一種離體誘導冬棗花葯愈傷組織的方法
2023-10-06 20:05:49
專利名稱：一種離體誘導冬棗花葯愈傷組織的方法
技術領域：
本發明涉及一種離體誘導冬棗花葯愈傷組織的方法。
背景技術：
單倍體育種，主要是指通過花葯培養或游離小孢子培養(以下簡稱小孢子培養)的方式得到單倍體植株，然後經秋水仙素等處理加倍為雙單倍體，從而直接獲得純合的品系。無論是花葯培養還是小孢子培養，從開始培養到獲得完全純合的品系一般只需要1年左右的時間。對果樹來說，單倍體育種有可能使某些原來無性繁殖的果樹也能用種子繁殖，並為基因型高度雜合的果樹遺傳性研究提供純系材料，從而促進果樹遺傳理論工作的研究。因此，該項技術若應用於育種實踐，必將大大加快育種的速度，節省大量的人力物力，是一項對育種工作極其有用的生物技術。
1953年，Tuleck用銀杏花粉在人工培養基上第一次成功地誘導形成單倍體愈傷組織Guha和Maheshwari(1964)首次成功地從毛葉曼陀羅(Datura inoxia)花葯培養中獲得單倍體植株，隨後證實是由胚狀體途徑獲得的單倍體花粉植株，從此開創了利用花粉培育單倍體的新途徑，近30年來，利用花葯培養產生單倍體植株的技術已被廣泛應用到10個科，24個屬，34個種的250多種植物上。果樹花葯培養單倍體的研究起步較晚，20世紀70年代末到80年代初先後在柑橘、蘋果、葡萄、草莓、荔枝、龍眼等樹種上取得了成功。我國至今已經培育出了40餘種由花粉或花葯發育成的單倍體植株。棗(Ziziphus jujuba Mill.)是我國特色優勢果樹，關於棗的花葯培養，迄今只在金絲小棗上有過報導，但存在愈傷組織誘導率較低(43.1％)的問題，在離體誘導冬棗花葯愈傷組織方面尚未見相關報導，因此提高棗花葯愈傷組織誘導率，將大大加快棗的單倍體育種進程。
發明內容
本發明建立了冬棗花葯愈傷組織誘導技術體系，能保證獲得冬棗花葯的愈傷組織，並實現其增殖，為深入開展棗的單倍體育種研究提供了一種新的技術平臺。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案是首先建立合適的冬棗花葯外植體的消毒方法，再對外植體進行初始愈傷組織的誘導，通過不同基本培養基、不同碳源，不同植物生長調節劑的調控，篩選出最適冬棗花葯愈傷組織誘導培養基，獲得花葯的初始愈傷組織；然後在此基礎上進行花葯愈傷組織的增殖培養基篩選，以達到使愈傷組織快速增殖的目的。
本發明的具體內容，即離體誘導冬棗花葯愈傷組織的方法如下 外植體採集與消毒在5～6月選取田間直徑為0.3～0.6cm、花萼尚未張開的冬棗未成熟花蕾，4℃冰箱預處理1～3d。流水衝洗1～2h，超淨工作檯上將花蕾放入70％乙醇30s，再轉入0.1％HgCl2溶液中8min，無菌水衝洗3～4次後剝取花葯。
培養條件 基本培養基為MS培養基，麥芽糖15～20g/L，瓊脂3.5g/L，培養基滅菌前pH為5.8～6.0。光照周期為15小時光照、9小時黑暗。光照強度800～1000Lux。溫度控制在27±1℃。
啟動培養 將無菌花葯接種在MS+麥芽糖15～20g/L+TDZ0.5-10mg/L+NAA0-0.5mg/L的培養基上進行暗培養三周，然後轉至弱光下(800～1000Lux)培養。花葯逐漸產生黃綠色的、鬆散顆粒狀的愈傷組織，且隨培養時間的延長逐漸增多。
增殖培養 將獲得的初始愈傷組織轉接到MS+麥芽糖15～20g/L+TDZ0.1-0.5mg/L+NAA0-0.5mg/L的培養基中進行增殖培養。
本發明專利的有益效果是，通過對冬棗花葯外植體的消毒、初始愈傷組織誘導、愈傷組織的增殖培養，可快速獲得大量花葯愈傷組織，誘導率高達86.23％，從而攻克了棗花葯不易獲得愈傷組織這一大技術難題，並大大提高了花葯愈傷組織的誘導率(86.23％)。該發明可用於獲得大量冬棗花葯愈傷組織，為冬棗單倍體育種奠定基礎，並可為其他棗品種的花葯培養提供參考。
圖1中是冬棗花葯在MS+麥芽糖15～20g/L+TDZ0.5-1.0mg/L+NAA0-0.5mg/L的培養基上培養40～50d時獲得的初始愈傷組織。
圖2中是初始愈傷組織在MS+麥芽糖15～20g/L+TDZ0.1-0.5mg/L+NAA0-0.5mg/L的培養基中的增殖培養。
具體實施例方式 在5～6月選取田間直徑為0.3～0.6cm、花萼尚未張開的冬棗未成熟花蕾，4℃冰箱預處理1～3d。流水衝洗1～2h，超淨工作檯上將花蕾放入70％乙醇30s，再轉入0.1％HgCl2溶液中8min，無菌水衝洗3～4次後剝取花葯。啟動培養時將無菌花葯接種在MS+麥芽糖15～20g/L+TDZ0.5-1.0mg/L+NAA0-0.5mg/L的培養基上進行暗培養三周，然後轉至弱光下(800～1000Lux)培養。花葯逐漸產生黃綠色的、鬆散顆粒狀的愈傷組織，且隨培養時間的延長逐漸增多。增殖培養時將獲得的初始愈傷組織轉接到MS+麥芽糖15～20g/L+TDZ0.1-0.5mg/L+NAA0-0.5mg/L的培養基中進行增殖培養，愈傷組織可快速增殖。以上培養基基本培養基為MS培養基，麥芽糖15～20g/L，瓊脂3.5g/L，培養基滅菌前pH為5.8～6.0。光照周期為15小時光照、9小時黑暗。光照強度800～1000Lux。溫度控制在27±1℃。
權利要求
1.一種離體誘導冬棗花葯愈傷組織的方法，其特徵在於通過對冬棗花葯進行組織培養，獲得其愈傷組織，愈傷組織誘導率達86.23％。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於包括以下培養步驟
(1)在5～6月選取田間直徑為0.3～0.6cm、花萼尚未張開的冬棗未成熟花蕾，4℃冰箱預處理1～3d後流水衝洗1～2h，在超淨工作檯上將流水衝洗後的花蕾放入70％乙醇30s，再轉入0.1％HgCl2溶液中8min，然後用無菌水衝洗3～4次，獲得無菌花蕾；
(2)經步驟(1)將獲得的無菌花蕾剝取花葯接種在MS+麥芽糖15～20g/L+TDZ0.5-1.0mg/L+NAA0-0.5mg/L的培養基上進行暗培養三周，然後轉至弱光下(800～1000 Lux)培養，培養30～50d後產生初始愈傷組織；
(3)經步驟(2)獲得的初始愈傷組織，轉接到MS+麥芽糖15～20g/L+TDZ0.1-0.5mg/L+NAA0-0.5mg/L的增殖培養基中進行增殖培養。
3.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於基本培養基為MS，含麥芽糖15～20g/L，瓊脂3.5g/L，培養基滅菌前pH為5.8～6.0，光照周期為15小時光照、9小時黑暗，光照強度800～1000Lux，溫度控制在27±1℃。
全文摘要
一種離體誘導冬棗花葯愈傷組織的方法，即通過冬棗花葯的組織培養獲得其愈傷組織，愈傷組織誘導率達86.23％，包括外植體採集、消毒、初始誘導、增殖培養。在5～6月選取田間直徑為0.3～0.6cm、花萼尚未張開的冬棗未成熟花蕾，4℃冰箱預處理1～3d。流水衝洗1～2h，超淨工作檯上將花蕾放入70％乙醇30s，再轉入0.1％HgCl2溶液中8min，無菌水衝洗3～4次後剝取花葯，啟動培養時將無菌花葯接種在MS+麥芽糖15～20g/L+TDZ0.5－1.0mg/L+NAA0－0.5mg/L的培養基上進行暗培養三周，然後轉至弱光下(800～1000Lux)培養。花葯逐漸產生黃綠色的、鬆散顆粒狀的愈傷組織，且隨培養時間的延長逐漸增多。增殖培養時將獲得的初始愈傷組織轉接到MS+麥芽糖15～20g/L+TDZ0.1－0.5mg/L+NAA0－0.5mg/L的培養基中進行增殖培養，愈傷組織可快速增殖。以上培養基基本培養基為MS培養基，麥芽糖15～20g/L，瓊脂3.5g/L，培養基滅菌前pH為5.8～6.0。光照周期為15小時光照、9小時黑暗。光照強度800～1000Lux。溫度控制在27±1℃。該方法可在70d左右獲得大量冬棗花葯愈傷組織。
文檔編號A01G7/00GK1934932SQ20061013909
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月9日 優先權日2006年10月9日
發明者劉孟軍, 王娜, 趙錦, 秦子禹 申請人:河北農業大學