物)和交聯劑B (成分為帶有乙烯基和S1-H基團的二甲基矽氧烷前體)兩種成分。C為末端帶乙烯基的引發劑，購於杭州東偉公司。最後修飾上的高分子是寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯單體(Oligo (ethylene glycol) methacrylate,以下簡稱 0EGMA,分子量 Mw = 526)購買於Aldrich。將聚二甲基矽氧烷前體A和交聯劑B與帶乙烯基末端的引發劑C以A:B:C=10:1:0.5比例充分混合。通過固化反應製成透明的彈性矽橡膠，然後通過SIP技術進行表面修飾即可得到SJ改性矽膠。實驗表明，SJ改性矽膠的表面有足夠高密度的、通過共價鍵固定的引發劑，其可以通過表面引發聚合反應(SIP)實現表面高分子修飾。使用poly(OEGMA)(聚乙二醇甲基丙烯酸酯)進行反應獲得聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)修飾的表面，實現較強的抗蛋白非特異性吸附的能力。
[0054]制好的SJ改性矽膠薄膜需保存在4°C冰箱中。
[0055]採用晶芯?PersonalArrayerTM 16個人點樣儀在改性矽膠上製備多肽微陣列，過程為:
1)預處理將SJ改性矽膠薄片(15 X 15mm2)浸泡在活化液中，30min後取出用去離子水淋洗3次，用氮氣吹乾，馬上用於點樣。
[0056]2)點樣
將點樣液稀釋好並轉移到384孔板相應的微孔中，將帶樣本的384孔板置於點樣儀基臺上，同時將預處理的改性矽膠薄片置於點樣儀的基臺上，馬上進行點樣。點樣環境條件為室溫(25°C)，溼度設定為50%。製成的多肽微陣列上每個點的點樣量約為0.6nL，樣點半徑為200 μ m。
[0057]3)化學固定
剛制好的多肽微陣列要放在恆溫恆溼箱(26°C，60%溼度)中固定至少6h。化學固定過程如圖5所不。
[0058]首先通過點樣儀將包含有捕獲多肽分子的緩衝液點在改性矽膠薄膜上，接著緩衝液開始蒸發，捕獲多肽分子與SJ改性矽膠表面親密接觸並相互作用，通過化學結合，改性矽膠表面的ploy (OEGMA)高分子的末端-COOH與多肽分子的-一NH2形成穩定共價鍵，進而將有化學活性的多肽分子固定在SJ改性矽膠表面。 [0059]5)裝配
固定6h的多肽微陣列必須在兩天內裝配好。首先通過背膠將SJ改性矽膠薄片貼在專門的反應柱上，蓋上反應腔體。一個反應器由兩個反應柱和一個反應腔體組成。
[0060]6)保存
裝配好的多肽微陣列，需要抽真空密封，保存在4°C的冰箱中，備用。
[0061]3.用檢測器件進行檢測 檢驗步驟
1、開始檢測前，將濃縮清洗液按1:10的比例加入純化水或蒸餾水進行稀釋，稀釋完成後直接使用。使用移液槍將2mL清洗液加到晶片表面，浸泡晶片3分鐘，保證晶片表面被完全浸潤。
[0062]2、將待測血清樣本用樣本稀釋液按照1:40稀釋混勻。
[0063]3、棄去浸泡晶片的清洗液，在晶片表面完全溼潤的狀態下，每個血清樣本吸取200 μ L稀釋後的血清加入到晶片反應器內。
[0064]4、將晶片反應器放入晶片固定座，放到搖床上，開啟搖床，頻率150轉/分鐘，室溫孵育30分鐘。
[0065]5、棄去晶片反應器內的血清樣本，用15mL洗液清洗反應腔體和晶片表面3次。
[0066]6、清洗完成後，每個晶片反應器分別加入200 μ L酶標抗體溶液，將晶片反應器放入晶片固定座，放到搖床上，開啟搖床，頻率150轉/分鐘，室溫孵育30分鐘。
[0067]7、棄去晶片反應器內的酶標抗體溶液，用15mL洗液清洗反應腔體和晶片表面3次。
[0068]8、清洗完成後，取下反應腔體，每個晶片表面分別加入15 μ L發光底物液，使發光液能均勻的鋪於晶片表面。
[0069]9、將加入了發光液的晶片置於凝膠成像儀中化學發光成像，並判讀結果。
[0070]乾燥症候群病人血清來源於瀋陽中國醫科大學附屬第一醫院提供，均為臨床確診了的乾燥症候群病病人血清，血清由相關人員用冰塊/乾冰等包裹運送或快遞至實驗室。[0071]陰性對照有PBS緩衝液(即在第3步中不用待測血清孵育，而用PBS溶液孵育，其餘步驟相同)的對照，血清稀釋液的對照，及陰性病人(指健康人血清及非乾燥症候群病人)血清的對照。
[0072]多肽微陣列的點樣模式如圖6所示。其中，三角形的20個點的樣本為人IgG，作為實驗的定位點；正方形的4個點的樣本為PB點樣液，作為實驗的空白對照；圓形點的的樣本是其他的乾燥症候群自身抗原蛋白多肽，作為實驗的檢測指標(這些多肽有響應說明檢測血清中有乾燥症候群自身抗體)；星形點的樣本多肽即為本發明的多肽SEQ ID N0:1，它是乾燥症候群自身抗原蛋白多肽，會對乾燥症候群患者血清產生響應。
[0073]實驗結 果如圖7和8所示。其中，圖7顯示了陰性對照的檢測結果，只有三角形所示的點的樣本有響應。圖8顯示了乾燥症候群病人血清的檢測結果，三角形、圓形和星形點的樣本有響應。需要說明的是，儀器測得信號值由低到高，相應的信號點顏色由黑一紅一白漸變。
【權利要求】
1.由SEQID NO:1所示的胺基酸序列構成的多肽。
2.編碼權利要求1所述的多肽的核酸。
3.包含權利要求2所述的核酸的表達載體。
4.導入了權利要求3所述的表達載體的宿主細胞。
5.一種檢測器件，其包括: 固體載體，以及 連接於該固體載體上的權利要求1所述的多肽。
6.根據權利要求5所述的檢測器件，其中，所述固體載體是SJ改性矽膠。
7.—種檢測試劑盒，其包括權利要求1所述的多肽、或者權利要求5或6所述的檢測器件。
8.抗權利要求1所述的多肽的抗體。
9.權利要求1 所述的多肽在製備用於檢測乾燥症候群的試劑盒或檢測器件中的用途。
【文檔編號】C12N15/63GK103880941SQ201210559215
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月21日 優先權日:2012年12月21日
【發明者】李鍾 , 馬雄明, 章為江 申請人:蘇州偲聚生物材料有限公司