一種建立泰山黃精高頻再生體系的方法及培養基與流程
2023-10-06 19:53:09 1
本發明涉及生物技術領域，具體為一種利用泰山黃精離體芽鱗為外植體建立泰山黃精高頻再生體系的方法及培養基。
背景技術：
泰山黃精(polygonatum sibiricum Red.)為百合科黃精屬多年生草本植物，別名老虎姜、雞頭參、仙人餘糧等。該屬植物約有40多種，主要分布在北溫帶和北亞熱帶，我國有31種，全國大部分省市均有分布。泰山黃精與滇黃精、多花黃精同被《中國藥典》（2010版）確定為正品藥用品種，主要以其肉質根狀莖入藥，藥性甘，平；歸脾、肺、腎經；具補氣養陰，健脾，潤肺，益腎的藥用功效。泰山黃精也稱「雞頭黃精」，主產泰山地區，是著名的泰山四大名藥之一，屬藥用正品黃精。
自古以來，泰山黃精主要作為常用中藥方的配藥使用，市場需求量並不大，多以採挖野生資源為主。隨著對黃精應用研究的不斷深入，其用途也日益廣泛，除藥用保健外，還用以加工成飲料、化妝品及各種菜餚；因其獨特的外形，還被作為觀賞花卉等園林用途，因此，近年來，市場對黃精的需求量快速增長，供需矛盾日益突出。因目前市場上黃精的來源還主要靠採挖野生資源，這導致了人們對野生資源的過度掠奪性採挖，致使黃精野生資源瀕臨滅絕，而黃精人工繁育栽植的規模較小，並且面臨繁育技術方面的一些問題，如黃精直接用種子繁殖較難且容易出現品種退化問題；生產上一般採用的根莖繁殖方式也存在連續種植後根莖病蟲害逐年加重、品質下降的問題，進而影響黃精產品質量和產量。再加上，黃精野生生長環境遭到嚴重破壞，很難恢復自然種群生長，也更進一步影響了黃精資源的可持續利用和深入發展。為解決黃精供需矛盾，從種源方面改善黃精品質，提高生產繁殖效率，更好地保護生態環境，亟需進行野生黃精人工繁育技術方面的研究。
利用組織培養技術對黃精進行快速繁殖，既有利於對黃精野生資源的保護及高效繁殖又有利於黃精藥材的商品化生產。對不同品種黃精進行組織培養技術的研究已有很多報導，但大多集中在多花黃精和雞頭黃精。Zhao等以多花黃精頂芽為外植體建立快繁體系，獲得黃精再生植株；徐忠傳等篩選出有利於離體多花黃精不定芽增殖的最佳6-BA濃度，並得到可用於生根的再生苗，完善了多花黃精組培技術體系；劉紅美等以多花黃精帶芽根莖為外植體建立多花黃精組織培養快速繁殖體系；萬學峰等以多花黃精的根莖為外植體，初步研究了福建多花黃精快速繁殖技術體系，繁殖係數3.0左右；梁引庫進行了黃精脫毒苗繁殖方面的現狀闡述，指出黃精脫毒組培苗可有效減輕黃精苗木病蟲害發生；李鶯等以雞頭黃精的根狀莖作為外植體，研究了植物激素對其離體快速繁技術的影響。對泰山黃精的組培快繁技術研究，最早報導的是牟小翎等以泰山野生黃精的根狀莖頂芽和莖尖為外植體進行培養，獲得黃精組培苗，繁殖係數最高可達4.5左右。
以上關於黃精組織培養的研究雖然都取得了成功，但都局限於以黃精的地下根莖為外植體建立快繁體系，而根莖外植體因長期深埋在泥土中，容易攜帶各類病菌，不利於徹底消毒，易導致較高的外植體汙染率和較低的無菌體建成率；而用根莖頂芽、莖尖做外植體，雖然提高了無菌體成功率，卻存在組培材料來源單一，莖尖剝取的無菌操作不好控制，且需大量消耗根莖頂芽，導致無頂芽的黃精根莖當年難以發芽生長的問題。因此，從目前黃精組培的研究現狀來看，黃精的組織培養技術研究還存在一定局限性，對黃精不同器官的組培技術探索也很少，黃精組織培養還存在一定的技術空白。
技術實現要素：
本發明針對當前泰山黃精生產中用種子繁殖困難，常規根莖繁殖易出現病蟲害加重和種質退化，而組培主要以根莖頂芽和莖尖為外植體建立快繁體系，外植體來源單一、試驗材料消耗量大、繁殖效率低的現狀，選擇以比較易得的黃精頂芽芽鱗為外植體試材，通過誘導芽鱗分化獲得不定根，再對不定根進一步誘導產生同時具有不定根和頂芽的根莖、不定芽團和多種形態的愈傷組織等不同類型的分化體；對這些類型的分化體分別繼續培養，均可繼續產生新的不定芽團、具頂芽根莖和多種類型愈傷組織，從而建立泰山黃精離體根、莖、葉的高頻再生體系；採用同樣的培養基也可獲得根莖的高頻再生體系。利用以上方法獲得的根、莖、葉、愈傷組織及根莖之間在不同培養時期可相互轉化生長。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案是：一種建立泰山黃精高頻再生體系的方法，包含有如下步驟：
（1）外植體的選擇 選擇泰山黃精根莖頂芽外層包被的芽鱗作為外植體；
（2）無菌外植體的篩選 將外植體用無菌水衝洗，再用無菌濾紙吸乾表面多餘水分，置於無菌空瓶內，在無菌室超淨工作檯上進行表面消毒，消毒完後，無菌水衝洗，用無菌濾紙吸乾表面多餘水分，接種於誘導分化培養基上，每瓶1片，放置在無菌室暗培養；培養3-9 d後挑選並棄除真菌或細菌汙染的外植體，將獲得的無菌外植體作為試驗材料在誘導分化培養基中繼續培養；從第7 d開始，外植體開始出現明顯生長變化；
（3）外植體再生分化誘導 外植體在誘導分化培養基上培養14 d後，芽鱗基部開始長出白色不定根，隨著培養時間延長，不定根表面覆蓋白色絨毛，20-30 d後，新生的白色不定根變成條狀、片狀或束狀，並不斷伸長至2-4 cm；
（4）離體根莖葉的再生誘導
A、離體根誘導 將外植體誘導分化產生的不定根切下，接種在分化啟動培養基上，繼續培養20-30 d後，在根束基部、距新根的根尖生長點1-1.5 cm處均開始長出淺黃色半透明狀顆粒突起，並逐漸長成白色不定芽，將這些不定芽與根束共同體繼續在分化培養基上培養，繼續培養30 d後，這些不定芽形成直徑2-3 cm的不定芽芽團，每個不定芽芽團約有15-23個不同類型的不定芽苗；不定芽苗的類型主要有以下幾種：a具有根和頂芽的圓球狀根莖；b無根的白色不定芽；c無根，具黃綠色莖葉的小苗；
B、離體葉誘導 從不定根誘導獲得的不定芽芽團上，選擇生長健壯、綠色、葉片寬度大於0.3 cm的完整葉片，單獨剪下平鋪在分化啟動培養基表面，7 d後葉片開始膨大卷翹，14 d後，在葉片基部長出白色顆粒狀愈傷或直接長出白色不定芽；平均每片葉的繁殖係數可達6-15；
C、離體莖誘導 剪取不定根誘導獲得的不定芽芽團中高度0.5 cm以上、至少具有1個節的莖段，直接插入或平鋪在分化啟動培養基上，14 d後，在莖段剪口處形成一圈白色叢生芽，每段莖段約可產生9-20個不定芽，25 d後逐漸長成直徑1-3 cm的叢生芽芽團，將這樣的芽團切分成直徑0.5-1 cm的小芽團進行繼代增殖培養；
（5）增殖繼代培養
將上一步驟中分化的各種器官類型離體根莖葉誘導產生的不定芽和各種類型的分化體在分化繼代培養基上進行繼代增殖培養，每隔15-20 d繼代一次，最後得到泰山黃精高頻再生體系。各類型的最高增殖頻率可達13，綜合增殖效率較僅用根莖繁殖提高2-3倍。
所述步驟1中外植體的具體選擇方法為：選擇生長健壯、無病蟲害、性狀表現優良的泰山黃精單株為試驗株，於10月底11月初地上部分完全枯萎後挖出地下根莖，選擇其中具飽滿頂芽的根莖為試驗材料，或於翌年3月早春挖出地下根莖進行適當催芽，並以此為試驗材料進行預處理；
選擇已初步催芽的生長健壯具飽滿頂芽的泰山黃精根莖，先將根莖在流水下衝洗乾淨表面泥土，去掉多餘鬚根，並用毛刷刷洗殘存在根莖表面凹縫中的泥土，再用洗潔精溶液浸泡15 min，然後用流水洗淨表面的溶液，再用酒精棉球擦洗表面，直接剝取或待頂芽開始膨大，芽鱗開始張開時，用消毒刀片小心剝取頂芽外層包被的白色芽鱗，具體操作為：按從外至內順序依次剝取3-5層，儘量保持每片芽鱗的完整性。
所述步驟2中的表面消毒方法為：先用70%酒精溶液浸泡30-60 s，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡6-10 min。
所述步驟4中將外植體誘導分化產生的不定根切下，接種在分化培養基上，切取的不定根長度以2-4 cm為最佳。
一組建立泰山黃精高頻再生體系所用培養基，由誘導分化培養基、 分化啟動培養基、分化繼代培養基組成：
所述誘導分化培養基為：MS+BA1.0-2.0 mg/L +2,4-D0.3-0.8 mg/L +蔗糖4-6%；
所述分化啟動培養基1為：MS+BA0.1-0.3 mg/L+IBA0.2-0.3 mg/L +蔗糖3-5%；
所述分化繼代培基1為：MS+BA2.0-2.5 mg/L +IBA0.5-1.0 mg/L +蔗糖3-5%。
一組建立泰山黃精高頻再生體系所用培養基，所述分化啟動培養基2還可為：MS+BA2.0-5.0 mg/L +IBA0.05-0.2 mg/L +蔗糖3-6%；
所述分化繼代培基2還可為： MS+BA0.8-1.0 mg/L +IBA0.03-0.05 mg/L +蔗糖3-5%。
上述各階段採用的基本培養基均為MS培養基，碳源為3-6%的分析純蔗糖，pH 5.5-6.2。上述各階段中除使用誘導分化培養基為暗培養外，其他培養條件均相同，培養室溫度均為晝溫25±2℃ ，夜溫20±2℃，光照強度1000-1500 lx，光照時間8-12 h/d。
本發明使泰山黃精外植體有效利用率提高3-4倍，使組培苗繁殖係數達12以上，比已有報導中繁殖效率提高了7.0以上，且用離體根莖葉誘導繁殖的不定芽苗還具有生長速度快和獨立成苗能力；各分化類型之間在不同培養時期相互轉化生長的形態和時期特徵明顯。
本發明的技術方法，可重複性高，取材易得，操作簡便，繁殖效率高，大大突破了泰山黃精組培中再生材料單一用根莖及頂芽繁殖的瓶頸問題，成功建立泰山黃精根、莖、葉等不同器官的再生體系，填補泰山黃精組培技術體系的空白，可從根本上解決泰山黃精種質退化及常規繁育中周期長、繁殖率低等問題，為滿足市場需求、緩解生態壓力及工廠化、規範化苗木生產奠定基礎。
具體實施方式
實施例1
試驗苗為從海拔300 m以上泰山山麓採集的泰山野生黃精根莖繁殖的後代，根莖已在泰山羅漢崖林場試驗地馴化栽培2年。生長季節，從試驗地選擇生長健壯、無病蟲害、性狀表現優良的泰山黃精單株為試驗株，於10月底11月初地上部分完全枯萎後挖出地下根莖，選擇其中具飽滿頂芽的根莖為試驗材料進行預處理。
先將根莖在流水下衝洗乾淨表面泥土，去掉多餘鬚根，並用毛刷刷洗殘存在根莖表面凹縫中的泥土，再用洗潔精溶液浸泡15 min，然後再用流水衝洗乾淨表面的溶液，再用酒精棉球擦洗表面，剝取頂芽外層包被的白色芽鱗。具體操作為：用消毒刀片和鑷子，按從外至內順序依次剝取3-5層頂芽外層包被的白色芽鱗，儘量保持每片芽鱗的完整性。
將剝取的泰山黃精頂芽芽鱗用無菌水衝洗2-3遍，再用無菌濾紙吸乾表面多餘水分，置於無菌空瓶內，在無菌室超淨工作檯上進行表面消毒。先用70%酒精溶液浸泡30 s，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡6 min，取出後，無菌水衝洗3-5遍，用無菌濾紙吸乾表面多餘水分，接種於誘導分化培養基，誘導分化培養基的成分組成為：MS+BA1.0 mg/L +2,4-D0.3 mg/L +蔗糖4%；每瓶1片，放置在無菌培養室暗培養。
經過7-14 d的暗培養，芽鱗片切口處開始長出白色不定根， 20 d後，部分不定根基部連成片或束狀，片狀根和單獨根表面均覆蓋白色絨毛。當這樣的根長至2-4 cm時，切下接種於分化啟動培養基單獨培養，分化啟動培養基的成分為：MS+BA0.1mg/L+IBA0.2 mg/L +蔗糖3%，分化啟動培養基進行根的再生分化誘導。離體根在分化啟動培養基繼續培養20 d後，在根束基部開始長出淺黃色半透明狀顆粒突起，並逐漸長成白色不定芽，將這些不定芽與根束共同體繼續在分化啟動培養基上培養，30 d後，這些不定芽形成直徑2-3 cm的不定芽芽團，每個不定芽芽團約有15-20個不同生長時期的不定芽苗和愈傷組織。這類型產生芽團的根，具有可連續產生2代以上不定芽團的能力。
不定根產生的芽團繼續培養30-40 d後，芽苗明顯生長，葉片變綠，並長出具2節以上莖段。從不定根誘導獲得的不定芽芽團上剪取生長勢旺盛、葉片寬度0.3 cm以上的的葉片進行不定芽誘導，接種於分化啟動培養基上培養7 d後開始出現體積膨大，葉片卷翹，15 d後，在葉片基部長出白色顆粒狀愈傷或直接長出白色不定芽，顏色較綠的葉片先長出白色愈傷顆粒，顏色淺綠的葉片大部分直接長出不定芽，平均每片葉的繁殖係數可達10.5。
結合葉片誘導，同時進行莖段不定芽的誘導培養。剪取不定根誘導獲得的不定芽芽團中大於0.5 cm並具有1-2個節的莖段，莖段基部向下直接插入或平鋪在分化啟動培養基上。14 d後，在莖段剪口處形成一圈白色叢生芽，每段莖段約可產生9-12個不定芽，25 d後逐漸長成直徑1-3cm的叢生芽芽團，將這樣的芽團切分成直徑0.5-1 cm的小芽團進行繼代增殖培養。
對誘導出的不同類型愈傷組織進行不定芽的誘導。表面光滑的白色圓球形根莖愈傷在分化啟動培養基上培養20 d後，表面長出毛刺狀白色叢生芽，每個愈傷球可形成5個以上白色新芽，繼續培養20 d左右，即可長成無根，具黃綠色葉片的小苗；水滴狀具頂芽的圓球莖在芽鱗痕處分化出新的具頂芽的綠色不定芽，根據每個圓球莖體積大小不同可產生1-5個新芽。
對以上誘導產生的不定芽和不同類型分化體在分化繼代培養基上進行繼代增殖培養，分化繼代培養基為MS+BA2.0mg/L +IBA0.5mg/L +蔗糖3%，每隔15-20 d繼代一次，最高增殖頻率可達13，各類型的綜合增殖效率較僅用根莖繁殖提高2-3倍。在分化繼代培養基MS+BA2.0 mg/L +IBA0.5mg/L +蔗糖3%和分化繼代培養基MS+BA0.8 mg/L +IBA0.03 mg/L +蔗糖3%中交替繼代，每隔15-20 d繼代一次，可獲得不同分化類型的分化體，並保持較高的增殖分化率。
實施例2
試驗苗為從海拔300 m以上泰山山麓採集的泰山野生黃精根莖繁殖的後代，根莖已在泰山羅漢崖林場試驗地馴化栽培2年。生長季節，選擇生長健壯、無病蟲害、性狀表現優良的泰山黃精單株為試驗株，定株觀察，於翌年3月早春挖出地下根莖，選擇其中具飽滿頂芽的根莖，在溫室進行適當催芽，具體處理為：選溫室內向陽處堆砌深15-25 cm，長30-40 cm，寬20-30 cm的沙池，用溼沙填埋基層10-15 cm厚，把選擇好的黃精根莖整齊排布在沙層上，然後再覆蓋10 cm左右溼沙，適當遮蓋保溼，溫室內晝夜溫差為10℃以上，白天高溫25℃左右， 7-14 d後，頂芽明顯膨大，頂芽尖部芽鱗明顯開裂時，取出沙藏的黃精試驗根莖，進行預處理。
先將黃精根莖表面泥沙在流水下衝洗乾淨，並用毛刷刷洗殘存在根莖表面凹縫中的泥土，再用洗潔精溶液浸泡10 min，流水衝洗乾淨表面溶液後，用濾紙吸乾表面多餘水分，用消毒刀片和鑷子剝取頂芽外層包被的白色芽鱗。具體操作為：按從外至內順序依次剝取3-5層，儘量減少芽鱗的傷口，並保持每片芽鱗的完整性。
將剝取的泰山黃精頂芽芽鱗用無菌水衝洗2-3遍，再用無菌濾紙吸乾表面多餘水分，置於無菌空瓶內，在無菌室超淨工作檯上進行表面消毒。先用70%酒精溶液浸泡60 s，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡8 min，取出後，無菌水衝洗3-5遍，用無菌濾紙吸乾表面多餘水分，接種於誘導分化培養基，誘導分化培養基的成分為：MS+BA2.0 mg/L +2,4-D0.8 mg/L +蔗糖6%；每瓶1片，放置在無菌培養室暗培養。
經過7-14 d的暗培養，芽鱗片切口處開始長出白色不定根， 25 d後，不定根基部連成片狀，且根表面覆蓋白色絨毛。當這樣的根長至2-4 cm時，切下接種於分化啟動培養基進行根的再生分化誘導。分化啟動培養基的成分為：MS+BA0.3mg/L +IBA0.3mg/L +蔗糖5%；在分化啟動培養基繼續培養22 d後，在根束基部開始長出淺黃色半透明狀顆粒突起，並逐漸長成白色不定芽，將這些不定芽與根束共同體繼續在分化啟動培養基上培養，40 d後，這些不定芽形成直徑2-3 cm的不定芽芽團，每個不定芽芽團約有15-23個不同生長時期的不定芽苗和愈傷組織。這類型產生芽團的根，具有可連續產生2代以上不定芽團的能力。
不定根產生的不定芽芽團繼續培養15-20 d後，芽苗明顯生長，葉片變綠，並長出具節莖段，剪取生長勢旺盛、綠色、葉片寬度0.2-0.5 cm的葉片接種於分化啟動培養基進行不定芽誘導。葉片培養7 d後開始出現體積膨大，葉片卷翹，18 d後，在葉片基部長出白色顆粒狀愈傷或直接長出白色不定芽，顏色較綠的先長出白色愈傷顆粒，顏色淺綠的葉片大部分直接長出不定芽，平均每片葉的繁殖係數可達11。
結合葉片誘導不定芽，同時進行莖段不定芽誘導培養。剪取高度大於0.5 cm，至少具有1個節的莖段，基部向下直接插入或平鋪在分化啟動培養基上。18 d後，在莖段剪口處形成白色叢生芽，每段莖段約可產生6-20個不定芽，30 d後逐漸長成直徑3 cm左右的叢生芽芽團，將這樣的芽團切分成直徑0.5 cm的小芽團進行繼代增殖培養。
對誘導出的不同類型愈傷組織進行不定芽的誘導。表面光滑的白色圓球形根莖愈傷在分化培養基上培養30 d後，表面長出毛刺狀白色叢生芽，每個愈傷球可形成6-11個白色新芽，繼續培養25 d左右，即可長成無根，具黃綠色葉片的小苗；水滴狀具頂芽的圓球莖在芽鱗痕處分化出新的具頂芽的綠色不定芽或繼續產生白色具頂芽圓球莖，根據每個圓球莖體積大小不同可產生3-5個新芽。
對以上誘導產生的不定芽和不同類型分化體進行接種於分化繼代培養基進行繼代增殖培養，分化繼代培養基的成分為：MS+BA2.5 mg/L +IBA1.0 mg/L +蔗糖5%，每隔20 d左右轉移到新鮮培養基一次，各類型的最高增殖頻率可達10以上，綜合增殖效率較僅用根莖繁殖提高2-3倍。在MS+BA2.5 mg/L +IBA1.0 mg/L +蔗糖5%和MS+BA1.0 mg/L +IBA0.05 mg/L +蔗糖5%中交替繼代，每種培養基的培養時間不超過20天，可獲得不同分化類型的分化體，並保持較高的增殖分化率。
實施例3
試驗苗為從海拔300 m以上泰山山麓採集的泰山野生黃精根莖繁殖的後代，根莖已在泰山羅漢崖林場試驗地馴化栽培2年。生長季節，從試驗地選擇生長健壯、無病蟲害、性狀表現優良的泰山黃精單株為試驗株，於10月底11月初地上部分完全枯萎後挖出地下根莖，選擇其中具飽滿頂芽的根莖為試驗材料進行預處理。
先將根莖在流水下衝洗乾淨表面泥土，去掉多餘鬚根，並用毛刷刷洗殘存在根莖表面凹縫中的泥土，再用洗潔精溶液浸泡15 min，然後再用流水衝洗乾淨表面的溶液，再用酒精棉球擦洗表面，剝取頂芽外層包被的白色芽鱗。具體操作為：用消毒刀片和鑷子，按從外至內順序依次剝取3-5層頂芽外層包被的白色芽鱗，儘量保持每片芽鱗的完整性。
將剝取的泰山黃精頂芽芽鱗用無菌水衝洗2-3遍，再用無菌濾紙吸乾表面多餘水分，置於無菌空瓶內，在無菌室超淨工作檯上進行表面消毒。先用70%酒精溶液浸泡30 s，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡6 min，取出後，無菌水衝洗3-5遍，用無菌濾紙吸乾表面多餘水分，接種於誘導分化培養基，誘導分化培養基的成分組成為：MS+BA1.5 mg/L +2,4-D0.5 mg/L +蔗糖5%；每瓶1片，放置在無菌培養室暗培養。
經過7-14 d的暗培養，芽鱗片切口處開始長出白色不定根， 20 d後，部分不定根基部連成片或束狀，片狀根和單獨根表面均覆蓋白色絨毛。當這樣的根長至2-4 cm時，切下接種於分化啟動培養基單獨培養，分化啟動培養基的成分為：MS+BA0.2mg/L+IBA0.25 mg/L +蔗糖4%，分化啟動培養基進行根的再生分化誘導。離體根在分化啟動培養基繼續培養20 d後，在根束基部開始長出淺黃色半透明狀顆粒突起，並逐漸長成白色不定芽，將這些不定芽與根束共同體繼續在分化啟動培養基上培養，30 d後，這些不定芽形成直徑2-3 cm的不定芽芽團，每個不定芽芽團約有15-20個不同生長時期的不定芽苗和愈傷組織。這類型產生芽團的根，具有可連續產生2代以上不定芽團的能力。
不定根產生的芽團繼續培養30-40 d後，芽苗明顯生長，葉片變綠，並長出具2節以上莖段。從不定根誘導獲得的不定芽芽團上剪取生長勢旺盛、葉片寬度0.3 cm以上的的葉片進行不定芽誘導，接種於分化啟動培養基上培養7 d後開始出現體積膨大，葉片卷翹，15 d後，在葉片基部長出白色顆粒狀愈傷或直接長出白色不定芽，顏色較綠的葉片先長出白色愈傷顆粒，顏色淺綠的葉片大部分直接長出不定芽，平均每片葉的繁殖係數可達10.5。
結合葉片誘導，同時進行莖段不定芽的誘導培養。剪取不定根誘導獲得的不定芽芽團中大於0.5 cm並具有1-2個節的莖段，莖段基部向下直接插入或平鋪在分化啟動培養基上。14 d後，在莖段剪口處形成一圈白色叢生芽，每段莖段約可產生9-12個不定芽，25 d後逐漸長成直徑1-3cm的叢生芽芽團，將這樣的芽團切分成直徑0.5-1 cm的小芽團進行繼代增殖培養。
對誘導出的不同類型愈傷組織進行不定芽的誘導。表面光滑的白色圓球形根莖愈傷在分化啟動培養基上培養20 d後，表面長出毛刺狀白色叢生芽，每個愈傷球可形成5個以上白色新芽，繼續培養20 d左右，即可長成無根，具黃綠色葉片的小苗；水滴狀具頂芽的圓球莖在芽鱗痕處分化出新的具頂芽的綠色不定芽，根據每個圓球莖體積大小不同可產生1-5個新芽。
對以上誘導產生的不定芽和不同類型分化體在分化繼代培養基上進行繼代增殖培養，分化繼代培養基為MS+BA2.2 mg/L +IBA0.8 mg/L +蔗糖4%，每隔15-20 d繼代一次，最高增殖頻率可達13，各類型的綜合增殖效率較僅用根莖繁殖提高2-3倍。在分化繼代培養基MS+BA2.2 mg/L +IBA0.8 mg/L +蔗糖4%和分化繼代培養基MS+BA0.9 mg/L +IBA0.04 mg/L +蔗糖4%中交替繼代，每種培養基的培養時間不超過20天，可獲得不同分化類型的分化體，並保持較高的增殖分化率。
實施例4
以上從大田試驗地挖取的根莖和溫室沙藏的根莖，在取完頂芽芽鱗後，剩餘的具頂芽生長點的根莖可繼續作為外植體材料進行誘導培養。
在流水下將試驗根莖表面泥土衝洗乾淨，去掉多餘鬚根，並用毛刷刷洗殘存在根莖表面凹縫中的泥土，再用洗潔精溶液浸泡15 min，然後洗淨表面溶液，並用無菌水衝洗2-3遍，吸乾表面多餘水分，再用酒精棉球擦洗根莖表面，切成0.5-2 cm長的段，置於無菌空瓶內，在無菌室超淨工作檯上進行表面消毒。先用70%酒精溶液浸泡60 s，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡10 min，取出後，無菌水衝洗3-5遍，用無菌濾紙吸乾表面多餘水分，接種於分化啟動培養基2，分化啟動培養基的成分為：MS+BA2.0-5.0 mg/L +IBA0.05-0.2 mg/L +蔗糖3-6%，每瓶一段，放置在無菌室暗培養。
15 d後，根莖頂芽開始萌發，芽鱗痕處出現小米粒狀白色新芽，25 d後，頂芽明顯伸長，長成綠色具2個節以上的小苗，白色新芽變成直徑0.3 cm左右具頂芽圓球莖，30 d後新生圓球莖開始長出粗壯、光滑的白色新根，每個圓球莖可生根1-3條，頂芽葉片也開始展開並長出具結莖段。在上述分化培養基中經3次繼代培養後，將所獲根莖再轉移至分化繼代培養基MS+BA0.8-1.0 mg/L +IBA0.03-0.05 mg/L +蔗糖3-5%中30-40d，新生圓球莖可繼續分化產生白色光滑球狀或橢圓形愈傷、具頂芽白色圓球莖等分化類型。隨著繼代培養時間延長，這類分化體體積繼續增大，30 d後約可增至原體積的1倍以上，並出現白色叢生芽和圓球莖的繼續增殖分化，叢芽數量依愈傷體積大小約產生3-9個。這樣在分化啟動培養基和分化繼代培養基中按2:1的頻次交替繼代培養，可保持根莖較穩定的分化頻率。
這類型的根莖分化體每隔20-25 d繼代一次，每代增殖2-3倍，在MS+BA2.0-5.0 mg/L +IBA0.05-0.2 mg/L +蔗糖3-6%和MS+BA0.8-1.0 mg/L +IBA0.03-0.05mg/L+蔗糖3-5%中交替繼代，可獲得不同分化類型的分化體，並保持較高的增殖分化率。
方案一、二、三誘導產生的不定芽具有獨立生根能力，新根和葉片誘導產生的新芽可重複進行二次誘導，並可繼續產生不定芽芽團。根莖誘導產生的愈傷組織和長出的新根與芽鱗誘導產生的新根具有同樣分化不定芽的能力；且，以上方式產生的根莖葉和不同類型的愈傷組織之間，在不同培養時期時期具有相互轉換生長分化的能力，且各分化類型相互轉化生長的形態和時期特徵明顯。